CN105671070B - 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法 - Google Patents
一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法,属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf,该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA‑C基因的sgRNA,可以指引cas9蛋白在srfA‑C基因的特异性位点切割双链,然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组,在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA‑C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养,泡沫显著减少,证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法,属于基因工程技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于革兰氏阳性菌,因其易于分离培养,具有较清晰的遗传背景和良好的分泌性,又无致病性等特点,已成为重要的工业菌种,被越来越多的用于生产抗生素、药物蛋白和工业酶制剂等。B.subtilis 168是一种实验室模式菌株,包含有许多突变。目前被工业上使用的菌株如B.subtilisWB600和B.subtilisWB800都是来源于B.subtilis168。本实验室之前筛选到一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌株,分类命名为芽胞杆菌(Bacillus.Sp)WSH10-03(于2013年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号CCTCC NO:M2013012,专利公开号CN103255079A),后来鉴定是枯草芽孢杆菌。但是B.subtilis WSH10-03在发酵过程中会产生大量的泡沫,使得发酵过程很难控制并且可能造成染菌。枯草芽孢杆菌在发酵过程中会产生表面活性素(surfactin),表面活性素是一种两性分子,它在液体表面的聚集会造成泡沫的产生。srfA-C基因控制着枯草芽孢杆菌表面活性素形成。采用基因操作技术敲除srfA-C基因来减少枯草芽孢杆菌发酵过程泡沫的产生,这无疑具有极大的工业应用前景。
细菌长期生活在充满噬菌体或者其它病毒的自然环境中,进化出了多种防御系统,CRISPR/CAS系统就是其中之一,比较常见的是Ⅱ型CRISPR-CAS获得性免疫系统(Streptococcus pyogenes和S.thermophilus),当噬菌体入侵时,其基因组上的原间隔序列(postospacer)作为新的间隔序列插入到宿主细胞CRISPR序列的起始序列之后,作为第一个间隔序列;当该噬菌体再次入侵时,细菌的CRISPR序列转录产生一条长链RNA,即crRNA前体(pre-crRNA),随后Cas蛋白复合体在tracrRNA(trans-activating crRNA)的协助下剪切产生成熟体crRNAs,最后tracrRNA-crRNA-Cas9复合体识别并剪切与crRNA互补的位点。现在通常设计1个sgRNA(small guide RNA)来代替trancrRNA-crRNA引导Cas9蛋白。
建立枯草芽孢杆菌的基因编辑系统,将有利于对基因进行敲除等改造。
发明内容
本发明的目的在于提供CRISPR/Cas9基因编辑系统在枯草芽孢杆菌中的建立和应用。利用本发明的CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑,当把sgRNA和Cas9基因表达质粒转化枯草芽孢杆菌后,sgRNA通过靶序列与基因对应的互补序列配对,sgRNA中的其他序列则形成茎环结构,此结构能为Cas9所识别,然后在PAM(Protospacer-Adjacent Motif)序列上游2-3碱基间将靶基因的DNA双链切断。断裂的双链DNA在有同源修复模板的情况下可以通过HDR(homology-directed repair)途径进行准确的基因组重组。若断裂发生在编码区内,并且修复模板在断裂处插入几个碱基(非3的倍数),就会导致修复后的基因阅读框码组移动(frameshift),造成编码区提前出现终止密码子。
本发明的第一个目的是提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统,所述CRISPR/Cas9基因编辑系统建立在单个敲除质粒PHY300dsrf的基础上;PHY300dsrf包含sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌复制原点p15A、温度敏感的复制原点PE194、氨苄青霉素筛选标记基因和四环素筛选标记基因。
所述PHY300dsrf是将同源修复臂连接到PHY300d上得到的;而PHY300d是由四个片段(Frag1、Frag2、Frag3和Frag4)连接而成;其中Frag1含有特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列和PE194温度敏感的复制原点的基因序列,Frag2包含氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A,Frag3包含四环素筛选基因,Frag4包含cas9基因。
在本发明的一种实施方式中,四个片段按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的顺序连接。
在本发明的一种实施方式中,所述sgRNA双链寡核苷酸序列的设计,根据靶序列sgRNA软件可以设计出一系列的sgRNA,选取其中一个脱靶率低的,并且在阅读框前面的作为sgRNA;sgRNA的设计原理和方法是本领域技术人员根据已有技术可以常规获知的。
在本发明的一种实施方式中,所述PE194温度敏感的复制原点的基因序列是NCBIGenBank:M17811.1。
在本发明的一种实施方式中,氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因都是以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板扩增得到的。
在本发明的一种实施方式中,所述穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase是在穿梭质粒pHY300PLK(TaKaRa Code No.3060)中的Xba I和EcoR I酶切位点处插入地衣芽孢杆菌来源的淀粉酶启动子和β-CGTase基因构建而成,是由本实验室保藏的质粒。
在本发明的一种实施方式中,所述CRISPR/Cas9基因编辑系统由三部分依次连接而成;第一部分为特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列,第二部分含有PE194温度敏感的复制原点的基因序列、氨苄青霉素筛选基因、大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因、cas9基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列;第三部分为待敲除基因的同源修复臂。
所述同源修复臂是根据靶序列设计的,(在cas9切割断裂处)缺失了靶基因序列中的3N个碱基(N为整数),并插入了一个酶切位点和3N±1(N为整数)碱基,造成阅读框的移码突变。
在本发明的一种实施方式中,所述敲除质粒PHY300dsrf的构建包括如下步骤:
(1)根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向基因的sgRNA,再在靶向基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡核苷酸序列,化学合成sgRNA及PE194序列,并将这两个片段连接到一起,获得载体骨架Frag1;
(2)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板,获得氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A,获得载体骨架Frag2;
(3)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板,获得四环素筛选基因,即得载体骨架Frag3;
(4)以质粒pwtcas9-bacterial(Addgene plasmid#44250)为模板,获得cas9基因,即获得载体骨架Frag4;
(5)按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的顺序连接四个片段,得到质粒PHY300d。
(6)以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR扩增得到需要敲除的基因的同源修复臂上游片段、同源修复臂下游片段,并通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来,得到完整的同源修复臂;
(7)将上述含有同源修复臂片段连接到质粒PHY300d上,得到敲除质粒PHY300dsrf。
在本发明的一种实施方式中,所述编辑系统用于敲除srfA-C基因;所述步骤(1)是设计特异性靶向srfA-C基因的sgRNA,将化学合成sgRNA及PE194序列到PMD18-T载体上(sgRNA在PE194的下游),用如SEQ ID NO:5和如SEQ ID NO:6的引物进行PCR扩增,获得载体骨架Frag1。
在本发明的一种实施方式中,所述编辑系统用于敲除srfA-C基因;所述步骤(6)是用如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物进行PCR扩增获得同源修复臂上游片段,用如SEQID NO:15和SEQ ID NO:16的引物进行PCR扩增获得同源修复臂下游片段,然后通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来,并引入XbaI酶切位点;将同源修复臂连到PMD18-T载体上。
在本发明的一种实施方式中,所述编辑系统用于敲除srfA-C基因;所述步骤(7)是将上述含有同源修复臂的PMD18-T载体质粒用XhoI酶切,得到带有酶切位点的同源修复臂片段;将质粒PHY300d用XhoI酶切,将带有酶切位点的同源修复臂片段连入相应酶切位点,得到敲除质粒PHY300dsrf。
本发明还提供所述编辑系统的应用,是用于敲除枯草芽孢杆菌的srfA-C基因;是将含有srfA-C基因的sgRNA和srfA-C基因的同源修复臂的敲除质粒PHY300dsrf转化到枯草芽孢杆菌中,通过四环素抗性筛选转化子,并验证转化子。
在本发明的一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis 168或B.subtilisWSH10-03。
在本发明的一种实施方式中,所述验证是用如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物进行PCR扩增,然后PCR纯化产物进行XbaI酶切验证是否敲除成功。
在本发明的一种实施方式中,对srfA-C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行发酵培养,以2‰的接种量从甘油管中吸取菌液接种于LB培养基(含20μg/ml四环素)中,37℃,200r/min,培养8-10h;以5%的接种量将种子液接入装在穿刺摇瓶的TB(甘油5g/L,蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L,K2HPO412.54g/L,KH2PO42.31g/L)发酵液体培养基(含20μg/mL四环素)中,30℃,转速200r/min,培养48-60h。
本发明的有益效果:
成功构建了能够用于枯草芽孢杆菌基因编辑的系统,成功用于枯草芽孢杆菌的srfA-C基因的敲除,srfA-C基因的敲除菌株在发酵过程中几乎不产生泡沫,证明srfA-C基因的敲除可以有效的控制发酵过程中泡沫的产生,减少染菌的机率并且有利于发酵过程的控制。
附图说明
图1:敲除质粒PHY300dsrf质粒图谱;
图2:srfA-C基因敲除XbaI酶切验证;
图3:srfA-C基因敲除测序验证。
具体实施方式
实施例1:构建CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除质粒PHY300dsrf
(1)根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向srfA-C基因的sgRNA,再在srfA-C基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡核苷酸序列(如SEQ ID NO:2),从NCBI上查找PE194温度敏感的复制原点的基因序列(如SEQ ID NO:3)然后合成sgRNA及PE194序列并连接到到PMD18-T载体上,用以下引物5’-GGAACGTACAGACGCATTTTACATTTTTAGAAATGGGC-3’(如SEQ ID NO:5)和5’-CGTTTGTTGAACTACGCAGTCGGCTTAAACCAG-3’(如SEQ ID NO:6)进行PCR扩增,得到Frag1。反应体系如表1。
表1反应体系
5xPhusion HF Reaction Buffer | 10uL |
dNTP(10mmol/L) | 4uL |
模板(50pmol/L) | 0.5uL |
PCR引物1 | 0.5uL |
PCR引物2 | 0.5uL |
Primerstar DNA Ploymerase(2U/uL) | 0.5uL |
ddH<sub>2</sub>O | 将体系补足50uL |
反应程序如下:94℃预变性4min;98℃10s,55℃10s,72℃1.5min,进行30个循环;72℃延伸10min,降温至4℃。最终得到sgRNA及PE194序列单元Frag1。
(2)穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase是本实验室保藏的质粒,它是在穿梭质粒pHY300PLK(TaKaRa Code No.3060)中插入地衣芽孢杆菌来源的淀粉酶启动子和β-CGTase基因构建而成。以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板,获得氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A,用以下引物5’-GGCAACCGTAAGCTTGGTAAT-3’(如SEQ ID NO:7)和5’-GCGTCTGTACGTTCCTTAAGG-3’(如SEQ ID NO:8)进行PCR扩增,获得载体骨架Frag2。
(3)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板,获得四环素筛选基因,用以下引物5’-TTTCTTATACAAATTATATTTTACATATCAAT-3’(如SEQ ID NO:9)和5’-GTAGTTCAACAAACGGGCC-3’(如SEQ ID NO:10)进行PCR扩增,获得载体骨架Frag3。
(4)以质粒pwtcas9-bacterial(Addgene plasmid#44250)为模板,获得cas9基因,用以下引物5’-AATTTGTATAAGAAAATGGATAAGAAATACTCAATAGGCT-3’(如SEQ ID NO:11)和5’-AAGCTTACGGTTGCCTTAGTCACCTCCTAGCTGACTC-3’(如SEQ ID NO:12)进行PCR扩增,获得载体骨架Frag4。
(5)采用In-Fusion HD Cloning Plus kits连接四个片段Frag1、Frag2、Frag3和Frag4,In-Fusion HD Cloning Plus kits连接体系如表2:
表2连接体系
线性化载体和纯化的PCR产物片段的摩尔比为1:2;用水补足10uL体系。50℃连接20min,冰浴5min,然后转化入E.coli JM109感受态细胞,涂布到LB固体培养基(含100ug/mL氨苄青霉素)上,37℃过夜培养。挑取阳性克隆,提取质粒,进行测序验证。验证正确的质粒即为PHY300d。
(6)以枯草芽孢杆菌基因组为模板,用以下引物5’-CTCTAGACTGCTCCTACAATGAGAAGGAG-3’(如SEQ ID NO:13)和5’-CTCTAGAGAGCAGCTCTTTCGGCTCATAG-3’(如SEQ ID NO:14)进行PCR扩增,获得同源修复臂上游片段,用以下引物5’-CTCGAGGCTAGGGGCAGCGAGCAAACAGC-3’(如SEQ ID NO:15)和5’-GAGCAGCTCTTTCGGCTCATAG-3’(如SEQ ID NO:16)进行PCR扩增,获得同源修复臂下游片段,然后通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来,并引入XbaI酶切位点。将同源修复臂(如SEQ ID NO:4)连到PMD18-T载体上,转化入E.coli JM109感受态细胞,涂布到LB固体培养基(含100g/mL氨苄青霉素)上,37℃过夜培养。挑取阳性克隆,提取质粒,进行测序验证。
(7)将上述含有同源修复臂的PMD18-T载体质粒用XhoI酶切,得到带有酶切位点的同源修复臂片段;将质粒PHY300d用XhoI酶切,然后将带有酶切位点的同源修复臂片段连入相应酶切位点。酶切体系和连接体系如表3、表4所示。
表3 XhoI酶切体系
酶切成分 | 酶切用量 |
XhoI限制性内切酶 | 0.5uL |
10xH Reaction Buffer | 1uL |
纯化的PCR产物片段 | 4uL |
ddH<sub>2</sub>O | 4.5uL |
37℃酶切反应2h。
表4连接体系:
连接成分 | 各成分用量 |
T4 Ligase | 1uL |
10xT4 Ligase buffer | 1uL |
同源修复臂酶切片段 | 7uL |
PHY300d质粒酶切片段 | 1uL |
16℃连接过夜,连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞,涂布到LB固体培养基(含100g/mL氨苄青霉素)上,37℃过夜培养。挑取阳性克隆,提取质粒,进行测序验证,得到敲除质粒PHY300dsrf,它包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记(图1)。
实施例2:枯草杆菌转化方法
用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌,然后在LB平板上划线,37℃培养过夜活化。挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中,37℃培养过夜培养18h。取一定量的过夜培养物到4.5mL的GMⅠ中,使OD600值到达0.1-0.2,留下4.5mL混合菌液。37℃200rpm振荡培养,每个20min测一次OD600,当OD600到达0.4-0.6(大约需要60-90min);继续振荡培养90min,吸取0.05ml菌液至存有0.45mL预热的GMⅡ的无菌试管中;37℃振荡90min,此时培养物中有很多感受态细胞形成;加1μg的质粒(15-20uL),37℃振荡培养30min;离心去除大部分的上清液,重悬细胞,涂在含有相应抗生素的筛选平板上,37℃培养过夜。
培养基配方:
(1)10×最低盐溶液:K2HPO414g(K2HPO4·3H2O 18.34g),KH2PO46g,(NH4)2SO42g,柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)1g,MgSO4·7H2O 0.2g,在蒸馏水中依次溶解,加水至100ml。(2)L-trp溶液,2mg/mL,贮于棕色瓶内,113℃灭菌30min,用黑纸包裹。
(3)GMⅠ溶液:1×最低盐溶液95ml,50%葡萄糖1mL,5%水解酪蛋白0.4mL,10%酵母汁1mL,2mg/mL L-trp 2.5mL。
(4)GMⅡ溶液:1×最低盐溶液97.5mL,50%葡萄糖1mL,5%水解酪蛋白0.08mL,10%酵母汁0.04mL,0.5M MgCl20.5mL(2.5mM),0.1M CaCl20.5mL(0.5mM),2mg/mL L-trp0.5mL(5ug/mL)。
实施例3:用质粒PHY300dsrf敲除B.subtilis 168基因组中的srfA-C基因
采用实施例2中的方法,将敲除质粒PHY300dsrf转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中,涂布到LB固体培养基(含20ug/mL四环素)上,37℃过夜培养。挑取阳性克隆,提取基因组,以基因组为模板,用以下引物5’-CTCGAGGCTAGGGGCAGCGAGCAAACAGC-3’(如SEQ ID NO:17)和5’-GAGCAGCTCTTTCGGCTCATAG-3’(如SEQ ID NO:18)进行PCR扩增,然后在37℃进行XbaI酶切验证。敲除srfA-C基因的菌株进行基因组同源修复时在srfA-C基因断裂处插入了XbaI酶切位点,所以可以被XbaI内切酶切开,而野生型的则不会被切开(图2,图3)。
实施例4:用质粒PHY300dsrf敲除B.subtilis WSH10-03基因组中的srfA-C基因
采用实施例2中的方法,将敲除质粒PHY300dsrf转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中,涂布到LB固体培养基(含20ug/mL四环素)上,37℃过夜培养。挑取阳性克隆,提取基因组,以基因组为模板,用如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物进行PCR扩增,然后在37℃进行XbaI酶切验证。敲除srfA-C基因的菌株进行基因组同源修复时在srfA-C基因断裂处插入了XbaI酶切位点,所以可以被XbaI内切酶切开,而野生型的则不会被切开。
实施例5:枯草芽孢杆菌B.subtilis WSH10-03srfA-C基因敲除菌的发酵
吸取200μL的甘油管菌液接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中,30℃,200r/min培养24h,将上述培养液接入装液量为0.9L的3L发酵罐,以25%氨水控制pH 7,培养温度30℃,通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30%左右,当溶氧迅速上升,表明培养基中的葡糖糖已经耗尽,开始流加体积比为50%葡萄糖补料液,
种子培养基:蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,葡萄糖20g/L
发酵培养基:硫酸钙0.939g/L,硫酸镁7.27g/L,氢氧化钾4.13g/L,硫酸钾18.2g/L,玉米浆30g/L,磷酸26.7mL/L,葡萄糖5g/L,金属离子PTM溶液(g/L):CuSO4·5H2O 6,KI0.08,MnSO4·H2O,Na2MoO3·2H2O 0.2,H3BO30.02,CoCl20.5,ZnCl220,FeSO4·7H2O 65,生物素0.2,H2SO45.0。
srfA-C基因敲除的B.subtilis WSH10-03在上罐发酵过程中泡沫明显减少了,在生长对数期泡沫产生较多,但是可以通过滴加少量消泡剂控制泡沫的产生;B.subtilisWSH10-03原始菌在上罐发酵过程中泡沫大量产生,通过滴加消泡剂控制不住,可能造成培养基从通气管中喷出和染菌等。
Claims (8)
1.一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,所述CRISPR/Cas9基因编辑系统建立在单个敲除质粒PHY300dsrf的基础上;所述PHY300dsrf是将同源修复臂连接到PHY300d上得到的;而PHY300d是由Frag1、Frag2、Frag3和Frag4这四个片段连接而成;其中Frag1含有特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列和PE194温度敏感的复制原点的基因序列,Frag2包含氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A,Frag3包含四环素筛选基因,Frag4包含cas9基因;所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,所述CRISPR/Cas9基因编辑系统由三部分依次连接而成;第一部分为特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列,第二部分含有PE194温度敏感的复制原点的基因序列、氨苄青霉素筛选基因、大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因、cas9基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列;第三部分为待敲除基因的同源修复臂。
3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,四个片段按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的顺序连接。
4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,所述PE194温度敏感的复制原点的基因序列是NCBI GenBank:M17811.1。
5.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,所述氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因都是以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板扩增得到的。
6.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统,其特征在于,所述敲除质粒PHY300dsrf的构建方法如下:
(1)根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA;再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡核苷酸序列,化学合成sgRNA及温度敏感的复制原点PE194序列;
(2)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板,PCR获得氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A;
(3)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板,PCR获得四环素筛选基因;
(4)以质粒pwtcas9-bacterial(Addgene plasmid#44250)为模板,PCR获得cas9基因;
(5)采用In-Fusion HD Cloning Plus kits将分别含有sgRNA及温度敏感的复制原点PE194序列、氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因和cas9基因的四个片段连接起来,得到质粒PHY300d;
(6)以枯草芽孢杆菌基因组为模板,重叠PCR获得在断裂处插入XhoI酶切位点的同源修复臂,并连接到PMD18-T载体上;
(7)将上述含有同源修复臂的PMD18-T载体质粒用XhoI酶切,得到带有酶切位点的同源修复臂片段;将质粒PHY300d用XhoI酶切,然后将带有酶切位点的同源修复臂片段连入相应酶切位点,得到敲除质粒PHY300dsrf。
7.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在编辑枯草芽孢杆菌的srfA-C基因上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis 168或B.subtilis WSH10-03。
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