CN103966249B

CN103966249B - 一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用

Info

Publication number: CN103966249B
Application number: CN201310028228.7A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 谈晓明; 梁飞燕
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2033-01-24
Also published as: CN103966249A

Abstract

本发明涉及蓝细菌基因工程领域。具体而言，本公开涉及用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的载体，包括所述载体的启动子和基因元件，以及构建无筛选标签的蓝细菌突变株的方法。

Description

一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用

技术领域

本发明涉及蓝细菌基因工程领域，具体而言是一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用。

背景技术

蓝细菌广泛分布于地球各种环境中，是一类能够进行植物型光合作用的原核生物。1996年，日本Kazusa研究所完成了蓝细菌集胞藻PCC6803全基因组测序工作，这是第一个完成全基因组测序的光合生物；到目前为止，已经有约40多种蓝细菌基因组被测序完成。另外，由于蓝细菌具有细胞结构简单、易于培养、生长相对迅速、遗传操作简单方便等优势，包括集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942和鱼腥藻PCC7120在内的一些蓝细菌菌株，成为光合作用、昼夜节律和固氮机理等研究的重要模式生物。

近年来，在能源和环境危机的背景下，基于生物质资源的通过生物或化学转化制备生物燃料的研究再次成为研究热点。而蓝细菌由于具有高效的光合作用能力、清晰的遗传背景、简单方便的遗传操作体系等优势，又被改造成为新一代光合能源微生物系统（Angermayr,S.A.,etal.(2009).“Energybiotechnologywithcyanobacteria”,CurrOpinBiotechnol20(3):257-263.），用于合成各种生物燃料分子，如乙醇（Dexter,J.andFu,P.(2009).“Metabolicengineeringofcyanobacteriaforethanolproduction”,Energy&EnvironmentalScience2(8):857-864.；Gao,Z.,H.Zhao,etal.(2012).″Photosyntheticproductionofethanolfromcarbondioxideingeneticallyengineeredcyanobacteria.″Energy&EnvironmentalScience5(12):9857-9865.）、正丁醇（Lan,E.I.andJ.C.Liao(2012).″ATPdrivesdirectphotosyntheticproductionof1-butanolincyanobacteria.″ProcNatlAcadSciUSA109(16):6018-6023.）、异丁醇（Atsumi,S.,etal.(2009).“Directphotosyntheticrecyclingofcarbondioxidetoisobutyraldehyde”,Nat.Biotechnol.27:1177-1180.）、脂肪醇（Tan,X.,L.Yao,etal.(2011).″Photosynthesisdrivenconversionofcarbondioxidetofattyalcoholsandhydrocarbonsincyanobacteria."MetabEng13(2):169-176.）、脂肪酸（Liu,X.,J.Sheng,etal.(2011).″Fattyacidproductioningeneticallymodifiedcyanobacteria.″ProcNatlAcadSciUSA108(17):6899-6904.）和脂肪烃（Schirmer,A.,M.A.Rude,etal.(2010).″Microbialbiosynthesisofalkanes.″Science329(5991):559-562.）等。自2009年以来，相关研究证明了基因工程蓝细菌合成生物燃料的可能性和巨大应用潜力，也引起了国际上学术界和工业界的高度关注。不过，产品产率不高以及由此引起的生产成本过高，又成为限制了基因工程蓝细菌合成生物燃料路线产业化应用的主要瓶颈问题。

为了不断提高蓝细菌合成生物燃料的产量，对蓝细菌基因组系统地遗传改造工作就显得十分重要。传统的蓝细菌遗传操作手段多通过同源重组的方式将筛选标签（多为抗性筛选标签）插入待改造基因位点中或置换其部分编码序列。这种遗传改造方式依赖于可用的抗性筛选标签数目，已经不能满足多基因位点（3个以上）乃至基因组范围的遗传改造工作。因此，开发一种能够在蓝细菌中切除筛选标签，构建无筛选标签突变株的方法，对于蓝细菌系统地遗传改造工作，和基因工程蓝细菌生产生物燃料研究具有重要的意义。

位点特异性重组系统，如Flp/FRT或Cre/LoxP等，就是一种能够实现筛选标签基因组内切除的有效工具，目前已经在包括E.coli（Datsenko,K.A.andB.L.Wanner(2000).″One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.″ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97(12):6640-6645.和植物（Li,B.,N.Li,etal.(2010).″Generationofmarker-freetransgenicmaizewithimprovedsalttoleranceusingtheFLP/FRTrecombinationsystem.″JBiotechnol145(2):206-213.）等许多模式生物体系中成功应用。以Flp/FRT重组系统在E.coli的应用为例，它的基本原理是，首先，在第一轮转化中通过抗生素筛选得到基因组的特定位置被带有FRT侧翼的抗性基因片段插入的突变株；然后，通过第二轮转化将flp基因导入到上述突变株，并诱导其表达，而FLP则特异地切除并连接抗性基因片段两侧的FRT位点实现抗性标签的切除；最终，通过热激等条件诱导实现flp表达质粒的丢失。而重复这一过程就能实现在多个基因位点的遗传改造。其中Flp/FRT系统中的Flp酶，最适反应温度为30°C，这与大多数蓝细菌最适生长温度一致，适合用于构建无筛选标签的基因工程蓝细菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，包含抗性基因片段和FLP基因元件；所述FLP基因元件包含FLP基因和用于驱动FLP基因的启动子；所述FLP基因由诱导型启动子控制。

所述驱动FLP基因启动子为P_petJ启动子、P_tac启动子、P_petE、P_rbp1、P_isiA或P_nrsB。

所述FLP基因为酿酒酵母的FLP基因。所述用于构建无筛选标签蓝细菌的载体如序列表SEQIDNO:5的碱基序列所示。所述抗性基因片段为Omega片段、氯霉素抗性基因片段或红霉素抗性基因片段。

所述蓝细菌为集胞藻（Synechocystissp.）PCC6803、聚球藻（Synechococcuselongatussp.）PCC7942、聚球藻（Synechococcussp.）PCC7002、鱼腥藻（Anabaenasp.）PCC7120或嗜热聚球藻（Thermosynechococcuselongatus）BP-1。

用于构建无筛选标签蓝细菌的载体的应用，利用所述载体诱导FLP基因表达获得无筛选标签蓝细菌突变株。

本发明所具有的优点：

本发明利用来源于酿酒酵母的FLP/FRT重组系统构建无筛选标签的蓝细菌突变株。

本发明利用在蓝细菌中具有活性的启动子驱动FLP酶在带有FRT侧翼的抗性基因敲除的蓝细菌突变株中表达，利用FLP特异性切除并连接FRT位点的特点，构建无筛选标签的蓝细菌突变株。获得的切除抗性片段后的突变株，可以多次被遗传改造，最终得到的还是无筛选标签的蓝细菌突变株。本发明由FLP/FRT重组系统能够很好的切除蓝细菌突变株基因组中的抗性基因片段，可以实现对蓝细菌多个基因位点乃至基因组规模的系统改造。

附图说明

图1为本发明实施例提供的质粒pXT218a的基本结构图。其中元件包括P_tac启动子、P_petJ启动子、flp基因、T_rrnB终止子和Omega片段。

图2为本发明实施例提供的质粒pXT218b的基本结构图。其中元件包括P_tac启动子、Omega片段、P_petJ启动子、flp基因和T_rrnB终止子。

图3为本发明实施例提供的反转录PCR检测FLP基因在蓝细菌突变株转录效果图。其中M，200bpDNA标准品；B，以无菌水作为模板；W，以野生型集胞藻PCC6803或野生型聚球藻PCC7942cDNA作为模板；+Cu，以普通BG11培养基培养的6803-XT206（pXT218b）细胞cDNA作为模板；-Cu，以缺铜BG11培养基培养的6803-XT206（pXT218b）细胞cDNA作为模板；-IPTG，以普通BG11培养基培养的7942-XT212(pXT218a)细胞cDNA为模板；+IPTG，以补加IPTG（终浓度1mM）BG11培养基培养的7942-XT212(pXT218a)细胞cDNA为模板。

图4为本发明实施例提供的FLP表达后蓝细菌突变株基因型检测结果图。其中A图为集胞藻PCC6803野生型、phaAB基因突变株以及后续FLP表达后phaAB突变株基因型检测结果；B图为聚球藻PCC7942野生型、NS1基因突变株以及后续FLP表达后NS1突变株基因型检测结果。A、B图中，M为200bpDNA标准品；WT为以野生型集胞藻PCC6803或野生型聚球藻PCC7942基因组DNA作为模板；MT为以phaAB突变株或NS1突变株DNA作为模板；S为以诱导条件下培养的6803-XT206（pXT218b）或7942-XT212(pXT218a)细胞DNA作为模板。

图5为本发明实施例提供的FLP表达质粒丢失后突变株基因型检测结果图。其中A，B图为，以flp-F和flp-R引物对PCR检测各菌株中pXT218b和pXT218a质粒的丢失情况；C图为以pha-c1和pha-c2引物检测各突变株phaAB位点基因型；D图为，以7942-NS1-seq-1和7942-NS1-seq-2引物对PCR检测检测各突变株NS1位点基因型。图A、B、C和D图中M为200bpDNA标准品；BC为以无菌水作为模板；W为以pXT218b或pXT218a质粒作为模板；C为以未诱导质粒丢失的突变株(在补加壮观霉素或链霉素的BG11培养基培养)DNA为模板；1-4，以随机选取的4个对壮观霉素（或链霉素）和卡那霉素敏感的单克隆DNA作为模板。

其中，

SEQIDNO:1：质粒pXT218a序列。

SEQIDNO:2：质粒pXT218b序列。

SEQIDNO:3：切除抗性标签后的phaAB突变株phaAB位点附近的DNA序列。

SEQIDNO:4：切除抗性标签后的NS1突变株NS1位点附近的DNA序列。

SEQIDNO:5：来源于酿酒酵母的Flipase酶基因序列。

具体实施方式

相关术语

蓝细菌（也称为蓝藻）是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。

FLP酶（Flipase，FLP）是能够特异性的剪切和连接FRT位点的酶。

FRT位点（FlipaseRecognitionTarget，FRT）是一段长度为34bp的特定DNA序列（GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC）。

细胞色素c553（cytochromec553，PetJ）是光合作用中将电子由细胞色素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体，在集胞藻PCC6803基因组其编码基因为petJ，sll1796。在本发明的实施方案中，将它的启动子（本发明的实施方案中表示为P_petJ）克隆用于驱动FLP基因在集胞藻PCC6803中的表达，（其具体序列如SEQIDNO:5的碱基序列所示）

tac启动子(P_tac)是大肠杆菌色氨酸启动子（P_trp）和乳糖启动子（P_lac）的杂合启动子。在本发明的实施方案中，该启动子被用于驱动FLP基因在聚球藻PCC7942中的表达，其具体序列为TGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC。

phaAB基因簇是集胞藻PCC6803基因组中编码酮硫解酶（beta-ketothiolase）和乙酰乙酰辅酶还原酶（acetoacetyl-CoAreductase）的基因。本发明的实施方案就是通过同源重组将带有FRT侧翼序列的抗性基因片段置换该基因簇的编码序列，从而构建得到集胞藻PCC6803phaAB突变株。

NS1位点是聚球藻PCC7942基因组中的一个中性位点（neturalsite）。本发明的实施方案就是通过同源重组在该位点整合带有FRT侧翼序列的抗性基因片段，从而构建得到聚球藻PCC7942NS1突变株。

在本发明的实施方案中，载体（vector）是指能够将DNA片段（目的基因）转移到受者细胞中的一种自我复制的DNA分子。

“杂交”表示这样一个过程：在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）（或尿嘧啶（U））之间（则这称为A-T键）或在互补碱基鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之间（则这称为G-C键）形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的（则称为互补序列），即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分的（则称为足够互补的序列），即获得的双链包含允许形成双链的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。

如本领域已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0%到至少大约15%v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-30℃到大约42℃。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少大约16%v/v到至少大约30%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31%v/v到至少大约50%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行：T_m=69.3+0.41(G+C)%（Marmur和Doty,J.Mol.Biol.5：109,1962）。但是，每增加1%的错配碱基对数目，双链体DNA的T_m下降1℃（Bonner和Laskey,Eur.J.Biochem.46.：83,1974）。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定：低严紧杂交条件是6xSSC缓冲液，1.0%w/vSDS，在25-42℃下；中等严紧杂交条件是2xSSC缓冲液，1.0%w/vSDS，在20℃至65℃的温度下；高严紧杂交条件是0.1xSSC缓冲液，0.1%w/vSDS，在至少65℃的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen,(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第1部分,第2章(Elsevier,NewYork);和Ausubel等人,编辑(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章（GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork）。还可参见Sambrook等人,(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual（第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork）。

“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数（即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数（例如，重叠位置）×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目（即，窗的大小），并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman（Adv.Appl.Math.2：482,1970）的局部同源性算法；Needleman和Wunsch（J.Mol.Biol.48：443,1970）的同源性比对算法；Pearson和Lipman（Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444,1988）的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施（例如，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLASTP、BLASTN和TFASTA）；或手工比对和目测检查（参见，例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology（1995增刊））。

本发明的实施方案所涉及的同一性百分比包括至少大约60%，或至少大约65%，或至少大约70%，或至少大约75%，或至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或更高，例如大约95%，或大约96%，或大约97%，或大约98%，或大约99%，例如至少大约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。

本发明用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的载体为质粒pXT218a和质粒pXT218b。所述载体可以包含在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的FLP酶基因。

所述载体还可以包含RSF1010复制子，用于使所述载体能够在蓝细菌中自主复制。所述在蓝细菌中具有活性的启动子可以选自P_petJ启动子和P_tac启动子。另外，在本发明的实施方案中还可以使用P_petE、P_rbp1、P_isiA和P_nrsB。

所述FLP酶基因可以为选自下列的基因：来源于酿酒酵母的flp基因，另外，在本发明的实施方案中还可以使用与上述基因具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更加优选地至少95%同一性，最优选地至少99%同一性，并且编码具有FLP酶活性的蛋白质的基因；或者与上面所列基因在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下杂交，并且编码具有FLP酶活性的蛋白质的基因。

所述蓝细菌为集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942。另外，在本发明的实施方案中还可以使用聚球藻（Synechococcussp.）PCC7002、鱼腥藻（Anabaenasp.）PCC7120和嗜热聚球藻（Thermosynechococcuselongatus）BP-1。

实施例1：

构建用于在蓝细菌表达FLP基因从而得到无筛选标签蓝细菌突变株的载体pXT218a或pXT218b：

为了验证FLP/FRT系统用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的可行性，基于穿梭载体pRL59EH构建了载体pXT218b和pXT218a。在这两个载体中，P_petJ启动子和P_tac启动子分别被用于驱动FLP基因在两种蓝细菌(集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942)的突变株中表达。

1）质粒pXT218a的构建

以PpetJ-F（CATCGGGGGCTGTGTTGGC）和PpetJ-R（GTGTTTTACATAATATACCAAATTGTGGCATATGTTCTCCTTTCAAGGATAAAGT）为引物对，以集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR扩增（反应体系如表1所示；反应程序如表2所示）；再以Flp-F（ACTTTATCCTTGAAAGGAGAACATATGCCACAATTTGGTATATTATGTAAAACAC）和Flp-R（TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGG）为引物对，以质粒pCP20（Datsenko,K.A.andB.L.Wanner(2000).″One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.″ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97(12):6640-6645.）为模板进行PCR扩增（反应体系如表1所示；反应程序如表2所示）；将上述两步分别得到的PCR产物分别用回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）收后，等摩尔比混合，不加任何引物，通过融合PCR串联（融合PCR反应体系中除了不添加任何引物和模板，其他如表1所示；反应程序除了退火温度由55℃改为50℃，循环次所由30次改为10次，其他如表2所示）；取融合PCR产物为模板，以PpetJ-F（CATCGGGGGCTGTGTTGGC）和Flp-R（TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGG）为引物对，再次PCR（反应体系如表1所示；反应程序除了72℃延伸时间改为2分钟，其他如表2所示），将得到的PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,CatalogNo.:D101A）中，从而得到质粒pXT208。

表1.PCR反应体系a

试剂	生产商及货号	用量或浓度
			10X Taq Buffer with(NH4)2SO4	Fermentas，Catalog No.:EP0402	5μL
25mM MgCl2	Fermentas，Catalog No.:EP0402	4μL
			Taq DNA Polymerase 5U/L	Fermentas，Catalog No.:EP0402	0.5μL
dNTP Mixture	Takara,Catalog No.:4030	4μL
			引物1	上海桑尼公司合成	0.4μM
引物2	上海桑尼公司合成	0.4μM
			DNA模板		1ng
无菌水		补充至50μL

^a本说明书中涉及的所有PCR反应体系，大致相同；如说明书特别指出的，不同PCR反应所用的引物可能有差别。

表2.PCR反应程序a

^a本说明书中涉及的所有PCR反应，均在Bio-radMyCyclerThermalCyclerPCR仪中进行；反应程序大致相同，部分PCR反应72℃延伸时间或重复循环次数有差别。

用DraI（Takara,CatalogNo.:D1037A）酶切质粒pRL57（Elhai,J.andC.P.Wolk(1988).″Aversatileclassofpositive-selectionvectorsbasedonthenonviabilityofpalindrome-containingplasmidsthatallowscloningintolongpolylinkers.″Gene68(1):119-138.），用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约1.9kb的Omega片段；将质粒pXT208经XbaI（Takara,CatalogNo.:D1093A）酶切为线性条带，并用T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平；将两片段通过T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）相连得到质粒pXT217a。

用SmaI（Takara,CatalogNo.:D1085A）酶切质粒pRL59EH（Black,T.A.andC.P.Wolk(1994).″AnalysisofaHet-mutationinAnabaenasp.strainPCC7120implicatesasecondarymetaboliteintheregulationofheterocystspacing.″J.Bacteriol.176(8):2282-2292.），用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约9kb的线性条带；将质粒pXT217a经BamHI（Takara,CatalogNo.:D1010A）和PstI（Takara,CatalogNo.:D1073A）酶切，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约3.7kb的片段，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平；将两片段通过T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）相连得到SEQIDNO:1所示质粒pXT218a（有效长度12545碱基对），即为构建无筛选标签蓝细菌的载体（参见图1）。

2)质粒pXT218b的构建

用DraI（Takara,CatalogNo.:D1037A）酶切质粒pRL57（Elhai,J.andC.P.Wolk(1988).″Aversatileclassofpositive-selectionvectorsbasedonthenonviabilityofpalindrome-containingplasmidsthatallowscloningintolongpolylinkers.″Gene68(1):119-138.），用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约1.9kb的Omega片段；将质粒pXT208经SalI（Takara,CatalogNo.:D1080A）酶切，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平；将两片段通过T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）相连得到质粒pXT217b。

用SmaI（Takara,CatalogNo.:D1085A）酶切质粒pRL59EH（BlackT.A.和WolkC.P.，1994），用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约9kb的片段；将质粒pXT217b经BamHI（Takara,CatalogNo.:D1010A）和PstI（Takara,CatalogNo.:D1073A）酶切，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约3.7kb的片段，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平；将两片段通过T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）相连得到SEQIDNO:2所示质粒pXT218b（有效长度12545碱基对），即为构建无筛选标签蓝细菌的载体（参见图2）

实施例2：

利用含有FRT侧翼的卡那霉素抗性基因片段构建携带有抗性筛选标签的蓝细菌突变株

为了验证FLP/FRT系统用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的可行性，基于含有FRT侧翼的卡那霉素抗性基因片段，构建了分别用于在集胞藻PCC6803中敲除phaAB基因以及在聚球藻PCC7942中敲除NS1基因的质粒pXT206和pXT212。这两个质粒分别含有phaAB位点和NS1位点两侧的上、下游同源DNA片段，以及位于上、下游同源DNA片段之间的卡那霉素抗性基因片段（抗性基因片段两侧带有FRT位点）。通过转化(transformation)的方式，将这两个质粒分别导入集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942，由于质粒含有同源DNA片段，因此将与基因组发生同源双交换，从而将卡那霉素抗性基因片段（抗性基因片段两侧带有FRT位点）整合到蓝细菌基因组。利用卡那霉素筛选，最终得到携带有抗性筛选标签(抗性筛选标签两侧带有FRT位点)的两个蓝细菌突变株，6803-XT206和7942-XT212。具体实验过程描述如下：

1)质粒pXT206的构建

以phaAB-1（GGGGACCATCCTGACTACACGG）和phaAB-2（TTCCAATGCCATGGGTTGGGAT）为引物对，以集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR扩增（反应体系如表1所示；反应程序如表2所示），并用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）收约1kb的PCR产物，然后用T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）将PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,CatalogNo.:D101A）中，从而得到质粒pKC102。

以phaAB-3（GTAGCCATGGTAGCTATGTCACCG）和phaAB-4（TGTTGATGGTGGGTATCGTGGTG）为引物对，以集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR扩增（反应体系如表1所示；反应程序如表2所示），并用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）收约1kb的PCR产物，然后用T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）将PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,CatalogNo.:D101A）中，从而得到质粒pKC103。

用NcoI和BamHI酶切质粒pKC102，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收4kb的片段；用NcoI和BamHI酶切pKC103，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）收1kb的片段；将上述回收的两片段用T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）连接得到质粒pKC104。

用NcoI（Takara,CatalogNo.:D1160A）酶切质粒pKC104，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约4.7kb的片段；将质粒pKD4（Datsenko,K.A.andB.L.Wanner(2000).″One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.″ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97(12):6640-6645.）用NdeI（Takara,CatalogNo.:D1161A）和ClaI（Takara,CatalogNo.:D1034A）酶切，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收1.8kb的片段；将两片段相连得到质粒pXT206。

2）质粒pXT212的构建

以7942-NS1-F（TGGATGTGATCGGAACCCTGA）和7942-NS1-R（TCATCACTGCCACTGTCCTGC）为引物对，以聚球藻PCC7942基因组为模板进行PCR（反应体系如表1所示；反应程序除了72℃延伸时间改为2分钟外，其他如表2所示），并用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约2.1kb的PCR产物，然后用T4DNA连接酶（Fermentas,CatalogNo.:EL0011）将PCR产物克隆到pMD18-T载体（Takara,CatalogNo.:D101A）中，从而得到质粒pXT176。

用XhoI（Takara,CatalogNo.:D1094A）酶切质粒pXT176，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收约4.8kb的片段；将质粒pKD4（Datsenko,K.A.andB.L.Wanner(2000).″One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.″ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences97(12):6640-6645.）用NdeI（Takara,CatalogNo.:D1161A）和ClaI（Takara,CatalogNo.:D1034A）酶切，T4DNA聚合酶（Fermentas,CatalogNo.:EP0061）补平，用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）回收1.8kb的片段；将两片段相连得到质粒pXT212。

2）通过转化得到携带有抗性筛选标签的蓝细菌突变株6803-XT206和7942-XT212

a）取处于对数生长期（OD₇₃₀约为0.5～1.0）的野生型集胞藻PCC6803或聚球藻PCC7942细胞培养物10mL，离心收集细胞；并用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mLBG11培养基（1.5gL^-1NaNO₃,40mgL^-1K₂HPO₄·3H₂O,36mgL^-1CaCl₂·2H₂O,6mgL^-1柠檬酸,6mgL^-1柠檬酸铁铵,1mgL^-1EDTA二钠盐,20mgL^-1NaCO₃,2.9mgL^-1H₃BO₃,1.8mgL^-1MnCl₂·4H₂O,0.22mgL^-1ZnSO₄·7H₂O,0.39mgL^-1NaMoO₄·2H₂O,0.079mgL^-1CuSO₄·5H₂O和0.01mgL^-1CoCl₂·6H₂O）中。

b）取0.2mL细胞悬液于新的1.5mLEP管中，加入2～3μg质粒（将集胞藻PCC6803细胞与质粒pXT206混合；将聚球藻PCC7942细胞与质粒pXT212混合），混匀，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下温育5小时。

c）将藻细胞与质粒DNA的混合物涂布于铺在BG11平板（未加抗生素）上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有25μgmL^-1卡纳霉素的BG11平板上，并在30℃、30μEm^-2s^-1的光照条件下继续培养。大约5～7天，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板（补加25μgmL^-1卡纳霉素）划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体BG11（补加25μgmL^-1卡纳霉素）培养基，在30℃、30μEm^-2s^-1光照，140转每分钟的振荡条件下培养。

d）取培养到平台期的液体细胞培养物，按1:100的比例接种到新鲜的含有相同抗生素的BG11培养基中，并在相同温度、光照和转速条件下培养；待细胞重新生长到平台期后，再次按1:100的比例将其接种到新鲜的含有相同抗生素的BG11培养基中。当细胞再次生长到平台期，取1.5mL培养物，离心收集细胞；加入200μLTE缓冲液（10mMTris,pH8.0,1mMEDTA）,加入50mg石英砂粉末，再加入200μL酚：氯仿：异戊醇混合物（酚：氯仿：异戊醇=25:24:1（V/V）），漩涡震荡5分钟；离心，回收上层溶液，并利用酒精沉淀DNA；再次离心，弃上清，并用70%乙醇洗涤沉淀两次，最后将DNA沉淀溶解于20μLTE缓冲液。取提取得到的DNA作为模板，分别以pha-c1/pha-c2（pha-c1为GGGGGGATTTGTTTATTTGTTGTCA；pha-c2为CCCCATTTACCCGTAATACTTCGCC）为引物对PCR检测phaAB突变株及集胞藻PCC6803野生型的在phaAB位点的基因型；以7942-NS1-seq-1/7942-NS1-seq-2（7942-NS1-seq-1为GTTATCTCTCGGCTAGTGGAC和7942-NS1-seq-2为GTAGGGATTTCGCCAGATCAATG）为引物对PCR检测NS1突变株及聚球藻PCC7942野生型在NS1位点的基因型（反应体系如表1所示；反应程序除了72℃延伸时间改为2分钟外，其他如表2所示）。结果如图4所示。

e）发生同源双交换，抗性基因片段整合到基因组，那么通过PCR就能够发现突变株PCR条带大小与野生型不同；而由于蓝细菌染色体是多拷贝的，突变株中除了整合抗性片段的染色体还含有野生型的染色体拷贝，那么通过PCR应该还能够扩增出与野生型为模板时PCR一样大小的条带。

图4的PCR结果显示，相比于野生型菌株，phaAB突变株和NS1突变株中的PCR条带与野生型条带明显不同，大小符合预期，因此卡那霉素抗性片段分别整合到了蓝细菌基因组的特定位置。而phaAB突变株和NS1突变株中的PCR条带均为单一条带，而没有与野生型PCR条带大小相同的条带出现，因此两个突变株已经分离完全，为纯合的突变株。phaAB突变株和NS1突变株分别被命名为6803-XT206和7942-XT212。

实施例3

载体pXT218a或pXT218b用于构建无筛选标签的蓝细菌突变株：

为了验证pXT218a或pXT218b是否用于构建无筛选标签蓝细菌突变株，我们首先通过接合转移(conjugaltransfer)的方式将这两个质粒分别转移到携带有抗性筛选标签(抗性筛选标签两侧带有FRT位点)的两个蓝细菌突变株7942-XT212和6803-XT206中。然后，通过加入IPTG和缺铜培养基培养的方式诱导FLP基因表达，以反转录PCR（RT-PCR）检测FLP基因的转录表达情况，以PCR方式检测突变株相应基因位点基因型的变化，以DNA测序的方式分析突变株相应基因位点DNA序列的变化。最后，通过质粒自然丢失的方式，将FLP表达质粒从突变株中移除。具体实验过程如下：

1.蓝细菌的接合转移以及接合子的筛选

1）取处于对数生长期（OD₇₃₀约为0.5～1.0）的6803-XT206和7942-XT212藻株细胞10mL，离心收集细胞；并用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mLBG11培养基（1.5gL^-1NaNO₃,40mgL^-1K₂HPO₄·3H2O,36mgL^-1CaCl₂·2H₂O,6mgL^-1柠檬酸,6mgL^-1柠檬酸铁铵,1mgL^-1EDTA二钠盐,20mgL^-1NaCO₃,2.9mgL^-1H₃BO₃,1.8mgL^-1MnCl₂·4H₂O,0.22mgL^-1ZnSO₄·7H₂O,0.39mgL^-1NaMoO₄·2H₂O,0.079mgL^-1CuSO₄·5H₂O和0.01mgL^-1CoCl₂·6H₂O）中待用。

2）将质粒pRL443和pRL623（ElhaI,J.,A.Vepritskiy,etal.(1997).″ReductionofconjugaltransferefficiencybythreerestrictionactivitiesofAnabaenasp.strainPCC7120.″JournalofBacteriology179(6):1998-2005.）分别与pXT218a或pXT218b共转化E.coliHB101菌株，分别得到E.coliHB101（pRL443+pRL623+pXT218a）和E.coliHB101（pRL443+pRL623+pXT218b）。将这两株E.coli菌株在LB培养基中过夜培养。10mL过夜培养物用新鲜LB培养基洗涤2次后，悬于1mL新鲜LB培养基中待用。

3）将上面两个步骤制备的藻细胞悬液与E.coli悬液等体积混合（6803-XT206藻细胞与E.coliHB101（pRL443+pRL623+pXT218b）混合；7942-XT212藻细胞与）E.coliHB101（pRL443+pRL623+pXT218a）混合），并涂布于铺在BG11平板（未加抗生素）上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μEm^-2s^-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有20μgmL^-1壮观霉素(用于筛选6803-XT206的接合子)或2μgmL^-1链霉素(用于筛选7942-XT212的接合子)BG11平板上，并在30℃、30μEm^-2s^-1的条件下继续培养。

4）大约5～7天，将接合子从平板上挑出，在新鲜的含有相同抗生素的BG11平板划线。

5）pXT218b和pXT218a分别通过接合转移被转移到6803-XT206和7942-XT212后，得到的藻株命名为6803-XT206(pXT218b)和7942-XT212(pXT218a)。

2.FLP在蓝细菌中的转录表达分析

1）6803-XT206(pXT218b)藻株培养：分别在温度为30℃、光照强度为30μEm^-2s^-1和转速为140转每分钟的摇床培养条件下，在100mL普通液体BG11和缺铜BG11培养基（用去离子水配置，除了不加CuSO₄·5H₂O，培养基成分与BG11相同）中培养6803-XT206(pXT218b)藻株至对数期，同时在100mL普通液体BG11中培养集胞藻PCC6803野生型作为对照；

2）7942-XT212(pXT218a)藻株培养：分别在温度为30℃、光照强度为30μEm^-2s^-1和转速为140转每分钟的摇床培养条件下，在普通液体BG11和补加IPTG至终浓度为1mM的液体BG11培养基中培养7942-XT212(pXT218a)藻株至对数期，同时在普通液体BG11中培养集胞藻PCC7942野生型作为对照；

3）上述各藻株总RNA的提取及cDNA的制备：将上述各种藻细胞培养至对数期后，离心收集50mL藻细胞，用Trizol（Invitrogen,美国）试剂参照生产商的说明提取细胞总RNA；用DNase（Fermentas，CatalogNo.:EN0525）处理总RNA以去除DNA污染；用M-MuLV反转录酶（Fermentas，CatalogNo.:EP0352）将RNA反转录得到cDNA；总RNA的提取，DNase消化以及反转录反应均按照产品说明书进行；

3）RT-PCR反应分析各藻株中FLP基因的转录表达情况：取各种条件下培养的藻细胞cDNA作为模板，分别以flp-rt-F/flp-rt-R（flp-rt-F为TGTGCTGCTGAACTAACC；flp-rt-R为GGCTTCCAGAATTGTTGC）为引物对进行PCR扩增（反应体系如表1所示；反应程序如表2所示），以检测各藻株细胞中flp基因的转录表达情况。

结果如图3所示，以无菌水（泳道B）和野生型PCC6803或PCC7942DNA（泳道W）作模板时，均未扩增出条带，说明两种野生型蓝细菌中没有FLP基因转录；而在导入pXT218b或pXT218a质粒的突变株中，无论普通培养条件（泳道+Cu，-IPTG）还是诱导条件（泳道-Cu，+IPTG），均扩增出flp基因条带。这说明，通过导入穿梭载体pXT218b或pXT218a，flp基因在两个蓝细菌突变株中均正常转录；flp基因在正常培养条件下存在一定的本底表达，不过在诱导条件下flp基因转录水平高于对照培养条件。

3.FLP表达对蓝细菌突变株相关位点基因型的影响分析

1）6803-XT206(pXT218b)藻株中FLP基因的诱导和突变株的分离：将6803-XT206(pXT218b)藻株在温度为30℃、光照强度为30μEm^-2s^-1和转速为140转每分钟的摇床培养条件下培养至对数期，通过稀释涂平板法在缺铜的BG11固体平板（含有20μgmL^-1壮观霉素）上分离单克隆；将得到的单克隆分别在缺铜的BG11固体平板（含有20μgmL^-1壮观霉素）和卡那霉素的BG11固体平板上划线，并在30度光照培养1周；

2）7942-XT212(pXT218a)藻株中FLP基因的诱导和突变株的分离：将7942-XT212(pXT218a)藻株在温度为30℃、光照强度为30μEm^-2s^-1和转速为140转每分钟的摇床培养条件下培养至对数期，通过稀释涂平板法在含有1mMIPTG的BG11固体平板（含有2μgmL^-1链霉素）上分离单克隆；将得到的单克隆分别在含有1mMIPTG的BG11固体平板（含有2μgmL^-1链霉素）和卡那霉素的BG11固体平板上划线，并在30度光照培养1周；

3）选择对壮观霉素（或链霉素）耐受，而对卡那霉素敏感的单克隆，按照实施例2第2部分第d)部分相同的方法提取基因组DNA，并通过PCR鉴定其基因型（phaAB突变株采用pha-c1和pha-c2为引物对进行PCR，其中pha-c1为GGGGGGATTTGTTTATTTGTTGTCA和pha-c2CCCCATTTACCCGTAATACTTCGCC；NS1突变株采用7942-NS1-seq-1和7942-NS1-seq-2为引物对进行PCR，其中7942-NS1-seq-1为GTTATCTCTCGGCTAGTGGAC；7942-NS1-seq-2为GTAGGGATTTCGCCAGATCAATG）。基因型检测的结果如图4所示，通过比较泳道MT和泳道S的PCR条带，无论是phaAB位点还是NS1位点，其DNA片段长度在诱导条件下比对照条件下少了约1.4kb，这一大小正是pXT206和pXT212质粒中带有FRT侧翼的卡那霉素抗性基因片段的大小。

4）将从诱导条件下培养的藻细胞DNA模板中扩增出的PCR条带（图4泳道S），用胶回收试剂盒（Omega,CatalogNo.:D2500-01）收后，再用DNA测序技术分析其核苷酸序列。分析测序结果(SEQIDNO:3和4)发现，卡那霉素抗性基因片段被从原突变株基因组中切除，切除的位点正是在抗性基因片段两侧的FRT位点。

这些结果证明了，载体pXT218b和pXT218a携带的FLP基因，在两种蓝细菌突变株中得到了转录表达，而且FLP在这两种蓝细菌中发挥了功能，精确切除了突变株中的抗性基因片段，实现了无筛选标签蓝细菌突变株的构建。

4.FLP表达质粒的丢失

由于本实施例中FLP基因在正常培养条件下存在本底表达，因此FLP基因还需要从无筛选标签的蓝细菌突变株中被移除，以消除其本底表达对后续基因改造工作存在的潜在不利影响。由于携带FLP基因的载体pXT218b和pXT218a均为自主复制质粒，因此通过质粒丢失的方式，就能够实现FLP基因的移除。具体实验过程如下：

1）将上述鉴定正确的切除了抗性基因片段的蓝细菌突变株，进一步通过稀释平板的方法，在不含有任何抗生素的BG11固体平板上分离单克隆；

2）将分离得到的单克隆分别在含有卡那霉素、壮观霉素（或链霉素）和不含抗生素的BG11固体平板上划线，并在30度光照培养1周；

3）选择对卡那霉素和壮观霉素（或链霉素）均敏感的单克隆，进一步培养，按照实施例2第2部分第d)部分相同的方法提取基因组DNA，并通过PCR鉴定其基因型（phaAB突变株采用pha-c1和pha-c2为引物对进行PCR，其中pha-c1为GGGGGGATTTGTTTATTTGTTGTCA和pha-c2CCCCATTTACCCGTAATACTTCGCC；NS1突变株采用7942-NS1-seq-1和7942-NS1-seq-2为引物对进行PCR，其中7942-NS1-seq-1为GTTATCTCTCGGCTAGTGGAC；7942-NS1-seq-2为GTAGGGATTTCGCCAGATCAATG）。结果如图5A所示，phaAB突变株对抗生素敏感的4个单克隆基因组中均未能检测到flp基因的存在；如图5B所示，NS1突变株对抗生素敏感的4个单克隆有3个基因组中均未能检测到flp基因的存在。同时，如图5C和D所示，虽然没有抗生素的选择压力存在，phaAB位点或NS1位点基因型在质粒丢失过程中维持稳定。

由上述转录分析的结果、基因型分析结果以及DNA测序的结果，证明了FLP在蓝细菌突变株中的有效表达，也证明FLP特异性切除FRT位点之间的卡纳霉素抗性片段，同时FLP表达质粒能够自然丢失。这些结果证明酿酒酵母来源的FLP/FRT重组系统能够用于无筛选标签基因工程蓝细菌的构建。而由于构建得到的突变株不再带有筛选标签，因此通过采用本实施例描述的方法和载体（pXT218a或pXT218b），就能够突破筛选标签数目的限制，实现对蓝细菌基因组多次乃至大规模的基因工程改造。

以上是实例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，单本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，这些实施方案在所有方面被视为举例说明性的而非限制性的。

在另外一个方面，本发明的实施方案可以涉及在构建无筛选标签蓝细菌突变株的方法，所述方法包括：在权利要求5中任一项的蓝细菌中，通过FLP/FRT系统构建无抗性标签的蓝细菌突变株。

通过本发明的实施方案，成功地构建了无筛选标签的蓝细菌突变株。

Claims

1.一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于：包含抗性基因和FLP基因元件；所述FLP基因元件包含FLP基因和用于驱动FLP基因的启动子；所述FLP基因由诱导型启动子控制；

所述驱动FLP基因启动子为P_petJ启动子、P_tac启动子、P_petE、P_rbp1、P_isiA或P_nrsB；

所述用于构建无筛选标签蓝细菌的载体如序列表SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中碱基序列所示。

2.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于：所述FLP基因为酿酒酵母的FLP基因。

3.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于：所述抗性基因为Omega、氯霉素抗性基因或红霉素抗性基因。

4.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于：所述蓝细菌为集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803、细长聚球藻(Synechococcuselongatussp.)PCC7942、聚球藻(Synechococcussp.)PCC7002、鱼腥藻(Anabaenasp.)PCC7120或细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-1。

5.一种权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体的应用，其特征在于：利用所述载体诱导FLP基因表达获得无筛选标签蓝细菌突变株。