CN116987158A - 具有抗氧化活性的功能蛋白及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组具有抗氧化活性的功能蛋白及应用，其氨基酸序列如SEQ ID No:1‑18中任一所示，由SEQ ID No:1‑18中任一所示氨基酸序列编码得到的功能蛋白具有类似超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的功能，可以通过清除自由基来用于实现细胞水平和动物水平的抗氧化、抗衰老功效果。功能蛋白属于天然抗氧化剂，安全性高，副作用小，并具有较高抗氧化活性，且热稳定性佳，pH适合范围广，兼容性高，适合用作抗氧化添加剂，加入到医药、化妆品、保健品、食品或饲料中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一组具有抗氧化活性的功能蛋白及应用。
背景技术
天然抗氧化剂是一类具有清除自由基、抑制脂质过氧化以及螯合金属离子等作用的生物活性蛋白，具有抗氧化、抗衰老功效，可用于防治疾病、延缓衰老和延长食品保质期。天然抗氧化剂在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面应用前景广阔，与在市面上用于食品、药品以及化妆品和饲料的工业合成的添加剂相比，其安全性和效用都很高，使之成为当前国际的热门研究课题，筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为食品科学、生物学、医学等研究的新趋势。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一组具有抗氧化活性的功能蛋白及应用。
本发明采用的技术方案是：具有抗氧化活性的功能蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1-18中任一所示。
一种抗氧化剂，包括一种或多种具有抗氧化活性的功能蛋白。
具有抗氧化活性的功能蛋白在抗氧化剂中的应用。
优选地，抗氧化剂包括如序列SEQ ID No:1-18的氨基酸序列编码得到一种或多种功能蛋白的混合物。
优选地，应用于食品、保健食品、化妆品、药物或饲料中。
优选地，应用于含有甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO、甘油正已烷、Tween、Triton X-100、SDS、PMSF、EDTA、β-ME、DTT、GdmHCl和尿素中的一种或多种成分的产品中。
本发明具有的优点和积极效果是：具有抗氧化活性的功能蛋白属于天然抗氧化剂，具有较高安全性，同时具有较高的抗氧化效果；能够通过清除自由基来用于实现细胞水平和动物水平的抗氧化、抗衰老功效，在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面应用前景广阔。
附图说明
图1为具有抗氧化活性的功能蛋白在BL21(DE3)表达的SDS-PAGE分析图；
图2为本发明实施例2中功能蛋白ID(1)-(18)的SOD活力测定原始图；
图3为本发明实施例2中功能蛋白ID(1)-(18)的CAT活力测定原始图；
图4为本发明实施例2中功能蛋白ID(1)-(18)的POD活力测定原始图；
图5为本发明实施例3中功能蛋白ID(18)在不同温度(60-100℃)下处理10小时后的SOD活力测定折线图；
图6为本发明实施例3中功能蛋白ID(18)在不同pH值(pH2.0-9.0)下处理2小时和10小时后的SOD活力测定柱形图；
图7为本发明实施例3中功能蛋白ID(18)在不同浓度的不同化学试剂溶液中处理10后的SOD活力测定柱形图；
图8为本发明实施例3中功能蛋白ID(18)在30-70％乙醇溶液中处理24小时和72小时后的SOD活力测定柱形图和蛋白浓度柱形图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例做出说明。
本发明提供一组具有抗氧化活性的功能蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo:1-18中任一所示。
SEQ ID NO.1
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EEYLLVIKYLKKREVP
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DHMAREECYYLMKIAESTN
SEQ ID NO.5
DVFVERSLDEIRFWSRIMKEHSLFLKLGFNCDDTKLINEADRFYSIFEDIENRA
HSFSPDVDPQRIYDFNQVVYNAVSHIWAYKRHVLGLIIRCKIGGNNFPLLVDH
VSREAAYFRNRLEQLNT
SEQ ID NO.6
PLPDAVINENVFFLRIMADHAKFINHLLDPSERKLVEQARDFSHDFDQLLFQA
QDLDSMRPQSQTQPLLDQFVDQNRVSVRQLRDFKKTARDLIEECRIKSIIPPLL
ADHVFREASHFLEILDSFEMALTSSKC
SEQ ID NO.7
MLSSINFIRQSLELHLFFGRIMKEHSFFLEAGFTPKNSRFIDEADDFRRAFDRFL
ADVISLSNGVSLAVDNPVLERRVYILNERSQELIRALIQFKARILSDVISCRIFTV
NYPLLIDHIMREAKFYFSIVQRLQNREE
SEQ ID NO.8
INLEQEAYEQETFWNRIMAEHSKFIRGLLDPTEEQLINTANNFGNEFDELTKEA
KAAMDKTIPISKVTDDSLKATTEISKFKAQGTQGLVECKIRSIIIPLLGDHTLRE
ANHYLRLLKIFQKSA
SEQ ID NO.9
MSDPLYEHRFWLQILGDHCRFIFTALSPKEKGDIATAESLMATFDMLLGEARRP
DASTFIAKLTNDAYNATYELREFKLNLLERQLAGKIDLLLTPSFVNHMVNELE
EYLRILQALQEGKGVP
SEQ ID NO.10
LFHPLHYDMVWLQDAFGHAASLAADLDFAEKPLIAKSLAFQKDFEGFYLKAV
EMTGYLRTHLKDFPALRKFHADIDLEMRVFMHFLAELEEFELRGEVLDRINPL
MPDHMYREECYYLSKLAALGE
SEQ ID NO.11
VMFVERSLNEIRFWSRIMKEHSFFLRLGFRCEDTQLIEEANQFYRLFEHIEQIA
HSYTNETDPEQIKRFNSEVQQAATNIWGFKRKILGLILTCKLPGQNNFPLLVDH
TSREADYFRKRLI
SEQ ID NO.12
LPDAIIKENVFFLRIMADHAKFIGHLLDPSERKLVDTARNFSNDFDELMYQAID
LESMKPQSQTVPLLDQFLDQNRVSVASLRDFKKTARDLIEQCKIKSIIHPLLAD
HVFREADRFLEIIDMFDVHLTNIQSQPRY
SEQ ID NO.13
MPLRVLEEIRFWKMQEKEHTVVIRELVPTLEPQFVLLMQQWEGVFAQTEAVS
GQLIEAVVRSHPPISPYLSAQIQQLLYISIRQSREFVNQLFNLMKQSQPVRSNPV
IQTVVMHIIRESEYFIGVLHAASPG
SEQ ID NO.14
MNQFTCVFNELQLWSHISSDHPIFLKTVASLSNIKLPKPIVDGLNNIHNAFLKLY
NNAVQLKKSTSTNPAQYTMHIKKLIDEFIYYDTRALSFYPQLLTFAKANKAWQ
ELVRHIINEQAFMLELFKNLRQQIR
SEQ ID NO.15
QFACIFNELELWTHISSEHPTFLKTVASLSKINLPKSAVDKLDDIHKRFLGLYND
VVYLKKALRANPMLYYQSIGNIKRIINKFMFYDTQALSFYPELLEFGKENKV
WQELVNHIIHEQNFMLELFKNLILQIG
SEQ ID NO.16
DKMPLRILDEGEFWKLQEAEHTEVIQALVPNLEPQFVQALKAWEQALSRTQA
TFVQYIETVVRGGKELNQQFYTQVMQLVQFAAEQSKQFIKLLNQLGTESQAL
KQNATAVVVLNHIRRESEYFIGISNALLYQQ
SEQ ID NO.17
MPLRILDEIEFWKHQEEEHTVVIRELVSGLEARYVDALKKWEEALSVTHQQA
VRYIESVIRVGYYVPEQLYQQVLHFVSFCLQQSLQFIELCRQVKTKSAAVAQNP
TAKVVLDHIIRESEYFIGIAQLLLYGTQTAP
SEQ ID NO.18
MGSFLPLRVLEEIRHWKQQESWHVEVIKSATEGLEPAYVRLLDDWRTVFEQT
ERAAIELLEEQRSALDASQELNRRLDDLLQTANRQSQEYVRQLGLLTEHSHAL
RQQPKSAGVVIHAAHESQYFLISTTPFQEPG
由SEQ ID No:1-18中任一所示氨基酸序列编码得到的功能蛋白具有类似超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的功能，可以通过清除自由基来用于实现细胞水平和动物水平的抗氧化、抗衰老功效果。功能蛋白中的一种或多种的混合物能够用作抗氧化添加剂，加入到医药、化妆品、保健品、食品或饲料中。
具有抗氧化活性的功能蛋白包含保守蛋白结构域家族DUF2935(NCBI ID:pfam11155)的氨基酸序列，来源于Firmicute门的18个具有特殊结构域的金属蛋白的氨基酸序列，序列长度为118-139个氨基酸，每个结构域由四个α螺旋组成，两个结构域之间存在相同的功能域。
制备具有抗氧化活性的功能蛋白时，先根据氨基酸序列如SEQ ID No:1-18所示功能蛋白的DNA序列设计带有限制性酶切位点的特异引物，并扩增目的基因，经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体中，构建重组质粒；将重组质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组工程菌；对重组工程菌诱导培养，分离纯化后得到具有抗氧化活性的功能蛋白。本发明所涉及的具有抗氧化活性的功能蛋白，属于天然来源的保守蛋白结构域家族的功能蛋白，具有较高安全性；进一步的，对其抗氧化活性进行了研究，发现其同时具有较高的抗氧化活性。
下面结合具体实施例对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：具有抗氧化活性的功能蛋白的克隆、表达和纯化
以氨基酸序列如SEQ ID No:1-18所示功能蛋白的DNA序列为模板，设计带有限制性酶切位点的特异引物，并扩增目的基因，引物信息如表1所示；扩增得到的基因片段经双酶切后连接于经相同酶切处理后的质粒载体pET28a中，构建得到重组质粒，测序验证后依次命名为p2935(1)-(18)。
表1
经化学转化法将质粒p2935(1)-(18)分别转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，经筛选，获得高产2935(1)-(18)的菌株。将制备得到的重组菌2935(1)-(18)挑取单克隆菌斑进行液体培养和诱导，收集菌体，超声破碎和离心诱导后提取得到粗蛋白，利用亲和层析Ni柱将其纯化，再采用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证目的蛋白，结果如图1所示。理论上推算蛋白ID(1)-(18)的分子量约为16.3～17.5kD，与SDS-PAGE检测结果一致。
实施例2：具有抗氧化活性的功能蛋白的体外抗氧化活性测定
将实施例1制备得到的纯化后的功能蛋白ID(1)-(18)定量后，分别进行抗氧化酶酶活力测定，包括超氧化物歧化酶(SOD)活力测定、过氧化氢酶(CAT)活力测定、过氧化物酶(POD)活力测定、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力测定，检验其对常见自由基底物的清除能力。
2.1超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
SOD活性采用Fridovich的氮蓝四唑还原法测定，总反应体系3ml，组分依次为13mML-甲硫氨酸、63mM氮蓝四唑、1.3mM核黄素、10mM EDTA-Na、50mM PBS(pH 7.8)，样品加入10μL。避光保存一管测吸光值时用于调零。阳性对照用SOD，阴性对照用PBS。样品和空白对照在25℃光照15min后于560nm波长下测定吸光值。
2.2过氧化氢酶(CAT)活力测定
CAT活性采用紫外吸收法测定，H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢生成氧气和水，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低，肉眼可观察到气泡产生。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。总反应体系3ml，在100mMPBS(pH7.8)中依次加入200μL样品、300μL 100mM H2O2，每加完一管立即用酶标仪测定240nm处各孔吸光度，每隔1min读数1次，共测4次，待全部测定完毕后，计算酶活力。阳性对照组用CAT，阴性对照用PBS。
2.3过氧化物酶(POD)活力测定
POD活性采用TMB检测法测定，TMB在过氧化物酶存在条件下，能被过氧化氢氧化生成明亮的蓝色物质，已知该有色物质于波长655nm下有最大吸收峰。将0.8mM TMB、1mM H2O2和100μg/mL样品在醋酸缓冲液中室温移液混合，并在时间扫描模式下立即测量反应混合物在652nm处的吸光度变化，以评估POD活性(n＝3)。阳性对照用POD，阴性对照用PBS。
2.4谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力测定
GPx活性测定使用的是白鲨生物的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)检测试剂盒，试剂盒中提供的有机过氧化物试剂(Cum-OOH)不会被过氧化氢酶分解，可以特异地检测出谷胱甘肽过氧化物酶的活力。操作方法见试剂盒说明书。。
以上实验均设置三个平行，取实验结果的平均数用于统计。
酶活测定结果如表2和图2-4所示，本实施例所提供的功能蛋白ID(1)-(18)具有三种不同的抗氧化酶功能，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)，可有效清除常见的自由基底物。
表1本实施例中所提到的蛋白样品抗氧化活力检测结果统计表
“+”,在特定波长下测定吸光值结果为阳性，即检测出抗氧化
酶活力；
“-”,在特定波长下测定吸光值结果为阴性，即未检测出抗氧化
酶活力
实施例3：功能蛋白的稳定性和兼容性测定
将实施例2制备得到的纯化后的功能蛋白ID(18)定量后，在下述不同温度、pH和化学试剂的条件处理，再进行SOD酶活力测定，以检验其在常规生产和应用过程的稳定性：
3.1温度稳定性
将蛋白溶液在不同温度(60-100℃)下处理10小时，每隔1小时取一次样品，测定剩余活性百分比(n＝3)。
结果如图5所示，功能蛋白ID(18)能够在60-70℃温度环境下能长时间保持极高的活性，在80-90℃温度环境下能长时间保持大部分活性，在100℃环境中活性有所降低。结果表明，功能蛋白ID(18)在低高温环境下(60-70℃)下表现出优异的热稳定性。其在60℃处理10小时后，仍保留了90％以上的初始活性，在70℃下，处理2、5和10小时后分别保留了95％、80％和75％以上的初始活力。其在中高温范围环境下(80-90℃)，随着培养时间的增加，酶活性下降变快。在80℃和90℃下孵育10小时后，分别只剩下50％和30％的初始活性。在100℃环境中，该蛋白孵育一小时后仅剩下33％的初始活性，并且随着孵育时间的增加，其热稳定性继续下降。10小时后，仅保留约8％的初始酶活性。
3.2pH稳定性
将蛋白溶液与不同pH值(pH2.0-9.0)的20mM缓冲液在25℃下混合10小时，分别于2、10小时取样，测定剩余活性百分比(n＝3)。
结果如图6所示，功能蛋白ID(18)在pH2.0-9.0环境中，能够长期保持较高活性，证明其pH适合范围广泛，不易收到pH环境影响。
3.3化学试剂稳定性和兼容性
将蛋白溶液分别在不同试剂溶液(5、10、20、40％(v/v)甲醇、异丙醇、DMSO、甘油、正己烷；5、10、20、40％、50％、60％(v/v)乙醇；0.1、1、5、10％(v/v)Tween；0.1、1、5、10、20％(v/v)Triton X-100、0.1、1、2、5、10、20％(v/v)SDS；1、2、4、10mM PMSF；1、2、4、10、20mMEDTA；1、10mMβ-ME；1、2、4mM DTT；2.5、3M GdmHCl；2.5、3、3.5M尿素)中处理10小时后，取样测定剩余活性百分比(n＝3)。
结果如图7所示，功能蛋白ID(18)在甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO、甘油正已烷等常见工业溶剂和Tween、Triton X-100、SDS、PMSF、EDTA、β-ME、DTT、GdmHCl、尿素等蛋白生产加工过程中常见试剂中均具有较高的稳定性，在正常使用浓度范围下均能保持极高的活性，显著高于其他已知SOD产品。
此外，本实施例进一步研究乙醇溶液对蛋白溶液稳定性的影响。将蛋白溶液在室温(25℃)下用30、35、40、45、50、55、60、62.5、65、67.5和70％(v/v)乙醇溶液处理24和72小时，分别取样测定剩余活性百分比(n＝3)。
结果如图8所示，功能蛋白ID(18)在乙醇溶液中具有极高的稳定性和兼容性，其可以在50％乙醇溶液中长时间放置并保持大部分活性，在浓度高达70％乙醇溶液中仍具有极高的兼容性，长时间放置不会析出蛋白沉淀。能够适用于含有乙醇的产品中。
本实施例对功能蛋白ID(18)稳定性和兼容性进行了研究，证明其具有极高的稳定性和兼容性，与其他17个功能蛋白比较，这18个功能蛋白具有相似的结构，相同的功能域，通过实验也证明了其他17个功能蛋白也具有极高的稳定性和兼容性，对于各类溶剂的耐受性和稳定性的实验结果也较为相似。通过上述实验能够看出，该功能蛋白产品热稳定性佳，pH适合范围广，在常规生产和应用过程的试剂处理下，均能表现出优异的稳定性，能够与大多数常规产品溶质兼容，该特性为其工业应用奠定坚实基础。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (6)
1.具有抗氧化活性的功能蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No:1-18中任一所示。
2.一种抗氧化剂，其特征在于：包括一种或多种权利要求1所述具有抗氧化活性的功能蛋白。
3.权利要求1所述具有抗氧化活性的功能蛋白在抗氧化剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：抗氧化剂包括如序列SEQ IDNo:1-18的氨基酸序列编码得到一种或多种功能蛋白的混合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：应用于食品、保健食品、化妆品、药物或饲料中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：应用于含有甲醇、乙醇、异丙醇、DMSO、甘油正已烷、Tween、Triton X-100、SDS、PMSF、EDTA、β-ME、DTT、GdmHCl和尿素中的一种或多种成分的产品中。
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