CN112941093B - 一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，提供了一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的方法，包括：先分别制备蓝藻丙酮酸脱氢酶PDHc E1的α亚基和β亚基所对应的DNA片段，然后将α亚基对应的DNA片段和β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet‑1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，获得重组质粒pETDuet‑1‑α‑β；再将重组质粒pETDuet‑1‑α‑β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet‑1‑α‑β‑pGro7重组宿主细胞；最后进行通过宿主细胞的培养，蛋白诱导表达，菌体收集，超声波破碎等蛋白表达分离纯化流程，即可获得异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1。本发明提供的制备方法不受生物组织的限制，操作简单、高效、制备成本低，获得的蓝藻PDHc E1产量高、纯度高、活性高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，更具体而言，涉及一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法。
背景技术
蓝藻是地球上最古老的物种之一，蓝藻丙酮酸脱氢酶的制备是研究其酶学性质、揭示丙酮酸脱氢酶定向分化等相关研究的基础，对研究以蓝藻丙酮酸脱氢酶为靶标的杀藻剂同样具有重要的科学意义。
丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate Dehydrogenase complex,PDHc)催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2并为生物体提供能量。PDHc由三种不同的酶组份构成：丙酮酸脱羧酶E1(pyruvate decarboxylase,EC 1.2.4.1,PDHc E1)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶E2(EC2.3.1.12)和二氢硫辛酰胺脱氢酶E3(EC 1.8.1.4)。PDHc还包括一些辅因子焦磷酸硫胺素、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫辛酸和金属Mg2+等。PDHc 在生命活动中起着重要作用，缺乏PDHc会导致生物体内碳水化合物的代谢障碍，造成能量供应不足，引起与丙酮酸代谢异常相关的疾病。PDHc E1催化丙酮酸的氧化脱羧，其催化效率决定了整个酶联反应的速率，是整个酶联反应中的限速步和唯一不可逆步。
上世纪40年代，人们首先采用直接从生物组织中提取的方法制备丙酮酸脱氢酶。通过组织直接提取法，人们先后获得了大肠杆菌、嗜热芽胞杆菌、牛、玉米及豌豆等物种的丙酮酸脱氢酶。然而从生物组织中直接提取的丙酮酸脱氢酶存在产量少、纯度低等问题，其无法满足现代科学研究的需求。基因工程的发展使得人们可以在体外制备大量、高纯度的蛋白。人们通过基因工程的方法首先制备了结构简单的同源二聚体α2型丙酮酸脱氢酶，如大肠杆菌丙酮酸脱氢酶，而结构复杂的异源四聚体α2β2型PDHc E1的异源表达一直是难点，此类蛋白由α亚基和β亚基在生物体内通过折叠组装而成。研究人员首先尝试将嗜热脂肪芽孢杆菌PDHc E1的α亚基和β亚基分别表达，再将所获得的α亚基和β亚基混合在一起，期望使其在体外自组装为异源四聚体α2β2型嗜热脂肪芽孢杆菌PDHc E1，但由于缺少对α亚基和β亚基进行翻译后的必要修饰，α亚基和β亚基存在折叠和组装错误的问题，所获得的α2β2型嗜热脂肪芽孢杆菌PDHc E1 几乎没有活性。这表明分别制备α亚基和β亚基，再进行体外组装的方法不可行。
发明内容
本发明提供一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的方法，以解决现有制备方法产量低或者无法获得高活性异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法，所述方法包括：
分别制备蓝藻丙酮酸脱氢酶PDHc E1的α亚基和β亚基所对应的DNA片段，所述α亚基对应的DNA片段如SEQ ID No：1所示，所述β亚基对应的DNA 片段如SEQ ID No：2所示；
将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到 pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒 pETDuet-1-α-β；
将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；
宿主细胞培养，蛋白诱导表达，菌体收集；
宿主细胞经超声波破碎后进行蛋白分离纯化，得到异源四聚体α2β2型蓝藻 PDHcE1。
优选的，所述将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β，包括：
先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点 1区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点2区域以得到所述重组质粒 pETDuet-1-α-β；或者，
先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点 2区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点1区域以得到所述重组质粒 pETDuet-1-α-β。
优选的，所述得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β之后，还包括：对得到的所述重组质粒pETDuet-1-α-β进行酶切及测序验证。
优选的，所述多克隆位点1区域包括双酶切位点EcoRI9和SaLI，所述多克隆位点2区域包括双酶切位点NdeI和XhoI。
优选的，所述将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞，包括：
先将所述重组质粒pETDuet-1-α-β转化到宿主细胞中，构建pETDuet-1-α-β宿主细胞，使用氨苄霉素筛选阳性菌株，并对所述阳性菌株中的质粒进行测序验证，然后将测序验证正确的阳性菌株制备为感受态细胞，将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到所述感受态细胞中以得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；或者，
先将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到宿主细胞中，构建pGro7宿主细胞，然后将所述pGro7宿主细胞制备为感受态细胞，将所述重组质粒pETDuet-1-α-β转化到所述感受态细胞中以得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞。
优选的，所述宿主细胞为BL21(DE3)。
优选的，所述得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞之后，还包括：
使用氨苄霉素和氯霉素双抗性筛选阳性菌株，并提取所述阳性菌株的质粒进行测序验证，保留验证正确的pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞。
优选的，所述蛋白诱导表达，收集菌体，包括：培养所述pETDuet-1-α-β-pGro7 宿主细胞至细胞密度OD680＝0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖，于15-37℃诱导表达4-24h，然后离心收集菌体；其中，所述诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.0mM。
优选的，培养所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞至细胞密度OD680＝0.6-0.8时，加入诱导剂阿拉伯糖和0.5mM IPTG，于16℃诱导表达16h。
优选的，所述宿主细胞经超声波破碎后进行蛋白分离纯化，包括：
宿主细胞超声波破碎后，离心获取包含蓝藻PDHc E1的上清液，然后使用亲和层析法对所述包含蓝藻PDHc E1的上清液进行蛋白纯化以获得目的蛋白，再使用凝胶排阻层析法对所得目的蛋白进行脱盐处理以除去咪唑。
与现有技术相比，本发明提供的制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法，通过在同一个载体上同时表达蓝藻PDHc E1的α和β亚基的重组质粒，并将重组质粒与伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，使得蓝藻丙酮酸脱氢酶的α、β亚基与伴侣蛋白在同一宿主细胞内进行共表达。宿主细胞表达的伴侣蛋白可直接对α和β亚基进行翻译后修饰，使其正确折叠和组装为高活性态的α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶。本发明提供的制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法相比直接从生物组织中提取丙酮酸脱氢酶的方法，不受生物组织的限制，通过简单的制备流程即可获得高纯度、高产量的异源四聚体α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶。相比于将α和β亚基对应的DNA片段分别克隆到两个载体上，在两个独立的宿主细胞内分别表达α和β亚基，再于体外组装为α2β2型丙酮酸脱氢酶的方法，本制备方法更经济，且所制备的蓝藻丙酮酸脱氢酶活性更高。
附图说明
图1是重组质粒pETDuet-1-α-β的构建图谱；
图2是诱导时间对蓝藻PDHc E1表达的影响(图2中M：标准蛋白；GroEL：伴侣蛋白条带；α：蓝藻PDHc E1的α亚基条带；β：蓝藻PDHc E1的β亚基条带)；
图3是诱导剂IPTG浓度对蓝藻PDHc E1表达的影响(图3中M、GroEL、α、β所代表的含义同图2)；
图4是表达时的温度对蓝藻PDHc E1表达的影响(图4中M、GroEL、α、β所代表的含义同图2)；
图5是蓝藻PDHc E1的纯化表达结果(图5中lane 1：上清；lane 2：沉淀； lane 3：流川；lane 4：杂蛋白；lane 5：目的蛋白。图5中M、GroEL、α、β所代表的含义同图2)；
图6是蓝藻PDHc E1对底物丙酮酸的米氏常数；
图7是蓝藻PDHc E1对辅因子ThDP的米氏常数。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法，该方法具体描述如下：
蓝藻PDHc E1由α和β两个亚基构成的异源四聚体α2β2型蛋白，α和β亚基分子量分别为38.2和35.7KD，α(1039bp)和β(984bp)亚基所对应DNA 的序列如序列表中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。首先通过人工合成或其他基因工程的方法获得蓝藻PDHc E1的α和β对应的DNA片段，将α亚基所对应的α-DNA克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域，构建重组质粒 pETDuet-1-α，酶切位点为EcoRI(GAATTC)和SaLI(GTCGAC)。接着将β亚基的β-DNA克隆到上步获得的pETDuet-1-α载体的多克隆位点2区域，其酶切位点为NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)，获得了重组质粒pETDuet-1-α-β (图1)。亦可将α亚基的DNA片段克隆到多克隆位点2区域，β亚基的DNA 片段克隆到多克隆位点1区域，所有酶切位点亦可更换为其他可行的酶切位点。
接着将重组质粒pETDuet-1-α-β转化到宿主细胞BL21(DE3)中，构建了 pETDuet-1-α-β-BL21(DE3)宿主细胞。使用氨苄霉素筛选阳性菌株，并对阳性菌株中的质粒进行测序验证。将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到pETDuet-1-α-β-BL21(DE3)宿主细胞，构建了pETDuet-1-α-β-BL21(DE3)-pGro7 宿主细胞。通过这种巧妙地组合使蓝藻丙酮酸脱氢酶α、β亚基和伴侣蛋白在同一宿主细胞中进行共表达，伴侣蛋白可对宿主细胞中pETDuet-1-α-β质粒表达的α和β亚基进行翻译后修饰，使得α和β亚基可进行正确的折叠，进而组装为高活性的α2β2型蓝藻PDHc E1。亦可先将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到宿主细胞，再将重组质粒转化到宿主细胞，所用宿主细胞BL21(DE3)亦可选择其他可行的蛋白表达细胞。
经过氨苄霉素及氯霉素双抗性筛选为阳性的菌株，提取其质粒进行测序验证，保留测序验证无误的菌株，后续也可将正确无误的菌株保存于-80℃备用。对于未冷冻保存的测序验证无误的菌株，培养该菌株至细胞密度OD680＝0.6-0.8 时，加入诱导剂IPTG诱导蓝藻PDHc E1α亚基和β亚基的表达，加入阿拉伯糖诱导伴侣蛋白的表达，于15-37℃诱导表达4-24h，然后离心收集菌体；其中，诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.0mM。优选的，通过对表达条件的优化，确定了最佳的表达条件，挑取单菌落于50mg/L氨苄霉素和10mg/L氯霉素的培养基中，于37℃，220rpm恒温摇床培养大约2-3h至菌液OD680＝0.6-0.8。加入IPTG和阿拉伯糖，于16℃诱导表达16h。离心收集发酵后的细菌，每升菌液即可获得 10g菌泥。对于冷冻保存后的菌株，需要复苏、菌株划线后进行菌株的培养和诱导蛋白的表达，通过对表达条件的优化，确定了最佳的表达条件，将宿主细胞活化，于固体培养基上培养12h，挑取单菌落于50mg/L氨苄霉素和10mg/L氯霉素的培养基中，于37℃，220rpm恒温摇床培养大约2-3h至菌液OD680＝0.6-0.8。加入IPTG诱导蓝藻PDHc E1α亚基和β亚基的表达，加入阿拉伯糖诱导伴侣蛋白的表达，于16℃诱导表达16h。离心收集发酵后的细菌，每升菌液即可获得 10g菌泥。
本法所制备的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的α亚基的N端带有His标签，因此本文采用高效、快速且特异性高的亲和层析法进行蓝藻PDHc E1的纯化分离。通过将菌泥反复冻融，加入Lysis Buffer重悬菌体，超声破碎，高速离心除去细菌碎片，即可获得含蓝藻PDHc E1的澄清液。本方法使用AKTA Purifier 10蛋白纯化仪进行蓝藻PDHc E1的纯化，选用柱子型号为HisTrap FF 5mL型 Ni柱，仪器参数如下：A280m检测蛋白，流速2.5mL/min，压力设为0.35MP，实验环境温度为4℃(层析冷柜)。Ni柱再生后，加Lysis Buffer平衡，细胞破碎混合液上样流速为0.5mL/min。首先加Lysis Buffer洗脱未结合到Ni柱上的蛋白，接着用含75mM咪唑的Column Buffer洗脱杂蛋白至紫外A280低于30mAu 时，使用含250mM咪唑的Elution Buffe洗脱目的蛋—蓝藻PDHc E1。接着通过凝胶排阻层析去除高浓度咪唑，选用HiTrap Desalting型脱盐柱，将蛋白样品以2.5mL/min的流速通过脱盐柱，检测A280获得高纯度的蓝藻PDHc E1。本方法制备的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1产量为16.1mg/L菌液，蛋白纯度高于90％。
本法制备的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的活性通过DCIP法确定，反应混合液含50mM K2HPO4-KH2PO4(pH 7.2)、0.375mM 2,6-二氯苯酚(DCIP)、 0.8mM丙酮酸钠为底物、0.1mg/ml纯化Cy-PDHc E1酶。反应混合物37℃孵育 3min，加入200μM ThDP启动反应，通过酶标仪检测反应体系在600nm处的吸光度来确定2,6-二氯苯酚(2,6-dcip)的消耗量，进而反映蓝藻PDHc E1的活性。实验结果表明本法制备的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1对底物丙酮酸具有较高的亲和力(米氏常数Km＝52.98μM)，可高效催化丙酮酸的氧化脱羧，对辅因子ThDP的米氏常数Km＝14.27μM，酶的比活力达到110.1U/mg，活力单位 U的定义为每mg蓝藻PDHc E1在1min内催化丙酮酸生成羟乙基-ThDP消耗 2,6-二氯吲哚酚的量。
目前尚未见有关异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1异源表达纯化的报道，本发明提供了一种可快速、高效、经济、不受生物组织材料限制且能够制备出高纯度、高活性的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的方法。本法巧妙地将蓝藻 PDHc E1的α和β基因片段克隆到同一表达质粒上，并通过重组质粒与pGro7 的共转化，使得α和β亚基在宿主细胞中可进行正确的翻译后修饰，进而折叠和组装为高活性的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1。本法通过条件优化，建立了高效的蓝藻PDHc E1表达和纯化方法。相较于直接从生物组织中提取丙酮酸脱氢酶的方法，本法不受原料-生物组织的限制，通过简单的制备流程即可获得高纯度、高产量的异源四聚体α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶，制备成本低；相比于将α和β亚基对应的DNA片段分别克隆到两个载体上，在两个独立的宿主细胞内分别表达α和β亚基，再于体外组装为α2β2型丙酮酸脱氢酶的方法，本法简化了制备步骤，只需通过构建一个载体，并在同一宿主细胞中即可制备得高活性的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1。
实施例1：蓝藻PDHc E1表达载体的构建
第一步、制备DNA片段：蓝藻PDHc E1的α和β亚基所对应的DNA片段可通过人工合成或基因工程的方法从蓝藻中提取获得。α(1039bp)和β(984bp) 亚基对应的DNA序列分别如序列表中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。
第二步、构建载体：将α亚基所对应的α-DNA片段克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域，构建重组质粒pETDuet-1-α，双酶切位点为：EcoRI (GAATTC)和SaLI(GTCGAC)。将β亚基所对应的β-DNA片段克隆到 pETDuet-1-α重组载体的多克隆位点2区域，构建重组质粒pETDuet-1-α-β，双酶切位点为：NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)。重组质粒经酶切和测序确认正确无误。
第三步、共转化：使用试剂盒提取上述构建好的重组质粒，将重组质粒 pETDuet-1-α-β转化到宿主细胞BL21(DE3)中，构建了pETDuet-1-α-β-BL21(DE3) 宿主细胞。使用氨苄霉素筛选阳性菌株，并对阳性菌株中的质粒进行测序验证。将测序正确的阳性菌株制备为感受态细胞，将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到 pETDuet-1-α-β-BL21(DE3)宿主细胞，构建了pETDuet-1-α-β-BL21(DE3)-pGro7 宿主细胞，使用氨苄霉素和氯霉素筛选阳性菌株。使得蓝藻丙酮酸脱氢酶α、β亚基和伴侣蛋白在同一宿主细胞中进行共表达。伴侣蛋白可辅助α和β亚基进行正确折叠，并组装为高活性的α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶。
结果：如图1所示，本方法分别将蓝藻PDHc E1的α和β亚基的DNA片段克隆到同一载体pETDuet-1的多克隆位点1和2区域，成功构建了表达蓝藻丙酮酸脱氢酶的重组质粒pETDuet-1-α-β。接着依次将重组质粒和pGro7质粒共转化到表达宿主细胞BL21(DE3)，使得蓝藻丙酮酸脱氢酶α、β亚基在同一宿主细胞内中进行共表达，同时宿主细胞表达的伴侣蛋白可辅助α和β亚基进行正确折叠和组装，以制备高活性的α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶。本发明解决了先将α和β亚基单独表达，再于体外组装时由于折叠和组装错误所导致的无法获得高活性α2β2型PDHc E1的问题。
实施例2：蓝藻PDHc E1表达条件的优化
第一步、蛋白诱导时间的优化，按照蓝藻PDHc E1的表达方法，将含重组质粒的菌液接种到含氨苄霉素和氯霉素的培养基中，于37℃摇床培养至 OD600＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖，于25℃分别诱导0、4、8、12、 16、20和24h时，取菌液，凝胶电泳检测蛋白表达情况。
第二步、诱导温度的优化，按照蓝藻PDHc E1的表达方法，将菌液接种到含氨苄霉素和氯霉素的培养基中，培养至OD600＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖，分别于16℃、22℃、28℃和37℃诱导16h，分别取样，使用凝胶电泳检测上清和沉淀中蛋白的表达情况。
第三步、诱导剂浓度的优化，按照上述蓝藻PDHc E1的表达方法，将培养的菌液接种到含氨苄霉素和氯霉素的培养基中，培养至OD600＝0.6-0.8，分别加入0、0.1、0.25、0.5、0.75和1.0mM诱导剂IPTG和阿拉伯糖诱导蛋白表达，于16℃诱导16h，分别取样，凝胶电泳检测蛋白的表达。
结果：如图2、3、4所示，本方法最终确定了蓝藻PDHc E1表达时的最佳温度(16℃)、诱导剂IPTG的最佳浓度(0.5mM)、蛋白诱导的最佳时间(16h)，在此表达条件下，1L菌液可获得16.1mg蓝藻PDHc E1。与从生物组织直接提取的方法相比，本方法可大量制备蓝藻丙酮酸脱氢酶。
实施例3：蓝藻PDHc E1的纯化
本法制备的蓝藻PDHc E1α亚基的N端带有His标签，因此采用亲和层析法进行分离纯化。
本制备方法所用溶液的配方如下：
Lysis Buffer：pH 7.2,50mM磷酸钾缓冲液，300mM NaCl,1mM MgCl2,0.1 mMThDP,0.2％Tween 20,2mM DTT。
Column Buffer：pH 7.2,50mM磷酸钾缓冲液，300mM NaCl,1mM MgCl2, 0.1mMThDP,0.2％Tween 20,2mM DTT,75mM imidazole。
Elution Buffer：pH 7.2,50mM磷酸钾缓冲液，300mM NaCl,1mM MgCl2,0.1 mMThDP,0.2％Tween 20,2mM DTT,250mM imidazole。
Desalting Buffer：pH 7.2,50mM磷酸钾缓冲液，100mM NaCl。
Stripping Buffer：pH 8.0，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，100mM EDTA。
第一步、细胞破碎：将保存于-20℃的菌泥反复冻融2-3次，缓慢解冻0.5h 至透亮，加入50ml Lysis Buffer，重悬菌体。超声波破碎，参数设置为功率300W，工作3s，间隔3s，破碎20min，至溶液通亮。破碎好的菌液于4℃，12000rpm，高速离心40min，弃沉淀，保留上清，0.22μm滤膜过滤。
第二步、蛋白纯化：本法使用AKTA Purifier 10蛋白纯化仪进行蓝藻PDHc E1 的纯化，亲和层析柱为HisTrap FF 5mL型Ni柱，仪器参数为A280m检测蛋白，流速2.5mL/min，压力0.35MP，实验环境温度为4℃(层析冷柜)。Ni柱再生后，用3-5个柱体积Lysis Buffer平衡Ni柱，蛋白混合液上样流速为0.5mL/min。首先，亲和层析柱按如下程序再生：依次使用Stripping Buffer，0.5M NaOH和0.1 M NiSO4清洗柱子，每种溶液清洗5个柱体积，两种溶液之间去离子水洗3个柱体积。用3个柱体积Lysis Buffer平衡亲和层析柱至紫外A280稳定，细胞破碎混合液以0.5mL/min通过亲和层析柱HisTrap FF 5，待所有样品通过后，用Lysis Buffer洗脱未结合到Ni柱上的蛋白至紫外A280稳定，用含75mM咪唑的 ColumnBuffer洗脱杂蛋白至紫外A280低于30mAu，接着用250mM咪唑的 Elution Buffe洗脱目的蛋白蓝藻PDHc E1。
第三步、蛋白保存：考虑到所得的蓝藻PDHc E1蛋白含高浓度咪唑，其对蛋白活性及后续实验有较大影响，需通过凝胶排阻层析脱盐除去咪唑。选用 HiTrap Desalting型脱盐柱，首先用Desalting Buffer平衡脱盐柱至A280稳定，将蛋白以2.5mL/min的流速通过脱盐柱，使用Desalting Buffer洗脱，待A280 出现峰值时开始接收蛋白，制备的蛋白加入等体积甘油混匀，分装保存于-80℃备用。
结果：如图5所示，本法通过细胞破碎、亲和层析和凝胶排阻层析，建立了α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶的纯化方法，制备了纯度高于90％的α2β2异源四聚体型蓝藻PDHc E1。本发明结合现代分离纯化技术解决了蓝藻PDHc E1异源四聚体制备困难的问题，与从生物组织直接提取的方法相比，本法可获得高纯度蓝藻PDHc E1。
实施例4：蓝藻PDHc E1活性测定
第一步、蓝藻PDHc E1对底物丙酮酸米氏常数的测定：95μL反应体系为 50mM磷酸钾，pH 7.2，1.0mM MgCl2，0.375mM DCIP,0.1mg/mL PDHc E1蛋白，再分别加入丙酮酸钠溶液0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.2、0.40、0.8、 1.0和2.0mM，涡旋振荡混匀，于37℃温浴3min，加入5μL ThDP启动反应，测定600nm处的吸光度，根据吸光度计算体系反应速率。
第二步、蓝藻PDHc E1对辅因子ThDP米氏常数的测定：95μL反应体系为 pH 7.2，50mM磷酸钾，1.0mM MgCl2，0.375mM DCIP,0.1mg/mL PDHc E1， 0.8mM丙酮酸钠，涡旋振荡混匀，于37℃温浴3min，加入5μL ThDP启动反应，ThDP浓度梯度设为0、1、2、4、8、10、20、40、80、100、200、400、500、 1000μM，测定600nm处的吸光度，根据吸光度计算体系反应速率。
第三步、蓝藻PDHc E1活性的测定：反应体系包括50mM磷酸钾缓冲液， pH＝7.2，1.0mM MgCl2,0.375mM DCIP,0.1mg/mL PDHc E1蛋白，0.8mM丙酮酸钠，ddH2O补齐总反应体系为95μL，振荡混匀，37℃温浴3min，加入5μL 0.2mM ThDP启动反应，于37℃反应5min，测定600nm处的吸光度，根据吸光度计算体系反应速率。
结果：如图6、7所示，通过活性测试，验证了本法制备的异源四聚体α2β2型蓝藻PDHcE1可高效催化丙酮酸的氧化脱羧反应(米氏常数Km＝52.98μM)，可对辅因子ThDP的米氏常数Km＝14.27μM。制备的蓝藻PDHc E1具有高活性 (比活力：110.1U/mg)，活力单位U的定义为每mg蓝藻PDHc E1在1min内催化丙酮酸生成羟乙基-ThDP消耗2,6-二氯吲哚酚的量。相比于将α和β亚基对应的DNA片段分别克隆到两个载体上，在两个独立的宿主细胞内分别表达α和β亚基，再于体外组装为α2β2型丙酮酸脱氢酶的方法，本制备方法更经济，所制备的蓝藻丙酮酸脱氢酶活性更高。
本发明提供的制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法，通过在同一个载体上同时表达蓝藻PDHc E1的α和β亚基的重组质粒，并将重组质粒与伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞BL21(DE3)中，使得蓝藻丙酮酸脱氢酶的α、β亚基与伴侣蛋白在同一宿主细胞内进行共表达。宿主细胞表达的伴侣蛋白可直接对α和β亚基进行翻译后修饰，使其正确折叠和组装为高活性态的α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶。本发明提供的制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1 方法相比直接从生物组织中提取丙酮酸脱氢酶的方法，不受生物组织的限制，通过简单的制备流程即可获得高纯度的异源四聚体α2β2型蓝藻丙酮酸脱氢酶。相比于将α和β亚基对应的DNA片段分别克隆到两个载体上，在两个独立的宿主细胞内分别表达α和β亚基，再于体外组装为α2β2型丙酮酸脱氢酶的方法，本制备方法更经济，所制备的蓝藻丙酮酸脱氢酶活性更高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中师范大学
<120> 一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法
<130> 2021
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1039
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
gaattcggtt tcagaacgca ttttgcctga attgaacacc gcagaaattt ccctggacag 60
agaaaccgcc ttagtgcttt acgaagacat ggtcctgggt cgcttcttcg aggataaatg 120
cgctgagatg tattaccggg gcaaaatgtt tggttttgtc cacctctaca acggccagga 180
agcggtgtcc tctgggataa tcaaagccat gcgccaggat gaggattacg tttgcagtac 240
ctatcgagac catgttcatg ccctcagtgc gggagttcca gctcgggaag taatggcgga 300
actgtttggt aaggaaaccg gttgcagtcg gggtcggggt ggttctatgc acctattttc 360
ctcggcccat aatctcctgg ggggctttgc gttcatcggg gaagggattc ccgtggccct 420
gggagcggcg tttcaaacta agtaccgccg ggaagtgttg aaagatgacg gctacgacca 480
agttaccgcc tgtttcttcg gtgatggcac cagtaataac ggccagtttt ttgaatgcct 540
gaacatggcc gccctgtgga aactgcccat tctgtttgtg gtggaaaata ataaatgggc 600
gatcggtatg gcccacgagc gggcaacgtc ccaaccagaa atctacaaaa aagccagtgt 660
gttcaacatg gtgggggtag aagtggatgg tatggatgtg gtggcaatgc ataaagtagc 720
aacggaagca gtggctaggg ccagggcagg cgaagggcct accttgattg aagcgttgac 780
ctatcgtttc cggggtcact ccctagcgga tcccgatgaa ctccgttctg ccgaagaaaa 840
acagttttgg gctgcccggg acccaattaa gaaatttgcc gctttcatga cggaacacga 900
attagccagc aatgaagagc taaaggcgat cgataaacgc attcaagaag taattgacga 960
tgccctggcc tttgccgagt ctagccccga acccaatccc gaagatctga ggaaatatat 1020
tttcgccgat taggtcgac 1039
<210> 2
<211> 984
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
catatggctg agaccctact gtttgccgcc ctacgccaag cccttgacga agaaatggga 60
cgggatgtca acgtccttgt gctgggagaa gatgtgggac tctatggcgg ttcctataag 120
gtaaccaagg atttgtacga gaagtatggc gaaatgcggg tgctggatac gcccatcgcc 180
gaaaacagtt ttaccggcat ggcggtgggg gcggccatga caggattgcg cccagtcatt 240
gaaggcatga atatgggttt tcttctgctg gcgtttaacc aaattgccaa taatgcgggg 300
atgttgcgct atacctccgg cggcaattac caaattccca tggttatccg tggtcctggg 360
ggcgtaggtc ggcaattagg ggcagaacat tcccaacggt tggaggccta tttccatgcg 420
gtgccggggt taaaaattgt ggcttgctcc accccctata acgccaaggg attgctcaaa 480
gcagccattc gggataataa cccagtgtta ttttttgagc acgtactttt gtacaacttg 540
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tacaacggta tgttggaacg actgaccatt gtgcaaccgc cccaaattgt ggacgcagtt 960
aaggcgatca tcggctaact cgag 984
Claims (9)
1.一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法，其特征在于，所述方法包括：
分别制备蓝藻丙酮酸脱氢酶PDHc E1的α亚基和β亚基所对应的DNA片段，所述α亚基对应的DNA片段如SEQ ID No：1所示，所述β亚基对应的DNA片段如SEQ ID No：2所示；
将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β；
将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；宿主细胞培养，蛋白诱导表达，菌体收集，超声波破碎后进行蛋白分离纯化，得到异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1；
所述宿主细胞为BL21(DE3)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述α亚基对应的DNA片段和所述β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，得到重组质粒pETDuet-1-α-β，包括：
先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点1区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点2区域以得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β；或者，
先将所述α亚基对应的DNA片段克隆到所述pETDuet-1载体的多克隆位点2区域以构建重组质粒pETDuet-1-α，然后将所述β亚基对应的DNA片段克隆到所述重组质粒pETDuet-1-α载体的多克隆位点1区域以得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述得到所述重组质粒pETDuet-1-α-β之后，还包括：对得到的所述重组质粒pETDuet-1-α-β进行酶切及测序验证。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多克隆位点1区域包括双酶切位点EcoRI9和SaLI，所述多克隆位点2区域包括双酶切位点NdeI和XhoI。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述重组质粒pETDuet-1-α-β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞，包括：
先将所述重组质粒pETDuet-1-α-β转化到宿主细胞中，构建pETDuet-1-α-β宿主细胞，使用氨苄霉素筛选阳性菌株，并对所述阳性菌株中的质粒进行测序验证，然后将测序验证正确的阳性菌株制备为感受态细胞，将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到所述感受态细胞中以得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞；或者，
先将伴侣蛋白表达质粒pGro7转化到宿主细胞中，构建pGro7宿主细胞，然后将所述pGro7宿主细胞制备为感受态细胞，将所述重组质粒pETDuet-1-α-β转化到所述感受态细胞中以得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述得到所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞之后，还包括：
使用氨苄霉素和氯霉素双抗性筛选阳性菌株，并提取所述阳性菌株的质粒进行测序验证，保留验证正确的pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞培养，蛋白诱导表达，菌体收集，包括：培养所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞至细胞密度OD680＝0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖，于15-37℃诱导表达4-24h，然后离心收集菌体；其中，所述诱导剂IPTG的浓度为0.1-1.0mM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，培养所述pETDuet-1-α-β-pGro7宿主细胞至细胞密度OD680＝0.6-0.8时，加入诱导剂阿拉伯糖和0.5mM IPTG，于16℃诱导表达16h。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，宿主细胞经过所述超声波破碎后进行蛋白分离纯化，包括：
超声波破碎宿主细胞后，离心获取包含蓝藻PDHc E1的上清液，然后使用
亲和层析法对所述包含蓝藻PDHc E1的上清液进行蛋白纯化以获得目的蛋白，
再使用凝胶排阻层析法对所得目的蛋白进行脱盐处理以除去咪唑。
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