CN110195044A

CN110195044A - 一组可提高sod活性和稳定性的氨基酸序列及其应用

Info

Publication number: CN110195044A
Application number: CN201910561464.2A
Authority: CN
Inventors: 王威; 孙林博
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2039-06-26
Also published as: CN110195044B

Abstract

本发明涉及一组可提高SOD稳定性和活性的氨基酸序列及其应用，它是一种来源于Paenibacillus属Fe/Mn‑SOD的N端氨基酸序列。这组氨基酸序列具有以下特征：1）位于Fe/Mn‑SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为60‑296个氨基酸；2）其相互之间具有75‑100%的同源性；3）这组氨基酸序列可特异性结合金属离子Fe和Mg，并可将其结合的金属离子转移至SODA功能域，对Paenibacillus属的Fe/Mn‑SOD的稳定性和活性具有决定性作用，可广泛应用于其它SOD（特别是常温SOD）的改造，显著提高其稳定性和活性。

Description

一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用。

背景技术

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD），是唯一能够特异性清除自由基O₂·^ˉ的抗氧化金属酶，是生物体防御氧毒性的关键。该酶广泛存在于自然界的生物体内，自1969年从牛红细胞发现并正式命名以来，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。由于SOD的特殊功效，其在医药、日用化工、食品、农业以及环保等领域具有广泛的应用价值。目前，SOD临床应用主要集中在抗炎症方面（以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主），此外对某些自身免疫性疾病（如红斑狼疮、皮肌炎）、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料；在化妆品行业里主要用作抗炎、抗衰老的重要功能性成分。

基于金属辅基不同，该酶可分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD四种类型。Mn-SOD与Fe-SOD主要存在于原核生物中，二者序列及结构同源性很高，进化上相近；而Cu/Zn-SOD存在于真核生物中，属于进化上的另一个分支。目前已开发的SOD产品绝大部分都是Cu/Zn-SOD，最早是从动物的血、肝中分离提取的，近年来植物来源的SOD也有了大量相关报道。微生物来源的SOD，尤其嗜热菌中分离的SOD由于具有耐高温、稳定性好的特点，使其在化工应用中比常温酶具有更好的适用性，而越来越受到更多关注。嗜热SOD具有极高的热稳定性、耐受物理、化学变性剂的优良特性，在工农业生产中具有巨大的应用价值，主要来源与自然界分离，原料受限，难以满足工业化需要。目前对SOD进行生产加工以提高其热稳定性的方法主要有基因工程方法、研究SOD模拟物、化学修饰、酶固定化等，但普遍存在改造手段技术繁琐，操作困难，适应性差，且其效果并不太明显等弊端和局限性，这些问题已严重影响到了嗜热SOD的工业化进程。本专利涉及的一组可提高SOD耐热温度和热稳定性的氨基酸序列为实现SOD的耐热性改造提供了一种全新思路和方法，该方法操作简便、可行性强、适应性好，可实现传统工业用SOD的升级换代，具有重要的应用价值和前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，这13个N端氨基酸序列具有以下特征：（1）位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为60-296个氨基酸，不能独立行使SOD的功能；（2）其相互之间具有75-100%的同源性；（3）都包含特殊的金属离子结合结构域。

本发明的另一目的是提供一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，这一组N端氨基酸序列对Paenibacillus属的Fe/Mn-SOD的活性和稳定性具有决定性作用，除去这一组N端氨基酸序列后的Paenibacillus属的Fe/Mn-SOD活性和稳定性大幅降低（具体详见实施例1所示）。

本发明的另一目的是提供一种能表达重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端）的重组质粒pET-SOD_M1。

本发明的再一目的是提供一种能产生上述重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌SOD_M1-BL21。

本发明的再一目的是提供了SEQ ID NO:1-13氨基酸序列在提高SOD的活性、提高SOD的稳定性方面的应用。实验结果证明：改组氨基酸序列的存在可显著提高SOD的活性和稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，如SEQ ID NO:1-13所示。

上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，其特征在于：（1）位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为159-296个氨基酸；（2）其相互之间具有75-100%的同源性；（3）都包含特殊金属离子结合结构域。上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，其具有与SEQ ID NO:1-13所示的氨基酸序列至少75%的同源性。

上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，其具有SEQ ID NO:1-13所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-100个。

上述一组来源于Paenibacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，其特征在于，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它SOD，如本实施例中的枯草芽孢杆菌的Mn-SOD，通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端，可以显著提高SOD的活性和稳定性。

本发明提供的SEQ ID NO:1-13氨基酸序列如下：

Paenibacillus polymyxa M1 SEQ ID NO:1

MLSTYGSFLPLRVLEEIRHWKQQESWHVEVIKSATEGLEPAYVRLLDDWRTVFEQTERAAIELLEEQRSALDPVEQAWQHQEKKASSAPQAHTHQLDESSAHSRGSDASATGEKPLSESGLNSQPASQELNRRLDDLLQTANRQSQEYVRQLGLLTEHSHALRQQPKSAGVVIHAAHESQYFLISTTPFQEPGSIARATGLYHVAAEGEDYPEQAFRERHASMRGEGSGATKGVQSGQTQPSAAEKSLVGRPVPIGG

Paenibacillus alvei A6-6i-x SEQ ID NO:2

MQLIYGPLMPVRVLEESAYWKQQEKKHTEVIRAIVPQLEPEYVQLLAQWEQVLSQTEDAARGQLRTALQQ

PDVLQPDQLQQLQELLRASVYQSEQFVQQLDAIKHNSQAVQHTEHAPVVFDHITERSQYFLKAIKPVFYP

AVDPPGSNHNTRSNSSSSPPARIHAAGNEPSSHWPQHQYQPQQHQYPYPQQSIQGIHAHIGNTRSAQPEQ

DDETDGESFVPIGG

Paenibacillus alvei DSM 29 SEQ ID NO:3

MQLIYGPLMPVRVLEESTYWKQQEKRNTEVIRAAVPQLEPEYVQLLAQWEQVLSQTEAAAKAQLRTALQR

PDALQPEQLQQLQELLRASVYQSEQFVQHLEAIKHSSQAVQLTEHAPVVLDHIAERSQYFLQAIKPVFYP

AQEQGSSSPVRSSHNTEPPARIHSTDVNEPSSNWPPYPPHQHQQYPQHQHQQYSMQGIHAFIGNSRSSQF

EHSEESDDESFVPIGG

Paenibacillus alvei TS-15 SEQ ID NO:4

MQLIYGPLMPVRVLEESAYWKQQEKKHTEVIRAIVPQLEPEYVQLLAQWEQVLSQTEDAARGQLRTALQQ

PDVLQPDQLQQLQELLRASVYQSEQFVQQLDAIKHNSQAVQHTEQAPVVFDHITERSQYFLNAIKPVFYP

AVESPGSNNNTRSSSSSSPPVRIHAAGNEPSAHWPQHQYQPQQHQYPYQQQSIQGIHAHIGNTRSAQPEQ

EQDDETDGESFVPIGG

Paenibacillus assamensis SEQ ID NO:5

MLLIYGPYMPIRILEAIQDWKNQEKEHAVLIRSVVPELEPSFSQVLTEWEHVFAKTEETARGWLHNCISS

DTRWDNSLLTQIDQLLGASVQQSEHFIQQLEHIKQYSQAVRYTSAAPLLCAHVVRESYVFVSVTKSLTST

PLAEAQANAAAYGQGPAAAYHSAAVRPNDVTAAIGSRPAQSQACAAGEAIPPQSERPPNGAGAMQHGTAH

APHAAALQHGSPYSPQAAASQHNSPYSPQGSPYAPQTAASAQPAAASEPQLRQAAPEEARPADNVYVPPG

G

Paenibacillus barengoltzii SEQ ID NO:6

MLFVYGPFLPVRILEEIRFWKQQEAEHTEVIQAIVPSLEADYVKLLEEWKPIFERTEAAADKLLQYALAT

PHAATSHEVIRQTERLLRASCQQSQEFIRHLEYMLKHSAAVKSVPLAPVVLLHIIRESAYFLEVLERLNR

PGEIAGSMAAAPPYPDPYHAAGAQPFYREEEAQELAAPPTSEHPELTDDASPAITDELNRFETSEVANPP

EEPDGIETADISEASLEVEAEQEHKQEEQEQDELSLRQEPSADDNTETTTARVPERSVPIGG

Paenibacillus curdlanolyticus YK9 SEQ ID NO:7

MLFVYGPQTPIRLLEEIRDWKRQEIEHAAMIRRFTPTLEPEFKWLLNEWEQPLRAAERVADRCLNEALTR

SDNAGDGSSSAMTQAQADLLLQASAYQSQKLVEHLLHLMERSASLASAPAARSFILHAVRESNGFLGLQE

TYRYSYSPEQALAQSAEALRNADRSSHAGTQDIANAGDDPQGGSDADADRAPVAQVPIGG

Paenibacillus daejeonensis SEQ ID NO:8

MTQVQEQSESQRRLEQIERWKRREEEQTAQLLQVLPQLEPPLISVLQEWRPILRLTSRYAADWQQTRPFQ

SARPEPHTEIQVEWLTSEAVRQTEEWSRQLGVLLQHSRALAADPEASELVRQFIRESQETIGVQFTADPA

APPTFAAIEQYEEENRTIDGDTPSPDKPVNSAEADGEHSRAEEEPPNAPDMNGGAVGTDNHMSDDKPVPI

GG

Paenibacillus darwinianus SEQ ID NO:9

MLFVDGPYVQLRLLEELQSWKKREKEHAAVLRAISPGSDPGFVRTLEEWESVFADTERCAEWWLNASLER

PGLLPASAGPQLAALVHAARAQSEAFVRQLHDYRTHSADLRAAPVTSVIIGLMLRESQYLLDRSVGFDAL

QGERGEARARPPAAVPVGG

Paenibacillus dendritiformis C454 SEQ ID NO:10

MEYIYGSLMPVRVLEEIVFWKKQEREHIEVILAIVPQLEPEYVQVLREWEPVFTKTEEAASAWLQFILSQ

GGSTPSDTMHKIELLLKASVYQSEQFVKHLETMKQYSRAVQSVPLAPIVFDHIASESVYFLNVVHALKDK

PLSSFAPPDAPGAHAVQPKAFIHEAPPVDSGSSSGAPAEAEYPLTAYDSESEEDSHSPAATAPQSPAPGI

LAYIGSAQTPQAAQAAQAAQGIQPVQPVQEHGEARSSREDAPFGSLPYRELPYTLPEGWPAGHPQHQPPV

PEYYLRAEPASVPIGG

Paenibacillus ehimensis SEQ ID NO:11

MLYVYGSLMPLRVLEEIRFWKMQEREHTVVIRELVPKLEPEYAALLQQWEGVLAQTEAASQQWIEAVLRT

KPPVGPYIIDKVNELLYASIAQSQEFIRQLFLILERSRPVRANPVVQTVFMHIIRESEYFLGVLHAVQNT

PEGYEEFRAEEEADPSTQTRAPDEEQAHIHLWRSESESHPVDLNQLTATQEGTWSGERPPSPYARPVPIG

Paenibacillus elgii SEQ ID NO:12

MLYVYGSLMPLRVLEEIRFWKTQEREHTVVIRELVPTLEPEYAALLQQWEGVLAQTESASQQWIEAVLRA

KHPVSPYIIDKVNELLYASIAQSKEFIRHLFLILERSRPVRANPVVQTVFLHIIRESEYFLGVLHAVQSS

ECYEEPRDEEAAETRSPGEEQAHIHLWRGESESAPVDLNQLTATQEGTWTGDRPQAPFSKPVPIGG

Paenibacillus fonticola SEQ ID NO:13

MLLVYGPYLPVRILEEIRFWKQQEAEHTDVIKAIVPGLEPYYVQLLNDWKRVFEETTLAANQLLQYATSS

QHAACDPKLIHETEKLLNTAFRQSHEFVRQLYTILDCSHAVKAVPLAKTVLLHIIRESEYFLGVLETLNS

PGAIKRNSEQFPSTPDLQQIAGDPHQLLGNGFPDSSPDLSDFGPDFDSKPRTEPWSESWSEPKLKIAAYE

EEMTINDNRDKDDAVPIGG

一种表达上述的超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组质粒pET-SOD_M1该质粒至少包括SEQ ID NO:1-13所示的基因。

上述表达重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组质粒的载体为pET-28a(+)（实验室常用已知载体）。

一种产生上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌，SOD_M1-BL21该重组菌导入了超氧化物歧化酶。

上述产生重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌为大肠杆菌。

上述产生重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌的大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株（购买后，保存在实验室）。

上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）应用于催化超氧阴离子自由基，发生歧化反应生成氧气和双氧水。

对本发明的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列具有至少75%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有重组超氧化物歧化酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。

本发明提出的上述重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的性能不同于已知的超氧化物歧化酶，将这段N段序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端，可以提高其它SOD的耐热温度和热稳定性，可高效催化超氧阴离子自由基(O₂·^ˉ)发生歧化反应生成氧气O₂和双氧水H₂O₂。

上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）改造后的重组超氧化物歧化酶主要应用于医药、卫生保健、食品或化妆品加，例如，将改造后的SOD添加于大宝SOD密后可显著提高其活性和稳定性：

从上面的比较可以看出添加了重组超氧化物歧化酶的大宝SOD密其活性和稳定性均有显著提高。

本发明公开的一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列所具有的积极效果在于：

（1）阐明了一种提高SOD活性和稳定性的新方法。利用添加本专利中氨基酸序列的基因重组方法进行其他SOD的稳定性和活性改造和高效表达，具有重要应用价值，也为其高稳定性工业酶的改造提供新思路。

（2）通过添加本专利中氨基酸序列所获得的SOD酶可在金属离子匮乏的环境下保持极好的稳定性，克服了其他不含该类特殊金属离子结合结构域的SOD在应用过程中出现的化学性质不稳定现象，有利于其在食品、化妆品、药品及保健品等领域的工业应用。

（3）通过添加本专利中氨基酸序列提高SOD活性和稳定性的方法操作简单，成本低廉，重复性好，具有重要的工业应用前景和实际意义。

附图说明

图1为金属离子重构后SOD与SODA的活性恢复趋势。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。需要特别说明的是实施例中所用到的试剂均由市售，类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa M1（分离自大港油田）。

实施例1

构建编码M1的Fe/Mn-SOD全序列基因（sodM1）的克隆，并且构建编码SODM1的结构域sodA的DNA序列（sodAM1）的克隆，并且测定表达蛋白的最适活性及稳定性。

1. 类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa M1总DNA的提取

在本实施例中，采用从中国天津大港油田油井地层水分离获得的类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxaM1，取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离心收集菌体，菌体悬于250μL 50mM Tris缓冲液中（pH8.0），加入10μL 0.4M EDTA（pH8.0），混匀后37℃保温20min，之后加入30μL 20mg/L溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μL 20mg/L蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μL 10%SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100μL TE缓冲液（pH8.0，10mM Tris，1 mM EDTA），加入10mg/L RNase2μL，65℃保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μL TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=1.95，A260=0.73。

2. 超氧化物歧化酶基因的克隆和筛选

2.1扩增M1的Fe/Mn-SOD全序列基因（sod _M1），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

95℃，3min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，2hr

上游引物：5'-CGGGATCCCGCTGAGTACTTATGGGTCTTT-3'

下游引物：5'-CCCAAGCTTGGAGGCTTGAGCATAGC-3'

2.2扩增M1的Fe/Mn-SOD的结构域sodA的DNA序列（sodA _M1），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5' CATCGGCTCCCTCCGCTTCC 3'

下游引物：5'CCCAAGCTTGGAGGCTTGAGCATAGC 3'

2.3 扩增M1的N端DNA序列sod _N，取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5'CGGGATCCCGCTGAGTACTTATGGGTCTTT 3'

下游引物：5'CCCAAGCTTTCCCCCAATAGGGACCGGG 3'

上述三组PCR产物纯化后都用NdeI和HindIII双酶切，分别与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α（购买后，保存在实验室）后，涂于含50μg/mL Kan（卡拉霉素）的LB固体培养基（Tryptone:1%；Yeast Extract: 0.5%;NaCl:1%。）上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定，插入有sod _M1编码的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW01，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH01。插入有sodA _M1编码的序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW02，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH02。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。然后将重组质粒pLW01和pLW02分别转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命名为BL01和BL02。

3.重组超氧化物歧化酶的纯化和特性

将上述重组菌BL01和BL02单克隆分别接入20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1%（V/V）接种量接入200mL含50μg/mL Kan的LB培养基（共2个摇瓶），37℃，220rpm/min培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1 mM, 37℃, 180rpm/min诱导3小时。离心收集菌体，悬于50 mM Tris-Cl（pH8.0）缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose）镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。理论上推算SOD-M1和 SODA-M1的分子量分别为54.0kD和26.6kD，与SDS-PAGE检测结果一致。

4. 金属离子转移测定

实验通过电感耦合等离子发光色谱仪对SOD的N端进行金属离子含量测定（表1）：

5.重组超氧化物歧化酶（SOD）活性测定

3mL反应混合液中14.5 mM L-甲硫氨酸加入2.7mL，30μL EDTA-Na₂加入10ul，2.25 mMNBT加入100uL，60mM核黄素加入100μL，PBS加入90μL，加入10μL的样品酶液。各试剂加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸钠缓冲液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于一定温度光强为4000Lux条件下光照15min，然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定各样品管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）

6. NTD金属离子转移机制

分别将M1 SOD野生型与M1 SODA功能区进行Fe金属离子重构，使得两种蛋白均处于离子空载状态。随后按照protein/metal比例为1:1往蛋白溶液添加Fe，每隔一段时间取出蛋白样品，测定酶活，得到如下活性恢复趋势。可以看出，不含N端的SODA蛋白活性在很短的时间内恢复到了最大值，而含有N端的SOD野生型则表现出较慢的活性恢复趋势，这就表明N端与SODA功能区存在离子竞争关系，N端可以首先结合上金属离子，随着时间的推移，其所结合的金属离子逐步转移到SODA功能区，使得其酶活得以恢复，并最终达到最高活性。我们对60min时SOD和SODA的Fe含量进行测定，也验证了这一结论（图1）。

实施例2

构建编码B. subtilis BSn5的Mn-SOD全序列基因（sod-BSn5）的克隆，并且构建编码SOD-BSn5的结构域sodA的DNA序列（sodA-BSn5）的克隆，最后还要构建编码重组SOD（SOD-GTNG_2215的N端序列和B. subtilis BSn5的SODA重组结合成重组SOD）全序列基因（sod- combinant）的克隆。并且测定表达蛋白的酶活性及热稳定性。

1. B. subtilis BSn5总DNA的提取

在本实施例中，取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离心收集菌体，菌体悬于250μL 50 mMTris缓冲液中（pH8.0），加入10μL 0.4M EDTA（pH8.0），混匀后37℃保温20min，之后加入30μL 20mg/L溶菌酶，混匀后37℃再保温20min，再加入5μL 20mg/L蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20μL 10%SDS，50℃保温至溶液澄清，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100μL TE缓冲液（pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA），加入10mg/L RNase 2μL，65℃保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50μL TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=1.96，A260=0.72。

2. 超氧化物歧化酶（SOD）基因的克隆和筛选

2.1 扩增BSn5的Mn-SOD全序列基因（sod-BSn5），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5' GGAATTCATGAAACGTGAATCTTATCAAACG 3'

下游引物：5' CCGCTCGAGTTAATAGAGCTTCCAAACGACTTC 3'

2.2 扩增BSn5的Mn-SOD的结构域sodA的DNA序列（sodA -BSn5），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5' GGAATTCCATATGAAACAcGTGCTGCCAAAGCT 3'

下游引物：5' CGCGGATCCTTAATAGAGCTTCCAAACGACTTC 3'

2.3扩增重组SOD的DNA序列（sod-combinant）

2.3.1 扩增M1 SOD的N端序列基因（sod_N-M1），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5' GGAATTCCATATGGACGACCAAACGTTGTTTGC 3'

下游引物：5' GCACATGTTTCGAAACCGCC 3'

2.3.2 扩增BSn5 SOD的C端序列基因（sod_C-BSn5），取前面所述的总DNA溶液0.5μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5' GGCGGTTTCGAAACATGTGC 3'

下游引物：5' CGCGGATCCTTAATAGAGTTTCCAAACGACTTC 3'

2.3.3 扩增重组SOD的DNA序列（sod-combinant），sod_N-M1和sod_C-BSn5各取0.25μL（约10ng）作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。

设定的PCR循环参数如下：

上游引物：5' GGAATTCCATATG GACGACCAAACGTTGTTTGC 3'

下游引物：5' CGCGGATCCTTAATAGAGcTTCCAAACGACTTC 3'

sod-BSn5的PCR产物纯化后用EcoRI/ XhoI双酶切，sodA-BSn5和sod-combinant的PCR产物纯化后用NdeI/ BamH双酶切，以上酶切产物分别与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α（本实验室保存）后，涂于含50μg/mLKan（卡拉霉素）的LB固体培养基上。37℃培养16～18小时，挑取单克隆菌落鉴定，插入有sod-BSn5编码的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW03，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH03。插入有sodS-BSn5编码的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW04，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH104。插入有sod-combinant编码的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW05，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH05。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。将上述重组质粒pLW03、pLW04和pLW05分别转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命名为BL03、BL04和BL05。

3.重组超氧化物歧化酶的纯化和特性

将上述重组菌BL03、BL04和BL05单克隆分别接入20mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，37℃，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1%（V/V）接种量接入200mL含50μg/mL Kan的LB培养基（共2个摇瓶），37℃，220rpm/min培养A600为0.6时， BL03加入IPTG至终浓度为0.05mM, 25℃, 180rpm/min诱导3小时。BL04加入IPTG至终浓度为0.05mM, 25℃, 180rpm/min诱导3小时。BL05加入IPTG至终浓度为0.1mM, 30℃, 180rpm/min诱导3小时。诱导完后离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl（pH8.0）缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose）镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。理论上推算SOD-BSn5、SODA-BSn5 和SOD-combinant的分子量分别为37.28099 kD、26.28290 kD和53.61853 kD，与SDS-PAGE检测结果一致。

4.重组超氧化物歧化酶活性测定

3mL反应混合液中14.5 mM L-甲硫氨酸加入2.7mL，30μL EDTA-Na₂加入10μL，2.25 mMNBT加入100μL，60μM核黄素加入100μL，PBS加入90μL，加入10μL的样品酶液。各试剂加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸钠缓冲液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于一定温度光强为4000Lux条件下光照15min，然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定各样品管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）

5. 重组超氧化物歧化酶金属离子稳定性测定

蛋白酶结合金属离子分为两种方式：一种是在机体内补充金属离子，蛋白翻译后修饰；一种是在机体外补充金属离子，蛋白表达后进行金属离子重构。

（1）蛋白翻译后修饰（制备Mn-medium-added和Fe-medium-added SODM1和rSODM1-N）

取重组菌株5μL接种于20mL LB培养基(含50μg/mL Kan中)，37 ℃，150r/min振荡培养过夜。将过夜培养的菌液按1%转接到200 mL LB培养基(含50μg/mL Kan)中，37 ℃，150r/min振荡培养直至OD600在0.6～0.8之间。在培养基中加入一定量的IPTG，使其终浓度为0.05～0.2mM，同时加入MnSO4或FeSO4，终浓度为1mM。16℃～37℃，150r/min 诱导表达3h后纯化。

（2）金属离子重构（制备Mn-reconstituted和Fe-reconstituted SODM1和rSODM1-N）

1、将纯化好的SOD在含有50mM 醋酸缓冲液（pH 3.8），6M 盐酸胍，10mM EDTA的溶液中30℃透析16h，使SOD充分变性并释放金属离子成为脱辅基蛋白。

2、将脱辅基蛋白在50mM 醋酸缓冲液（pH 3.8），6M 盐酸胍中30℃透析5h除去EDTA。

3、将以上蛋白在50mM 醋酸缓冲液（pH 3.8），6M 盐酸胍，10mM MgSO4或FeSO4中室温透析4h，结合金属离子,每隔五分钟取出一次蛋白样品。

4、将以上蛋白在50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），6M 盐酸胍，10mM MgSO4或FeSO4中室温透析4h，结合金属离子，每隔五分钟取出一次样品。

5、将以上蛋白在50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），1mM MgSO4或FeSO4中室温透析4h除去盐酸胍。

6、将以上蛋白在50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），0.5mM EDTA中室温透析12h除去未结合到蛋白活性中心的金属离子。

7、最终在50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）室温透析5h去除EDTA，得到金属离子重构蛋白，将分次取出的样品分别测定酶活。

以上金属结合蛋白以10%的硝酸进行消解后，用IRIS Intrepid II XSP型电感耦合等离子体发射光谱仪测定金属含量。配制浓度为1.0mg/L, 2.0 mg/L, 和4.0 mg/L的Mg2+和Fe2+溶液来测定离子含量标准曲线。计算时将50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）及10%硝酸的离子含量作为空白对照。

结论：融合了N端的SODA其会随着时间的推移缓慢恢复活性，说明在金属离子匮乏的情况下N端可向除M1以外的其他SODA功能域转移金属离子并维持其活性和稳定性。

6. 重组超氧化物歧化酶稳定性测定

测定SOD对酸碱的耐受性，将纯化的SOD分别置于25℃下pH3-10的缓冲液中温育90min后，用上述标准反应（pH 7.8，25℃）测定SOD的剩余活性。将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同pH条件下SOD的剩余酶活性与最高酶活性的比值。缓冲液分别为50mM柠檬酸钠（pH3.0-8.0），50mM Tris-Hcl（pH8.0-9.0），50mM甘氨酸-氢氧化钠（pH9.0-10.0）。

测定抑制剂、清洁剂和变性剂对SOD活性的影响，将纯化的SOD分别置于终浓度为1mM或10mM的变性剂（乙二胺四乙酸（EDTA）和β-巯基乙醇（β-ME））、0.1%(w/v或v/v)或1%(w/v或 v/v)的清洁剂（十二烷基磺酸钠（SDS））和2.5M的变性剂（尿素和盐酸胍）中，25℃保温30分钟，用上述标准反应（pH 7.8，25℃）测定SOD的剩余活性。将不加变性剂、清洁剂、变性剂的反应作为对照，测得的酶活力定义为100%。分别计算不同条件下SOD的剩余酶活性。

抗逆性实验证明N端对SOD的稳定性起到了一定的保护作用，我们推测N端的主要作用依然是在金属离子饥饿的情况下向SODA功能域转移金属离子，从而保证SOD能够正常行使功能。

结论：N端氨基酸序列添加到SODA-BSn5的N端，可以显著提高常温SOD的稳定性和抗逆性。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> Paenibacillus polymyxa M1

<400> 1

Met Leu Ser Thr Tyr Gly Ser Phe Leu Pro Leu Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Arg His Trp Lys Gln Gln Glu Ser Trp His Val Glu Val Ile Lys

20 25 30

Ser Ala Thr Glu Gly Leu Glu Pro Ala Tyr Val Arg Leu Leu Asp Asp

35 40 45

Trp Arg Thr Val Phe Glu Gln Thr Glu Arg Ala Ala Ile Glu Leu Leu

50 55 60

Glu Glu Gln Arg Ser Ala Leu Asp Pro Val Glu Gln Ala Trp Gln His

65 70 75 80

Gln Glu Lys Lys Ala Ser Ser Ala Pro Gln Ala His Thr His Gln Leu

85 90 95

Asp Glu Ser Ser Ala His Ser Arg Gly Ser Asp Ala Ser Ala Thr Gly

100 105 110

Glu Lys Pro Leu Ser Glu Ser Gly Leu Asn Ser Gln Pro Ala Ser Gln

115 120 125

Glu Leu Asn Arg Arg Leu Asp Asp Leu Leu Gln Thr Ala Asn Arg Gln

130 135 140

Ser Gln Glu Tyr Val Arg Gln Leu Gly Leu Leu Thr Glu His Ser His

145 150 155 160

Ala Leu Arg Gln Gln Pro Lys Ser Ala Gly Val Val Ile His Ala Ala

165 170 175

His Glu Ser Gln Tyr Phe Leu Ile Ser Thr Thr Pro Phe Gln Glu Pro

180 185 190

Gly Ser Ile Ala Arg Ala Thr Gly Leu Tyr His Val Ala Ala Glu Gly

195 200 205

Glu Asp Tyr Pro Glu Gln Ala Phe Arg Glu Arg His Ala Ser Met Arg

210 215 220

Gly Glu Gly Ser Gly Ala Thr Lys Gly Val Gln Ser Gly Gln Thr Gln

225 230 235 240

Pro Ser Ala Ala Glu Lys Ser Leu Val Gly Arg Pro Val Pro Ile Gly

245 250 255

Gly

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> Paenibacillus alvei A6-6i-x

<400> 2

Met Gln Leu Ile Tyr Gly Pro Leu Met Pro Val Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ser Ala Tyr Trp Lys Gln Gln Glu Lys Lys His Thr Glu Val Ile Arg

20 25 30

Ala Ile Val Pro Gln Leu Glu Pro Glu Tyr Val Gln Leu Leu Ala Gln

35 40 45

Trp Glu Gln Val Leu Ser Gln Thr Glu Asp Ala Ala Arg Gly Gln Leu

50 55 60

Arg Thr Ala Leu Gln Gln Pro Asp Val Leu Gln Pro Asp Gln Leu Gln

65 70 75 80

Gln Leu Gln Glu Leu Leu Arg Ala Ser Val Tyr Gln Ser Glu Gln Phe

85 90 95

Val Gln Gln Leu Asp Ala Ile Lys His Asn Ser Gln Ala Val Gln His

100 105 110

Thr Glu His Ala Pro Val Val Phe Asp His Ile Thr Glu Arg Ser Gln

115 120 125

Tyr Phe Leu Lys Ala Ile Lys Pro Val Phe Tyr Pro Ala Val Asp Pro

130 135 140

Pro Gly Ser Asn His Asn Thr Arg Ser Asn Ser Ser Ser Ser Pro Pro

145 150 155 160

Ala Arg Ile His Ala Ala Gly Asn Glu Pro Ser Ser His Trp Pro Gln

165 170 175

His Gln Tyr Gln Pro Gln Gln His Gln Tyr Pro Tyr Pro Gln Gln Ser

180 185 190

Ile Gln Gly Ile His Ala His Ile Gly Asn Thr Arg Ser Ala Gln Pro

195 200 205

Glu Gln Asp Asp Glu Thr Asp Gly Glu Ser Phe Val Pro Ile Gly Gly

210 215 220

<210> 3

<211> 226

<212> PRT

<213> Paenibacillus alvei DSM 29

<400> 3

Met Gln Leu Ile Tyr Gly Pro Leu Met Pro Val Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ser Thr Tyr Trp Lys Gln Gln Glu Lys Arg Asn Thr Glu Val Ile Arg

20 25 30

Ala Ala Val Pro Gln Leu Glu Pro Glu Tyr Val Gln Leu Leu Ala Gln

35 40 45

Trp Glu Gln Val Leu Ser Gln Thr Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gln Leu

50 55 60

Arg Thr Ala Leu Gln Arg Pro Asp Ala Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln

65 70 75 80

Gln Leu Gln Glu Leu Leu Arg Ala Ser Val Tyr Gln Ser Glu Gln Phe

85 90 95

Val Gln His Leu Glu Ala Ile Lys His Ser Ser Gln Ala Val Gln Leu

100 105 110

Thr Glu His Ala Pro Val Val Leu Asp His Ile Ala Glu Arg Ser Gln

115 120 125

Tyr Phe Leu Gln Ala Ile Lys Pro Val Phe Tyr Pro Ala Gln Glu Gln

130 135 140

Gly Ser Ser Ser Pro Val Arg Ser Ser His Asn Thr Glu Pro Pro Ala

145 150 155 160

Arg Ile His Ser Thr Asp Val Asn Glu Pro Ser Ser Asn Trp Pro Pro

165 170 175

Tyr Pro Pro His Gln His Gln Gln Tyr Pro Gln His Gln His Gln Gln

180 185 190

Tyr Ser Met Gln Gly Ile His Ala Phe Ile Gly Asn Ser Arg Ser Ser

195 200 205

Gln Phe Glu His Ser Glu Glu Ser Asp Asp Glu Ser Phe Val Pro Ile

210 215 220

Gly Gly

225

<210> 4

<211> 226

<212> PRT

<213> Paenibacillus alvei TS-15

<400> 4

Met Gln Leu Ile Tyr Gly Pro Leu Met Pro Val Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ser Ala Tyr Trp Lys Gln Gln Glu Lys Lys His Thr Glu Val Ile Arg

20 25 30

Ala Ile Val Pro Gln Leu Glu Pro Glu Tyr Val Gln Leu Leu Ala Gln

35 40 45

Trp Glu Gln Val Leu Ser Gln Thr Glu Asp Ala Ala Arg Gly Gln Leu

50 55 60

Arg Thr Ala Leu Gln Gln Pro Asp Val Leu Gln Pro Asp Gln Leu Gln

65 70 75 80

Gln Leu Gln Glu Leu Leu Arg Ala Ser Val Tyr Gln Ser Glu Gln Phe

85 90 95

Val Gln Gln Leu Asp Ala Ile Lys His Asn Ser Gln Ala Val Gln His

100 105 110

Thr Glu Gln Ala Pro Val Val Phe Asp His Ile Thr Glu Arg Ser Gln

115 120 125

Tyr Phe Leu Asn Ala Ile Lys Pro Val Phe Tyr Pro Ala Val Glu Ser

130 135 140

Pro Gly Ser Asn Asn Asn Thr Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro

145 150 155 160

Val Arg Ile His Ala Ala Gly Asn Glu Pro Ser Ala His Trp Pro Gln

165 170 175

His Gln Tyr Gln Pro Gln Gln His Gln Tyr Pro Tyr Gln Gln Gln Ser

180 185 190

Ile Gln Gly Ile His Ala His Ile Gly Asn Thr Arg Ser Ala Gln Pro

195 200 205

Glu Gln Glu Gln Asp Asp Glu Thr Asp Gly Glu Ser Phe Val Pro Ile

210 215 220

Gly Gly

225

<210> 5

<211> 281

<212> PRT

<213> Paenibacillus assamensis

<400> 5

Met Leu Leu Ile Tyr Gly Pro Tyr Met Pro Ile Arg Ile Leu Glu Ala

1 5 10 15

Ile Gln Asp Trp Lys Asn Gln Glu Lys Glu His Ala Val Leu Ile Arg

20 25 30

Ser Val Val Pro Glu Leu Glu Pro Ser Phe Ser Gln Val Leu Thr Glu

35 40 45

Trp Glu His Val Phe Ala Lys Thr Glu Glu Thr Ala Arg Gly Trp Leu

50 55 60

His Asn Cys Ile Ser Ser Asp Thr Arg Trp Asp Asn Ser Leu Leu Thr

65 70 75 80

Gln Ile Asp Gln Leu Leu Gly Ala Ser Val Gln Gln Ser Glu His Phe

85 90 95

Ile Gln Gln Leu Glu His Ile Lys Gln Tyr Ser Gln Ala Val Arg Tyr

100 105 110

Thr Ser Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala His Val Val Arg Glu Ser Tyr

115 120 125

Val Phe Val Ser Val Thr Lys Ser Leu Thr Ser Thr Pro Leu Ala Glu

130 135 140

Ala Gln Ala Asn Ala Ala Ala Tyr Gly Gln Gly Pro Ala Ala Ala Tyr

145 150 155 160

His Ser Ala Ala Val Arg Pro Asn Asp Val Thr Ala Ala Ile Gly Ser

165 170 175

Arg Pro Ala Gln Ser Gln Ala Cys Ala Ala Gly Glu Ala Ile Pro Pro

180 185 190

Gln Ser Glu Arg Pro Pro Asn Gly Ala Gly Ala Met Gln His Gly Thr

195 200 205

Ala His Ala Pro His Ala Ala Ala Leu Gln His Gly Ser Pro Tyr Ser

210 215 220

Pro Gln Ala Ala Ala Ser Gln His Asn Ser Pro Tyr Ser Pro Gln Gly

225 230 235 240

Ser Pro Tyr Ala Pro Gln Thr Ala Ala Ser Ala Gln Pro Ala Ala Ala

245 250 255

Ser Glu Pro Gln Leu Arg Gln Ala Ala Pro Glu Glu Ala Arg Pro Ala

260 265 270

Asp Asn Val Tyr Val Pro Pro Gly Gly

275 280

<210> 6

<211> 272

<212> PRT

<213> Paenibacillus barengoltzii

<400> 6

Met Leu Phe Val Tyr Gly Pro Phe Leu Pro Val Arg Ile Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Arg Phe Trp Lys Gln Gln Glu Ala Glu His Thr Glu Val Ile Gln

20 25 30

Ala Ile Val Pro Ser Leu Glu Ala Asp Tyr Val Lys Leu Leu Glu Glu

35 40 45

Trp Lys Pro Ile Phe Glu Arg Thr Glu Ala Ala Ala Asp Lys Leu Leu

50 55 60

Gln Tyr Ala Leu Ala Thr Pro His Ala Ala Thr Ser His Glu Val Ile

65 70 75 80

Arg Gln Thr Glu Arg Leu Leu Arg Ala Ser Cys Gln Gln Ser Gln Glu

85 90 95

Phe Ile Arg His Leu Glu Tyr Met Leu Lys His Ser Ala Ala Val Lys

100 105 110

Ser Val Pro Leu Ala Pro Val Val Leu Leu His Ile Ile Arg Glu Ser

115 120 125

Ala Tyr Phe Leu Glu Val Leu Glu Arg Leu Asn Arg Pro Gly Glu Ile

130 135 140

Ala Gly Ser Met Ala Ala Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Pro Tyr His Ala

145 150 155 160

Ala Gly Ala Gln Pro Phe Tyr Arg Glu Glu Glu Ala Gln Glu Leu Ala

165 170 175

Ala Pro Pro Thr Ser Glu His Pro Glu Leu Thr Asp Asp Ala Ser Pro

180 185 190

Ala Ile Thr Asp Glu Leu Asn Arg Phe Glu Thr Ser Glu Val Ala Asn

195 200 205

Pro Pro Glu Glu Pro Asp Gly Ile Glu Thr Ala Asp Ile Ser Glu Ala

210 215 220

Ser Leu Glu Val Glu Ala Glu Gln Glu His Lys Gln Glu Glu Gln Glu

225 230 235 240

Gln Asp Glu Leu Ser Leu Arg Gln Glu Pro Ser Ala Asp Asp Asn Thr

245 250 255

Glu Thr Thr Thr Ala Arg Val Pro Glu Arg Ser Val Pro Ile Gly Gly

260 265 270

<210> 7

<211> 200

<212> PRT

<213> Paenibacillus curdlanolyticus YK9

<400> 7

Met Leu Phe Val Tyr Gly Pro Gln Thr Pro Ile Arg Leu Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Arg Asp Trp Lys Arg Gln Glu Ile Glu His Ala Ala Met Ile Arg

20 25 30

Arg Phe Thr Pro Thr Leu Glu Pro Glu Phe Lys Trp Leu Leu Asn Glu

35 40 45

Trp Glu Gln Pro Leu Arg Ala Ala Glu Arg Val Ala Asp Arg Cys Leu

50 55 60

Asn Glu Ala Leu Thr Arg Ser Asp Asn Ala Gly Asp Gly Ser Ser Ser

65 70 75 80

Ala Met Thr Gln Ala Gln Ala Asp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Tyr

85 90 95

Gln Ser Gln Lys Leu Val Glu His Leu Leu His Leu Met Glu Arg Ser

100 105 110

Ala Ser Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Arg Ser Phe Ile Leu His Ala

115 120 125

Val Arg Glu Ser Asn Gly Phe Leu Gly Leu Gln Glu Thr Tyr Arg Tyr

130 135 140

Ser Tyr Ser Pro Glu Gln Ala Leu Ala Gln Ser Ala Glu Ala Leu Arg

145 150 155 160

Asn Ala Asp Arg Ser Ser His Ala Gly Thr Gln Asp Ile Ala Asn Ala

165 170 175

Gly Asp Asp Pro Gln Gly Gly Ser Asp Ala Asp Ala Asp Arg Ala Pro

180 185 190

Val Ala Gln Val Pro Ile Gly Gly

195 200

<210> 8

<211> 212

<212> PRT

<213> Paenibacillus daejeonensis

<400> 8

Met Thr Gln Val Gln Glu Gln Ser Glu Ser Gln Arg Arg Leu Glu Gln

1 5 10 15

Ile Glu Arg Trp Lys Arg Arg Glu Glu Glu Gln Thr Ala Gln Leu Leu

20 25 30

Gln Val Leu Pro Gln Leu Glu Pro Pro Leu Ile Ser Val Leu Gln Glu

35 40 45

Trp Arg Pro Ile Leu Arg Leu Thr Ser Arg Tyr Ala Ala Asp Trp Gln

50 55 60

Gln Thr Arg Pro Phe Gln Ser Ala Arg Pro Glu Pro His Thr Glu Ile

65 70 75 80

Gln Val Glu Trp Leu Thr Ser Glu Ala Val Arg Gln Thr Glu Glu Trp

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Ser Arg Gln Leu Gly Val Leu Leu Gln His Ser Arg Ala Leu Ala Ala

100 105 110

Asp Pro Glu Ala Ser Glu Leu Val Arg Gln Phe Ile Arg Glu Ser Gln

115 120 125

Glu Thr Ile Gly Val Gln Phe Thr Ala Asp Pro Ala Ala Pro Pro Thr

130 135 140

Phe Ala Ala Ile Glu Gln Tyr Glu Glu Glu Asn Arg Thr Ile Asp Gly

145 150 155 160

Asp Thr Pro Ser Pro Asp Lys Pro Val Asn Ser Ala Glu Ala Asp Gly

165 170 175

Glu His Ser Arg Ala Glu Glu Glu Pro Pro Asn Ala Pro Asp Met Asn

180 185 190

Gly Gly Ala Val Gly Thr Asp Asn His Met Ser Asp Asp Lys Pro Val

195 200 205

Pro Ile Gly Gly

210

<210> 9

<211> 159

<212> PRT

<213> Paenibacillus darwinianus

<400> 9

Met Leu Phe Val Asp Gly Pro Tyr Val Gln Leu Arg Leu Leu Glu Glu

1 5 10 15

Leu Gln Ser Trp Lys Lys Arg Glu Lys Glu His Ala Ala Val Leu Arg

20 25 30

Ala Ile Ser Pro Gly Ser Asp Pro Gly Phe Val Arg Thr Leu Glu Glu

35 40 45

Trp Glu Ser Val Phe Ala Asp Thr Glu Arg Cys Ala Glu Trp Trp Leu

50 55 60

Asn Ala Ser Leu Glu Arg Pro Gly Leu Leu Pro Ala Ser Ala Gly Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ala Ala Leu Val His Ala Ala Arg Ala Gln Ser Glu Ala Phe

85 90 95

Val Arg Gln Leu His Asp Tyr Arg Thr His Ser Ala Asp Leu Arg Ala

100 105 110

Ala Pro Val Thr Ser Val Ile Ile Gly Leu Met Leu Arg Glu Ser Gln

115 120 125

Tyr Leu Leu Asp Arg Ser Val Gly Phe Asp Ala Leu Gln Gly Glu Arg

130 135 140

Gly Glu Ala Arg Ala Arg Pro Pro Ala Ala Val Pro Val Gly Gly

145 150 155

<210> 10

<211> 296

<212> PRT

<213> Paenibacillus dendritiformis C454

<400> 10

Met Glu Tyr Ile Tyr Gly Ser Leu Met Pro Val Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Val Phe Trp Lys Lys Gln Glu Arg Glu His Ile Glu Val Ile Leu

20 25 30

Ala Ile Val Pro Gln Leu Glu Pro Glu Tyr Val Gln Val Leu Arg Glu

35 40 45

Trp Glu Pro Val Phe Thr Lys Thr Glu Glu Ala Ala Ser Ala Trp Leu

50 55 60

Gln Phe Ile Leu Ser Gln Gly Gly Ser Thr Pro Ser Asp Thr Met His

65 70 75 80

Lys Ile Glu Leu Leu Leu Lys Ala Ser Val Tyr Gln Ser Glu Gln Phe

85 90 95

Val Lys His Leu Glu Thr Met Lys Gln Tyr Ser Arg Ala Val Gln Ser

100 105 110

Val Pro Leu Ala Pro Ile Val Phe Asp His Ile Ala Ser Glu Ser Val

115 120 125

Tyr Phe Leu Asn Val Val His Ala Leu Lys Asp Lys Pro Leu Ser Ser

130 135 140

Phe Ala Pro Pro Asp Ala Pro Gly Ala His Ala Val Gln Pro Lys Ala

145 150 155 160

Phe Ile His Glu Ala Pro Pro Val Asp Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala

165 170 175

Pro Ala Glu Ala Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Tyr Asp Ser Glu Ser Glu

180 185 190

Glu Asp Ser His Ser Pro Ala Ala Thr Ala Pro Gln Ser Pro Ala Pro

195 200 205

Gly Ile Leu Ala Tyr Ile Gly Ser Ala Gln Thr Pro Gln Ala Ala Gln

210 215 220

Ala Ala Gln Ala Ala Gln Gly Ile Gln Pro Val Gln Pro Val Gln Glu

225 230 235 240

His Gly Glu Ala Arg Ser Ser Arg Glu Asp Ala Pro Phe Gly Ser Leu

245 250 255

Pro Tyr Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Leu Pro Glu Gly Trp Pro Ala Gly

260 265 270

His Pro Gln His Gln Pro Pro Val Pro Glu Tyr Tyr Leu Arg Ala Glu

275 280 285

Pro Ala Ser Val Pro Ile Gly Gly

290 295

<210> 11

<211> 210

<212> PRT

<213> Paenibacillus ehimensis

<400> 11

Met Leu Tyr Val Tyr Gly Ser Leu Met Pro Leu Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Arg Phe Trp Lys Met Gln Glu Arg Glu His Thr Val Val Ile Arg

20 25 30

Glu Leu Val Pro Lys Leu Glu Pro Glu Tyr Ala Ala Leu Leu Gln Gln

35 40 45

Trp Glu Gly Val Leu Ala Gln Thr Glu Ala Ala Ser Gln Gln Trp Ile

50 55 60

Glu Ala Val Leu Arg Thr Lys Pro Pro Val Gly Pro Tyr Ile Ile Asp

65 70 75 80

Lys Val Asn Glu Leu Leu Tyr Ala Ser Ile Ala Gln Ser Gln Glu Phe

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Phe Leu Ile Leu Glu Arg Ser Arg Pro Val Arg Ala

100 105 110

Asn Pro Val Val Gln Thr Val Phe Met His Ile Ile Arg Glu Ser Glu

115 120 125

Tyr Phe Leu Gly Val Leu His Ala Val Gln Asn Thr Pro Glu Gly Tyr

130 135 140

Glu Glu Phe Arg Ala Glu Glu Glu Ala Asp Pro Ser Thr Gln Thr Arg

145 150 155 160

Ala Pro Asp Glu Glu Gln Ala His Ile His Leu Trp Arg Ser Glu Ser

165 170 175

Glu Ser His Pro Val Asp Leu Asn Gln Leu Thr Ala Thr Gln Glu Gly

180 185 190

Thr Trp Ser Gly Glu Arg Pro Pro Ser Pro Tyr Ala Arg Pro Val Pro

195 200 205

Ile Gly

210

<210> 12

<211> 206

<212> PRT

<213> Paenibacillus elgii

<400> 12

Met Leu Tyr Val Tyr Gly Ser Leu Met Pro Leu Arg Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Arg Phe Trp Lys Thr Gln Glu Arg Glu His Thr Val Val Ile Arg

20 25 30

Glu Leu Val Pro Thr Leu Glu Pro Glu Tyr Ala Ala Leu Leu Gln Gln

35 40 45

Trp Glu Gly Val Leu Ala Gln Thr Glu Ser Ala Ser Gln Gln Trp Ile

50 55 60

Glu Ala Val Leu Arg Ala Lys His Pro Val Ser Pro Tyr Ile Ile Asp

65 70 75 80

Lys Val Asn Glu Leu Leu Tyr Ala Ser Ile Ala Gln Ser Lys Glu Phe

85 90 95

Ile Arg His Leu Phe Leu Ile Leu Glu Arg Ser Arg Pro Val Arg Ala

100 105 110

Asn Pro Val Val Gln Thr Val Phe Leu His Ile Ile Arg Glu Ser Glu

115 120 125

Tyr Phe Leu Gly Val Leu His Ala Val Gln Ser Ser Glu Cys Tyr Glu

130 135 140

Glu Pro Arg Asp Glu Glu Ala Ala Glu Thr Arg Ser Pro Gly Glu Glu

145 150 155 160

Gln Ala His Ile His Leu Trp Arg Gly Glu Ser Glu Ser Ala Pro Val

165 170 175

Asp Leu Asn Gln Leu Thr Ala Thr Gln Glu Gly Thr Trp Thr Gly Asp

180 185 190

Arg Pro Gln Ala Pro Phe Ser Lys Pro Val Pro Ile Gly Gly

195 200 205

<210> 13

<211> 229

<212> PRT

<213> Paenibacillus fonticola

<400> 13

Met Leu Leu Val Tyr Gly Pro Tyr Leu Pro Val Arg Ile Leu Glu Glu

1 5 10 15

Ile Arg Phe Trp Lys Gln Gln Glu Ala Glu His Thr Asp Val Ile Lys

20 25 30

Ala Ile Val Pro Gly Leu Glu Pro Tyr Tyr Val Gln Leu Leu Asn Asp

35 40 45

Trp Lys Arg Val Phe Glu Glu Thr Thr Leu Ala Ala Asn Gln Leu Leu

50 55 60

Gln Tyr Ala Thr Ser Ser Gln His Ala Ala Cys Asp Pro Lys Leu Ile

65 70 75 80

His Glu Thr Glu Lys Leu Leu Asn Thr Ala Phe Arg Gln Ser His Glu

85 90 95

Phe Val Arg Gln Leu Tyr Thr Ile Leu Asp Cys Ser His Ala Val Lys

100 105 110

Ala Val Pro Leu Ala Lys Thr Val Leu Leu His Ile Ile Arg Glu Ser

115 120 125

Glu Tyr Phe Leu Gly Val Leu Glu Thr Leu Asn Ser Pro Gly Ala Ile

130 135 140

Lys Arg Asn Ser Glu Gln Phe Pro Ser Thr Pro Asp Leu Gln Gln Ile

145 150 155 160

Ala Gly Asp Pro His Gln Leu Leu Gly Asn Gly Phe Pro Asp Ser Ser

165 170 175

Pro Asp Leu Ser Asp Phe Gly Pro Asp Phe Asp Ser Lys Pro Arg Thr

180 185 190

Glu Pro Trp Ser Glu Ser Trp Ser Glu Pro Lys Leu Lys Ile Ala Ala

195 200 205

Tyr Glu Glu Glu Met Thr Ile Asn Asp Asn Arg Asp Lys Asp Asp Ala

210 215 220

Val Pro Ile Gly Gly

225

Claims

1.一组可提高包含特殊N端金属离子结合结构域的SOD氨基酸序列，其特征在于它是来源于属Paenibacillus的13个特殊Fe/Mn-SOD的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1-13所示。

2.一组可提高包含特殊N端金属离子结合结构域的SOD氨基酸序列在用于金属离子匮乏的情况下维持SOD较好的活性和稳定性方面的应用。

3.权利要求1所述的一组可提高SOD活性和稳定性的N端氨基酸序列，其特征在于：

（1）这组N端氨基酸序列相互之间具有75-100%的同源性；

（2）这组N端氨基酸序列都包含特殊的金属离子结合结构域。

4.权利要求3所述的一组可提高SOD活性和稳定性的N端氨基酸序列，其中所述N端多肽序列具有与SEQ ID NO:1-13所示的氨基酸序列至少70%的同源性；SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有对所有Paenibacillus属的Fe/Mn-SOD的活性和稳定性具有决定性作用，此外，利用此N端序列改造枯草芽孢杆菌B. subtilis BSn5的Mn-SOD后，其活性和稳定性均得到较好的提升。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的一组可提高SOD活性和稳定性的氨基酸序列，其特征在于，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它SOD，通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的一组可提高SOD稳定性和活性的氨基酸序列，其特征在于将编码N端氨基酸序列的核苷酸与编码其它SOD或sodA功能域的核苷酸连接后经过克隆表达重组SOD，可显著提高SOD的稳定性和活性。

7.权利要求1所述的SEQ ID NO:1-13氨基酸序列在提高SOD的活性、稳定性方面的应用。