CN111662917A - 一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构建及碱性磷酸酶纯化方法 - Google Patents
一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构建及碱性磷酸酶纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构建及碱性磷酸酶纯化方法，属于生物工程技术领域。本发明通过对Cobetia marina的碱性磷酸酶基因进行密码子优化，利用优化后的碱性磷酸酶基因构建工程菌，该工程菌的保藏编号为CGMCC NO.18926。用本发明所构建的基因工程菌表达，其发酵量可达10mg(1L发酵液)。本发明还对蛋白的纯化方法进行了创新，用本发明中的提纯方法，可以得到最终纯度大于95％的酶蛋白，比活力可达12000U/mg，相对现有国际上常见的碱性磷酸酶，是一种活力极高的碱性磷酸酶，为进一步实现工业化铺垫，也为工业大规模生产碱性磷酸酶提供了有效地方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构 建及碱性磷酸酶纯化方法。
背景技术
碱性磷酸酶(Apase；EC 3.1.3.1)在碱性条件下催化磷酸盐化合物水解，该酶被广泛应 用于免疫标记和化学发光。此外，碱性磷酸酶在DNA和蛋白质免疫分析中也有广泛应用。 酶的比活力高低直接影响到免疫分析以及化学发光的灵敏度，因此大量获得高比活力的碱 性磷酸酶显得尤为重要。
自然界中绝大多数生物体细胞内都含有碱性磷酸酶，从微生物细胞到人体细胞。大肠 杆菌碱性磷酸酶是目前研究最为透彻的碱性磷酸酶，该酶为同源二聚体结构，每个亚基由 449个氨基酸组成，商品化大肠杆菌碱性磷酸酶的比活力为40-100U/mg，其比活力相对较 低。比活力最高的商品化碱性磷酸酶来源于牛小肠，最高可达7000U/mg左右。
来源于一种深海菌Cobetia marina的碱性磷酸酶，命名为CmAP，其比活力可达15000U/mg，远大于牛小肠碱性磷酸酶。详见参考文献：A Highly Active AlkalinePhosphatase from the Marine Bacterium Cobetia,E.Yu Plisova etc.,MarineBiotecnology,Volume 7, 173–178(2005)。但是，Cobetia marina在工业上很难大规模培养，而且该菌株的碱性磷酸 酶产量很低。通过基因工程的方法构建工程菌虽然可以外源表达碱性磷酸酶，但CmAP 的N端有一段由32个氨基酸组成的信号肽，该信号肽对蛋白质折叠成正确构象起着必不 可少的作用，蛋白折叠成有活性的构象后，该信号肽即被自动切除，因此该酶不适合在N 末端加亲和标签；而在肽链的C末端加亲和标签会严重影响酶的表达与活力，这导致外源 表达的CmAP很难进行纯化。
因此，如何提高CmAP的表达量以及如何获得高纯度的CmAP是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种高比活力碱性磷酸酶工程菌，以及利用 该工程菌表达纯化碱性磷酸酶CmAP的方法。本发明所构建的工程菌，其碱性磷酸酶的发 酵量比野生菌株Cobetia marina有大幅度的提高，更加适应工业化生产需求；本发明还对 蛋白纯化工艺进行优化，最终得到纯度不亚于用亲和标签纯化的蛋白。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种编码碱性磷酸酶CmAP的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明以源于海科贝特氏菌Cobetia marina的碱性磷酸酶基因为模板，进行针对大肠 杆菌表达体系的密码子优化，使优化后的编码碱性磷酸酶CmAP的基因更适合于大肠杆菌 的表达系统。
本发明的第二方面，提供上述基因在构建碱性磷酸酶工程菌中的应用。
本发明的第三方面，提供一种碱性磷酸酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET16b-CmAP，该碱性磷酸酶工程菌的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，该碱性磷酸酶工程菌的指定名称为(E.coli)CmAP，已于2019年11月08日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，其生物保藏号为：CGMCC NO.18926。
本发明的碱性磷酸酶工程菌能够高效表达高比活力的碱性磷酸酶CmAP，酶的比活力 可达12000U/mg，一定浓度的盐溶液对该碱性磷酸酶的比活力还具有激活作用；而且酶的 活性稳定，-20℃条件下用50％(v/v)甘油保存一年活力不变。
本发明的第四方面，提供上述碱性磷酸酶工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以海科贝特氏菌Cobetia marina的碱性磷酸酶基因CmAP为模板，对CmAP基因进 行适合大肠杆菌表达体系的密码子优化，优化后的CmAP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
(2)将步骤(1)优化后的CmAP基因酶切后与pET16b表达载体连接，得到重组表达载体pET16b-CmAP；
(3)将重组表达载体pET16b-CmAP转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coliBL21(DE3)中，构建得到碱性磷酸酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET16b-CmAP。
优选的，所述重组表达载体pET16b-CmAP是将碱性磷酸酶基因CmAP插入到表达载体 pET16b的NdeⅠ和BamHⅠ位点间得到。
本发明的第五方面，提供上述碱性磷酸酶工程菌在生产高比活力碱性磷酸酶中的应 用。
上述应用中，所生产的高比活力碱性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第六方面，提供一种高比活力碱性磷酸酶的表达纯化方法，包括以下步骤：
将上述碱性磷酸酶工程菌的种子液接种至含有氨苄青霉素的发酵培养基中，接菌量为2‰～5‰(v/v)，发酵培养，得到工程菌发酵液；
将工程菌发酵液离心，收集菌体，进行细胞超声破碎，再经40％和70％硫酸铵分级分 离、Phenyl HP疏水层析、2次High Q阴离子交换层析，得到纯化的高比活力碱性磷酸酶CmAP。
优选的，所述碱性磷酸酶工程菌的种子液是由如下方法制备而成：
将碱性磷酸酶工程菌接种至种子培养基中，接种量为2‰～5‰(v/v)，37℃、180r/min 振荡培养至OD600≈6.0，获得种子液；
所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白 胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；培养基的pH值为7.0-7.2。
优选的，所述含有氨苄青霉素的发酵培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100μg/mL；培养基的pH值为7.0～7.2。
优选的，所述发酵培养的条件为：37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.6-0.8时加入终 浓度0.5mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为16℃，诱导发酵18～24h。
优选的，所述细胞超声破碎具体为：将菌体溶于缓冲液A中，置于冰上超声破碎，至菌液由粘稠状态变为透亮。
优选的，所述40％和70％硫酸铵分级分离具体为：将细胞超声破碎后的菌液离心，收 集上清蛋白液，在4℃条件下缓慢向上清蛋白液中加入研磨后的硫酸铵粉末并不断搅拌， 4℃静置2h后，12000r/min离心15min后收集上清，并继续在4℃条件下缓慢向上清蛋白液中 加入研磨后的硫酸铵粉末，并不断搅拌，4℃静置2h后，12000r/min离心15min后收集沉淀， 将沉淀用15-20mL缓冲液A复溶即可。
优选的，所述Phenyl HP疏水层析具体为：将40％和70％硫酸铵分级分离步骤中复溶的 蛋白12000r/min离心15min后收集上清，进行Phenyl HP疏水层析，用含有硫酸铵浓度为 1M-0M的缓冲液A线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐。
优选的，所述2次High Q阴离子交换层析具体为：将Phenyl HP疏水层析步骤中透析后 的蛋白液进行High Q阴离子交换层析，用含NaCl浓度为0M-0.5M的缓冲液B线性洗脱，用 反应液检测，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐；将透析后的蛋白液再次进行High Q阴离子交换层析，用含NaCl浓度为0.1M-1M的缓冲液B线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，用缓冲液B透析除盐。
所述缓冲液A为pH＝10.0的Tris-HCl；所述缓冲液B为pH＝8.0的Tris-HCl；所述反应液 由如下方法制备而成：取10.5g二乙醇胺，加入50mL去离子水混溶，调pH至10.3，将溶液 定容至100mL，加入37.1mg PNPP·6H2O，4℃保存。
本发明通过对碱性磷酸酶表达纯化条件的优化，使碱性磷酸酶的发酵量比野生菌株 Cobetia marina有大幅度的提高，更加适应工业化生产需求；特别是对蛋白的纯化工艺进 行了优化，纯化过程无需采用亲和标签，特别适用于碱性磷酸酶CmAP的纯化，可以得到纯度不亚于用亲和标签纯化的蛋白。
本发明的有益效果：
(1)本发明对源于海科贝特氏菌Cobetia marina的碱性磷酸酶基因CmAP进行了密码子优化，用大肠杆菌常用密码子替换基因mRNA原始密码子，经密码子优化之后，密 码子适应指数(CAI)从0.57提高为0.97(CAI在0.8-1.0之间有利于表达)。
(2)基于密码子优化后的CmAP基因，本发明构建了碱性磷酸酶工程菌，本发明所构建的工程菌中碱性磷酸酶发酵量比野生菌株Cobetia marina有大幅度的提高，本发明制备的碱性磷酸酶的产量可达到10mg(1L发酵液)，酶的比活力可达12000U/mg，相对现 有国际上常见的碱性磷酸酶，是一种活力极高的碱性磷酸酶，为进一步实现工业化铺垫， 也为工业大规模生产碱性磷酸酶提供了有效地方法。
(3)本发明对碱性磷酸酶CmAP的纯化工艺进行了优化，纯化过程无需采用亲和标签，可以得到纯度不亚于用亲和标签纯化的蛋白。
附图说明
图1为最终纯化后CmAP的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中，1道是Marker，2-5道(HighQ1-High Q4)为第二次High Q层析收集到的每管样品。
图2为本发明CmAP酶的最适pH曲线。
图3为本发明CmAP酶的热稳定性曲线。
图4为本发明CmAP酶的KCl与NaCl影响曲线。
图5为本发明CmAP酶的存储稳定性曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有 指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，来源于深海菌Cobetia marina的碱性磷酸酶CmAP，其比 活力可达15000U/mg。但由于Cobetia marina在工业上很难大规模培养，而且该菌株的碱性 磷酸酶产量很低，因此，很难直接利用深海菌Cobetia marina发酵培养进行大规模生产碱 性磷酸酶CmAP。
通过基因工程的手段构建工程菌，理论上是可以实现碱性磷酸酶CmAP的外源表达的。 但是，一方面，由于深海菌Cobetia marina和现有基因工程宿主菌的表达体系存在差异， Cobetia marina中编码碱性磷酸酶的基因CmAP在现有基因工程宿主菌不一定能够稳定表 达；另一方面，CmAP的N端有一段由32个氨基酸组成的信号肽，该信号肽对蛋白质折叠成正确构象起着必不可少的作用，蛋白折叠成有活性的构象后，该信号肽即被自动切除，因此该酶不适合在N末端加亲和标签；而且经过验证，在CmAP的C末端加亲和标签会严重 影响酶的表达与活力。因此，由于CmAP结构的特殊性，使得外源表达的CmAP很难通过 亲和标签的方式进行纯化。
综上，碱性磷酸酶CmAP的大规模生产应用主要存在两个技术难题：一是如何提高CmAP表达量，二是如何获得高纯度的CmAP。
基于此，本发明的目的是提供一种高比活力碱性磷酸酶工程菌，基因工程菌株的构建 方法，以及重组碱性磷酸酶纯化方法。
本发明首先以源于海科贝特氏菌Cobetia marina的碱性磷酸酶基因CmAP为模板，进行 针对大肠杆菌表达体系的密码子优化，用大肠杆菌常用密码子替换基因mRNA原始密码 子，调整密码子为大肠杆菌偏好密码子之后，CAI(密码子适应指数)从0.57提高为0.97(CAI在0.8-1.0之间有利于表达)；去除原始序列中的重复区域以避免mRNA中的茎环结 构。经过密码子优化后的基因CmAP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在得到密码子优化的基因CmAP基础上，本发明将该优化后的碱性磷酸酶基因CmAP连接到表达载体pET16b上获得重组表达载体，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中得到重组表达碱性磷酸酶工程菌。该工程菌中碱性磷酸酶发酵量比野生菌株Cobetia marina有大幅度的提高，更加适应工业化生产需求，而且利用该工程菌发酵制备的碱性磷酸酶CmAP(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)具有许多特性，酶的比活力可达12000U/mg，该酶最适反应pH为10.3，最适反应温度45℃，-20℃条件下用50％(v/v)甘油 保存一年活力不变。4℃条件下保存一年活力降低20％；一定浓度的盐溶液可以作为该酶 的激活剂。因此，发明人对所构建的基因工程菌进行了生物保藏。
本发明构建的工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，本发明还对蛋白的纯化工艺进行了 创新，通过细胞超声破碎、硫酸铵分级分离、疏水层析、2次离子交换层析进行分离纯化 得到纯净的酶蛋白，即CmAP。纯化过程无需采用亲和标签，可以得到纯度不亚于用亲和标签纯化的蛋白。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的 实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规 条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说 明，均可通过商业途径获得。
下述实施例中蛋白含量的测定使用的仪器为Nano Drop微型分光光度计检测蛋白浓 度。
实施例1：(E.coli)CmAP工程菌的构建
1.重组表达载体pET16b-CmAP的构建：
以源于海科贝特氏菌Cobetia marina的碱性磷酸酶基因为模板，进行针对大肠杆菌表 达体系的密码子优化。根据氨基酸序列对CmAP进行全基因合成及密码子优化，5’端引入NdeⅠ酶切位点(CATATG)，3’端引入BamHⅠ酶切位点(GGATCC)。目的基因 与克隆载体PUC57相连形成重组质粒PUC57-CmAP。测序表明，该目的基因的大小为 1608bp，其序列如SEQ IDNO.1所示。将重组质粒PUC57-CmAP用NdeⅠ和BamHⅠ双 酶切，与经过NdeⅠ和BamHⅠ双酶切的载体pET16b的骨架片段进行16℃过夜连接， 获得重组载体pET16b-CmAP，经过测序证实，重组载体为在载体pET16b的NdeⅠ和BamH Ⅰ位点间插入序列。
酶切体系如下(20μL)：
连接体系如下(20μL)：
2.制备工程菌：
2.1感受态细胞的制备：
将E.coli BL21(DE3)在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到LB培养基中。37℃振 荡培养。测定OD600值，当OD600值达到0.3时(大约培养3-4小时，此为实验成功的关 键)。取上述菌体培养液于50mL离心管中，冰上放置10min。4℃离心10min(4000r/min)， 倒出培养基，将管口倒置以便培养基流尽。用冰冷(4℃)的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细 胞沉淀，冰上放置30min。4℃离心10min(4000r/min)。倒出上清液，用冰冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞沉淀(务必放在冰上)。分装细胞，加入预冷的含30％(v/v)甘油， 每管200μL分装，-80℃冰箱保存，此细胞为感受态细胞。本感受态细胞可以直接用于DNA 的转化实验，也可以于-80℃冰箱保存，以备以后使用。在-80℃冰箱保存时，可以有效保 存一年以上，但不能反复冻融，一旦冻融，不能在进行-80℃冰箱保存。
2.2表达载体的转化：
感受态细胞的DNA转化是将-80℃冰箱保存的感受态细胞置于冰中融化5min。加入全 部连接产物pET16b-CmAP 20μL，轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴锅中放置90s后，立即于冰中放置2min。每管加入800μL预温的LB培养基，37℃培养1h(160r/min)。 4000rpm离心1min后，取沉淀涂布平板，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
2.3重组菌扩增与验证：
随机挑取5-10个菌斑于装有5-10mL的LB培养基(氨苄青霉素终浓度为100μg/mL)的试管中，37℃振荡培养过夜。分别提取质粒后双酶切验证(质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司，双酶切方法同上)。
验证正确的重组菌即为(E.coli)CmAP工程菌。并对该工程菌进行生物保藏，保藏信 息如下：
菌种名称：(E.coli)CmAP
分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年11月08日。
保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.18926。
实施例2：重组碱性磷酸酶CmAP的表达纯化
1.制备种子液：
将实施例1获得的工程菌(E.coli)CmAP以4‰(v/v)接种至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，37℃、180r/min振荡培养过夜，获得种子液；所述种子培养基的溶剂 为水，溶质及其在所述种子培养基的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl10g/L。
2.发酵培养：
取种子液以4‰(v/v)的接种量接种至装有2L含有100μg/mL氨苄青霉素的发酵培养基的5L的锥形瓶中；先37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.6-0.8，然后加入IPTG(诱 导剂，诱导目的蛋白CmAP的表达)至终浓度为0.5mM，20℃、180r/min继续振荡培养过 夜，获得发酵液。
所述发酵培养基与前面所述的种子培养基成分相同(均为LB培养基，种子培养基20mL，发酵培养基2L)。
3.蛋白纯化：
将上述步骤中所获得发酵液6000r/min离心10min，弃上清，收集菌体(500mL菌液收集一管，放入-20℃保存)；从该菌体中分离纯化CmAP，具体方法如下：
缓冲液A(pH10.0 Tris-HCl)的配方：取24.2g Tris-base置于1L烧杯中，加入约800mL 去离子水充分搅拌溶解，用浓HCl调pH至10.0，将溶液用容量瓶定容至1L，4℃保存。使用时稀释10倍。
缓冲液B(pH8.0 Tris-HCl)的配方：取24.2g Tris-base置于1L烧杯中，加入约800mL 去离子水充分搅拌溶解，用浓HCl调pH至8.0，将溶液用容量瓶定容至1L，4℃保存。使用时稀释10倍。
反应液配方：取10.5g二乙醇胺，加入约50mL去离子水混溶，用浓HCl调pH至 10.3，将溶液用容量瓶定容至100mL，加入37.1mg PNPP·6H2O，4℃保存。使用时分装成 900μL/管。
CmAP纯化过程：
(1)取2管离心后的工程菌溶于50mL缓冲液A中，置于冰上超声破碎30min(分3次)，当菌液由粘稠状态变为透亮即可，4℃、12000r/min离心15min，收集上清蛋白液；
(2)在4℃条件下缓慢向上清蛋白液中加入研磨后的硫酸铵粉末9.7g，并不断搅拌， 4℃静置2h后，12000r/min离心15min后收集上清，并继续在4℃条件下缓慢向上清蛋白液中加入研磨后的硫酸铵粉末10.9g，并不断搅拌，4℃静置2h后，12000r/min离心15min 后收集沉淀，将沉淀用15-20mL缓冲液A复溶；
(3)将复溶后的蛋白12000r/min离心15min后收集上清，进行Phenyl HP疏水层析，用含有硫酸铵浓度为1M-0M的缓冲液A线性洗脱，用反应液检测(遇流穿液变黄则含目 的蛋白)，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐；
(4)将透析后的蛋白液进行High Q阴离子交换层析，用含NaCl浓度为0M-0.5M的缓冲液B线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B 透析过夜除盐；
(5)将透析后的蛋白液再次进行High Q阴离子交换层析，用含NaCl浓度为0.1M-1M的缓冲液B线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，用缓冲液B透析除盐后， 即得到本发明所述的高比活力碱性磷酸酶CmAP，其SDS-PAGE电泳结果如图1所示，其 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(6)将收集到的酶蛋白液用100mM、pH8.0的Tris-HCl超滤浓缩处理，使蛋白终浓度大于2mg/mL，纯度大于95％，加入终浓度为50％(v/v)的甘油和0.1％(v/v)的 TritonX-100，于-20℃保存。
实施例3：重组碱性磷酸酶CmAP的特性研究
CmAP的酶活测定方法具体如下：
底物的配制：称取10.5g二乙醇胺(DEA)置于100mL烧杯中，加入约50mL去离子 水混溶、用浓HCl调pH至10.3，将溶液用容量瓶定容至100mL，加入371mg PNPP·6H2O， 配成20mM的底物。
对照组：取900μL底物37℃预热1min，加入100μL、20mM、pH8.0的Tris-HCl，2min 内测定405nm的吸光度值；
实验组：取900μL底物37℃预热1min，加入100μL、2μg/mL左右的CmAP溶液， 2min内测定405nm的吸光度值。
碱性磷酸酶的一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述条件下，1min反应时间内消耗1μmol底物对硝基苯磷酸二钠(PNPP)生成产物所需的酶量。
碱性磷酸酶比活力(U/mg)计算公式如下：
式中：18.5(cm2/μM)为产物在405nm处的摩尔吸光系数。
本发明所做的碱性磷酸酶的性质研究，如无特殊说明，都是透析后的CmAP蛋白液；采用测活方法如无特殊说明，都是405nm处吸收。
(1)最适pH
方法：将实施例2所得到CmAP酶液作为待测溶液，按照上述酶活测定方法，在37℃进行碱性磷酸酶活性检测，差异仅在于将反应体系中的底物的溶于1M DEA缓冲液中，滴 加浓HCl调pH值(9.0、10.0、10.1、10.3、10.5、10.7、11.0)。
将最高酶活记为100％，计算CmAP在不同pH的DEA缓冲液下的相对酶活(％)， 结果如图2所示。结果表明：本发明所述CmAP对pH的变化比较敏感，在pH10.0-pH10.5 的条件下活力较大，在pH为10.3时的酶活力最大。
(2)热稳定性
方法：将实施例2所得到的CmAP酶液作为待测溶液，按照上述酶活测定方法，在 不同温度、不同时间下进行碱性磷酸酶活性检测，差异仅在于反应条件中使用不同的反应 温度(20℃、25℃、30℃、37℃、40℃、45℃)。将初始酶活记为100％，计算同一温度 下孵育不同时间的相对酶活，结果如图3所示。结果表明：30℃以下酶稳定性较好，恒温 孵育1h后，活力下降不明显；37℃以上稳定性随着孵育时间推移而显著降低，30min以 前下降较快，30min-1h下降趋于平缓。
(3)盐浓度影响
方法：将实施例2所得到的CmAP酶液作为待测溶液，按照上述酶活测定方法，在 37℃进行碱性磷酸酶活性检测，差异仅在于反应条件中KCl与NaCl浓度(KCl和NaCl 浓度为0、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM)不同。
将KCl浓度为200mM时酶活记为100％，计算采用其他不同KCl与NaCl浓度的相对酶活，结果如图4所示。结果表明：KCl与NaCl均为本发明所述CmAP的激活剂，尤其 是KCl，可以使酶的比活力翻倍，KCl终浓度为200mM时，对酶的激活作用最明显，是 无KCl时酶比活力的1.5倍。
(4)存储稳定性
方法：将实施例2最终所得到的CmAP存储酶液作为待测溶液，按照上述酶活测定方法，在37℃进行碱性磷酸酶活性检测，一年之内每隔一段时间检测存储液比活力。
将初始时刻酶活作为100％，计算不同取样时刻该酶相对酶活，结果如图5所示。结果表明：该酶存储稳定性非常好，-20℃存放一年后，活力没有任何损失。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人 员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南国科医工科技发展有限公司
<120> 一种高比活力碱性磷酸酶工程菌、工程菌构建及碱性磷酸酶纯化方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgccgcacc agaaccgcca gggtcgttgg tgtcgtaaag gctgggcggt tgtggcgctg 60
accggtagca tgagctggat gccgctggcg aacgctgcgg aaatcaaaaa cgtgatcctg 120
atgatcggtg atggtatggg cccgcagcag gttggcatgc tggaaaccta cgcgaaccgc 180
gcgccggatt ctatctacca gggccgtagc accgcgctgt atcagctggc gaaagaaggc 240
gtggtgggtg cgagcctgac ccacccggaa gatgcagttg tggttgactc cgcgtgcagc 300
gcaacccagc tgagcaccgg tatcttcacc ggcggcgaag tgatcggcat cgattctgaa 360
ggtaaccgtg ttgaaaccgt tctggaactg gcgaaacgtg ttggtaaagc taccggcctg 420
gtttctgata cccgtctgac ccacgcgacc ccggcggcgt tcgcggcgca ccagccgcac 480
cgtagcctgg aaaacgcgat cgcggaagat atgctgatga ccggtccgga tgttatgctg 540
agcggtggcc tgcgccactt cgttccgtac tctgtgagcg aaccgggtga atctgcgggt 600
tctgttgaaa ccctgatgca gggcgcgtgg tccccgacct ccaaacgcaa agatgaacgt 660
aacctgctgc aggaagcagc tgatcagggc tacggcctgg cgttcacccg tgaccagatg 720
gcagcgctga acggcaccaa agttctgggt ctgttcgcga actccggtat ggcggatggt 780
atctctttcc gtgactctca tgatgatccg cagcgccagc agccgactct gcacgaaatg 840
acccagaaag cgctgagcat gctggaacag gatgatgatg gtttcttcct gatggttgaa 900
ggtggccaga tcgattgggc ggcacactct aacgacgcgg gcaccatgct gaacgaactg 960
atcaaattcg acgaagcggt gcagggtgtt ttcgactggg cgcgtgatcg tgatgatacc 1020
atcattctgg tgaccgcgga tcacgaaacc ggtgcattcg gcttcagcta tagcagcgca 1080
aacctgccgg ctgcgcagaa aaaatctggc ccggcgtttg cggatcagga ctatgcgccg 1140
aactttaact tcggcgattt ctccatcctg gacagcctgt acgaacagaa acagacctac 1200
tacgaactgc tgagcgactt cgaagcgctg ccgcagggtg aacgtacccc ggctcgtctg 1260
atggcagcag ttaacggtaa cagcgacttc cagatcaccg aagcccaggc ggctgaagtt 1320
ctggcgaaca aaccgaaccc gtaccacgtg gacggccact cctacctggg tgtttctgaa 1380
gttccggcgg tgcacgattt tgatgcgttc ttcccgtaca acgaccgtgg taacctgctg 1440
gcacgcgcac tggcgaccca gcagaacacc gtgtggggca ccggcaccca cacccacacc 1500
ccggtgaacg ttttcgcgtg gggtccggca aacgacatcc tgccggtttc ttccatcctg 1560
caccacagcg aaatcggtca gtacctgaaa accgtggttg ctaaataa 1608
<210> 2
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Pro His Gln Asn Arg Gln Gly Arg Trp Cys Arg Lys Gly Trp Ala
1 5 10 15
Val Val Ala Leu Thr Gly Ser Met Ser Trp Met Pro Leu Ala Asn Ala
20 25 30
Ala Glu Ile Lys Asn Val Ile Leu Met Ile Gly Asp Gly Met Gly Pro
35 40 45
Gln Gln Val Gly Met Leu Glu Thr Tyr Ala Asn Arg Ala Pro Asp Ser
50 55 60
Ile Tyr Gln Gly Arg Ser Thr Ala Leu Tyr Gln Leu Ala Lys Glu Gly
65 70 75 80
Val Val Gly Ala Ser Leu Thr His Pro Glu Asp Ala Val Val Val Asp
85 90 95
Ser Ala Cys Ser Ala Thr Gln Leu Ser Thr Gly Ile Phe Thr Gly Gly
100 105 110
Glu Val Ile Gly Ile Asp Ser Glu Gly Asn Arg Val Glu Thr Val Leu
115 120 125
Glu Leu Ala Lys Arg Val Gly Lys Ala Thr Gly Leu Val Ser Asp Thr
130 135 140
Arg Leu Thr His Ala Thr Pro Ala Ala Phe Ala Ala His Gln Pro His
145 150 155 160
Arg Ser Leu Glu Asn Ala Ile Ala Glu Asp Met Leu Met Thr Gly Pro
165 170 175
Asp Val Met Leu Ser Gly Gly Leu Arg His Phe Val Pro Tyr Ser Val
180 185 190
Ser Glu Pro Gly Glu Ser Ala Gly Ser Val Glu Thr Leu Met Gln Gly
195 200 205
Ala Trp Ser Pro Thr Ser Lys Arg Lys Asp Glu Arg Asn Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Ala Ala Asp Gln Gly Tyr Gly Leu Ala Phe Thr Arg Asp Gln Met
225 230 235 240
Ala Ala Leu Asn Gly Thr Lys Val Leu Gly Leu Phe Ala Asn Ser Gly
245 250 255
Met Ala Asp Gly Ile Ser Phe Arg Asp Ser His Asp Asp Pro Gln Arg
260 265 270
Gln Gln Pro Thr Leu His Glu Met Thr Gln Lys Ala Leu Ser Met Leu
275 280 285
Glu Gln Asp Asp Asp Gly Phe Phe Leu Met Val Glu Gly Gly Gln Ile
290 295 300
Asp Trp Ala Ala His Ser Asn Asp Ala Gly Thr Met Leu Asn Glu Leu
305 310 315 320
Ile Lys Phe Asp Glu Ala Val Gln Gly Val Phe Asp Trp Ala Arg Asp
325 330 335
Arg Asp Asp Thr Ile Ile Leu Val Thr Ala Asp His Glu Thr Gly Ala
340 345 350
Phe Gly Phe Ser Tyr Ser Ser Ala Asn Leu Pro Ala Ala Gln Lys Lys
355 360 365
Ser Gly Pro Ala Phe Ala Asp Gln Asp Tyr Ala Pro Asn Phe Asn Phe
370 375 380
Gly Asp Phe Ser Ile Leu Asp Ser Leu Tyr Glu Gln Lys Gln Thr Tyr
385 390 395 400
Tyr Glu Leu Leu Ser Asp Phe Glu Ala Leu Pro Gln Gly Glu Arg Thr
405 410 415
Pro Ala Arg Leu Met Ala Ala Val Asn Gly Asn Ser Asp Phe Gln Ile
420 425 430
Thr Glu Ala Gln Ala Ala Glu Val Leu Ala Asn Lys Pro Asn Pro Tyr
435 440 445
His Val Asp Gly His Ser Tyr Leu Gly Val Ser Glu Val Pro Ala Val
450 455 460
His Asp Phe Asp Ala Phe Phe Pro Tyr Asn Asp Arg Gly Asn Leu Leu
465 470 475 480
Ala Arg Ala Leu Ala Thr Gln Gln Asn Thr Val Trp Gly Thr Gly Thr
485 490 495
His Thr His Thr Pro Val Asn Val Phe Ala Trp Gly Pro Ala Asn Asp
500 505 510
Ile Leu Pro Val Ser Ser Ile Leu His His Ser Glu Ile Gly Gln Tyr
515 520 525
Leu Lys Thr Val Val Ala Lys
530 535
Claims (10)
1.一种编码碱性磷酸酶CmAP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的基因在构建碱性磷酸酶工程菌中的应用。
3.一种碱性磷酸酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET16b-CmAP，其生物保藏号为：CGMCC NO.18926。
4.权利要求3所述的碱性磷酸酶工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以海科贝特氏菌Cobetia marina的碱性磷酸酶基因CmAP为模板，对CmAP基因进行适合大肠杆菌表达体系的密码子优化，优化后的CmAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将步骤(1)优化后的CmAP基因酶切后与pET16b表达载体连接，得到重组表达载体pET16b-CmAP；
(3)将重组表达载体pET16b-CmAP转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)中，构建得到碱性磷酸酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET16b-CmAP；
优选的，所述重组表达载体pET16b-CmAP是将碱性磷酸酶基因CmAP插入到表达载体pET16b的NdeⅠ和BamHⅠ位点间得到。
5.权利要求3所述的碱性磷酸酶工程菌在生产高比活力碱性磷酸酶中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所生产的高比活力碱性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种高比活力碱性磷酸酶的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求3所述的碱性磷酸酶工程菌的种子液接种至含有氨苄青霉素的发酵培养基中，接菌量为2‰～5‰，发酵培养，得到工程菌发酵液；
将工程菌发酵液离心，收集菌体，进行细胞超声破碎，再经40％和70％硫酸铵分级分离、Phenyl HP疏水层析、2次High Q阴离子交换层析，得到纯化的高比活力碱性磷酸酶CmAP。
8.根据权利要求7所述的表达纯化方法，其特征在于，所述含有氨苄青霉素的发酵培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨苄青霉素100μg/mL；培养基的pH值为7.0～7.2；
优选的，所述发酵培养的条件为：37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.6-0.8时加入终浓度0.5mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为16℃，诱导发酵18～24h。
9.根据权利要求7所述的表达纯化方法，其特征在于，所述细胞超声破碎具体为：将菌体溶于缓冲液A中，置于冰上超声破碎，至菌液由粘稠状态变为透亮；
优选的，所述40％和70％硫酸铵分级分离具体为：将细胞超声破碎后的菌液离心，收集上清蛋白液，在4℃条件下缓慢向上清蛋白液中加入研磨后的硫酸铵粉末并不断搅拌，4℃静置2h后，12000r/min离心15min后收集上清，并继续在4℃条件下缓慢向上清蛋白液中加入研磨后的硫酸铵粉末，并不断搅拌，4℃静置2h后，12000r/min离心15min后收集沉淀，将沉淀用15-20mL缓冲液A复溶；
优选的，所述Phenyl HP疏水层析具体为：将40％和70％硫酸铵分级分离步骤中复溶的蛋白12000r/min离心15min后收集上清，进行Phenyl HP疏水层析，用含有硫酸铵浓度为1M-0M的缓冲液A线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐；
优选的，所述2次High Q阴离子交换层析具体为：将Phenyl HP疏水层析步骤中透析后的蛋白液进行High Q阴离子交换层析，用含NaCl浓度为0M-0.5M的缓冲液B线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，将收集的蛋白液用缓冲液B透析过夜除盐；将透析后的蛋白液再次进行High Q阴离子交换层析，用含NaCl浓度为0.1M-1M的缓冲液B线性洗脱，用反应液检测，收集并合并目的蛋白，用缓冲液B透析除盐。
10.根据权利要求9所述的表达纯化方法，其特征在于，所述缓冲液A为pH＝10.0的Tris-HCl；所述缓冲液B为pH＝8.0的Tris-HCl；
所述反应液由如下方法制备而成：
取10.5g二乙醇胺，加入50mL去离子水混溶，调pH至10.3，将溶液定容至100mL，再加入37.1mg PNPP·6H2O。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112341533A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-09 | 东北师范大学 | 无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用 |
| CN113564185A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-10-29 | 金标优尼科(无锡)生物科技有限公司 | 一种碱性磷酸酶基因及其cho稳定细胞株和alp制备方法 |
| CN113621550A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-11-09 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法 |
| CN114196688A (zh) * | 2022-02-08 | 2022-03-18 | 南开大学 | 在酵母中表达原核碱性磷酸酶 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1687413A (zh) * | 2005-04-21 | 2005-10-26 | 梁亮胜 | 重组人睫状神经营养因子突变体及其制备方法 |
| CN102250848A (zh) * | 2011-07-12 | 2011-11-23 | 湖北工业大学 | 一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法 |
| CN102465129A (zh) * | 2010-08-16 | 2012-05-23 | 重庆富进生物医药有限公司 | 人成纤维细胞生长因子21原核细胞中可溶性表达及制备 |
| CN103665140A (zh) * | 2013-12-20 | 2014-03-26 | 常州千红生化制药股份有限公司 | 大肠杆菌表达的膜联蛋白v或其衍生物的分离纯化方法 |
-
2020
- 2020-06-11 CN CN202010530428.2A patent/CN111662917A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1687413A (zh) * | 2005-04-21 | 2005-10-26 | 梁亮胜 | 重组人睫状神经营养因子突变体及其制备方法 |
| CN102465129A (zh) * | 2010-08-16 | 2012-05-23 | 重庆富进生物医药有限公司 | 人成纤维细胞生长因子21原核细胞中可溶性表达及制备 |
| CN102250848A (zh) * | 2011-07-12 | 2011-11-23 | 湖北工业大学 | 一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法 |
| CN103665140A (zh) * | 2013-12-20 | 2014-03-26 | 常州千红生化制药股份有限公司 | 大肠杆菌表达的膜联蛋白v或其衍生物的分离纯化方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| NASU E等: "Cloning and expression of a highly active recombinant alkaline phosphatase from psychrotrophic Cobetia marina", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 * |
| VASILY GOLOTIN等: "Recombinant Production and Characterization of a Highly Active Alkaline Phosphatase from Marine Bacterium Cobetia marina", 《MAR BIOTECHNOL》 * |
| YU PLISOVA E等: "A Highly Active Alkaline Phosphatase from the Marine Bacterium Cobetia", 《MARINE BIOTECHNOLOGY》 * |
| YU PLISOVA E等: "登录号：ABD92772.1", 《GENBANK》 * |
| YU PLISOVA E等: "登录号：DQ435608.1", 《GENBANK》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112341533A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-02-09 | 东北师范大学 | 无标签人半乳糖凝集素13及其制备方法和应用 |
| CN113564185A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-10-29 | 金标优尼科(无锡)生物科技有限公司 | 一种碱性磷酸酶基因及其cho稳定细胞株和alp制备方法 |
| CN113564185B (zh) * | 2021-09-07 | 2023-06-06 | 金标优尼科(无锡)生物科技有限公司 | 一种碱性磷酸酶基因及其cho稳定细胞株和alp制备方法 |
| CN113621550A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-11-09 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 用于发酵产碱性磷酸酶的培养基和碱性磷酸酶的制备方法 |
| CN114196688A (zh) * | 2022-02-08 | 2022-03-18 | 南开大学 | 在酵母中表达原核碱性磷酸酶 |
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