CN101603051A

CN101603051A - 利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽

Info

Publication number: CN101603051A
Application number: CNA2009101428966A
Authority: CN
Inventors: 黄赤夫
Original assignee: Department Of Hubei Special Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Department Of Hubei Special Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2009-05-20
Publication date: 2009-12-16

Abstract

本发明属于生物和基因工程技术领域，特别涉及到抗菌肽的生产方法的方法。具体来说，本发明涉及了使用重组浮萍来生产抗菌肽的方法。具体来说，本发明利用浮萍这种水生植物成本低、无污染、数量大的优点，开发浮萍真核生物表达系统lemna minor，用于大量生产抗菌肽，并将具有极强非特异性的生物活性分子抗菌肽用以治疗细菌或真菌感染，尤其是那些因为过度使用抗生素而产生耐药性的病原。一种高效、大量、无污染的方法来生产抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。

Description

利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽

技术领域

本发明涉及抗菌肽的生产方法。具体来说，本发明中浮萍这种水生植物成本低、无污染、数量大的优点，开发浮萍真核生物表达系统lemna minor，用于大量生产抗菌肽，并将具有极强非特异性的生物活性分子抗菌肽用于治疗细菌或真菌感染，尤其是那些因为过度使用抗生素而产生耐药性的病原。

背景技术

抗菌肽是一种在自然界分布极为广泛、微生物和多细胞生物都可以合成的生物活性分子。这使得抗菌肽很自然地成为生物体抵抗病原的第一道防线，并且与其非特异性免疫相关联。由抗菌肽在生物组织中的不同分布，它们确保生物体能全面或在局部地区抵抗环境中的病原。大多数抗菌肽为带正电荷的分子，有20-50个氨基酸，并且具有两性结构，如alpha-螺旋，发夹式折叠，beta-折叠，或者alpha-螺旋/beta-折叠混合结构等，而这些结构则可能是抗菌肽具有抗菌活性的关键。这些抗菌肽展现了有效的抗菌活性，特异性很小，因此能很多各种各样的细菌和真菌，包括口腔病原。抗菌肽主要被分为三种：1、具有α-螺旋构象的多肽(昆虫抗菌肽、magainins等)；2、具有一对半胱氨酸残基的环状和开放末端环状多肽(defensins、protegrin等)；3、特定氨基酸含量高的多肽(富含脯氨酸、富含组氨酸等)。

过去几十年，随着抗生素的广泛应用，持续进化的抗药物微生物，以及有可能出现的“末日审判”微生物，如MRSA、VRE，被越来越多地关注。然而，由于抗菌肽在生物活性(像亲水脂分子一样插入细菌细胞膜，在膜上产生的孔道能导致细菌细胞渗透性裂解)上具有非特异性，使得那些对抗生素具有抗性的细菌对抗生素仍旧是敏感的。因此，作为天然的抗菌物质，抗菌肽可以作为一种新的药物用于治疗。然而，由于无法生产大量具有生物活性的分子，限制了将抗菌肽用于抗感染治疗。

最近，水生植物由于其易于大量聚集和作为新能源潜在资源的特性，吸引了广泛的关注。同样，由于其生产成本低、无污染和数量大的特性，使水生植物作为表达系统生产抗菌肽成为可能。在研究过程中，我们使用普通的浮萍(lemna minor)作为“抗菌肽原型大量表达系统”生产两种重组抗菌肽，并且证实水生植物表达系统能用于生产足够的抗菌肽，用于科研活动和未来可能商业性抗菌肽治疗人或动物的感染，尤其是口腔感染。

水生生物，尤其是浮萍，是一组具有巨大生物技术潜力的生物，因为它们有低成本和数量大的优点。在每平方英里地域上，浮萍的数量大概是其它作物(如玉米)的30倍。由于可以进行光合作用产生能量用于代谢，大多数浮萍可以在非常简单的环境(水、碳源、光照)中生长。同样，浮萍可以作为新的生物反应器用于生产生物活性物质。农杆菌中介使基因稳定转化的浮萍表达系统可以作为潜在的高效表达系统，因为其具有如下优点：1、载体可以将外源基因整合到浮萍细胞中，如；2、可以获得稳定转化的转基因浮萍；3、转基因浮萍可以很快生长到很大的数量；4、真核生物浮萍可以进行糖基化修饰。

发明技术内容

本发明的目的是提供一种高效、大量、无污染的方法来生产抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。其特征在于利用分子生物学技术，采用具有独立自主知识产权的浮萍水生植物特异性表达的技术平台，以浮萍lemna minor为生物反应器，利用浮萍特异性表达的启动子，在浮萍中高效表达具有生物活性的重组抗菌肽。克服了重组抗菌肽的表达量低、可溶性差、无生物活性和纯化工艺难等技术问题，为实现重组抗菌肽的规模化生产提供了可能。

本发明将公开利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽的方法。所述利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽的主要步骤：

1、在浮萍表达系统中生产重组抗菌肽

为了能在浮萍(lemna minor)中表达抗菌肽，先将人β防御因子(hBD-3)和Cap18的cDNA序列连接到表达载体pKYLX71上，以便将其用于对浮萍组织的感染。随后把经PCR扩增的抗菌肽编码序列插入到表达载体pKYLX71中，基因两端的限制性酶切位点分别是Xbal1和Xhol1。将lemna minor的叶部组织转接到组织培养平板中的同时，将构建好的重组质粒转化到农杆菌。在卡那霉素存在的条件下培养5-10天后，转基因浮萍开始生长。初步检测转基因的浮萍是否具有一定的抗菌活性。

2、纯化重组抗菌肽

我们会预先在蛋白的C末端添加His-tag以便检测抗菌肽是否表达，以及纯化过程中也能使用该标签达到最好的效果。纯化工具使用Maxi His-tag纯化柱(USB公司)，纯化方法则完全按生产商提供的标准程序进行。纯化出来的抗菌肽蛋白进一步用Western blotting的方法加以确认，His-tag抗体来源于USB公司。如果需要纯度更高的蛋白用于检测其抗菌活性，则使用高效液相色谱的方法。

具体实施方式

本发明提供一种高效、大量、无污染的方法来生产抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。以下实施实例详细说明本发明，但不应视为本发明范围的限制。

实施例一：浮萍培养

接种浮萍于稀释的LB培养基，在1000mL的三角烧瓶中培养。将三角瓶放在光照培养箱中培养，控制其培养条件：光照强度75.3～80.1mmol/m²s，温度为26℃，ph为6～8。每天搅拌三次，每次1分钟，待浮萍长到一定程度后扩种于3000ml的三角烧瓶中，放在温度较低、光线较弱的地方，人工通入经过过滤的空气进行培养，每3个星期左右扩种1次。扩大培养的程序为3000mL三角烧瓶→20L细口玻璃瓶→桶中培养→生产池。

实施例二：浮萍固体培养

或者接种浮萍于固体培养基中培养。将培养瓶放在光照培养箱中培养，控制其培养条件：光照强度75.3～80.1mmol/m²s，温度为26℃，pH为6～8。每2个星期左右扩种1次。每次扩大十倍培养。

实施例三：抗菌肽基因克隆到穿梭载体

用PCR克隆抗菌肽基因，例如hbd3 and Cap18基因。将抗菌肽基因克隆到pKYLX71穿梭载体，以质粒形式存在。例如为了在PCR中克隆ADH基因，在上海生工公司合成扩增引物，上游引物含有Xho I限制位点，下游引物含有Xba I限制位点。

PCR(Polymerase Chain Reaction)在下列条件用“DNA热循环者”和Tag DNA聚合酶(Takara公司)作为反应试剂进行的。反应物：

PCR缓冲剂、1.25mM dNTP混合物、模板、引物(上游和下游)、Tag酶、无菌水。将以上成分混合，并使该混合物进行PCR反应。

PCR循环：

变性过程：94℃ 60s

退火过程：52℃ 60s

延伸过程：72℃ 120s

由以上过程组成的一个循环重复30个循环。反应完成后，将以上反应混合物10ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物片段大小是否符合。

抗菌肽基因与穿梭质粒连接：

用胶回收试剂盒(Invitrogen公司)回收作为PCR产物的抗菌肽目的片段，详细步骤参考试剂盒内的说明书。回收后的片段与pGEM-T载体连接，其连接体系为：反应缓冲剂、pGEM-T载体、PCR产物抗菌肽片段、T4连接酶。反应1小时后转入4℃连接反应16小时。

蓝白斑筛选连接产物，酶切获得目的片段，构建穿梭载体：

将以上连接反应产物用氯化钙的方法转化入感受态状态的Escherichia coliJM109细胞，涂布到含有0.2M IPTG的固体培养基(10g蛋白胨、5g酵母粉、5gNaCl、和16g琼脂溶解于1升双蒸水)。在该培养基挑取白色阳性菌落扩增培养，16小时后收集细胞并利用碱裂解法小量制备质粒。然后利用Xho I和Xba I双酶切质粒并回收抗菌肽目的片段。该片段与同样经过Xho I和Xba I双酶切处理的表达载体连接，其连接体系为：表达载体、抗菌肽目的基因、T4连接酶、无菌水。连接产物为目的基因与表达载体连接的质粒，简称Amp-表达载体。

实施例四：根癌农杆菌的培养和转化

利用冻融法把以上构建好的Amp-表达载体转入根癌农杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基上(LB+40mg/L利福平+25mg/L链霉素+75mg/L庆大霉素)，挑取单菌落，在2mL农杆菌液体培养基中，28℃培养过夜，取1mL以上培养物，加入50mL农杆菌液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀＝1.0，将50mL农杆菌液经3500～4000r/min离心8min收集菌体，用UM1液体培养基重悬，28℃继续培养3～4h，至OD₆₀₀＝0.5。

实施例五：浮萍的遗传转化及转化株的筛选

将以上培养好的浮萍放入上述农杆菌培养液中，在190r/min，28℃摇床上共培养10min后，用无菌滤纸吸去除多余培养液，置于铺有一层无菌滤纸的UM1培养基上，用封口膜封好培养皿，25℃，于暗处共培养约60h，之后依次用无菌水、含500mg/L氨苄青霉素的无菌水和用含500mg/L氨苄青霉素的UM1将农杆菌洗掉，放在UM2培养基上，用封口膜封好培养皿，暗处培养，待藻种生长到一定程度时，转至UM3培养基中继续培养，之后转至无激素的MS0培养基中培养，得到浮萍转化株，而非转化株则在含有50mg/L卡娜霉素的培养基上逐渐死亡。

实施例六：浮萍的转化株的筛选和抗菌肽活性

碾碎1克浮萍抗菌肽转化株，将碾碎的浮萍抗菌肽转化株放入1毫升PBS缓冲液中。取1微升和5微升的溶液加入100微升的变异链球菌Streptococcusmutans的培养液中于37℃培养过夜。将此培养液稀释1∶10000。取5微升稀释过的培养液涂于血液琼脂盘上培养过夜。计算盘上的克隆数，与对照对比计算浮萍抗菌肽的抑菌活性结果表明浮萍抗菌肽具有很好的抗菌活性。终浓度5毫克/毫升的提取物能够抑制100％变异链球菌Streptococcus mutans的生长。更多的稀释研究表明浮萍抗菌肽具有很好的抗菌活性。

Claims

1、一种用高效、大量、无污染的方法生产的抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。其特征在于利用分子生物学技术，采用具有独立自主知识产权的浮萍水生植物特异性表达的技术平台，以浮萍lemna minor为生物反应器，利用浮萍特异性表达的启动子，在浮萍中高效表达具有生物活性的重组抗菌肽。

2、根据权利要求1所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法。其特征在于，所述利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽的主要步骤：

(1)在浮萍表达系统中生产重组抗菌肽

为了能在浮萍(lemna minor)中表达抗菌肽，先将人β防御因子(hBD-3)和Cap18的cDNA序列连接到表达载体上，以便将其用于对浮萍组织的感染。随后把经PCR扩增的抗菌肽编码序列插入到表达载体中，构建重组质粒Amp-Amp-表达载体，基因两端的限制性酶切位点分别是Xbal1和Xhol1。将lemna minor的叶部组织转接到组织培养平板中的同时，将构建好的重组质粒转化到农杆菌。在卡那霉素存在的条件下培养5-10天后，转基因浮萍开始生长。初步检测转基因的浮萍是否具有一定的抗菌活性。

(2)纯化重组抗菌肽

3、根据权利要求2中所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法，构建重组穿梭质粒Amp-表达载体，其特征在于抗菌肽基因与高效穿梭载体连接，并用于转化农杆菌。

4、根据权利要求2中所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法，构建重组穿梭质粒Amp-表达载体，其特征在于将人β防御因子(hBD-3)和Cap18的cDNA序列连接到表达载体上。包括生产其他的抗菌肽。