CN107828749A

CN107828749A - 一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法

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Publication number: CN107828749A
Application number: CN201711348410.5A
Authority: CN
Inventors: 李亚男; 张海滨; 孔雪; 刘君; 刘合露
Original assignee: Institute of Deep Sea Science and Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Deep Sea Science and Engineering of CAS
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN107828749B

Abstract

本发明公开了一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法，该方法使用冷休克表达载体pColdⅡ构建原核表达重组质粒，并导入到含有伴侣质粒的大肠杆菌Chaperone Competent Cell pG‑KJE8/BL21中进行重组蛋白表达。通过该方法，重组蛋白能够在上清中大量表达，易于后期纯化，能够快速获得产量高、纯度高、活力好的MnSOD。本发明的表达产物具有耐低温、稳定性好的特性，可大规模应用于生物、食品、医药、美容、农业、工业等领域，节约成本。

Description

一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，按所含金属种类不同主要可分为铜锌SOD、锰SOD和铁SOD三种。锰SOD主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

由于锰SOD定位于线粒体，因此被认为是抵御氧化压力的第一线。许多研究表明，氧自由基在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，而锰SOD是最有效的具有抗肿瘤活性的抗氧化酶之一(曾跃平,刘洁, 王宝玺.锰超氧化物歧化酶与肿瘤关系研究进展[J].癌症进展,2009, 7(6):613-616.)。另外，锰超氧化物歧化酶还具有抗衰老、抗辐射、抗炎症，抑制肿瘤和癌症等重要的功能。临床研究表明，其对炎症、缺血再灌注损伤、辐射损伤均有一定疗效，还可减少抗癌药物对细胞和心脏的毒副作用(王峰,杨文杰,成子锋,等.人锰超氧化物歧化酶的扩增和表达研究[J].药物生物技术,2009(4):302-305.)。总之，由于锰 SOD的重要作用，其具有很强的医用价值及临床应用前景。

目前SOD的生产方式主要有以下四种:①利用动物血液提取法；②从植物中提取；③选用高产菌株进行微生物发酵法生产；④基因工程法获得。其中④是获得SOD的有效途径。目前的许多研究工作集中在优质SOD基因的选育上。深海生物生存环境恶劣，但是报道的超氧化物歧化酶相对较少，尤其是锰SOD，而通常的蛋白表达制备方法也多以包涵体的方式进行，表达的蛋白常常没有活性，不可回收或者要进行变复性回收。存在成功率低，操作繁琐，耗时长，产量低，酶活损失大等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明针对深海超氧化物歧化酶优质基因难以获取、蛋白制备过程变复性回收复杂繁琐、酶活损失大等不足的问题，提供了一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种深海海参来源的超氧化物歧化酶MnSOD的编码蛋白，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或者同等功能的氨基酸序列。

本发明还公开了一种编码上述蛋白的基因，记做PaMnSOD。

进一步地，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还公开了一种含有上述基因的pColdⅡ载体。

本发明还公开了一种含有上述载体的Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21表达宿主细胞。

本发明还公开了一种深海海参来源的超氧化物歧化酶MnSOD的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、Paelopatides sp.总RNA及cDNA的获得；

步骤2、Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得和序列分析；

步骤3、Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的可溶性表达与纯化。

进一步地，所述步骤2中的Paelopatides sp.超氧化物歧化酶 PaMnSOD基因的获得中所用的到的PCR反应体系为50μL，包括10μL PrimeSTAR GXL Buffer，4μL dNTP，F和R引物各1μL，模板cDNA1μL，2μL GXL DNA Polymerase(TaKARa公司)，用H₂O将总体积补至50μL。

进一步地，所述PCR反应体系中的引物对为引物F和引物R，其中，

引物F：CGGGATCCATGAAGGCTCCGTATGAAGGCCTGGA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

引物R：AACTGCAGTCACAATTCTTCATGTTTAGATGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

划线部分GGATCC代表Bam H I酶切位点，CTGCAG代表Pst I酶切位点。

进一步地，所述步骤2中的Paelopatides sp.超氧化物歧化酶 PaMnSOD基因的获得中所用的到的PCR反应条件为：98℃10s、55℃ 15s、68℃10s，30cycles，4℃保存。

进一步地，所述步骤3中的纯化采用Ni-NTA柱纯化。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

通过该方法制备的重组蛋白克服了深海优质生物资源难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐、酶活损失大等不足，纯化后的蛋白具有耐低温、纯度高、活力好，温度适应范围广等特性，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、美容、农业等领域奠定基础。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明PaMnSOD基因重组表达的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M:蛋白Marker；1：重组蛋白未诱导表达时菌体总蛋白；2：重组蛋白诱导表达后菌体总蛋白；3：重组蛋白在包涵体中的表达情况；4：重组蛋白在上清中的表达情况；5：经镍柱介质纯化所得的目的蛋白PaMnSOD；

图2是本发明实施例PaMnSOD的热稳定性曲线图；其中，横坐标表示不同温度，纵坐标表示PaMnSOD的相对活性；

图3是本发明实施例PaMnSOD的酸碱稳定性曲线图；其中，横坐标表示不同pH，纵坐标表示PaMnSOD的相对活性。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子克隆实验室手册(15、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议操作说明书条件进行。

实施例1Paelopatides sp.总RNA及cDNA的获得：

(1)样品采集

深海海参Paelopatides sp.采自于马里亚纳海沟深渊海域(深度： 6500m；纬度：10°57.1693’N，经度：141°56.1719’E)。

(2)总RNA提取

取50-100mg样品组织，用RNase FREE实验用纸吸干样品表面残留的RNAlater并尽量切碎。添加1ml QIAzol，Ruptor进一步充分搅拌研磨样品。匀浆液室温下放置10min以上，随后，用QIAGEN (凯杰)总RNA提取试剂盒进行总RNA提取(操作见说明书)。经电泳检测RNA无降解后进行下一步的反转录合成cDNA。

(3)cDNA合成

使用TAKARA反转录试剂盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行深海海参Paelopatides sp.总RNA到cDNA的反转录实验。操作详见产品说明书。得到的cDNA可用于实施例2中PCR 扩增。

其中，对于该样品而言，将样品在QIAzol中进行充分研磨很关键，有利于提高后期总RNA得率，经过各种总RNA试剂盒的使用比较，发现用QIAGEN(凯杰)试剂盒进行该样品的总RNA提取效果好。

实施例2Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的克隆和序列分析

(1)Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的克隆

①以实施例1获得的cDNA序列为模板，用引物F和R扩增 PaMnSOD基因。

划线部分GGATCC代表Bam H I酶切位点，CTGCAG代表Pst I 酶切位点。

②PCR反应体系

PCR反应体系为50μL，包括10μL PrimeSTAR GXL Buffer，4μL dNTP，F和R引物各1μL，模板cDNA1μL，2μL GXL DNA Polymerase(TaKARa公司)，用H₂O将总体积补至50μL。

本实验PCR反应采用PrimeSTAR GXL(TaKARa公司)高保真酶，扩增效率高，保真性好。

③PCR反应条件

98℃10s、55℃15s、68℃10s，30cycles。

(2)PaMnSOD基因的序列分析：

PCR产物经割胶纯化后与pMD^TM18-T Vector连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落PCR后选取有DNA片段的阳性克隆测序，其性质为双链线性DNA，长度为708bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，记做PaMnSOD，即为深海海参来源的超氧化物歧化酶MnSOD的核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD的可溶性表达与蛋白纯化

(1)构建pColdⅡ冷休克表达载体

选择的表达载体为pColdⅡ冷休克表达载体，在37℃条件下Bam H I(TAKARA公司)和Pst I(TAKARA公司)对载体和目的基因双酶切3h，再次胶回收酶切目的片段，并以T4DNA连接酶(TAKARA公司)将载体与目的基因4℃连接过夜，得到连接体系。连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌落PCR进行克隆验证挑取含有目的DNA片段的阳性克隆测序。测序正确的DH5α菌株即为构建好的包含目的PaMnSOD基因的表达载体。

(2)PaMnSOD基因的可溶性诱导表达

将上一步测序正确的DH5α进行扩大培养，抽提质粒，转化表达宿主大肠杆菌Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21，根据菌落 PCR筛选出正确转入重组质粒的菌株。将正确转入重组质粒的 Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21接种到LB培养基中(含20 μg/ml氯霉素、100μg/ml氨苄青霉素、0.5mg/ml L-Arabinose以及2 ng/mlTetracyclin)，37℃振荡培养至菌液OD600＝0.4-0.6时，15℃放置40分钟。0.1mM IPTG15℃继续振荡培养24小时。用12％的 SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白的表达情况，见附图1。

(3)PaMnSOD基因蛋白产物的纯化

8000g离心5min收集细胞，1X PBS清洗细胞一次后，用20mL Binding Buffer缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，300mM氯化钠，pH＝ 7.4)重悬细胞，冰上超声破碎1h，14000rpm离心20min，弃沉淀。0.45 μm一次性滤膜过滤所得上清后，用生工Ni-NTA柱进行蛋白纯化，操作及所用试剂参见说明书进行。稍后，对纯化得到的融合蛋白进行透析。4，8，14小时分别更换透析液，透析液为1X TBS。透析后的蛋白用10kDa超滤管(Millipore公司)7000g离心10min进行浓缩。最终得到的重组融合蛋白PaMnSOD经12％的SDS-PAGE电泳分析，其单亚基分子量约为29kDa，纯度达97％以上，如附图1所示。

本发明使用的pColdⅡ冷休克表达载体含有冷休克基因cspA启动子，当培养温度切换到低温时，大部分的大肠杆菌蛋白质表达减少，而目的基因还可以进行高效表达。选择的Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21表达宿主菌能够表达一组参与蛋白质折叠的分子伴侣，靶蛋白与这些分子伴侣们共同表达，便可增加可溶性蛋白的回收率。构建蛋白的高效表达系统对于后期蛋白质纯化以及应用是一项非常重要的技术。该表达载体与表达宿主的组合可以大大简化后期蛋白的纯化过程，降低酶类制剂的失活速度，提高蛋白产量。

实施例4重组超氧化物歧化酶PaMnSOD的酶学性质

a)测定原理及方法

采用南京建成公司的总超氧化物歧化酶(货号：A001-1羟胺法) 检测试剂盒进行重组超氧化物歧化酶PaMnSOD的酶学性质研究。其原理是通过黄嘌呤以及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计在OD550nm测定其吸光度。当被测样品中含有 SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使生成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD活力。SOD酶活用U/mg表示。定义每毫克蛋白对超氧阴离子自由基在上述反应中的抑制率达50％时所对应的PaMnSOD为一个酶活单位。酶活计算公式如下：

b)重组超氧化物歧化酶PaMnSOD的热稳定性

取30μL蛋白样品，分别置于0℃、5℃、10℃、20℃、30℃、 40℃、50℃、60℃和70℃下处理15min，立即放入冰中，检测PaMnSOD 残余活性。每个点三个重复，对照为1X TBS。结果显示，该酶的温度适应范围较广，在0℃-60℃范围内都具有较高活性，最适温度在0℃附近，属耐低温酶类，如图2所示。

c)重组超氧化物歧化酶PaMnSOD的酸碱稳定性

将30μL蛋白溶解于等量不同pH值的缓冲液中，在每个pH值设置三个重复，对照为1X TBS。25℃下孵育1h，测定其SOD残余活性。所用pH缓冲液为0.2M Gly/HCl缓冲液(pH2.2和3)、0.2M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4和5)、0.2M磷酸缓冲液(pH6和pH7)、 0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.5和9)和0.2M甘氨酸/NaOH(pH10、11、 12和13)。结果显示，该酶在pH2.2-13范围内均有活性，在pH为10 附近酶活最大，在pH5-12范围内，25℃处理1h，酶活仍能保持60％以上，如图3所示。

d)计算分析

温度和pH值作用点各设三个重复取其平均值计算酶活，各自具有最高SOD酶活的点设为100％酶活，其余的以其酶活占最高酶活的百分比获得。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院深海科学与工程研究所

<120> 一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法

<130> 2017

<141> 2017-12-15

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 深海海参(Paelopatides sp.)

<400> 1

atgaaggctc cgtatgaagg cctggagaag ttttcagaaa aatatgtctt tcctgagctt 60

gaatatggat acactgatct agaaccttat attgatgaag caactctcag ggtacaccat 120

ggaggtcacc ataagggcta catgaagaaa ataaatgcca aattagagga atggagagaa 180

gaggcctcgg atggattgtc atcagcgtcc cttgtcgata tcatcaccag tattgatgac 240

gttccaataa aataccaaaa ggccgttgaa gattttggtg gagggttctt gaaccatgcc 300

ctctatttcg ctgtgatgtc acctaacgaa gccaatgaga cacgtcttcc taccgatgct 360

cttttgggtg atattaatga ttcctttggt agtttccaac agtttaagga ccagtttacg 420

gctgaggccc tcaaactttt tggatcaggg tacgtctggc tcaaccaaga attatcctct 480

ggtggcaggt ttcttctgtc aatcaccacg acagccaatc aggagagtcc attatctgat 540

ggcttacagc ctatcctaac cttagatgta tgggagcatg catattacct taaacaccaa 600

ctacgcaggc ccaagcatgt agaagactgg tggaaggttg tcgattggac acaagtgaag 660

aaactctctg attggtggca gcagccatct aaacatgaag aattgtga 708

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> 深海海参(Paelopatides sp.)

<400> 2

Met Lys Ala Pro Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Phe Ser Glu Lys Tyr Val

1 5 10 15

Phe Pro Glu Leu Glu Tyr Gly Tyr Thr Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Asp

20 25 30

Glu Ala Thr Leu Arg Val His His Gly Gly His His Lys Gly Tyr Met

35 40 45

Lys Lys Ile Asn Ala Lys Leu Glu Glu Trp Arg Glu Glu Ala Ser Asp

50 55 60

Gly Leu Ser Ser Ala Ser Leu Val Asp Ile Ile Thr Ser Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val Pro Ile Lys Tyr Gln Lys Ala Val Glu Asp Phe Gly Gly Gly Phe

85 90 95

Leu Asn His Ala Leu Tyr Phe Ala Val Met Ser Pro Asn Glu Ala Asn

100 105 110

Glu Thr Arg Leu Pro Thr Asp Ala Leu Leu Gly Asp Ile Asn Asp Ser

115 120 125

Phe Gly Ser Phe Gln Gln Phe Lys Asp Gln Phe Thr Ala Glu Ala Leu

130 135 140

Lys Leu Phe Gly Ser Gly Tyr Val Trp Leu Asn Gln Glu Leu Ser Ser

145 150 155 160

Gly Gly Arg Phe Leu Leu Ser Ile Thr Thr Thr Ala Asn Gln Glu Ser

165 170 175

Pro Leu Ser Asp Gly Leu Gln Pro Ile Leu Thr Leu Asp Val Trp Glu

180 185 190

His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Leu Arg Arg Pro Lys His Val Glu

195 200 205

Asp Trp Trp Lys Val Val Asp Trp Thr Gln Val Lys Lys Leu Ser Asp

210 215 220

Trp Trp Gln Gln Pro Ser Lys His Glu Glu Leu

225 230 235

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cgggatccat gaaggctccg tatgaaggcc tgga 34

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aactgcagtc acaattcttc atgtttagat ggc 33

Claims

1.一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD的编码蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或者同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因，记做PaMnSOD。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的pColdⅡ载体。

5.含有权利要求4所述载体的Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21表达宿主细胞。

6.一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、Paelopatides sp.总RNA及cDNA的获得；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得中所用到的PCR反应体系为50μL，包括10μL PrimeSTARGXL Buffer，4μL dNTP，F和R引物各1μL，模板cDNA1μL，2μL GXL DNAPolymerase(TaKARa公司)，用H₂O将总体积补至50μL。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述PCR反应体系中的引物对为引物F和引物R，其中，

划线部分GGATCC代表Bam H I酶切位点，CTGCAG代表Pst I酶切位点。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的Paelopatides sp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得中所用的到的PCR反应条件为：98℃10s、55℃15s、68℃10s，30cycles，4℃保存。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的纯化采用Ni-NTA柱纯化。