CN102250848A - 一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法 - Google Patents
一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从高效表达的基因工程菌中提取重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法。该菌是携带重组质粒的大肠杆菌Rosetta(DE3)，该重组质粒是含黄曲霉尿酸氧化酶uricase基因的质粒pET-30c(+)。用该菌生产黄曲霉尿酸氧化酶的方法包括四个步骤：A、工程菌发酵，累积胞内尿酸氧化酶；B、超声波破胞，离心收集上清液（含可溶性尿酸氧化酶）；C、依次进行离子交换层析、疏水层析及凝胶过滤层析，收集活性峰；D、将活性峰冷冻干燥，即得高纯度的重组黄曲霉尿酸氧化酶。本发明的优点：生产重组黄曲霉尿酸氧化酶成本低，酶的表达量高，纯化步骤简便，收率大，纯度高，易于工业化规模生产，具有较大的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明本发明属于蛋白质分离纯化领域，具体的说是涉及一种分离纯化大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法。
背景技术
尿酸(又称2，6，8--三氧嘌呤)是人体内嘌呤内化合物代谢的最终产物，血尿酸水平取决于尿酸产生和排泄的动态平衡，而血浆尿酸的饱和度：37℃，PH7.4时为380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)。
在正常人体血液循环中99％的尿酸以尿酸钠盐形式存在，血清尿酸波动于较窄的范围，国内资料显示，男性平均为5.7mg/dL，女性4.3mg/dL，如果血清中的尿酸的浓度高于正常值，就导致高尿酸血症(Hyperuricemia)。恶性肿瘤的增殖会加快核酸分解代谢，嘌呤代谢产生生大量的尿酸会导致会出现该症状出现。肿瘤放射化疗过程也因为细胞的大量裂解而出现伴随高尿酸血症的肿瘤消退综合症(tumor lysissyndrome，TLS)。TLS会增加胞内物质如钾、磷、钙、尿酸等的浓度，大大超过了人体肾脏的排泄能力，导致高尿酸、高钾、高磷、高钙、高尿酸等症，最后导致肾脏衰竭。
升高的血尿酸在关节中形成尿酸钠水合物的微结晶，会引起痛风性急性关节炎的反复发作，关节、骨骼、软组织的痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累积肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。有资料显示我国20岁以上的人群高尿酸血症的发病率为2.4-5.7％，且有10％会发展成为痛风。
我国每年新发的癌症病人约为170万，大部分在发病以后采用化疗和放疗等治疗手段，而化疗和放疗时细胞分裂过剩和急剧破坏，核酸分解突然增多产生大量尿酸，导致尿酸血症，引起结石和肾衰，给病人带来生理和心理上极大的痛苦。
目前控制TLS的有饮食控制、水合、碱化酸毒症，用别嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段，但别嘌呤醇是靠抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而阻碍黄嘌呤和次黄嘌呤转化为尿酸，干扰6-巯基嘌呤的代谢，影响肿瘤的代谢，而且由于黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化受阻，相应的增加了肾脏的负荷，黄嘌呤比尿酸更难容与尿中。用别嘌呤醇治疗的病人可能会出现黄嘌呤肾病和结石。另外，别嘌呤醇对病人体内存留尿酸的排泄没有作用，而且有2％的病人再用别嘌呤醇的治疗过程中会产生过敏反应，甚至出现严重的超敏反应综合症，对于急性高尿酸血症的病人，别嘌呤醇也不能起到及时的治疗效果。
尿酸氧化酶(尿酸氧酶，Urate Oxidase，Uricase)普遍存在与自然界，在大多数动物体内该酶参与嘌呤代谢，将尿酸氧化为尿囊素。尿囊素是一种比较容易排泄的代谢物，其溶解度为尿酸的5-10倍，但在人和一些长灵类体内缺乏这种酶而尿酸作为最终产物而排出体外。1943年，Oppenheimer首次通过实验发现注射尿酸氧化酶可以降低血尿酸水平，1957年，动物来源的尿酸氧化酶用于临床治疗获得了一定的成功，1974年(Current Rheumatology Reports 2001，3：29-35)从微生物Asperigellas flavus中提取了尿酸氧化酶治疗痛风，而且这种直接提取的天然尿酸氧化酶也在欧洲上市已有20年，通过注射给药用于白血病化疗的严重高尿酸血症。相对于别嘌呤醇来说，尿酸氧化酶降低血尿酸水平迅速而且专一，可阻断痛风病人急性发作，并减小痛风石体积。但从微生物Asperigellas fkavus中提取酶周期长，发酵过程难于控制，易受病原体污染，产率低，产品纯度不高，在使用中产生还会产生副作用。1992年有人用基因重组的大肠杆菌来尝试对黄曲霉尿酸氧化酶基因进行胞内表达(J.Biol.Chem.1992，267(12)：8565-8570)，有酶活性，但表达量低，只占菌体总蛋白的4％，不能产业化。至2001年、2002年酵母表达的基因重组的Asperigellas flavus尿酸氧化酶先后在欧洲和美国上市(商品名Fasturtec)，用于高尿酸血症的预防和治疗(肿瘤化疗高尿酸血症的治疗和预防)。和传统的治疗药物相比，有起效快、药效明显、副作用小、药物相互反应限制少、治疗周期短等特点。其在痛风治疗方面也有使用的报道，目前已经使用在器官移植引起的痛风治疗(Rev Rhum Engl Ed.1995May；62(5)：392-4.)，也有在其它因素引起的痛风中的使用(Annals of theRheumatic Disease 2005：64；516)，评价良好。该酶系利用基因重组的酿酒酵母于胞内表达获得。该法主要的缺点是表达量低(该目的蛋白仅占细胞总蛋白的13％)，培养周期长，发酵操作方式及提取纯化工艺复杂，进而导致生产成本较高。
目前，国内也有关于用大肠杆菌表达的报道。例如朱献军等于2001年在大肠杆菌中克隆表达了产朊假丝酵母的尿酸氧化酶基因，产物可溶形式表达，占可溶蛋白的30％。国内发明专利“一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法”中也公开了一种利用融合表达的方式在大肠杆菌中表达并纯化该酶的方法(专利公开号：CN1690197A)。该法利用N端融合标签辅助目的蛋白的纯化，效率较高，但是纯化后还需对目标蛋白进行酶切，再次纯化，才能最终获得有应用价值的产品，而所用的蛋白酶价格较贵，酶切时间较长(需要过夜)，这样就显著增加了纯化成本与生产周期。另外，陈薇等在其发明专利“一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及专用基因”也介绍了利用密码子技术在大肠杆菌中表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法，该法表达量较高(表达量40％左右)，但是其纯化步骤相对较多，周期较长。因此迫切需要研制一种高效廉价的易于工业化的制备黄曲霉尿酸氧化酶的方法。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种分离纯化大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法。方法易行，操作简便，目标产物以可溶性形式积累于胞内、表达量高、表达时间短，纯化活性回收率高，纯度高，无环境污染，纯化全过程采用层析分离技术，易于自动化，易于放大到工业化规模生产。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达重组黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌Rosetta(DE3)，所述的重组质粒是含黄曲霉尿酸氧化酶，即Uricase基因的质粒pET-30c(+)。
所述的基因工程菌的进一步特征在于，所述的重组质粒是pET-30c-PT7-uricase，其中，PT7是所述质粒pET-30c(+)的启动子。
根据Uricase基因的核苷酸组成，合成引物后通过RT-PCR扩增获得Uricase双链DNA，经酶切，插入质粒pET-30c(+)，构建成重组质粒pET-30c-uricase，转化大肠杆菌，获得高效表达重组黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌。
一种构建表达黄曲霉尿酸氧化酶的重组大肠杆菌的方法，其步骤是：
a.Uricase DNA序列的扩增：
委托专业的生物技术公司化学合成如下碱基序列：P5-5’端引物，引入NdeI酶切位点，P3-3’端引物，引入XhoI酶切位点，
P5：5’-GGAATTCCATATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACG-3’
NdeI
P3：5’-AGCCTCGAGTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG-3’
XhoI；
以黄曲霉菌丝体总RNA为模板，按Promega公司的RT-PCR试剂盒的操作说明，进行RT-PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得UricaseDNA片段；将扩增产物(900bp左右)与Takara公司的T克隆载体pMD18-T连接，通过标准克隆操作得到含Uricase DNA片段的重组质粒pMD18-uricase。
b.构建含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列的基因工程菌：
用两种限制性内切酶双酶切步骤a获得的重组质粒，所述的两种限制性内切酶是NdeI和XhoI，纯化回收小片段，用同样的两种限制性内切酶双酶切质粒pET-30c(+)，纯化回收大片段。连接上述回收的小片段和大片段，得到含UricaseDNA片段的重组质粒pET-30c-uricase，将此重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，制得含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列(GenBank ID7916167)的工程菌(见图1)，将该工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含有完整的Uricase基因片段(见图2)。
c.构建高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌：
从步骤b构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET-30c-uricase，转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌。
上述构建涉及到的质粒pET-30c(+)，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌Rosetta(DE3)，限制性内切酶等均可从市场购得。委托合成所述的碱基序列和测序的生物技术公司是南京金斯瑞生物科技有限公司。
本发明要解决的另一个技术问题是：利用步骤c获得的基因工程菌生产黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其步骤是：
d.液体培养：
将步骤c构建好的高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4-1.2时，加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达2-6小时，生产和积累可溶性表达的黄曲霉尿酸氧化酶；
e.细胞破碎：
用冷冻离心机将步骤d获得的发酵液于4-20℃下以1000-10000g的速度离心5-30min，弃上清，用20-150mL裂解缓冲液(20mM Na2CO3/NaHCO3，2mMEDTA，pH 10.0)悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有20-200mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波功率300-500W，工作时间3-8秒，间隔时间3-10秒，共工作90-150次。4-10℃下1000-18000rpm离心30-60)min，收集上清液于4-20℃下保存备用。
f.离子交换层析：
将步骤e所获得的细胞破碎液进行阴离子柱层析。层析柱用裂解缓冲液(20mM Na2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0)平衡好，将上述裂解液样品过此柱，然后用此裂解液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1，0.2N NaCl，以2-4倍柱体积进行分步洗脱，收集由0.2N NaCl的洗脱峰，此峰即为初步纯化和浓缩的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液。
g.疏水层析：
将步骤f所得初步纯化浓缩的组黄曲霉尿酸氧化酶溶液进行疏水层析。层析柱预先用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液(pH 7.2，20mM)平衡好备用。将阴离子交换层析得到的活性大肠杆菌表达的黄曲霉尿酸氧化酶组分用磷酸盐缓冲液(pH 7.2，20mM)透析，透析液加入硫酸铵至终浓度0.8M，上样，然后用此含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以分别含有0.6、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液，以2-4倍柱体积进行分步洗脱，收集0.2M硫酸铵的洗脱峰，将该峰洗脱液用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩。
h.凝胶过滤层析：
将步骤g所得浓缩液经凝胶过滤层析。用平衡液(pH 7.2，20mM的磷酸盐缓冲液)平衡，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，洗脱特征峰-主峰即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶。
i.冷冻干燥：
将凝胶过滤分离后的收集液于-35℃--45℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得150-300mg纯度大于99％的白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶。
本发明的优点在于：
1)目标产物以可溶性形式积累于胞内、表达量高、表达时间短
目标产物积累于胞内，有利于对产物进行捕获，同时所用发明中所用受体菌Rosetta(DE3)由于其体内补充了大肠杆菌稀有密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs，因此目的真核基因不用进行密码子优化就可在其体内获得高效表达，薄层扫描分析显示3-5小时内，目的产物胞内表达量即可达总菌体蛋白的40％-50％，且不形成包涵体；
2)分离工艺简单、生产周期短
本纯化工艺仅由离子交换、疏水层析和凝胶层析三个操作单元所组成，步骤少，且步骤间衔接紧凑，只需一次透析衔接，操作周期短；
3)纯化活性回收率高，纯度高
在纯化步骤中，将在高pH条件下(pH＞10.0)进行的强阴离子交换层析作为纯化的第一步，其具有高处理量，纯化效率高的特点，一步即可除去85％以上的宿主蛋白和部分脂类物质。疏水层析可进一步去除90％以上的杂蛋白和部分脂类物质。凝胶过滤层析可进一步除去残留的绝大部分杂质，使最终样品纯度大于99％以上，达到电泳纯与色谱纯，完全满足作为注射用针剂原料药的纯度要求。同时，由于纯化工艺操作步骤少，且都为高效的层析方式，因此总体纯化回收率高，平均可达到50％以上；
4)产物生物活性高
由于纯化过程条件温和，蛋白质不变性，产品酶活可达30IU/mg，生物活性与天然产品相当；
5)占地小
本分离操作仅需二十多平米的实验室即可；
6)纯化全过程采用层析分离技术，易于自动化，易于放大到工业化规模生产；
7)条件温和、无环境污染。
因而用本发明提供的基因工程菌生产重组黄曲霉尿酸氧化酶，产量高，纯化工艺简便高效，生产周期短，成本较低。
附图说明
图1为一种重组表达质粒pET-30c-uricase的构建示意图。
图2为一种重组表达质粒pET-30c-uricase的测序结果图。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐述本发明，实施例中未注明具体条件的实验方法，都按照Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press.1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：
一种分离纯化大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其步骤是：
A、黄曲霉尿酸氧化酶cDNA的克隆：
黄曲霉经培养3天，过滤菌液，收集菌丝体，按Invitrogen公司Trizol RNA试剂盒操作说明提取黄曲霉菌丝体总RNA，以UricaseP1(5-GGAATTCCATATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACG-3)和UricaseP2(5-AGCCTCGAGTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG-3)为引物，按Promega公司的RT-PCR试剂盒的操作说明，进行RT-PCR扩增。将扩增产物(900bp左右)与Takara公司的T克隆载体pMD18-T连接，用电转化法转化大肠杆菌DH5α(购自生工生物(上海)有限公司)，挑取白色菌落进行鉴定。
挑取白色菌落，过夜培养后，以常规快速质粒提取法提取质粒，用Nde I和Xho I双酶切鉴定，挑取能酶切出900bp片段的质粒，命名为pMD18-uricase，委托专业生物技术公司进行全自动序列测定，测定结果表明克隆到的Uricase cDNA序列完全正确。
B、表达黄曲霉尿酸氧化酶的重组质粒pET-30c-uricase的构建：
用两种限制性内切酶双酶切步骤a获得的质粒pMD18-uricase，所述的两种限制性内切酶是Nde I和Xho I，回收切出的900bp的小片段，备用。用同样两种限制性内切酶酶切Novagen公司出售的质粒pET-30c(+)，纯化回收长约5400bp的大片段。用DNA连接酶连接上述大、小片段，转化大肠杆菌DH5α，随机挑选菌落，扩大培养后提取质粒，用Nde I和Xho I双酶切鉴定。鉴定正确的质粒以T7promoter primer(5-TAATACGACTCACTATAGGG-3)为引物进行全序列测定，测序结果证实重组质粒pET-30c-PT7-uricase具有如下特征：在原pET-30c(+)质粒的Nde I和Xho I位点插入了黄曲霉尿酸氧化酶的cDNA序列。
C、工程菌的建立
选用大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主菌(购自Novagen公司)，用氯化钙法制备感受态细胞，将pET-30c-uricase转化入感受态细胞，涂在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，重组菌落用含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基在37℃培养，经筛选后建立表达黄曲霉尿酸氧化酶的工程菌Rosetta/pET-30c-PT7-uricase，原始菌种用含有25％(质量体积比)甘油的LB培养基保存于-70℃，工程菌在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上生长呈典型大肠杆菌菌落特征，此工程菌每传30代做一次图谱分析，结果与原始菌种一致。
D、工程菌发酵：
将实施例2中构建好的基因工程菌接种于20mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，置于摇床37℃，220rpm，培养至OD600＝0.6-1.0。6000g，4℃，离心10分钟，收集沉淀的菌体。用20mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基重悬菌体，4％体积接种于500mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，培养至OD600＝0.4-1.0。加入终浓度为0.5mM IPTG诱导表达3-5h。将摇瓶置于冰上冰浴10min后，6000g，4℃，离心10分钟，收集沉淀的菌体。
E、重组黄曲霉尿酸氧化酶的分离纯化：
a.细胞破碎：
将实施例3制得的菌体按10％的量悬浮于裂解缓冲液(20mMNa2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0)，冰浴下超声破碎，超声波工作功率300-500W，工作时间3-6秒，间隔时间3-6秒，共工作90-150次。破碎液用12000g离心力离心20分钟除去细胞残渣，上清液经0.22μm尼龙微孔滤膜过滤后作为粗样品。
b.离子交换层析：
将步骤a的裂解液粗样品用Q-Sepharose Fast Flow(Q柱，Pharmacia公司产品)进行阴离子交换层析，层析柱1.6*30em。层析柱先用裂解缓冲液(20mMNa2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0)平衡好，将上述裂解液样品过此柱，上样速度7mL/分，然后用此裂解液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1，0.2N NaCl，以2-4倍柱体积进行分步洗脱，洗脱速度6mL/分，收集各洗脱峰，用10％(质量体积比)SDS-PAGE证实目的蛋白于0.2NNaCl被洗脱，保留该峰洗脱液备用。
c.疏水层析：
将步骤b所得初步纯化浓缩的尿酸氧化酶溶液用Phenyl Sepharose 6FastFlow(high sub)(H柱，Pharmacia公司产品)进行疏水层析，层析柱1.6*30cm。疏水层析柱预先用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液(pH 7.2，20mM)平衡好备用。将阴离子交换层析得到的活性大肠杆菌表达的黄曲霉尿酸氧化酶组分用磷酸盐缓冲液(pH 7.2，20mM)透析，透析液加入硫酸铵至终浓度0.8M，上样，然后用此含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以分别含有0.6、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液，以2-4倍柱体积进行分步洗脱，收集各洗脱峰，用10％(质量体积比)SDS-PAGE证实目的蛋白于0.2M硫酸铵被洗脱，将该峰洗脱液用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩。
d.凝胶过滤层析：
将步骤c所得浓缩液上样至Sephacryl S-200(S柱，Pharmacia公司产品)凝胶过滤层析柱，层析柱1.6*70cm。凝胶过滤层析柱预先用平衡液(pH 7.2，20mM的磷酸盐缓冲液)平衡好，待样品完全进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，流速1min/分，洗脱特征峰(主峰)即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶。本步骤可连续进行，即在特征峰(主峰)出现后进行下一次上样和洗脱，无须进行洗柱和再平衡，单次层析时间仅需40分钟左右。
e.冷冻干燥：
将凝胶分离后的收集液于-30℃--50℃下冷冻干燥，每升发酵液可制得150-300mg白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶。
实施例2：
重组黄曲霉尿酸氧化酶的体外生物学活性测定：
在4mL比色杯中加入3mL溶于3mL TEA缓冲液(7.5g/L三乙醇胺，0.38g/L EDTA，pH 8.9)的100μmol/L尿酸溶液，再加入1μg纯化后的尿酸氧化酶，25℃条件下反应5min后加0.5mL的20％(质量体积比)KOH终止反应。通过检测292nm处吸光度值的下降所反映的尿酸浓度的降低，从而得出酶的活性。酶活性定义：在pH 8.9、30℃条件下，每分钟催化1μmol尿酸氧化所需的酶量为一个单位。最终测得纯化后的黄曲霉尿酸氧化酶比活力为30IU/mg。
以上对本发明较佳实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北工业大学;湖北华龙生物制药有限公司
<120> 一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法
<130> 一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法
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<170> PatentIn version 3.1
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tcttacacca aggccgacaa cagcgtcatt gtcgcaaccg actccattaa gaacaccatt 240
tacatcaccg ccaagcagaa ccccgttact cctcccgagc tgttcggctc catcctgggc 300
acacacttca ttgagaagta caaccacatc catgccgctc acgtcaacat tgtctgccac 360
cgctggaccc ggatggacat tgacggcaag ccacaccctc actccttcat ccgcgacagc 420
gaggagaagc ggaatgtgca ggtggacgtg gtcgagggca agggcatcga tatcaagtcg 480
tctctgtccg gcctgaccgt gctgaagagc accaactcgc agttctgggg cttcctgcgt 540
gacgagtaca ccacacttaa ggagacctgg gaccgtatcc tgagcaccga cgtcgatgcc 600
acttggcagt ggaagaattt cagtggactc caggaggtcc gctcgcacgt gcctaagttc 660
gatgctacct gggccactgc tcgcgaggtc actctgaaga cttttgctga agataacagt 720
gccagcgtgc aggccactat gtacaagatg gcagagcaaa tcctggcgcg ccagcagctg 780
atcgagactg tcgagtactc gttgcctaac aagcactatt tcgaaatcga cctgagctgg 840
cacaagggcc tccaaaacac cggcaagaac gccgaggtct tcgctcctca gtcggacccc 900
aacggtctga tcaagtgtac cgtcggccgg tcctctctga agtctaaatt gtaataactc 960
gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagct 1017
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val
1 5 10 15
Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Glu
20 25 30
Met Thr Val Cys Val Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr
35 40 45
Lys Ala Asp Asn Ser Val Ile Val Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr
50 55 60
Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Val Thr Pro Pro Glu Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His
85 90 95
Ala Ala His Val Asn Ile Val Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile
100 105 110
Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys
115 120 125
Arg Asn Val Gln Val Asp Val Val Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe
145 150 155 160
Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp
165 170 175
Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe
180 185 190
Ser Gly Leu Gln Glu Val Arg Ser His Val Pro Lys Phe Asp Ala Thr
195 200 205
Trp Ala Thr Ala Arg Glu Val Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn
210 215 220
Ser Ala Ser Val Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu
225 230 235 240
Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Val Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys
245 250 255
His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr
260 265 270
Gly Lys Asn Ala Glu Val Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu
275 280 285
Ile Lys Cys Thr Val Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu
290 295 300
Claims (1)
1.一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法，其步骤是：
a.Uricase DNA序列的扩增：合成碱基序列：P5-5’端引物，引入NdeI酶切位点，P3-3’端引物，引入XhoI酶切位点，
P5：5’-GGAATTCCATATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACG-3’
NdeI；
P3：5’-AGCCTCGAGTTATTACAATTTAGACTTCAGAGAGGACCG-3’
XhoI；
以黄曲霉菌丝体总RNA为模板，按RT-PCR试剂盒的操作，进行RT-PCR扩增，反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收，获得Uricase DNA片段，将扩增产物与T克隆载体pMD18-T连接，得到含Uricase DNA片段的重组质粒pMD 18-uricase；
b.构建含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列的基因工程菌：用两种限制性内切酶双酶切步骤a获得的重组质粒，所述的两种限制性内切酶是NdeI和XhoI，纯化回收小片段，用同样的两种限制性内切酶双酶切质粒pET-30c(+)，纯化回收大片段，连接回收的小片段和大片段，得到含Uricase DNA片段的重组质粒pET-30c-uricase，将此重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，制得含黄曲霉尿酸氧化酶基因序列，即Uricase DNA序列的基因工程菌；
c.构建高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌：从步骤b构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET-30c-uricase，转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到高效表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌；
d.液体培养：将步骤c构建好的表达黄曲霉尿酸氧化酶的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4-1.2时，加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达2-6小时，生产和积累可溶性表达的黄曲霉尿酸氧化酶；
e.细胞破碎：用冷冻离心机将步骤d获得的发酵液于4-20℃下以1000-10000g的速度离心5-30min，弃上清，用20-150mL裂解缓冲液：20mMNa2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0，悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有20-200mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波功率300-500W，工作时间3-8秒，间隔时间3-10秒，共工作90-150次，4-10℃下1000-18000rpm离心30-60)min，收集上清液于4-20℃下保存备用；
f.离子交换层析：将步骤e所获得的细胞破碎液进行阴离子柱层析，层析柱用裂解缓冲液：20mM Na2CO3/NaHCO3，2mM EDTA，pH 10.0，平衡好，将上述裂解液样品过此柱，用此裂解液冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以其为流动相加0.1、0.2MNaCl，以2-4倍柱体积进行分步洗脱，收集由0.2MNaCl的洗脱峰，此峰即为纯化和浓缩的重组黄曲霉尿酸氧化酶溶液；
g.疏水层析：将步骤f所得纯化浓缩的组黄曲霉尿酸氧化酶溶液进行疏水层析，层析柱预先用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液：pH 7.2，20mM，平衡好备用，将阴离子交换层析得到的活性大肠杆菌表达的黄曲霉尿酸氧化酶组分用磷酸盐缓冲液：pH 7.2，20mM，透析，透析液加入硫酸铵至终浓度0.8M，上样，用含有0.8M硫酸铵的磷酸盐缓冲液冲洗直至检测基线接近上样前基线，以分别含有0.6、0.4、0.2M硫酸铵的磷酸盐缓冲液，以2-4倍柱体积进行分步洗脱，收集0.2M硫酸铵的洗脱峰，将该峰洗脱液用截留分子量为10,000的超滤膜进行超滤浓缩；
h.凝胶过滤层析：将步骤g所得浓缩液经凝胶过滤层析，用平衡液：pH 7.2，20mM的磷酸盐缓冲液，平衡，待样品进入胶中后，用平衡液从此凝胶过滤介质中洗脱出蛋白质，洗脱特征峰-主峰即为所需的纯重组黄曲霉尿酸氧化酶；
i.冷冻干燥：将凝胶过滤分离后的收集液于-30℃--50℃下冷冻升华干燥，每升发酵液制得150-300mg纯度大于99％的白色干粉状高活性黄曲霉尿酸氧化酶。
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