CN111424023B - 产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酰胺酶类溶菌酶、所述酰胺酶类溶菌酶的表达载体以及表达系统，尤其涉及产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用。采用本发明提供的蓝藻工程菌表达并纯化得到酰胺酶类溶菌酶，具有较高的抑菌活性以及酶解肽聚糖的活性，具有重要的医用抗菌、食品防腐、科研工具酶等价值。

Description

产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)是一类专门水解细菌细胞壁上黏多糖糖苷键的碱性酶。溶菌酶广泛存在于卵清、唾液、生物液体中，动物组织、植物组织、微生物中也有溶菌酶的存在。医用溶菌酶具有抗菌和抗病毒功效，适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。又由于溶菌酶的无毒、无副作用，其还可以作为天然的食品防腐剂，现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增值。此外，溶菌酶处理细菌还可以协助得到原生质体，因此溶菌酶还是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。

蛋清溶菌酶有限的抑菌谱限制了其进一步应用，高提取率和更广泛抑菌谱的微生物溶菌酶正日益受到研究人员重视。但该酶主要溶解革兰氏阳性菌，因而限制了它的进一步应用，且国内蛋清溶菌酶年产量不足50顿，特别是高活性的溶菌酶供应还不能满足日益增长的需求。微生物溶菌酶的研究和应用虽然尚处于起步阶段，但因其较高的提取率、广泛的溶菌谱和优越的抑菌性，正日益受到研究人员的重视。微生物产溶菌酶主要有3种:N－乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内肽酶。

酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase)是一类作用于肽聚糖酰胺键的溶菌酶，它可以切断细菌肽聚糖中NAM上乳酸的羧基与肽尾丙氨酸之间的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺键。酰胺酶广泛存在于细菌中，但是只有在少数菌株中才检测出活性高的溶菌酶。噬菌体T7溶菌酶就是一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，体外重组表达T7溶菌酶对细菌的肽聚糖有着明显的降解活性，但Zn²⁺是其酰胺酶活性所必需的。除此之外，鲜有其它种类的具有高效溶菌活性的酰胺酶被报道发现。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶，是目前除噬菌体T7溶菌酶外少数同样属于酰胺酶类溶菌酶的一种，具有重要的医用抗菌、食品防腐、科研工具酶的价值。

具体而言，本发明提供的酰胺酶类溶菌酶，具有SEQ1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

本发明提供的酰胺酶类溶菌酶具有高效裂解革兰氏阴性菌(大肠杆菌等)的细胞壁功能，具有高效抑菌活性。

本发明的第二目的是提供编码所述酰胺酶类溶菌酶的基因序列。

作为本发明的一种优选方案，本发明提供的编码酰胺酶类溶菌酶的基因序列，具有SEQ2所示的序列。

作为本发明的一种优选方案，所述基因序列的N端带有His标签，优选为6～10个His标签，以便于表达后纯化。

本发明的第三目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的表达载体，其包含本发明所述的基因序列。

作为本发明的一种优选方案，所述表达载体为蓝藻表达载体。

作为本发明的一种优选方案，所述表达载体为蓝藻穿梭载体pAQE19。所述蓝藻穿梭载体pAQE19的相关信息，可参见文献Dongyi Xu 2005；Plant Physiology,July 2005,Vol.138,pp.1586–1595。采用该表达载体，可以实现本发明所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。

作为本发明的一种优选方案，所述表达载体包含P_cpcBA启动子。所述P_cpcBA启动子在野生型蓝细菌中是控制表达藻胆体外周杆藻蓝蛋白α/β亚基的启动子。本发明采用所述P_cpcBA启动子可以进一步促进本发明所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。该启动子具有如SEQ3所示的核苷酸序列。

本发明的第四目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的表达系统，其中含有本发明所述的表达载体。

作为本发明的一种优选方案，所述表达系统为蓝藻。

作为本发明的一种优选方案，所述表达系统为聚球藻。

作为本发明的一种优选方案，所述表达系统为蓝细菌Synechococcus sp.PCC7002。Synechococcus sp.PCC 7002作为一种能够光合自养的微生物，培养成本低廉，生长速率快，分子和遗传操作十分方便；我们利用其表达酰胺酶类溶菌酶，达到了利用更低成本获取大量具有更高生物学活性的溶菌酶的成果。

本发明的第五目的是提供一种产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌，其是将包含本发明所述基因序列的蓝藻表达载体转化入蓝藻所得。所述蓝藻优选为野生型蓝藻。

作为本发明的一种优选方案，所述蓝藻表达载体为蓝藻穿梭载体pAQE19。

作为本发明的一种优选方案，所述蓝藻为聚球藻。

作为本发明的一种优选方案，所述表达系统为蓝细菌Synechococcus sp.PCC7002。采用该藻种构建蓝藻工程菌，可以实现本发明所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。

作为本发明的一种优选方案，所述蓝藻工程菌是将含有所述基因序列的蓝藻穿梭载体pAQE19转入蓝细菌Synechococcus sp.PCC 7002中所得。经PCR验证，可确认获得转基因产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌。

本发明提供的蓝藻工程菌利用蓝细菌表达系统能够获得大量的具有生物学活性的酰胺酶类溶菌酶，所述酰胺酶类溶菌酶能降解细菌细胞壁的肽聚糖层并具有高效抑菌活性。

本发明的第六目的是提供本发明所述表达载体、所述表达系统或所述蓝藻工程菌在制备酰胺酶类溶菌酶中的应用。

本发明的第七目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的制备方法，该方法包括：将所述的表达系统或所述蓝藻工程菌进行培养，离心富集后，破碎，纯化。

作为本发明的一种优选方案，所述纯化采用镍柱亲和层析法。

本发明采用上述方法表达并纯化得到的酰胺酶类溶菌酶，可以使细菌肽聚糖悬浊液变得澄清，通过高效液相色谱分析反应液，发现其能与细菌肽聚糖反应产生小肽分子，具有酶解肽聚糖的活性。

说明书附图

图1.A为蓝藻工程菌表达载体的示意图，B为验证阳性产溶菌酶工程菌的PCR鉴定图。

图2.利用镍柱亲和层析法纯化重组酰胺酶类溶菌酶后的SDS-PAGE蛋白电泳图

图3.采用抑菌圈法，验证酰胺酶类溶菌酶对大肠杆菌的抑制活性的结果示意图；A为滤纸片为空白对照，B为经过高温失活的酰胺酶类溶菌酶，C为蛋清溶菌酶，D为酰胺酶类溶菌酶。

图4.酰胺酶类溶菌酶高效裂解细菌细胞壁的结果示意图；A为酰胺酶类溶菌酶与细菌细胞壁提取成分(肽聚糖)悬浊液反应24小时后，反应液会变澄清；B为反应液的OD变化曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

蓝细菌Synechococcus sp.PCC 7002，即野生型聚球藻Synechococcus sp.PCC7002，最早在1962年由C.Van Baalen在海洋污垢中分离得到，其来源于法国巴黎的巴斯德研究所蓝藻保藏库(Pasteur Culture Collection)。其名称中，“PCC”是Pasteur CultureCollection的缩写，7002为藻种编号。在本发明中，该藻种生长于A⁺液体或者固体培养基中。

大肠杆菌HB101：购自takara公司，产品目录号：D9051。

A⁺培养基：每升培养基含有MgSO₄·7H₂O 5.0g，NaNO₃ 1.0g，NaCl 18g，KCl 0.6g，CaCl₂ 0.27g，KH₂PO₄ 0.05g，Na₂CO₃ 0.02g，FeCl₃·6H₂O 3.89mg，EDTA·Na₂ 30mg，Tris·Cl(pH8.2)1.0g，微量金属混合物(内含：H₃BO₃ 2.860mg/l，MnCl₂·4H₂O 1.810mg/l，ZnSO₄·7H₂O 0.222mg/l，Na₂MoO₄·2H₂O 0.390mg/l，CuSO₄·5H₂O 0.079mg/l，Co(NO₃)₂·6H₂O0.0494mg/l)1.0ml，另加维生素V_B12 4μg/ml。

A⁺固体培养基：在A⁺液体培养基中加入琼脂，使其终浓度为1.2％(质量百分含量)。液体培养时，以照明日光灯光源，光强为100uE/m²·s，温度30℃，并通以含1％CO₂(v/v)的空气。

实验用的大肠杆菌菌株DH5α生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度分别为：100μg/ml Amp⁺，50μg/ml Kan⁺。

实验所用穿梭蓝藻质粒pAQE19购买于生物技术公司，常见于市面。

实施例1：产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌的获得

(1)表达载体的构建

表达载体的构建流程如图1A。以野生型鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120基因组总DNA为模板，分别利用引物对P1/P2、P3/P4(引物序列见表1)进行扩增，得到N端带8个His标签的溶菌酶基因和启动子P_cpcBA片段。然后将所述溶菌酶基因和启动子P_cpcBA，利用酶切连接连入蓝藻穿梭载体pAQE19的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间，得到表达载体。

表1：引物序列(5’-3’)

名称	序列号	序列
			P1	SEQ4	gaaggaattcatgcaccaccaccaccaccaccaccacagatatggaattgatattgg
P2	SEQ5	gatcctcgagctaaccgattagtctttgcc
			P3	SEQ6	gttataaaataaacttaacaaatc
P4	SEQ7	gaattaatctcctacttgac
			P5	SEQ8	atgattgaacaagatggattg
P6	SEQ9	ctaatcgccatcttccagca

(2)阳性蓝藻工程菌的筛选和PCR验证其为纯合菌株

将步骤(1)所得表达载体通过转化入野生型聚球藻PCC 7002，pAQE19为蓝藻和大肠杆菌穿梭载体，能在蓝藻中自主复制。

聚球藻PCC 7002转化的方法如下：取培养的600ul聚球藻PCC7002(OD730nm值为0.8)，6000r/min离心2min，弃400ul上清液，加入制备好的质粒10ul，轻轻混匀，遮光静置4-8小时。将藻液均匀涂在A⁺固体培养基上，静置12-14小时，倒Top agar(5ml Top agar包含卡那霉素50μl(100mg/ml))。静置培养15天左右。

从A+固体培养基上挑选出单菌落，继续在已加入卡那霉素抗性的A+固体培养基上培养，连续划线传代获得高拷贝稳定的阳性工程菌。利用引物对P5和P6(引物序列见表1)对阳性菌株进行PCR鉴定(鉴定结果见图1B，野生型PCR没有条带，突变体PCR条带大小2069bp)，鉴定结果表明，已经获得了产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌。

实施例2：产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌的应用

(1)酰胺酶类溶菌酶的表达纯化

培养2L的OD₇₃₀＝2.0的产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌(实施例1所得)，离心富集后，破碎细菌利用镍柱亲和层析法纯化，通过SDS-PAGE电泳胶图(图2)证明获得了高纯度的酰胺酶类溶菌酶。

(2)酰胺酶类溶菌酶的抑菌活性验证

采用抑菌圈法分析其对革兰氏革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑菌特性。该实验的操作步骤如下：用打孔器打出一定直径大小的滤纸圆片，高压灭菌，将蛋清溶菌酶、有活性和失活的溶菌酶样滴在上述无菌滤纸圆片上，再置于混有大肠杆菌菌液的琼脂平板上，平板上的酶液是以浓度为推动力进行扩散，培养一段时间后将产生不同直径大小的抑菌圈，测量其直径大小。这些直径大小可以表示溶菌酶的抑菌性质。如图3所示，同等蛋白浓度的溶菌酶具有比蛋清溶菌酶更高的抑菌活性。

(3)酰胺酶类溶菌酶可裂解细菌肽聚糖

将溶菌酶用50μm ZnSO₄的磷酸钠缓冲液配制成1mg/ml的终浓度，与提取的大肠杆菌细胞壁肽聚糖(配置成10μg/μL的悬浊液)相互作用(反应过程和条件见表2)。由图4可知，随着反应时间的增加，重组溶菌酶可使得肽聚糖悬浊液的OD值逐渐降低，在反应24个小时后，已经使得肽聚糖悬浊液变澄清。

表2：酰胺酶类溶菌酶与细菌肽聚糖反应过程和条件

不同处理	反应浓度	反应条件
			溶菌酶+肽聚糖悬浊液	200μL溶菌酶+50μL肽聚糖	37℃孵化过夜
肽聚糖悬浊液空白对照	200μL l0mM磷酸钠缓冲液+50μL肽聚糖	37℃孵化过夜

本发明进一步通过对比实验发现，与本发明利用蓝藻工程菌表达得到的酰胺酶类溶菌酶相比，采用大肠杆菌表达系统得到的酰胺酶类溶菌酶，抑菌活性较低，且裂解细菌肽聚糖的效率低于本发明。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用

<130> RYP2010586.2

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 313

<212> PRT

<213> Anabaena PCC7120

<400> 1

Met Arg Tyr Gly Ile Asp Ile Gly His Asn Cys Pro Pro Asp Thr Gly

1 5 10 15

Ala Arg Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Leu Thr Leu Asp Val Gly Asn

20 25 30

Arg Val Ile Ser Lys Leu Arg Ala Leu Gly His Glu Val Ile Pro Cys

35 40 45

Lys Pro Asp Arg Ala Thr Ser Val Lys Asp Ser Leu Ser Gln Arg Cys

50 55 60

Asn Arg Ala Asn Ala Asn Lys Val Glu Val Phe Val Ser Ile His Phe

65 70 75 80

Asn Ala Phe Asn Gly Gln Ala Asn Gly Thr Glu Val Phe Ala Ala Ser

85 90 95

Asp Asn Gly Arg Arg Ile Ala Lys Pro Val Leu Asp Glu Ile Ile Lys

100 105 110

Leu Gly Tyr Phe Asn Arg Gly Val Lys Ser Gly Ser His Leu Phe Val

115 120 125

Leu Arg Asn Thr Asn Met Pro Ala Ile Leu Val Glu Cys Cys Phe Ile

130 135 140

Asp Ala Gln Lys Asp Met Asn Leu Phe Asp Pro Glu Ala Thr Ala Asn

145 150 155 160

Ala Ile Val Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Pro Ser Thr Pro Val Pro

165 170 175

Ser Val Pro Asp Glu Glu Gln Asn Ile Asp Thr Ser Ile Leu Arg Leu

180 185 190

Gln Lys Ser Leu Asn Arg Leu Lys Ile Thr Gly Arg Ser Asn Lys Ser

195 200 205

Leu Val Glu Asn Ser Gln Leu Asn Thr Glu Thr Lys Phe Ala Ile Glu

210 215 220

Arg Phe Gln Gly Ile Val Gly Leu Glu Lys Thr Gly Ile Val Asn Glu

225 230 235 240

Ala Thr Trp Asn Ala Ile Asn Leu Ile Leu Ala Lys Arg Ile Ile Arg

245 250 255

Gln Asn His Ala Gly Gly Pro Val Val Arg Tyr Leu Gln Phe Arg Val

260 265 270

Gly Val Glu Val Asp Gly Ile Tyr Gly Ala Gln Thr Glu Ala Ala Ile

275 280 285

Lys Arg Phe Gln Arg Gln Asn Gly Leu Leu Ala Asp Gly Ile Ile Gly

290 295 300

Pro Met Ser Trp Gln Arg Leu Ile Gly

305 310

<210> 2

<211> 942

<212> DNA

<213> Anabaena PCC7120

<400> 2

atgagatatg gaattgatat tggtcacaat tgcccaccag acactggagc tagagggatt 60

aggtttgaag ataatctgac tctagatgta ggcaatcgag tcatatctaa gttgagagct 120

ttaggacacg aagtaatacc ttgtaaacca gatagagcta cttccgttaa agattctctc 180

tcgcaaagat gtaatagggc taatgccaat aaagtagagg tttttgtttc catacacttt 240

aatgctttta atggacaagc caacggtact gaagtatttg ccgcgagtga taatggtaga 300

agaatcgcta aaccagtatt agatgaaatt attaagttag gatattttaa tcgcggggtt 360

aaaagtggct ctcacctgtt tgttttgcgt aatacaaata tgccagcaat attggtagag 420

tgttgcttta tcgatgccca aaaggacatg aatttatttg atccggaagc aactgctaat 480

gcaattgtca agggattaac aggaaaatta ccaagtactc ctgtgccttc tgttccagat 540

gaagaacaaa atatagatac gagtattttg agactacaaa aatcattaaa tcgtctcaaa 600

attactggta gaagtaataa atctcttgtc gaaaatagcc aacttaatac agagacaaag 660

tttgctatag agagatttca aggtattgtg ggactggaga aaactggaat tgtcaatgag 720

gcaacatgga atgccatcaa tctgatttta gctaaaagaa ttatcagaca gaaccatgct 780

ggtggcccgg tggttagata cttacaattc cgagtaggag ttgaagttga tggtatttat 840

ggcgcgcaga cagaagcagc aattaaaaga tttcagagac aaaatggttt gctggccgat 900

ggaattattg ggccgatgag ttggcaaaga ctaatcggtt aa 942

<210> 3

<211> 591

<212> DNA

<213> Anabaena PCC7120

<400> 3

cgttataaaa taaacttaac aaatctatac ccacctgtag agaagagtcc ctgaatatca 60

aaatggtggg ataaaaagct caaaaaggaa agtaggctgt ggttccctag gcaacagtct 120

tccctacccc actggaaact aaaaaaacga gaaaagttcg caccgaacat caattgcata 180

attttagccc taaaacataa gctgaacgaa actggttgtc ttcccttccc aatccaggac 240

aatctgagaa tcccctgcaa cattacttaa caaaaaagca ggaataaaat taacaagatg 300

taacagacat aagtcccatc accgttgtat aaagttaact gtgggattgc aaaagcattc 360

aagcctaggc gctgagctgt ttgagcatcc cggtggccct tgtcgctgcc tccgtgtttc 420

tccctggatt tatttaggta atatctctca taaatccccg ggtagttaac gaaagttaat 480

ggagatcagt aacaataact ctagggtcat tactttggac tccctcagtt tatccggggg 540

aattgtgttt aagaaaatcc caactcataa agtcaagtag gagattaatt c 591

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P1

<400> 4

gaaggaattc atgcaccacc accaccacca ccaccacaga tatggaattg atattgg 57

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P2

<400> 5

gatcctcgag ctaaccgatt agtctttgcc 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P3

<400> 6

gttataaaat aaacttaaca aatc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P4

<400> 7

gaattaatct cctacttgac 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P5

<400> 8

atgattgaac aagatggatt g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P6

<400> 9

ctaatcgcca tcttccagca 20

Claims (2)

1.酰胺酶类溶菌酶的制备方法，其特征在于，将含有酰胺酶类溶菌酶表达载体的蓝细菌Synechococcus sp.PCC 7002进行培养，离心富集后，破碎，纯化；

所述酰胺酶类溶菌酶表达载体为包含编码酰胺酶类溶菌酶的基因序列或SEQ2所示的基因序列的蓝藻穿梭载体pAQE19，所述酰胺酶类溶菌酶表达载体中还包含P_cpcBA启动子；所述酰胺酶类溶菌酶的氨基酸序列如SEQ1所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化采用镍柱亲和层析法。

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