CN114752610A - 柑橘木虱泛素结合酶e2j2基因在防控柑橘黄龙病中的应用 - Google Patents

柑橘木虱泛素结合酶e2j2基因在防控柑橘黄龙病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，属于动物基因工程技术领域。本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用。本发明设计特异性引物合成dsRNA，借助RNA干扰沉默E2J2基因，检测其基因沉默效率，后续放置在感染黄龙病菌的枝条上饲喂，探究此基因对黄龙病菌(CLas)侵染的影响。本发明通过阻断黄龙病菌在柑橘木虱体内传播途径而不是控制木虱本身，为柑橘黄龙病的有效防控提供了一种新的策略，为控制细菌类病原借助媒介昆虫的传播提供新的防控思路。

Description

柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，尤其涉及柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用。
背景技术
柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是世界柑橘产业中最具有毁灭性的病害之一。由于目前对黄龙病感病树体尚无有效的治疗方法，所以黄龙病又称为柑橘的“癌症”。至今黄龙病病菌仍不能进行人工培养，却能在柑橘木虱体内长期生长繁殖，柑橘木虱一旦被黄龙病菌(CLas)侵染就能够终身携带并迅速传播，这给研究黄龙病及其防控带来了巨大的困难，是近年来困扰柑橘产业的最大难题。当前国际柑橘产业对于黄龙病的控制主要局限于通过化学杀虫剂控制柑橘木虱的发生，然而化学杀虫剂的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性被破坏和害虫的抗药性等诸多问题。因此提供一种快速和长效的控制黄龙病的新方法是十分有必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，通过阻断CLas病菌在柑橘木虱体内传播途径而不是控制木虱本身进行防控HLB。本发明的目的之二在于提供一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述E2J2基因通过降低CLas侵染柑橘木虱发挥作用。
优选的，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法，包括如下步骤：将上述的E2J2基因在柑橘木虱中进行基因沉默。
优选的，所述基因沉默为采用RNA干扰技术进行基因沉默。
优选的，所述RNA干扰技术包括如下步骤：以柑橘木虱cDNA为模板，通过PCR技术，使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段，扩增产物连接入质粒中，以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收，合成dsRNA；稀释合成的dsRNA，饲喂柑橘木虱。
优选的，所述扩增引物为
PT-F:5'ATTCAAACCACCAAGCATCT 3'，
PT-R:5'TCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT 3'。
优选的，所述含启动子的引物为
RNAi-F:TAATACGACTCACTATAGGGATTCAAACCACCAAGCATCT，
RNAi-R:TAATACGACTCACTATAGGGTCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT。
优选的，所述质粒为pMD19-t质粒。
优选的，饲喂的柑橘木虱为4-5龄柑橘木虱若虫。
本发明的有益效果：
本发明首次提出柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因可用于柑橘黄龙病的防控中，通过阻断黄龙病菌在柑橘木虱体内传播途径而不是控制木虱本身，为柑橘黄龙病的有效防控提供了一种新的策略，为控制细菌类病原借助媒介昆虫的传播提供新的防控思路。
附图说明
图1为柑橘木虱泛素结合酶E2J2蛋白及其Western Blot验证图，其中左图为纯化蛋白SDS-PAGE图，BSA为对照；右图为Werstern Blot验证结果，箭头指示为目的条带，一抗为鼠源抗His，M 1:Protein Marker,Bio-rad,Cat.No.1610374S；M 2:Protein Marker,GenScript,Cat.No.M00521；
图2为柑橘木虱泛素结合酶E2J2体外泛素结合实验，其中M：Blue
Figure BDA0003630854150000021
ⅤProteinMaker(10-190kDa)；1为反应组别①；2为反应组别②；
图3为柑橘木虱泛素结合酶E2J2的RNAi后E2J2基因的相对表达情况，其中深色代表dsGFP处理组；浅色代表E2J2处理组；
图4为RNA干扰处理后柑橘木虱获菌情况。
具体实施方式
本发明提供了柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，所述E2J2基因优选的通过降低CLas侵染柑橘木虱发挥作用，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法，包括如下步骤：将上述的E2J2基因在柑橘木虱中进行基因沉默。
在本发明中，所述基因沉默优选的为采用RNA干扰技术进行基因沉默。本发明所述RNA干扰技术优选的包括如下步骤：以柑橘木虱cDNA为模板，通过PCR技术，使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段，扩增产物连接入质粒中，以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收，合成dsRNA；稀释合成的dsRNA，饲喂柑橘木虱。
本发明对于柑橘木虱的具体来源没有特殊限定，对于获得柑橘木虱的cDNA的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规获得cDNA的方法均可，在本发明中，优选的以柑橘木虱成虫的cDNA为模板。在本发明中，所述扩增引物优选为如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，具体如下：
PT-F:5'ATTCAAACCACCAAGCATCT 3'，
PT-R:5'TCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT 3'。本发明对于PCR技术的其它条件如反应体系和反应程序没有特殊限定。使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段后，优选的需回收扩增产物，将扩增产物连接入质粒中，所述质粒优选为pMD19-t质粒，本发明对于pMD19-t质粒的具体来源没有特殊限定。将扩增产物连接入质粒中后，优选的需转化至大肠杆菌感受态细胞Trans5α，涂平板，挑单菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩摇，对菌液进行测序，选取突变率低的菌液扩摇并提取质粒；以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收。在本发明中，所述含启动子的引物优选为含有T7启动子的引物序列，所述含有T7启动子的引物序列优选为如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，具体如下：
RNAi-F:TAATACGACTCACTATAGGGATTCAAACCACCAAGCATCT，
RNAi-R:TAATACGACTCACTATAGGGTCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT，其中划线部分代表T7启动子。本发明对于扩增产物胶回收的具体方法没有特殊限定。回收后，优选的用Promega T7RiboMAX Express RNAi System合成dsRNA(依据说明书的方法步骤)。
根据上述步骤合成dsRNA后，稀释合成的dsRNA，饲喂柑橘木虱。所述稀释试剂优选为无酶水，所述稀释的浓度优选为稀释至200ng/μL。所述饲喂方法优选为使用薄膜饲喂法，所述柑橘木虱优选为4-5龄柑橘木虱若虫，更优选为饥饿4h的4-5龄柑橘木虱若虫。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
cDNA序列如SEQ ID NO.1所示的柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因(DcUbcE2J2)原核表达及纯化委托南京金斯瑞生物科技有限公司，得到纯化蛋白并经Western Blot验证，结果如图1所示。
实施例2
将实施例1得到的纯化蛋白进行体外泛素化结合实验，以检测本发明所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因(DcUbcE2J2)是否具有泛素结合活性。实验步骤如下：
构建的体外泛素化反应体系如表1所示：
表1构建的体外泛素化反应体系
Figure BDA0003630854150000041
表1中咪唑的作用是防止带His标签的E1和E2与镍-琼脂糖柱结合。
由于作为泛素结合酶，需要泛素激活酶E1激活才可以实现结合功能，所以本发明在体外泛素化液体环境都相同的条件下设计了两组实验，差别在于是否E1激活。具体为①E1+E2+Ub；②E2+Ub。
将装有反应液的EP管插在翻转震荡器上，30℃恒温翻转孵育12h。孵育结束后，12000rpm离心10min，取上清，加入5×loading buffer煮样，12％SDS-PAGE和WesternBlot检测体外泛素化结果。Western Blot所用的一抗为兔源anti-Ub，二抗为HRP标记的羊抗兔的抗体。结果如图2所示。由图2可以看出，本发明柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因具有泛素结合活性。
实施例3
dsRNA的合成及RNAi实验
(1)dsRNA合成
以柑橘木虱成虫cDNA为模板，通过PCR技术，使用如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的扩增引物PT-F:5'ATTCAAACCACCAAGCATCT3'，PT-R:5'TCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT 3'获得E2J2基因的部分片段，用Omega胶回收试剂盒回收扩增产物；扩增产物连接入pMD19-t质粒中，转化至大肠杆菌感受态细胞Trans5α，涂平板，次日挑单菌落于含氨苄青霉素的LB液体培养基中扩摇，菌液送上海生工生物工程股份有限公司测序；选取突变率低的菌液扩摇并提取质粒(Sigma快速小量质粒提取试剂盒)；以质粒为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的含T7启动子的引物，RNAi-F:TAATACGACTCACTATAGGGATTCAAACCACCAAGCATCT，RNAi-R:TAATACGACTCACTATAGGGTCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT(其中划线部分代表T7启动子)进行扩增，扩增产物胶回收；回收后的产物测浓度，用Promega T7 RiboMAX ExpressRNAi System合成dsRNA(依据说明书的方法步骤)。
(2)RNAi分析
上述合成的dsRNA用无酶水稀释至200ng/μL的浓度，使用薄膜饲喂法处理饥饿4h的4-5龄柑橘木虱若虫。以dsGFP处理作为实验对照组。在处理24h、48h后收集5只若虫提取总RNA(TRizol法)，反转录成cDNA，实时荧光定量PCR检测其表达量的变化。实时荧光定量引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，具体为：
qPCR-F:5’ATGTCATAGCAGAACCAAACCCA 3’
qPCR-R:5’AGCCCTGTGAGGATGGTTGAT 3’，反应体系为：ddH2O8μL；SYBR 10μL；F/R0.5μL；cDNA模板1μL；总体系20μL。反应程序为：95℃预变性10min；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40个循环。实验用6次独立样品重复6次，反应均在Roche LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪上完成。结果如图3所示。表明本发明RNA干扰技术能够成功实现E2J2基因的沉默。
实施例4
将经实施例3RNA干扰处理后48h的柑橘木虱若虫挑取至感染黄龙病菌的柑橘嫩枝上饲养，每隔24h挑取存活的柑橘木虱15头，使用普通PCR检测其感病率，其中普通PCR的引物为：F：5’GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA 3’，R:5’GCGTCGCGACTTCGCAACCCAT 3’，PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃30s，62℃30s，72℃1min 10s，34个循环；72℃5min；25℃5min，结果如图4所示。经本发明RNA干扰处理后的柑橘木虱感染黄龙病菌的获菌率显著下降。
在此需要说明的是，RNAi原理是通过基因部分片段沉默后抑制基因的表达，本发明主要通过该技术实现基因的沉默，从而产生后续效果。本发明实施例中为随机选择E2J2基因中的部分序列进行沉默，若是选择其它序列进行基因沉默，也会获得获菌率显著下降的结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 赣南师范大学
<120> 柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttgttttt aaaagtactt ccaatagttc caattaaaat ttaacatgac catcactcac 60
ttcctcataa attattcata gatattgaag ttatttgaaa acaaaagcat actcgtgata 120
agaaagttct gtagagtttt tatctcgaac tcaaagggta cagtttgcta caacctcaga 180
agaacttgaa ttacaaattc tttatcatta tttaatttca agttttagct taaatagctg 240
tgttttacct tagactaata cagggagcac aaaatgtctt caaaacattg tggagccaca 300
gcaagattga agcaagatta catgaaattg aagaaagatc ctattccata tgtcatagca 360
gaaccaaacc cagctaatat tttagaatgg ttctatgtgg tcattggtcc agagaatacc 420
caatatgaag gaggcatgta cctgggtaaa ctagtttttc caagagattt cccattcaaa 480
ccaccaagca tctatatgat aactcccaat ggtagattca agaccaacac tcgattgtgt 540
ctatcaatgt cagactttca tcctgataca tggaatccag catggagtgt atcaaccatc 600
ctcacagggc tgctcagctt tatggtagag agaagtccaa ctttggggtc aatagaaatg 660
tctgactatg agagacgaca actggctgcc cgtagcctac gatttaattt gaatgacaag 720
aacttctgtg aattgtttcc tgacctagtg caaggcacaa aagaagagct agacagacga 780
gcacaagaag aattgaaaaa tcgaaggaca tcaaattcaa gaacaggtct tcaaaattct 840
ctcaatgaac atctagatca gcaaagtcca atgaatggag caattaccaa tatttgtttt 900
attataggct tggtagcttt tgctttcata gtcaaatatg ttctgagaag tattgcagca 960
gcagaataga gtaagttgaa attattaagg tcaaattaac aggtaattag ttgtaatact 1020
gttgtggcag atcccgtttt cagaacatgc tcagagttac caaaaatgtc taatatattg 1080
atgaagaggt aatattatac tggac 1105
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Ser Lys His Cys Gly Ala Thr Ala Arg Leu Lys Gln Asp Tyr
1 5 10 15
Met Lys Leu Lys Lys Asp Pro Ile Pro Tyr Val Ile Ala Glu Pro Asn
20 25 30
Pro Ala Asn Ile Leu Glu Trp Phe Tyr Val Val Ile Gly Pro Glu Asn
35 40 45
Thr Gln Tyr Glu Gly Gly Met Tyr Leu Gly Lys Leu Val Phe Pro Arg
50 55 60
Asp Phe Pro Phe Lys Pro Pro Ser Ile Tyr Met Ile Thr Pro Asn Gly
65 70 75 80
Arg Phe Lys Thr Asn Thr Arg Leu Cys Leu Ser Met Ser Asp Phe His
85 90 95
Pro Asp Thr Trp Asn Pro Ala Trp Ser Val Ser Thr Ile Leu Thr Gly
100 105 110
Leu Leu Ser Phe Met Val Glu Arg Ser Pro Thr Leu Gly Ser Ile Glu
115 120 125
Met Ser Asp Tyr Glu Arg Arg Gln Leu Ala Ala Arg Ser Leu Arg Phe
130 135 140
Asn Leu Asn Asp Lys Asn Phe Cys Glu Leu Phe Pro Asp Leu Val Gln
145 150 155 160
Gly Thr Lys Glu Glu Leu Asp Arg Arg Ala Gln Glu Glu Leu Lys Asn
165 170 175
Arg Arg Thr Ser Asn Ser Arg Thr Gly Leu Gln Asn Ser Leu Asn Glu
180 185 190
His Leu Asp Gln Gln Ser Pro Met Asn Gly Ala Ile Thr Asn Ile Cys
195 200 205
Phe Ile Ile Gly Leu Val Ala Phe Ala Phe Ile Val Lys Tyr Val Leu
210 215 220
Arg Ser Ile Ala Ala Ala Glu
225 230
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attcaaacca ccaagcatct 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcttcttgtg ctcgtctgtc t 21
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg attcaaacca ccaagcatct 40
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg tcttcttgtg ctcgtctgtc t 41
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtcatagc agaaccaaac cca 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agccctgtga ggatggttga t 21

Claims (10)

1.柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因在防控柑橘黄龙病中的应用，其特征在于，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述E2J2基因通过降低CLas侵染柑橘木虱发挥作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述柑橘木虱泛素结合酶E2J2基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种降低CLas侵染柑橘木虱的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的E2J2基因在柑橘木虱中进行基因沉默。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因沉默为采用RNA干扰技术进行基因沉默。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA干扰技术包括如下步骤：以柑橘木虱cDNA为模板，通过PCR技术，使用扩增引物获得E2J2基因的部分片段，扩增产物连接入质粒中，以质粒为模板，用含启动子的引物进行扩增，扩增产物胶回收，合成dsRNA；稀释合成的dsRNA，饲喂柑橘木虱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增引物为
PT-F:5'ATTCAAACCACCAAGCATCT 3'，
PT-R:5'TCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT 3'。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述含启动子的引物为
RNAi-F:TAATACGACTCACTATAGGGATTCAAACCACCAAGCATCT，
RNAi-R:TAATACGACTCACTATAGGGTCTTCTTGTGCTCGTCTGTCT。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒为pMD19-t质粒。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，饲喂的柑橘木虱为4-5龄柑橘木虱若虫。
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