CN110846340B

CN110846340B - 一步转化进行蓝藻基因无痕敲除的方法

Info

Publication number: CN110846340B
Application number: CN201911148764.4A
Authority: CN
Inventors: 郑正高; 董春霞; 王宏蕊; 赵进东
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110846340A

Abstract

本发明公开了一种一步转化进行蓝藻基因无痕敲除的方法，通过一步遗传转化将两个同向loxP序列以及序列之间包括的诱导型启动子驱动的Cre基因和选择标记基因序列替换目的基因，然后利用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达，最终获得无痕敲除的突变体。该方法只需要进行一步遗传转化，通过控制培养基中诱导条件来达到蓝藻基因的无痕敲除，大幅度缩短了在蓝藻中进行无痕敲除的时间，且能降低培养成本，减少抗生素使用和基因对环境的污染，也为今后更快速地开发各种优质无抗性的蓝藻工程菌底盘生物提供了一种方法。

Description

一步转化进行蓝藻基因无痕敲除的方法

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域中的基因敲除技术，具体涉及一种只进行一步遗传转化就可最终实现蓝藻某个基因的无痕敲除(无抗生素标记)的方法和应用。

背景技术

蓝藻由于其能进行光合作用、遗传背景简单、生长速度快等优点，已被当成合成生物学中一个理想的底盘生物，而这就涉及到许多对蓝藻的遗传操作及基因编辑。目前在蓝藻中进行基因敲除的方法，大部分都是利用同源重组的方法将目的基因替换成抗性基因，然后在抗生素的培养条件筛选下获得纯合子。但是，这种方法的缺点主要有：1、引入了外源抗性基因，使得对目的基因的功能分析可能不准确，抗性基因的引入还可能会导致要敲除的目的基因上下游基因的表达调控产生影响，导致基因敲除突变株的产生其它不可预知的表型；2、由于突变株要花费资源去表达抗生素基因，有抗生素培养的压力会导致蓝藻突变株生长速度变慢，增加研究周期；3、培养基中添加抗生素会导致研究成本增加，更会引起环境的污染。而对蓝藻基因进行无痕迹敲除，即无抗生素基因的标记，会避免上述所有缺点，是一种最理想的基因敲除方式。

而根据现有的文献报道，在蓝藻中进行基因无痕敲除的方法，都是要经过2步或者2步以上的遗传转化才能实现，使得构建无痕敲除的周期大约是有抗性敲除周期的3～4倍。例如利用Cre-loxP位点特异性重组酶系统：首先要通过同源重组在将敲除基因的上下游引入同向的loxP序列，这一步需要进行1次或者2次的遗传转化；然后在上一步的基础上再通过1次遗传转化转入一个穿梭载体，在这个穿梭载体上表达Cre重组酶，从而将两个同向的loxP位点之间的基因切除，这样被敲除的基因就被一个loxP序列所替代，然后再在无抗性板上连续划线10代左右，将后面转入的穿梭载体去除，最终可以获得一个无任何抗性标记的敲除突变株。

发明内容

本发明的目的是提供一种在蓝藻中只进行一步遗传操作就能最终得到基因无痕敲除的方法，大幅度缩短蓝藻中进行无痕敲除的时间，解决目前已有的蓝藻无痕敲除至少需要2步遗传转化而导致构建周期过长的技术问题，也为今后更快速的开发各种优质无抗性的蓝藻工程菌底盘生物提供一种方法。

为实现上述目的，本发明通过一步遗传转化将两个同向loxP序列以及序列之间包括的诱导型启动子驱动的Cre基因和选择标记基因序列替换目的基因，然后创造性的利用诱导型启动子诱导Cre重组酶的表达，最终获得无痕敲除的突变体。具体的，本发明的技术方案如下：

一种蓝藻基因无痕敲除的方法，包括以下步骤：

(1)设计构建一个无痕敲除载体，这个载体具有核心元件FlanKA—loxP—P₁—Cre—R—loxP—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB代表想要敲除的蓝藻基因X上下游的同源片段；loxP是一个由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，其中8bp的间隔序列同时也确定了loxP的方向，本核心元件的两个loxP序列是相同方向；P₁代表诱导型启动子，能够根据培养环境中的诱导条件调控Cre重组酶的表达；R代表选择标记基因；

(2)在无诱导条件的培养基中，将无痕敲除载体转入蓝藻中，然后在无诱导条件但有选择压力的平板培养基上连续划线传代阳性克隆，获得中间纯合突变株；

(3)将中间纯合突变株在无选择压力但存在诱导条件的平板培养基上划线培养，2代后即可获得无痕敲除突变体。

上述蓝藻基因无痕敲除的方法中，可以根据不同蓝藻物种选择比较适用的诱导型启动子，例如：在鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120中可以选用Cu²⁺诱导的启动子PpetE；在聚球藻Synechococcus sp.PCC 7002和集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803中可选用Fe³⁺诱导的启动子PisiAB；在聚球藻Synechococcus sp.PCC 7942中可选用Zn²⁺诱导的启动子Psmt。

上述蓝藻基因无痕敲除的方法中，FlanKA是要敲除基因X的上游同源片段，FlanKB是要敲除基因X的下游同源片段，其长度根据菌种而定，在丝状体蓝藻中(如鱼腥藻属、念珠藻属等)大小约为3Kb，在单细胞蓝藻(如聚球藻属、集胞藻属等)大小约为1Kb。

上述蓝藻基因无痕敲除的方法中，loxP的序列可以是5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’(SEQ ID No:15)或者为5’-ataacttcgtatatacatacgtatacgaagttat-3’(SEQ ID No:16)，要求核心元件中前后两个loxP的序列一致。

上述蓝藻基因无痕敲除的方法中，所述选择标记基因常见的为抗性标记基因，例如红霉素抗性基因(Em)、卡那霉素抗性基因(Kan)、新霉素抗性基因(Neo)、链霉素抗性基因(Sm)等。

上述蓝藻基因无痕敲除的方法中，可以通过自然转化的方法将所述无痕敲除载体转入蓝藻中，也可以通过三亲交配遗传转化方法。鱼腥藻属或者念珠藻属的丝状体蓝藻一般采用三亲交配遗传转化；而常见的单细胞蓝藻如聚球藻Synechococcus sp.PCC 7002、聚球藻Synechococcus sp.PCC 7942和集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803为天然感受态，可选用自然转化方法。

在本发明的一个实施例中，首先构建了无痕敲除载体PRL277Cre，其上具有核心元件FlanKA—loxP—PpetE—Cre—Em—loxP—FlanKB，其中受铜离子诱导的蓝细菌启动子PpetE能够根据培养环境中的铜离子的浓度来调控Cre重组酶的表达；然后在无铜离子的培养基中，将无痕敲除载体PRL277Cre通过三亲交配遗传转化进入鱼腥藻Anabaena sp.PCC7120中，接着在无铜离子培养基的红霉素抗性板上连续划线传代阳性克隆，获得中间纯合突变株；将中间纯合突变株在含铜离子培养基的无抗性板上划线培养，2代后即可获得无痕敲除突变体。

本发明提供了一种只需要进行一步遗传转化，创造性地通过控制培养基中诱导条件来达到蓝藻基因无痕敲除的方法，大幅度缩短了在蓝藻中进行无痕敲除的时间，且能降低培养成本，减少抗生素使用和基因对环境的污染，也为今后更快速的开发各种优质无抗性的蓝藻工程菌底盘生物提供一种方法。

附图说明

图1.无痕敲除载体PRL277Cre原理图和通过无铜再加铜获得无痕敲除突变体的示意图。

图2.hetR敲除中间突变体和无痕敲除突变体的PCR检验的电泳图。

图3.hetR无痕敲除突变体在无抗性的含N或不含N培养基下的表型图。

图4.野生型菌株WT、hetR无痕敲除突变体(△hetR)和hetR抗性敲除突变体(△hetR-Em)的生长速度曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

pRL277载体为实验室所有，该载体于1998年由美国宾夕法尼亚州立大学生化和分子生物系教授Donald A.Bryant教授赠送，原始文献来源T.A.Black,Y.P.Cai andC.P.Wolk,Spatial Expression and Autoregulation of Hetr,a Gene Involved in theControl of Heterocyst Development in Anabaena(Vol 9,Pg 77,1993),Mol Microbiol10(5),1153-1153。大肠杆菌HB101：购自takara公司，产品目录号：D9051。蓝细菌鱼腥藻属Anabaena sp.PCC 7120(来源于中国科学院淡水藻种库(FACHB))及其衍生的突变体，生长于BG11液体或者固体培养基中。BG11固体培养基：在BG11液体培养基中加入琼脂，使其终浓度为1.2％(质量百分含量，g/mL)。液体培养时，以照明日光灯光源，光强为25uE/m²·s，温度30℃，并通以含1％CO₂(v/v)的空气。用于选择生长所用的红霉素Em⁺抗生素浓度为：10μg/mL。

实验用的大肠杆菌菌株DH5α生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度分别为：75μg/mL Sm⁺，150μg/mL Em⁺。

其中Trace metal mix含有如下组分：

无铜离子的BG11培养基：即上述BG11培养基中不添加CuSO₄·5H₂O

无N源的BG11培养基：即上述BG11培养基中不添加NaNO₃

实施例1、蓝藻hetR无痕敲除突变体的构建和纯合验证

(1)hetR无痕敲除载体PRL277Cre的构建

hetR无痕敲除载体PRL277Cre的构建的示意图如图1中B所示，其中FlankA和FlankB分别表示hetR上下游各3KB的同源片段(参见图1中A)。以野生型鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120基因组总DNA为模板，利用引物对P1/P2、P3/P4分别扩增出FlanKA和FlanKB片段，利用引物对P5/P6、P7/P8分别扩增出PpetE和Cre片段，用引物对P9/P10扩增出红霉素Em基因片段；然后利用全式金一步无缝克隆试剂盒(

Seamless Cloning andAssembly Kit)将FlanKA、PpetE、Cre、Em、FlanKB五个片段同时连入pRL277质粒，得到无痕敲除载体PRL277Cre。由于引物P2、P5、P10、P3的5’端均设计加入了同方向的34bp的loxP序列，所以无痕敲除载体PRL277Cre上的核心元件为FlanKA—loxP—PpetE—Cre—Em—loxP—FlanKB。

(2)PRL277Cre转化蓝藻在无铜离子培养机上筛选中间突变体△hetR-Em

将hetR无痕敲除载体PRL277Cre通过三亲交配转入野生型鱼腥藻Anabaenasp.PCC7120基因组中，无痕敲除载体PRL277Cre与基因组发生同源双交换的示意图如图1中C所示，通过同源双交换将无痕敲除载体中loxP—PpetE—Cre—Em—loxP片段替换Anabaena sp.PCC 7120基因组的hetR基因间，三亲交配的方法如下：1、结合质粒pRL443和辅助质粒pRL528转化入大肠杆菌HB101，得到含有抗性基因Amp(氨苄青霉素)、Sm(链霉素)、Cm(氯霉素)和Tc(四环素)的重组菌甲；2、将无痕敲除载体PRL277Cre转入重组菌甲中，得到重组菌乙，用LB培养基洗涤3次；3、将野生型鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120用无铜离子的Bg11液体培养基洗涤3次；4、将步骤2的重组菌乙和步骤3处理的野生型鱼腥藻Anabaenasp.PCC 7120离心后置于悬浮培养基(将LB培养基和无铜离子的Bg11培养基等体积混合得到的培养基)，充分混合，于室温低光照培养条件下静置4小时；5、在无铜离子的Bg11固体培养基上覆盖无菌硝酸纤维素膜，然后将菌体混合物涂布无菌硝酸纤维素膜上，光照培养直至长出新生的蓝细菌菌落。

在含蔗糖红霉素Em的无铜离子BG11固体的平板上筛选阳性菌株，连续划线传代(约3代)使得突变体纯合。利用引物对P11和P12对阳性菌株进行PCR鉴定(鉴定结果见图2中A，WT的PCR条带大小为1328bp，而中间突变体的PCR条带大小为3417bp)，鉴定结果表明，阳性菌株已经完全看不到野生菌的特异条带，即阳性菌株△hetR-Em已经纯合。

(3)在含铜离子培养基上筛选最终无痕突变体△hetR

将纯合中间菌株△hetR-Em在含铜离子BG11固体的平板划线2代，由于铜离子的诱导PpetE启动子表达Cre重组酶，将两个同向loxP位点之间的基因序列全部切除(见图1中D)，最终hetR基因被loxP位点替代，从而得到最终的hetR无痕敲除突变体。利用引物对P13和P14对阳性菌株进行PCR鉴定(鉴定结果见图2中B，WT的PCR条带大小为1149bp，而无痕敲除突变体的PCR条带大小为283bp)，鉴定结果表明，纯合的hetR无痕敲除突变体△hetR构建成功。

(4)本发明一步无痕敲除、常规无痕敲除和有抗性敲除方法周期对比

我们统计了在蓝藻中本发明的一步无痕敲除、常规无痕敲除和有抗性敲除这三种方法的数据如表1。可以发现，本发明的一步无痕敲除方法，对比常规无痕敲除，需要构建更少的敲除载体，并且极大缩短了构建完成的周期，而对比有抗敲除又有着没有抗生素基因干扰的优势。

表1本发明的一步无痕敲除的数据优势表

	是否带有抗性标记	需构建的载体(个)	完成的周期(天)
				一步无痕敲除	否	1	约30天
常规无痕敲除	否	2～3	60～90天
				有抗性敲除	是	1	约30天

实施例2、蓝藻hetR无痕敲除突变体的表型验证

(1)表型验证

通过PCR鉴定无痕敲除突变体△hetR构建成功后，对△hetR突变体的表型进行验证。HetR蛋白是丝状蓝藻异形胞分化的主要调控蛋白，缺失hetR基因丝状蓝藻在缺N时将不能分化异形胞。分别将WT野生型鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120和△hetR在含有N和无N的无抗培养基中培养，可以发现在含N培养基中，WT与△hetR表型无差别(图3的A和B)；而在无N的无抗培养基中时，WT可以分化异形胞(图3中C，箭头所示)，而△hetR不能分化异形胞(图3中D)。这些结果表明，在无抗生素培养条件下，△hetR表型与文献报道吻合，说明我们构建的△hetR无痕敲除突变体确实失去了hetR基因的功能。

(2)生长曲线测定

为了验证无痕敲除突变体△hetR相对于抗性敲除的突变体△hetR-Em的生长速度上的优势，我们分别测定了WT野生型鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120、无痕敲除突变体△hetR和抗性敲除的突变体△hetR-Em的生长曲线。通过统计计算，WT的代时为6.1小时，△hetR为6.3小时，而△hetR-Em的代时为7.5小时。这也说明我们构建的无痕敲除突变体△hetR的生长状态不会受到添加抗生素的影响。

表2本发明所用的引物序列

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 一步转化进行蓝藻基因无痕敲除的方法

<130> WX2019-03-187

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatggcagaa attcgatatc taaagaacat ttacaagagg tacggc 46

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatattaca aatagttgaa tagcacgc 58

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatgcacc cagagtgaat aaaagtac 58

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaacgttgt tgccattgct gcagtatatc ttaactatta acgggt 46

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgatctt agccttaaac aagtaa 56

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acggtcagta aattggacat ctcctaacct gtagttttat tt 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaataaaact acaggttagg agatgtccaa tttactgacc gt 42

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagtataatt atagcacgcg ctaatcgcca tcttccagca ggc 43

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctgctgga agatggcgat tagcgcgtgc tataattata cta 43

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatctcatg tttgacagct tatcatc 57

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgttgtgtt gctatctcc 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cattactagt acttttattc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gagcatcttg accattaatc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atcgctgctg tgtcatctgc 20

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ataacttcgt atatacatac gtatacgaag ttat 34

Claims

1.一种蓝藻基因无痕敲除的方法，包括以下步骤：

1)设计并构建一个无痕敲除载体，其上具有核心元件FlanKA—loxP—P₁—Cre—R—loxP—FlanKB，其中：FlanKA和FlanKB分别代表想要敲除的蓝藻基因X上下游的同源片段，其长度在丝状体蓝藻中为3Kb，在单细胞蓝藻中为1Kb；两个loxP序列方向相同；P₁代表诱导型启动子，能够根据培养环境中的诱导条件调控Cre重组酶的表达；R代表选择标记基因；

2)在无诱导条件的培养基中，将无痕敲除载体转入蓝藻中，其中，通过自然转化的方法将所述无痕敲除载体转入单细胞蓝藻中，或者通过三亲交配遗传转化方法将所述无痕敲除载体转入丝状体蓝藻中；然后在无诱导条件但有选择压力的平板培养基上连续划线传代阳性克隆，获得中间纯合突变株；

3)将中间纯合突变株在无选择压力但存在诱导条件的平板培养基上划线培养，2代后即可获得无痕敲除突变体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导型启动子选自Cu²⁺诱导的启动子PpetE、Fe³⁺诱导的启动子PisiAB、Zn²⁺诱导的启动子Psmt。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，loxP的序列为5’-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3’或5’-ataacttcgtatatacatacgtatacgaagttat-3’，所述核心元件中前后两个loxP的序列一致。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择标记基因为抗性标记基因。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗性标记基因是红霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因或链霉素抗性基因。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蓝藻为鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120，首先构建无痕敲除载体，其上具有核心元件FlanKA—loxP—PpetE—Cre—Em—loxP—FlanKB，其中FlankA和FlankB分别代表想要敲除的蓝藻基因上下游各3KB的同源片段，受铜离子诱导的启动子PpetE能够根据培养环境中的铜离子的浓度来调控Cre重组酶的表达；然后在无铜离子的培养基中，将所述无痕敲除载体通过三亲交配遗传转化进入鱼腥藻Anabaena sp.PCC 7120中，接着在无铜离子培养基的红霉素抗性板上连续划线传代阳性克隆，获得中间纯合突变株；将中间纯合突变株在含铜离子培养基的无抗性板上划线培养，2代后即可获得无痕敲除突变体。