CN111893139A - 一种基于CRISPR-Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用 - Google Patents
一种基于CRISPR-Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种基于CRISPR‑Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法。所述方法利用待编辑基因敲除盒或表达盒的PCR片段直接与Cas9表达质粒或Cas9‑sgRNA复合物共转化芽孢杆菌宿主细胞，实现芽孢杆菌基因组的高效、无抗生素标记基因编辑。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9进行芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用。
背景技术
CRISPR-Cas，为规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，CRISPR)及其介导的基因剪切系统(CRISPR-associated，Cas)，是一类在细菌和古细菌中普遍存在的免疫系统，它可以高效识别并切割进入细胞的外源DNA。目前，来自于化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的天然CRISPR/Cas9系统应用最广泛。该系统包含由crRNA和tracrRNA构成的复合体，在特异性PAM序列辅助下完成对目标序列的切割，已成功应用于多种微生物的基因编辑，可实现快速、高效地定向修饰。
枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，具有非致病性、高效的分泌信号肽及分子伴侣系统及良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的最理想宿主，为工业应用中重要的模式菌株。枯草芽孢杆菌分泌的重组蛋白大多具有天然构象和生物活性，避免形成包涵体；目标蛋白表达周期短，产率高。在基因工程操作过程中，筛选标记是重组DNA载体的重要组成部分，通常用来验证转化子是否成功。目前，枯草芽孢杆菌表达系统中，常用的筛选标记是抗生素抗性基因。但抗生素抗性基因这一新型污染物不仅能在宿主细菌中伴随细菌增殖而增加丰度，还会通过基因突变和基因水平转移增加多样性、宿主范围及丰度。2016年11月，来自英国牛津大学等机构的研究人员，用新的实验模型证实质粒DNA是扩散抗生素耐药性的全球健康重大威胁的元凶之一。他们发现质粒DNA能够作为一种进化促进剂，加快新的耐药性类型进化。此外，质粒自动地扩增这些新的功能获得改善的耐药性基因的拷贝数。这些发现表明抗生素质粒对公共环境和卫生带来巨大的的威胁。
近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，如何利用CRISPR-Cas系统开发无抗生素标记遗传操作技术，快速和高效地对芽孢杆菌基因组进行编辑，成为本领域的研究热点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种基于CRISPR-Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法。所述方法利用待编辑基因敲除盒或表达盒的PCR片段直接与Cas9表达质粒或Cas9-sgRNA复合物共转化芽孢杆菌宿主细胞，实现芽孢杆菌基因组的高效、无抗生素标记基因编辑。
本发明涉及一种基于CRISPR-Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法，包括：
(1)构建Cas9表达质粒或体外组装Cas9蛋白和sgRNA mRNA的复合物Cas9-sgRNA；
(2)PCR扩增无筛选标记、包含上下游同源臂的待编辑基因敲除盒或表达盒；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增片段与Cas9表达质粒或与Cas9-sgRNA复合物和温敏质粒共转化(转染)芽孢杆菌宿主细胞；
(4)去除芽孢杆菌中的Cas9表达质粒或温敏质粒，筛选得到芽孢杆菌工程菌，实现待编辑基因敲除或外源基因整合。
步骤(1)中所述Cas9表达质粒由f1、f2和f3这三个片段融合而成，其中f1包含Cas9基因的启动子、温敏复制子、卡那霉素抗性基因、大肠杆菌复制子；f2包含Cas9基因；f3包含待编辑基因的特异性sgRNA转录盒。
所述f1片段中启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，温敏复制子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，卡那霉素抗性基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，大肠杆菌复制子的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
所述f2片段中Cas9基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
所述f3片段中sgRNA转录盒的启动子序列为SEQ ID NO:6；sgRNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15。
步骤(1)中所述复合物Cas9-sgRNA的体外组装方法，包括：
(a)在大肠杆菌中表达Cas9蛋白，并进行纯化；
(b)体外转录得到待编辑基因的特异性sgRNA mRNA，并进行纯化；
(c)将纯化的Cas9蛋白与sgRNA mRNA按分子摩尔比1:3进行体外组装，获得复合物Cas9-sgRNA。
步骤(a)中所述大肠杆菌中表达的Cas9蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:18。
步骤(b)中所述体外转录得到的sgRNA mRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:19或SEQID NO:20。
步骤(2)中所述待编辑基因为aprE基因、nprE基因、spo0IIE基因或碱性蛋白酶基因。
所述枯草芽孢杆菌aprE基因敲除盒或碱性蛋白酶基因表达盒的上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:8，下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
所述枯草芽孢杆菌nprE基因敲除盒的上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:11，下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:12。
所述碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:13，其编码的氨基酸序列为SEQID NO:14。
所述克劳氏芽孢杆菌spo0IIE基因的敲除盒上游同源臂序列为SEQ ID NO:16，下游同源臂序列为SEQ ID NO:17。
步骤(3)中所述芽孢杆菌优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
申请人利用本发明提供的方法将Cas9表达质粒与aprE或/和nprE基因敲除盒的PCR扩增片段直接共转化宿主细胞，成功实现枯草芽孢杆菌中aprE基因的单位点敲除、nprE基因的单位点敲除以及aprE和nprE基因的双位点同时敲除；通过将Cas9表达质粒与碱性蛋白酶vAP表达盒的PCR扩增片段直接共转化宿主细胞，实现了外源碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌基因组中的整合。此外，还成功实现了克劳氏芽孢杆菌中spo0IIE基因的单位点敲除。
申请人利用本发明提供的方法将体外组装的复合物Cas9-sgRNA与aprE基因或spo0IIE基因敲除盒的PCR扩增片段共转化宿主细胞，成功实现了枯草芽孢杆菌中aprE基因或解淀粉芽孢杆菌中spo0IIE基因的单位点敲除，敲除成功率分别为53％和55％。
本发明构建了高效率、高精准度的CRISPR-Cas9编辑系统，提供的编辑方法操作简单，广泛适用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌的基因组编辑，可实现单位点、多位点的基因敲除和外源基因整合等不同类型的基因编辑。同时，该系统利用PCR片段与温敏型Cas9质粒的高效共转化技术，解决了芽孢杆菌基因组编辑操作中存在的问题，不引入任何抗生素筛选标记，为无痕编辑，从而避免了抗性基因横向扩增对环境和公共卫生的污染。
附图说明
图1为质粒pZX-Cas9-gRNA图谱；
图2为aprE基因的无抗性标记敲除盒pZX-aprE deletion图谱；
图3为质粒pZX-Cas9-gRNA nprE图谱；
图4为nprE基因的无抗性标记敲除盒pZX-nprE deletion图谱；
图5为质粒pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE图谱；
图6为碱性蛋白酶基因vAP的整合型无抗性标记表达盒pZX-vAP图谱；
图7为质粒pZX-Cas9-gRNA spo0IIE图谱；
图8为克劳氏芽孢杆菌敲除盒pZX-spo0IIE del图谱；
图9为解淀粉芽孢杆菌敲除盒pZX-sp deletion图谱。
具体实施例
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。
LB液体培养基：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 0.5％；
LB平板：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 0.5％，琼脂2％；
GM I配制方法为：1*最低盐溶液95.6ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.4ml，10％酵母粉汁1ml；其中1*最低盐溶液的配制方法为：K2HPO4 14g/L，KH2PO4 6g/L，(NH4)2SO4 2g/L，柠檬酸三钠1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解；
GM II配制方法为：1*最低盐溶液96.98ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.08ml，10％酵母粉汁0.04ml，1M MgCl2 0.25ml，1M CaCl2 0.05ml；
电转培养基配制方法为：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油；
电转复苏培养基RM：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 0.5％，0.5M山梨醇，0.38M甘露醇。
实施例1 aprE基因的单位点敲除
1、质粒pZX-Cas9-gRNA的构建
质粒pZX-Cas9-gRNA的图谱如图1所示，组成片段由合成公司合成，具体操作如下，引物序列见表1：
PCR片段f1：合成片段1(F1)的组成元件为启动子aprEp(SEQ ID NO:1)、温敏型复制子Ts replicon(SEQ ID NO:2)、卡那霉素抗性基因kan(SEQ ID NO:3)、大肠杆菌复制子ColE1 rep(SEQ ID NO:4)；利用NEB phusion聚合酶，F1为模板，用引物assf1-F/assf1-Rv扩增，PCR条件为：98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃70s，30个循环；72℃5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为f1。
PCR片段f2：合成片段2(F2)的组成元件为Cas9基因Spy cas9 for B.subtilis(SEQ ID NO:5)；利用NEB phusion聚合酶，F2为模板，用引物assf2-F/assf21-Rv扩增，PCR条件为：98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃70s，30个循环；72℃5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为f2。
PCR片段f3：合成片段3(F3)的组成元件为sgRNA转录盒，由启动子P43(SEQ ID NO:6)和sgRNA(SEQ ID NO:7)组成。利用NEB phusion聚合酶，F3为模板，用引物assf3-F/assf3-Rv扩增，PCR条件为：98℃2min；984℃10s；58℃20s，72℃30s，30个循环；72℃5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为f3。
利用NEB Gbison assembly试剂盒，20uL反应体系中，f1、f2、f3的摩尔数比为1:3:3，50℃，反应60min，取10uL反应液转化大肠杆菌，涂布含30ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。
表1质粒pZX-Cas9-gRNA片段扩增引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| assf1-F | gaatggatccgtcgacctcgagagttacgctaggg |
| assf1-Rv | tcggtgccactagttaccctctccttttaaaaaaattc |
| assf2-F | agggtaactagtggcaccgaaaaaaaagcgcaaag |
| assf2-Rv | ttttttatgtaagctttctcgagttatcagtgatg |
| assf3-F | gagaaagcttacataaaaaaccggccttggccccg |
| assf3-Rv | cgaggtcgacggatccattctcaccaataaaaaac |
1.2测序分析
从实施例1.1所述的转化平板上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析，得到符合预期序列的质粒，命名为pZX-Cas-gRNA。
1.3 PCR扩增aprE基因同源臂敲除盒pZX-aprE deletion
枯草芽孢杆菌中敲除盒pZX-aprE deletion的图谱如图2所示，序列片段由合成公司合成，包括aprE基因上游同源臂Upstream-1kb-Cas9(SEQ ID NO:8)和下游同源臂Downstream-1kb-Cas9(SEQ ID NO:9)。
用NEB phusion聚合酶，以合成片段pZX-aprE deletion为模板，利用引物aprEup-F：5’CACATGGACTGAAACATCATCGGC 3’和aprE down-Rv：5’TGGATCGAAGCGGCCGTGCCTTTTC3’扩增pZX-aprE deletion，纯化回收PCR产物。
1.4 aprE基因的敲除
将Cas9质粒pZX-Cas9-gRNA、敲除盒pZX-aprE deletion的PCR产物，通过感受态方法共转化枯草芽孢杆菌宿主168，具体转化过程如下：将新鲜活化的枯草芽孢杆菌168由LB平板接种到5ml GMⅠ溶液，在30℃、125rpm振荡培养过夜。第二天取1ml转接到9ml GMⅠ中，37℃、220rpm培养3.5h。再取1ml上一步骤的培养液转接到9ml GMⅡ溶液中，37℃、125rpm培养90min后，5000g、10min离心收集菌体。用1ml GMⅠ溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后取0.2ml感受态细胞，加入10uL pZX-aprE deletion的PCR产物和2uL pZX-Cas-gRNA质粒，于30℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养24h。次日，从转化平板上挑取100个转化子，30℃过夜培养。用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取上述100株菌的基因组。用引物cas9 edited-up-F/cas9edited-down-Rv，分别以上述100株菌的基因组和枯草芽孢杆菌宿主168基因组为模板，PCR扩增。扩增条件为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃70s，30个循环；72℃7min。若aprE基因被正确敲除，PCR扩增条带大小为333bp；若aprE基因未被正确敲除，PCR扩增条带大小为1233bp；以宿主168基因组为模板时，PCR扩增条带大小为1233bp。凝胶电泳结果显示，其中有42株菌的扩增条带大小符合预期，333bp。将上述42株菌的扩增条带送至青岛华大基因公司进行测序，测序结果证实，42株菌的aprE基因均被正确敲除，成功率为42％。
将基因aprE正确敲除的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布LB平板，42℃过夜培养。次日挑选平板上的单菌落，分别点种于LB平板和含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养10h，挑选无卡那霉素抗性的菌株，pZX-Cas9-gRNA质粒丢失，完成枯草芽孢杆菌168基因组上基因aprE的无痕敲除。
实施例2 nprE基因的单位点敲除
2.1质粒pZX-Cas9-gRNA nprE的构建
枯草芽孢杆菌中质粒pZX-Cas9-gRNA nprE的图谱如图3所示，以质粒pZX-Cas9-gRNA为模板，用引物gRNA nprE-F/assf3 nprE-Rv，扩增nprE基因序列的特异性gRNA innprE ORF/tracr RNA片段(SEQ ID NO:10)，扩增条件为98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃30s，30个循环；72℃5min。具体引物序列见表2。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为gRNA nprE。用限制性内切酶KpnI/BamHI双酶切质粒pZX-Cas9-gRNA，凝胶回收8643bp片段。利用NEB Gbison assembly试剂盒，将片段gRNA nprE克隆到双酶切的质粒片段，20uL反应体系中，二者的的摩尔数比为3:1，50℃，反应60min，取10uL反应液转化大肠杆菌，涂布含50ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。
表2质粒pZX-Cas9-gRNA nprE的构建扩增引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| gRNA nprE-F | aaatataaagtgatagcggtaccatcgagcctgaacctgcaaac |
| assf3 nprE-Rv | ctgttatccctagcgtaactctcgaggtcgacggatccattctcaccaataaaaaacgcc |
2.2测序分析
从实施例2.1所述的转化平板上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析，得到符合预期序列的质粒，命名为pZX-Cas-gRNA nprE。
2.3PCR扩增基因nprE敲除盒pZX-nprE deletion
枯草芽孢杆菌敲除盒pZX-nprE deletion的图谱如图4所示，片段由合成公司人工合成，包括nprE基因上游同源臂Upstream nprE-1kb-Cas9(SEQ ID NO:11)和下游同源臂Downstream nprE-1kb-Cas9(SEQ ID NO:12)。
用NEB phusion聚合酶，以合成的片段pZX-nprE deletion为模板，利用引物nprEup-F：5’GATATGGCGCAAGCAGCAAGACAAG 3’和nprE down-Rv：5’CCTTCATCTAAGAGAGGATCATACG3’扩增pZX-nprE deletion，纯化回收PCR产物。
2.4 nprE基因的敲除
将Cas9质粒pZX-Cas9-gRNA nprE、敲除盒pZX-nprE deletion片段，通过感受态方法共转化枯草芽孢杆菌宿主168，具体转化过程如下：如实施例1.4所述制备感受态，然后取0.2ml感受态细胞，加入10uL敲除盒pZX-nprE deletion的PCR产物和2uL pZX-Cas-gRNAnprE质粒，于30℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养24h。次日，从转化平板上挑取100个转化子，30℃过夜培养。用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取上述100株菌的基因组。用引物cas9 edited-nprE up-F/cas9 edited-nprEdown-Rv，分别以上述100株菌的基因组和枯草芽孢杆菌宿主168基因组为模板，PCR扩增。扩增条件为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃90s，30个循环；72℃7min。若nprE基因被正确敲除，PCR扩增条带大小为472bp；若基因nprE未被正确敲除，PCR扩增条带大小为1804bp；以宿主168基因组为模板时，PCR扩增条带大小为1804bp。凝胶电泳结果显示，其中有48株菌的扩增条带大小符合预期，472bp。将上述48株菌的扩增条带送至青岛华大基因公司进行测序，测序结果证实，48株菌的nprE基因均被正确敲除，该系统可以实现枯草芽孢杆菌基因组的上nprE基因的无痕敲除，成功率为48％。
将基因nprE正确敲除的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布LB平板，42℃过夜培养。次日挑选平板上的单菌落，分别点种于LB平板和含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养10h，挑选无卡那霉素抗性的菌株，pZX-Cas9-gRNA nprE质粒丢失，完成枯草芽孢杆菌168基因组上基因nprE的无痕敲除。
实施例3 aprE基因和nprE基因的双位点同时敲除
3.1质粒pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE的构建
枯草芽孢杆菌质粒pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE的图谱如图5所示，以质粒pZX-Cas9-gRNA nprE为模板，用引物assgRNA aprE/nprE-F和assgRNA aprE/nprE-Rv，扩增nprE基因编辑的特异性gRNA-tracrRNA表达盒，扩增条件为98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃30s，30个循环；72℃5min。具体引物序列见表3。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为gRNA-tracrRNA nprE。用限制性内切酶BamHI单酶切质粒pZX-Cas9-gRNA，凝胶回收。利用NEB Gbison assembly试剂盒，将片段gRNA-tracrRNA nprE克隆到单酶切的pZX-Cas9-gRNA质粒片段，20uL反应体系中，二者的的摩尔数比为3:1，50℃，反应60min，取10uL反应液转化大肠杆菌，涂布含50ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。
表3质粒pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE的构建扩增引物表
3.2测序分析
从实施例3.1所述的转化平板上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析，得到符合预期序列的质粒，命名为pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE。
3.3基因aprE和nprE的双位点敲除
将Cas9质粒pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE、敲除盒pZX-aprE deletion的PCR产物和敲除盒pZX-nprE deletion的PCR产物通过感受态方法共转化枯草芽孢杆菌宿主168，具体转化过程如下：如实施例1.4所述制备感受态，然后取0.2ml感受态细胞，加入10uL敲除盒pZX-aprE deletion的PCR产物、10uL敲除盒pZX-nprE deletion的PCR产物和2uL pZX-Cas-gRNA aprE/nprE质粒，于30℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养24h。次日，从转化平板上挑取100个转化子，30℃过夜培养。用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取上述100株菌的基因组。分别用引物cas9 edited-up-F/cas9edited-down-Rv和引物cas9 edited-nprE up-F/cas9 edited-nprE down-Rv，以上述100株菌的基因组和枯草芽孢杆菌宿主168基因组为模板，PCR扩增。扩增条件均为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃90s，30个循环；72℃7min。若基因aprE、nprE均被正确敲除，PCR扩增条带大小应分别为333bp、472bp；若aprE基因未被正确敲除，PCR扩增条带大小为1233bp；若nprE基因未被正确敲除，PCR扩增条带大小为1804bp；以宿主168基因组为模板时，PCR扩增条带大小分别为1233bp、1804bp。凝胶电泳结果显示，其中有108株菌的扩增条带大小符合预期，333bp和472bp。将上述10株菌的扩增条带送至青岛华大基因公司进行测序，测序结果证实，108株菌的基因aprE、nprE同时被正确敲除，该系统可以实现枯草芽孢杆菌基因组上双位点的同时无痕敲除，成功率为10％。
将基因aprE、nprE正确敲除的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布LB平板，42℃过夜培养。次日挑选平板上的单菌落，分别点种于LB平板和含20μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养10h，挑选无卡那霉素抗性的菌株，pZX-Cas9-gRNA aprE/nprE质粒丢失，完成枯草芽孢杆菌168基因组上基因aprE、nprE的双位点同时无痕敲除。
实施例4外源碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合
4.1无抗生素标记表达盒pZX-vAP的构建
将来源于克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的碱性蛋白酶基因命名为vAP，其核苷酸序列为SEQ ID NO:13，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:14。
碱性蛋白酶基因vAP的表达盒pZX-vAP图谱如图6所示，片段由合成公司合成，组成元件包括整合位点aprE的上游同源臂upstream-1kb-Cas9(SEQ ID NO:8)、整合位点的下游同源臂downstream-1kb-Cas9(SEQ ID NO:9)、碱性蛋白酶基因vAP的表达盒。
4.2无抗生素标记枯草芽孢杆菌工程菌的构建
将碱性蛋白酶表达盒pZX-vAP的PCR产物和Cas9质粒pZX-Cas-gRNA通过感受态方法共转化枯草芽孢杆菌宿主168，具体转化过程如下：如实施例1.4所述制备感受态，然后取0.2ml感受态细胞，加入10uL表达盒pZX-vAP的PCR产物和2uL pZX-Cas-gRNA质粒，于30℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的脱脂牛奶平板，30℃培养24h，次日检查转化子的透明圈。挑取其中透明圈较大的100个转化子点种到含30μg/mL卡那霉素的的脱脂牛奶平板上，30℃培养10h，30℃过夜培养后，分别提取100株菌的基因组。分别以上述100株菌的基因组和枯草芽孢杆菌宿主168基因组为模板，以引物cas9edited-up-F/cas9edited-down-Rv，PCR扩增，扩增条件为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃90s，30个循环；72℃7min。若碱性蛋白酶基因正确整合到宿主168基因组的aprE基因区域，PCR扩增条带大小为1642bp；若碱性蛋白酶基因未正确整合，PCR扩增条带大小为1375bp；以宿主168基因组为模板时，PCR扩增条带大小为1375bp。凝胶电泳结果显示，其中有28株菌的扩增条带大小符合预期，1642bp。将上述28株菌的扩增条带，送至青岛华大基因公司进行测序验证。测序结果显示，28株菌中碱性蛋白酶基因正确整合。
将上述28株枯草芽孢杆菌工程菌中，透明圈最大的菌株接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布脱脂牛奶平板，42℃过夜培养。次日检查平板上的透明圈，挑选透明圈较大的单菌落分别点种于脱脂牛奶平板和含30μg/mL卡那霉素的脱脂牛奶平板，37℃培养10h，筛选无卡那霉素抗性、且透明圈较大的16株菌进行摇瓶验证。酶活测定结果显示，工程菌的碱性蛋白酶最高酶活可达20092U/ml。通过枯草芽孢杆菌CRISPR-Cas9系统，完成碱性蛋白酶基因vAP在枯草芽孢杆菌宿主168的高效整合和表达，且构建的工程菌无抗生素筛选标记，满足工业生产的要求，绿色环保。
实施例5克劳氏芽孢杆菌spo0IIE基因的敲除
5.1质粒pZX-Cas9-gRNA spo0IIE的构建
克劳氏芽孢杆菌质粒pZX-Cas9-gRNA spo0IIE的图谱如图7所示，以质粒pZX-Cas9-gRNA为模板，用引物gRNA spo-F/assf3 nprE-Rv，扩增spo0IIE基因序列的特异性gRNA in spo/tracr RNA片段(SEQ ID NO:15)，扩增条件为98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃30s，30个循环；72℃5min。具体引物序列见表4。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，命名为gRNA spo。用限制性内切酶KpnI/BamHI双酶切质粒pZX-Cas9-gRNA，凝胶回收8643bp片段。利用NEB Gbison assembly试剂盒，将片段gRNA spo克隆到双酶切的质粒片段，20uL反应体系中，二者的的摩尔数比为3:1，50℃，反应60min，取10uL反应液转化大肠杆菌，涂布含50ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。
表4质粒pZX-Cas9-gRNA nprE的构建扩增引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| gRNA spo-F | gtaaaatataaagtgatagcggtaccaggtgccgtgtttagttttca |
| assf3 nprE-Rv | ctgttatccctagcgtaactctcgaggtcgacggatccattctcaccaataaaaaacgcc |
5.2测序分析
从实施例5.1所述的转化平板上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析，得到符合预期序列的质粒，命名为pZX-Cas9-gRNA spo0IIE。
5.3 PCR扩增基因spo0IIE敲除盒pZX-spo0IIE del
克劳氏芽孢杆菌spoII敲除盒pZX-spo0IIE del序列由合成公司人工合成，包括spo0IIE基因上游同源臂Upstream spo-1kb-Cas9(SEQ ID NO:16)和下游同源臂Downstream spo-1kb-Cas9(SEQ ID NO:17)。
用NEB phusion聚合酶，以合成的片段pZX-spo0IIE del为模板，利用引物spo up-F：5’GAATTGCCAATCGCTCCGTATGG 3’和spo down-Rv：5’AGGACACTATTGGTAGACAGGAA3’扩增pZX-spo0IIE del，纯化回收PCR产物。
5.4基因spo0IIE的敲除
将Cas9质粒pZX-Cas9-gRNA spo0IIE、敲除盒pZX-spo0IIE del的PCR产物，通过感受态方法共转化克劳氏芽孢杆菌，具体转化过程如下：接种B.clausii于3ml LB培养基中，过夜培养。取400uL过夜培养物接入40ml(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.85～0.9。将菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃离心收集菌体。用50ml预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)，重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗2次。将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装60uL。
取60μl感受态细胞中加入10uL pZX-spo0IIE del的PCR片段和2uL质粒pZX-Cas9-gRNA spo0IIE，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2.2kv，1mm,电击1次。电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM，30℃，200rpm，复苏2h后，涂布含30ug/mL卡那霉素的LB平板。30℃，过夜培养。30℃培养24h。次日，从转化平板上挑取100个转化子，30℃过夜培养。用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取上述100株菌的基因组。用引物spo cas9 edited-F：5’CGTACGGGTCATCAAGCGAATCG 3’和spo cas9 edited-Rv：5’CTCATCATGACGAGCAGATCTC3’，分别以上述100株菌的基因组和克劳氏芽孢杆菌宿主基因组为模板，PCR扩增。扩增条件为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃90s，30个循环；72℃7min。若spo0IIE基因被正确敲除，PCR扩增条带大小为260bp；若spo0IIE基因未被正确敲除，PCR扩增条带大小为2750bp；以宿主基因组为模板时，PCR扩增条带大小为2750p。凝胶电泳结果显示，其中有62株菌的扩增条带大小符合预期，260bp。将上述62株菌的扩增条带送至青岛华大基因公司进行测序，测序结果证实，62株菌的spo0IIE基因均被正确敲除，成功率为62％。
将基因spo0IIE正确敲除的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布LB平板，42℃过夜培养。次日挑选平板上的单菌落，分别点种于LB平板和含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养10h，挑选无卡那霉素抗性的菌株，pZX-Cas9-gRNA质粒丢失，完成克劳氏芽孢杆菌基因spo0IIE的无痕敲除，菌株在培养过程中不生成芽孢，利于后续实验操作，效果显著。
实施例6体外组装Cas9-sgRNA，实现枯草芽孢杆菌aprE基因敲除
6.1 Cas9蛋白的体外表达、纯化
Cas9蛋白的DNA片段(SEQ ID NO:18)由合成公司人工合成。以合成片段为模板，利用引物assCas9-F/assCas9-Rv扩增基因，扩增条件均为：98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃90s，30个循环；72℃5min。凝胶回收PCR片段，命名为Cas9 in vitro。具体引物序列见表5。用限制性内切酶NcoI酶切载体粒pET-28a，凝胶回收片段。利用NEB Gbison assembly试剂盒，20uL反应体系中，片段盒载体的摩尔数比为3:1，50℃，反应60min，取10uL反应液转化大肠杆菌DH5a，涂布含50ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。从上述的转化平板上挑选10个转化子，采用omega公司的质粒提取试剂盒，送往青岛华大基因测序中心进行测序分析，得到符合预期序列的质粒，命名为pET28a-Cas9 in vitro。
表5质粒pET28a-Cas9 in vitro的构建扩增引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| assCas9-F | actttaagaaggagatataccatggacaagaaatatagcatcgg |
| assCas9-Rv | gatgatgatgatgatggctgctttatcaatcaccacctaactggc |
质粒pET28a-Cas9 in Vitro转化大肠杆菌BL21，涂布含50ug/ml卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养。挑单菌落到含1％葡萄糖的LB培养基中，37℃过夜培养。按1％接种量转接到含1％葡萄糖的LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.3-0.5时左右，分别加入终浓度为0.025mM、0.05mM、0.1mM 0.5mM、1mM IPTG溶液，在28℃、37℃下继续培养6-8h诱导蛋白Cas9的表达。蛋白Cas9为165KDa，SDS-PAGE电泳检测不同诱导条件下该蛋白的表达情况。电泳结果证实，最佳诱导条件为：OD600＝0.3-0.5时，加入终浓度为1mM IPTG溶液、37℃继续培养6-8h。用Ni-NTA Sefinose(TM)Resin Kit试剂盒进行蛋白纯化，获得纯的Cas9蛋白。
6.2 aprE基因特异性sgRNA的体外转录
利用Takara美国公司的Guide-itTMsgRNA In Vitro Transcription andScreening Systems体外转录gRNA mRNA。在枯草芽孢杆菌168基因组aprE基因序列内选择特异性sgRNA序列aprE-in vitro sgRNA，对应的正向扩增引物为aprE-in vitro sgRNA-F，序列为cctctaatacgactcactataggatgttatcaacatgagcctgtttaagagctatgc。利用试剂盒体系体外扩增上述sgRNA的DNA模板(SEQ ID NO:19)，再以上述DNA片段为模板，以上述引物aprE-in vitro sgRNA-F转录得到sgRNA mRNA，并纯化。
6.3体外组装Cas9-sgRNA mRNA复合物
体外组装Cas9-sgRNA mRNA，具体反应体系如下：
表6 Cas9/gRNA体外组装反应体系
| 试剂 | 体积(ul) |
| sgRNA(100uM) | 0.3 |
| Cas9蛋白(20uM) | 0.45 |
| Opti-MEM buffer | 23 |
| 总体积(ul) | 25 |
轻轻混合上述组分，置于室温5-10分钟，分别完成Cas9蛋白和sgRNA mRNA复合物的组装。Cas9蛋白：sgRNA核酸的分子摩尔比1:3。取8ul Lipofectamine CRISPR-MAX加到上述200ul组装好的Cas9-sgRNA蛋白质-核酸复合物中。
6.4体外验证复合物Cas9-sgRNA的切割效率
以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，用NEB phusion聚合酶，引物Cas9 editedaprE up-F/Cas9 edited aprE up-Rv扩增aprE基因片段，引物具体序列见表7，扩增条件如下：98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃90s，30个循环；72℃5min。凝胶回收PCR片段，1233bp，命名为aprE in vitro。按照表8所述反应体系，进行体外Cas9-sgRNA切割检测，反应条件为37℃，1h；80℃，5min；4℃保存。若复合物Cas9-sgRNA可以正确识别基因中的sgRNA序列，片段aprE in vitro会被切成837bp条带和396bp条带。体外切割反应液经凝胶电泳后，结果显示PCR片段被完全切开，符合预期大小837bp和396bp。
表7 aprE in vitro扩增引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| Cas9 edited aprE up-F | agagatgatatacctaaatagag |
| Cas9 edited aprE up-Rv | ccaagatatgttgcagtgctttc |
表8 Cas9-RNP体外切割反应体系表
| 试剂 | 体积(μl) |
| 片段aprE in vitro | 5 |
| 15X Cas9 Reaction Buffer | 1 |
| 15X BSA | 1 |
| 蒸馏水 | 6.5 |
| Cas9/sgRNA复合物RNP(实施例5.3所得) | 1.5 |
| Total | 15 |
6.5 Cas9-sgRNA和PCR片段共转染
参照实施例1.4所述步骤，制备枯草芽孢杆菌168感受态细胞。取0.2ml感受态细胞，加入5uL Cas9-sgRNA、10uL pZX-aprE deletion的PCR产物和2uL带有卡那霉素抗性基因的温敏质粒，于30℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养16-20h。次日，从转化平板上挑取100个转化子，30℃过夜培养。用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取上述100株菌的基因组。用引物cas9 edited-up-F/cas9 edited-down-Rv，分别以上述100株菌的基因组和枯草芽孢杆菌宿主168基因组为模板，PCR扩增。扩增条件为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃70s，30个循环；72℃7min。若aprE基因被正确敲除，PCR扩增条带大小为333bp；若aprE基因未被正确敲除，PCR扩增条带大小为1233bp；以宿主168基因组为模板时，PCR扩增条带大小为1233bp。凝胶电泳结果显示，其中有53株菌的扩增条带大小符合预期，333bp。将上述53株菌的扩增条带送至青岛华大基因公司进行测序，测序结果证实，53株菌的aprE基因均被正确敲除，成功率为53％。
将基因aprE正确敲除的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布LB平板，42℃过夜培养。次日挑选平板上的单菌落，分别点种于LB平板和含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养10h，挑选无卡那霉素抗性的菌株，共转化的温敏质粒丢失，完成枯草芽孢杆菌168基因组上aprE基因的无痕敲除。
实施例7体外组装Cas9-sgRNA(spo)，敲除解淀粉芽孢杆菌spo0IIE基因
7.1体外组装Cas9-sgRNA(spo)复合物
参照实施例6.1获得Cas9蛋白。
利用Takara美国公司的Guide-itTM sgRNA In Vitro Transcription andScreening Systems体外转录sgRNA(spo)mRNA。在解淀粉芽孢杆菌基因组Sp0IIE基因序列内选择特异性sgRNA序列sp-in vitro sgRNA，对应的正向扩增引物为sp-in vitro sgRNA-F，序列为cctctaatacgactcactatagtgtttcatttcagggaatgc gtttaagagctatgc。利用试剂盒体系体外扩增上述sgRNA的DNA模板(SEQ ID NO:20)，再以上述DNA片段为模板，以上述引sp-in vitro sgRNA-F转录得到sgRNA(spo)mRNA，并纯化。
参照实施例6.3，体外组装Cas9–sgRNA(spo)复合物。
7.2体外验证Cas9-sgRNA(spo)的切割效率
以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，用NEB phusion聚合酶，引物Cas9 edited spup-F/Cas9edited sp up-Rv扩增Sp基因片段，引物具体序列见表9，扩增条件如下：98℃2min；98℃10s；58℃20s，72℃90s，30个循环；72℃5min。凝胶回收PCR片段，2460bp，命名为sp in vitro。按照表8所述反应体系，进行体外Cas9-sgRNA(spo)切割检测，反应条件为37℃，1h；80℃，5min；4℃保存。若复合物Cas9-sgRNA(spo)可以正确识别基因sp0IIE中的sgRNA序列，片段sp in vitro会被切成869bp条带和1591bp条带。体外切割反应液经凝胶电泳后，结果显示PCR片段被完全切开，符合预期大小869bp和1591bp。
表9 sp in vitro扩增引物表
| 引物名称 | 引物序列 |
| Cas9 edited sp up-F | cgtacgggtcatcaagcgaatcg |
| Cas9 edited sp up-Rv | ctcatcatgacgagcagatctc |
7.3 PCR扩增sp0IIE基因同源臂敲除盒pZX-sp deletion
敲除盒pZX-sp deletion的图谱如图9所示，序列片段由合成公司合成，包括Sp0IIE基因上游同源臂Upstream-sp-Cas9和下游同源臂Downstream-sp-Cas9。
用NEB phusion聚合酶，以合成片段pZX-sp deletion为模板，利用引物sp up-F：5’CGCCGCTACCATATATATCTGG 3’和sp down-Rv：5’CCTTCATTGCTTCTTGGTCAAT 3’扩增pZX-spdeletion，纯化回收PCR产物。
7.4 Cas9-sgRNA(spo)、敲除盒PCR片段、温敏质粒共转化
参照实施例1.4所述步骤，制备解淀粉芽孢杆菌感受态细胞。取0.2ml感受态细胞，加入5uL Cas9-sgRNA(spo)、10uL pZX-sp deletion PCR产物和2uL带有卡那霉素抗性基因的温敏质粒，于30℃、200rpm振荡培养60min后，涂布含30μg/mL卡那霉素的LB平板，30℃培养16-20h。次日，从转化平板上挑取100个转化子，30℃过夜培养。用天根公司细菌基因组提取试剂盒，提取上述100株菌的基因组。用引物cas9 edited-sp-F/cas9 edited-sp-Rv，分别以上述100株菌的基因组和枯草芽孢杆菌宿主168基因组为模板，PCR扩增。扩增条件为：94℃4min；94℃40s；56℃40s，72℃2min30s，30个循环；72℃7min。若sp0IIE基因被正确敲除，PCR扩增条带大小为971bp；若spIIE基因未被正确敲除，PCR扩增条带大小为2460bp；以解淀粉芽孢杆菌宿主基因组为模板时，PCR扩增条带大小为2460bp。凝胶电泳结果显示，其中有55株菌的扩增条带大小符合预期，971bp。将上述55株菌的扩增条带送至青岛华大基因公司进行测序，测序结果证实，55株菌的aprE基因均被正确敲除，成功率为55％。
将spo0IIE基因被正确敲除的解淀粉芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，42℃、200rpm传代培养2次，将菌液梯度稀释，分别涂布LB平板，42℃过夜培养。次日挑选平板上的单菌落，分别点种于LB平板和含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养10h，挑选无卡那霉素抗性的菌株，共转化的温敏质粒丢失，完成解淀粉芽孢杆菌基因组上spo0IIE基因的无痕敲除，菌株在培养过程中不生成芽孢，显著提高产酶效率。
综上所述，申请人利用本发明提供的方法能成功实现对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)基因组的无痕编辑，包括单位点、多位点的基因敲除和外源基因整合等，所述编辑方法操作简单，成功率高，应用前景广泛。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司
青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种基于CRISPR-Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 607
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attcctccat tttcttctgc tatcaaaata acagactcgt gattttccaa acgagctttc 60
aaaaaagcct ctgccccttg caaatcggat gcctgtctat aaaattcccg atattggtta 120
aacagcggcg caatggcggc cgcatctgat gtctttgctt ggcgaatgtt catcttattt 180
cttcctccct ctcaataatt ttttcattct atcccttttc tgtaaagttt atttttcaga 240
atacttttat catcatgctt tgaaaaaata tcacgataat atccattgtt ctcacggaag 300
cacacgcagg tcatttgaac gaattttttc gacaggaatt tgccgggact caggagcatt 360
taacctaaaa aagcatgaca tttcagcata atgaacattt actcatgtct attttcgttc 420
ttttctgtat gaaaatagtt atttcgagtc tctacggaaa tagcgagaga tgatatacct 480
aaatagagat aaaatcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattac 540
aataaattca cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aattttttta aaaggagagg 600
gtaacta 607
<210> 2
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctatcggtca gatttatacc gatttgattt tatatattct tgaataacat acgccgagtt 60
atcacataaa agcgggaacc aatcataaaa tttaaacttc attgcataat ccattaaact 120
cttaaattct acgattcctt gttcatcaat aaactcaatc atttctttaa ttaatttata 180
tctatctgtt gttgttttct ttaataattc attaacatct acaccgccat aaactatcat 240
atcttctttt tgatatttaa atttattagg atcgtccatg tgaagcatat atctcacaag 300
acctttcaca cttcctgcaa tctgcggaat agtcgcattc aattcttctg ttaattattt 360
ttatctgttc ataagattta ttaccctcat acatcactag aatatgataa tgctcttttt 420
tcatcctacc ttctgtatca gtatccctat catgtaatgg agacactaca aattgaatgt 480
gtaactcttt taaatactct aaccactcgg cttttgctga ttctggatat aaaacaaatg 540
tccaattacg tcctcttgaa tttttcttgt tttcagtttc ttttattaca ttttcgctca 600
t 601
<210> 3
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgagccata ttcagagaga aacatcaaga ccgagactga attcaaatat ggatgcagat 60
ctgtacggct ataaatgggc aagagataat gttggccaat caggcgcaac aatttataga 120
ctgtatggca aaccggatgc accggaactg tttctgaaac atggcaaagg ctcagttgca 180
aatgatgtca cagatgaaat ggttcgcctt aattggctga cagaatttat gccgctgccg 240
acaattaaac attttattcg cacaccggat gatgcatggc tgctgacaac agcaattccg 300
ggaaaaacag catttcaagt cctggaagaa tatccggatt caggcgaaaa tattgttgat 360
gcactggcag tttttcttag acgcctgcat tcaattccgg tctgcaattg cccgtttaat 420
agcgatagag tttttagact ggcacaagca caaagcagaa tgaataatgg cctggttgat 480
gcaagcgatt ttgatgatga aagaaatggc tggcctgttg aacaagtttg gaaagagatg 540
cataaactgc tgccgttttc accggatagc gttgttacac atggcgattt ttcactggat 600
aacctgattt ttgatgaggg caaactgatt ggctgcattg atgttggcag agttggcatt 660
gcagatagat atcaagatct ggcaattctg tggaattgcc tgggcgaatt ttcaccgtca 720
ctgcaaaaaa gactgttcca gaaatatggc attgataacc cggatatgaa caagctgcaa 780
tttcatctta tgctggacga gtttttttaa tga 813
<210> 4
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 60
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 120
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 180
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 240
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 300
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 360
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 420
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 480
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 540
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 600
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 660
aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 720
aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac a 771
<210> 5
<211> 4182
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtggcaccga aaaaaaagcg caaagtcatg gacaaaaaat acagcattgg cctggatatt 60
ggcacaaatt cagttggctg ggcagttatc acagacgaat ataaagttcc gagcaagaaa 120
ttcaaagtcc tgggcaatac agatcgccat agcatcaaaa aaaacctgat tggcgcactg 180
ctgtttgatt caggcgaaac agcagaagca acaagactta aaagaacagc aagacgcaga 240
tatacaagac gcaaaaatcg catttgctac ctgcaagaaa tcttcagcaa tgaaatggcg 300
aaagtcgacg acagcttttt tcatagactg gaagaatcat ttctggtcga agaggacaaa 360
aagcatgaac gccatccgat ttttggcaac attgttgatg aagtcgcgta ccatgaaaaa 420
tatccgacaa tttatcatct gcgcaaaaaa ctggttgaca gcacagataa agcagatctt 480
cgcctgattt atctggcact ggcacatatg atcaaattta gaggccattt tctgatcgaa 540
ggcgatctga atccggataa ttcagatgtc gacaaactgt ttattcagct ggtccagaca 600
tataaccagc tgtttgaaga aaatccgatt aatgcatcag gcgttgatgc aaaagcaatt 660
ctgtcagcaa gactgtcaaa atcaagacgc ctggaaaatc tgattgcaca actgcctggc 720
gaaaaaaaga atggcctgtt tggcaatctt attgcactgt cactgggcct gacaccgaac 780
tttaaatcaa attttgatct ggcggaagat gcgaaactgc aactttcaaa agatacgtat 840
gatgacgatc tggataatct gctggcgcaa attggcgatc aatatgcaga tctttttctg 900
gcagcgaaaa atctgtcaga tgcaattctg ctgtcagata ttctgcgcgt caatacagaa 960
attacaaaag caccgctgag cgcgagcatg attaaaagat atgatgaaca tcatcaggac 1020
ctgacactgc tgaaagcact ggttagacaa caactgccgg aaaaatacaa agagattttc 1080
tttgaccaga gcaagaatgg ctatgcaggc tatattgatg gcggagcatc acaagaagaa 1140
ttttacaaat tcatcaaacc gatcctggaa aaaatggacg gcacagaaga actgctggtt 1200
aaactgaata gagaagattt actgcgcaaa cagcgcacat ttgataatgg ctcaattccg 1260
catcagattc atctgggcga actgcatgcg attcttagac gccaagagga tttttatccg 1320
ttcctgaaag ataaccgcga gaaaatcgaa aaaatcctga catttcgcat cccgtattat 1380
gtcggaccgc tggcaagagg caattcaaga tttgcatgga tgacacgcaa aagcgaagaa 1440
acaattacac cgtggaattt tgaagaggtt gttgataaag gcgcaagcgc acaatcattt 1500
attgaacgca tgacgaactt cgataaaaac ctgccgaatg aaaaagtcct gccgaaacat 1560
tcactgctgt atgaatactt tacggtctat aatgagctga cgaaagtcaa atatgtcaca 1620
gaaggcatga gaaaaccggc atttctgtca ggcgaacaga aaaaagcgat tgtcgatctt 1680
ctgtttaaaa cgaaccgcaa agtgacagtc aaacaactga aagaggacta cttcaaaaag 1740
atcgaatgct ttgatagcgt cgaaatttca ggcgtcgaag atagatttaa tgcaagcctg 1800
ggcacatatc atgatctgct gaaaatcatc aaggataaag attttctgga taacgaagaa 1860
aacgaagata tccttgaaga tatcgtgctg acactgacat tatttgaaga tcgcgaaatg 1920
attgaggaac ggctgaaaac atatgcacac ctgtttgatg acaaagtgat gaaacagctg 1980
aaacgcagaa gatatacagg ctggggcaga ctttcacgca aactgattaa tggcattcgc 2040
gataaacaaa gcggcaaaac aatcctggat tttctgaaat cagatggctt tgcgaatcgc 2100
aattttatgc agctgattca tgatgacagc ctgacgttta aagaggatat tcagaaagca 2160
caagtttcag gccaaggcga ttcactgcat gaacatattg caaatctggc aggctcaccg 2220
gcaatcaaaa aaggcattct gcaaacagtt aaagtcgtcg atgaactggt taaagttatg 2280
ggcagacata aaccggaaaa catcgttatt gaaatggcac gcgaaaatca gacaacacaa 2340
aaaggacaga aaaattcacg cgaacggatg aaaagaattg aagaaggcat taaagaactg 2400
ggcagccaga ttctgaaaga acatccggtt gaaaatacac agctgcagaa cgaaaaactg 2460
tatctgtatt atctgcagaa tggacgcgat atgtatgtcg atcaagaact ggatattaat 2520
cgcctgagcg attatgatgt ggatcatatt gttccgcaaa gcttccttaa agatgatagc 2580
atcgataaca aagttctgac acgcagcgac aaaaatagag gcaaatcaga taatgtcccg 2640
tcagaagagg tcgtcaaaaa aatgaaaaac tattggagac agctcctgaa cgcgaaactt 2700
attacacaac ggaaatttga caacctgaca aaagcagaaa gaggcggact ttcagaactt 2760
gataaagcgg gatttatcaa aagacagctg gtcgaaacac gccagattac aaaacatgtt 2820
gcgcaaattc tggatagccg catgaacaca aaatatgacg aaaacgataa actgatccgc 2880
gaggtcaaag tcattacact gaaatcaaaa ctggtcagcg attttcgcaa agacttccag 2940
ttttacaaag tccgcgaaat caacaactac catcatgcac atgatgcata tctgaatgca 3000
gttgtcggca cagcactgat taagaaatat cctaaactgg aaagcgaatt cgtctacggc 3060
gattataaag tctatgatgt ccgcaaaatg atcgcaaaaa gcgaacaaga aattggcaaa 3120
gcgacagcga aatacttttt ctacagcaat atcatgaact ttttcaaaac ggaaatcaca 3180
ctggcgaacg gcgaaattag aaaaagaccg cttattgaaa caaatggcga gacaggtgaa 3240
atcgtttggg ataaaggcag agattttgcg acagttagaa aagttctgtc aatgccgcaa 3300
gtcaacatcg tgaaaaaaac agaggttcaa acaggcggat ttagcaaaga atcaattctt 3360
ccgaaacgca actcagacaa acttatcgca cgcaaaaaag attgggaccc gaagaaatat 3420
ggcggatttg attcaccgac agttgcatat tcagttctgg ttgttgcaaa agtcgaaaaa 3480
ggcaagagca aaaagctgaa aagcgtcaaa gaacttctgg gcattacaat tatggaacgc 3540
agcagctttg agaaaaaccc gattgatttt cttgaagcga aaggctacaa agaggtgaaa 3600
aaggatctga ttatcaagct gccgaaatac agcctttttg aactggaaaa tggcagaaaa 3660
cgcatgctgg catcagcagg cgaacttcag aaaggcaatg aactggcact gccgtcaaaa 3720
tatgttaact ttctgtatct ggcgagccac tacgagaaac tgaaaggatc accggaagat 3780
aatgaacaga aacaactgtt tgtcgagcag cataaacatt acctggatga aatcatcgag 3840
cagatctcag aattcagcaa acgcgttatt ctggcagatg cgaacctgga taaagttctt 3900
agcgcatata acaaacaccg ggataaaccg attagagaac aagcggaaaa tatcattcac 3960
ctgtttacac tgacaaatct tggcgcaccg gcagcgttta aatactttga tacaacaatt 4020
gaccgcaagc gctatacaag cacaaaagaa gttctggacg caacacttat tcaccaatca 4080
attacaggcc tttatgaaac acgcattgat ctgtcacaac ttggcggaga tggcggtggc 4140
ggatcacatc atcaccacca tcaccatcat catcactgat aa 4182
<210> 6
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat gttttcgctt 60
gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa acatcaccct 120
cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttgc cgtgatttcg 180
tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt 240
attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg 300
atagcggtac ca 312
<210> 7
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttgacaaag ccgtttccag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgtaaccg aagaacgttc aaaaaaccaa atcatcaagc cgccattttc acttcgccgg 60
cacattgaga caataatgga caaatccggt atcctcttca tagccgtttt gctcatacaa 120
gcttcttgcc ttccggttgt ggtgctcagt ctgaagtgtt aaacattttg ccccgttttg 180
ccctgcataa tcctttgcgg cagaaagcag ccggccgccg gctccctttg tacgcgcatg 240
aggaacgaca aataagtcat ttaatatgta tatccttttc attgacacag aagaaaacgt 300
tggatagagc tgggtaaagc ctatgaattc tccattttct tctgctatca aaataacaga 360
ctcgtgattt tccaaacgag ctttcaaaaa agcctctgcc ccttgcaaat cggatgcctg 420
tctataaaat tcccgatatt ggttaaacag cggcgcaatg gcggccgcat ctgatgtctt 480
tgcttggcga atgttcatct tatttcttcc tccctctcaa taattttttc attctatccc 540
ttttctgtaa agtttatttt tcagaatact tttatcatca tgctttgaaa aaatatcacg 600
ataatatcca ttgttctcac ggaagcacac gcaggtcatt tgaacgaatt ttttcgacag 660
gaatttgccg ggactcagga gcatttaacc taaaaaagca tgacatttca gcataatgaa 720
catttactca tgtctatttt cgttcttttc tgtatgaaaa tagttatttc gagtctctac 780
ggaaatagcg agagatgata tacctaaata gagataaaat catctcaaaa aaatgggtct 840
actaaaatat tattccatct attacaataa attcacagaa tagtctttta agtaagtcta 900
ctctgaattt ttttaaaagg agagggtaaa gagtgagaag caaaaaattg tggatcagct 960
tgttgtttgc gttaacgtta atctttacga tggcgttcag 1000
<210> 9
<211> 1070
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taacggaacg tccatggcga ctcctcacgt tgccggagca gcagcgttaa ttctttctaa 60
gcacccgact tggacaaacg cgcaagtccg tgatcgttta gaaagcactg caacatatct 120
tggaaactct ttctactatg gaaaagggtt aatcaacgta caagcagctg cacaataata 180
gtaaaaagaa gcaggttcct ccatacctgc ttctttttat ttgtcagcat cctgatgttc 240
cggcgcattc tcttctttct ccgcatgttg aatccgttcc atgatcgacg gatggctgcc 300
tctgaaaatc ttcacaagca ccggaggatc aacctggctc agccccgtca cggccaaatc 360
ctgaaacgtt ttaacagcgg cttctctgtt ctctgtcaac tcgatcccat actggtcagc 420
cttattctcc tgataacgcg agacagcatt agaaaaaggc gtaaccgcaa agctcaaaac 480
agaaaacaaa agcaataaca gcggaagtgc cgcaagatca tgccgccctt ctaaatgaaa 540
catgctgcgg gttaggcgaa ccgtccgctt gtaaagctta tcaatgacat aaaatccggc 600
gagcgacacg agcaaatagc cagccagacc gatgtaaacg tgcttcatga cataatggcc 660
catttcgtgg cccataataa acagaatttc tgaatcgtca agtttgttca gcgtcgtatc 720
ccacaataca atccgtttat tggccccaat tcctgtaaca taggcattca gcgcatttgt 780
tttttctgac atgttcactt catatacatg gtcagccgga atattggctt catctgccag 840
ctctaaaatt ttgctttcaa gctctttgtt tttcagcgga taaaaatcat tgtataaagg 900
atcgataatg accggctgaa taaaaaacag aaacagcgaa aacggcactg ttaacagcca 960
ggcgtataac caccattttt tttcatgcct tttgatcagc caataaaaaa cgagaacgca 1020
aagcgtaaag attggaaagc tgatccaaaa gctgataacc tgatccttag 1070
<210> 10
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgagcctga acctgcaaac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 11
<211> 1006
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatatggcgc aagcagcaag acaagcagtc cgataatcag cgtataaaat aagcctagta 60
agatcttatc cgttctccaa tacagcttga aaaacactac attcaacgca atgggaagag 120
tgatgatgaa aaacagaaac acgaatgcaa tcggctccat cccatccggg tattccttcc 180
aatacgaaaa gaaactaaaa atcatttgta cgatcggcaa actgacaaca gcaaggtcga 240
acgtataaaa cttacccttt ccgccatgat cacgcggcat cagcatatag tgaaaagccg 300
tcagcagcac atatccgtat aacaaaaaat gcagcagcgg cagcagttct tttccgtcct 360
ctcttaagta agcgctggtg aagtttgttg attgcacctg gtgaataagt tcaacagaca 420
ctcccgccag cagcacaatc cgcaatataa cacccgccaa gaacattgtg cgctgccggt 480
ttattttggg atgatgcacc aaaagatata agcccgccag aacaacaatt gaccattgaa 540
tcagcagggt gctttgtctg cttaatataa aataacgttc gaaatgcaat acataatgac 600
tgaataactc caacacgaac aacaatcctt tacttcttat taaggcctca ttcggttaga 660
cagcggactt ttcaaaaagt ttcaagatga aacaaaaata tctcatcttc cccttgatat 720
gtaaaaaaca taactcttga atgaaccacc acatgacact tgactcatct tgatattatt 780
caacaaaaac aaacacagga caatactatc aattttgtct agttatgtta gtttttgttg 840
agtattccag aatgctagtt taatataaca atataaagtt ttcagtattt tcaaaaaggg 900
ggatttattg tgggtttagg taagaaattg tctgttgctg tcgctgcttc gtttatgagt 960
ttatcaatca gcctgccagg tgttcaggct gctgaaggtc atcagc 1006
<210> 12
<211> 1018
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgcgttaac aacgtacctc acgccttctt ccacgttcaa agatgccaag gcagctctca 60
ttcagtctgc ccgtgacctc tacggctcaa ctgatgccgc taaagttgaa gcagcctgga 120
atgctgttgg attgtaatat taggaaaagc ctgagatccc tcaggctttt attgttacat 180
atcttgattt ctctctcagc tgaaacgacg aaaagatgct gccatgagac agaaaaccgc 240
tcctgatttg cataaagagg gatgcagccg caagtgcgca ttttataaaa gctaatgatt 300
cagtccacat aattgataga cgaattctgc tacaggtcac gtggctatgt gaaggatcgc 360
gcgtccagtt aagagcaaaa acattgacaa aaaaatttat ttatgctaaa atttactatt 420
aatatatttg tatgtataat aagattctcc tggccagggg aatcttattt tttgtggagg 480
atcatttcat gaggaaaaat gagtccagct taacgtctct aatttcagct tttgcccgtg 540
catatcacag ccgatatgac acacctctta tttttgatga ttttatcgca aaagatctca 600
ttaacgaaaa agagtttatc gacatcagta aaaatatgat tcaagaaata tcgtttttca 660
acaaagagat cgccgaacgt cttcaaaatg atcctgaaaa aatattaaaa tgggttgcac 720
aaatccagct gtctccaacg cccctagcac gtgcttctta ttgtgaaaaa gtcttgcaca 780
acgaattaat cctgggggca aaacagtatg tcattcttgg agcgggactg gatactttct 840
gctttcggca tccagaatta gaaaacagct tacaggtttt cgaggttgat catccggcca 900
cacagcaatt gaaaaaaaat aagctgaagg atgcaaatct gacaattccg ggtcatcttc 960
attttgttcc tatggatttc accaaaacgt tttcgtatga tcctctctta gatgaagg 1018
<210> 13
<211> 1059
<212> DNA
<213> 克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)
<400> 13
gctgaagaag caaaagaaaa atatttaatt ggctttaatg agcaggaagc tgtcagtgag 60
tttgtagaac aagtagaggc aaatgacgag gtcgccattc tctctgagga agaggaagtc 120
gaaattgaat tgcttcatga atttgaaacg attcctgttt tatccgttga gttaagccca 180
gaagatgtgg acgcgcttga actcgatcca gcgatttctt atattgaaga ggatgcagaa 240
gtaacgacaa tggcgcaatc agtgccatgg ggaattagcc gtgtgcaagc cccagctgcc 300
cataaccgtg gattgacagg ttctggtgta aaagttgctg tcctcgatac aggtatttcc 360
actcatccag acttaaatat tcgtggtggc gctagctttg taccagggga accatccact 420
caagatggga atgggcatgg cacgcatgtg gccgggacga ttgctgcttt aaacaattcg 480
attggcgttc ttggcgtagc gccgagcgcg gaactatacg ctgttaaagt attaggggcg 540
agcggttcag gttcggtcag ctcgattgcc caaggattgg aatgggcagg gaacaatggc 600
atgcacgttg ctaatttgag tttaggaagc ccttcgccaa gtgccacact tgagcaagct 660
gttaatagcg cgacttctag aggcgttctt gttgtagcgg catctgggaa ttcaggtgca 720
ggctcaatca gctatccggc ccgttatgcg aacgcaatgg cagtcggagc tactgaccaa 780
aacaacaacc gcgccagctt ttcacagtat ggcgcagggc ttgacattgt cgcaccaggt 840
gtaaacgtgc agagcacata cccaggttca acgtatgcca gcttaaacgg tacatcgatg 900
gctactcctc atgttgcagg tgcagcagcc cttgttaaac aaaagaaccc atcttggtcc 960
aatgtacaaa tccgcaatca tctaaagaat acggcaacga gcttaggaag cacgaacttg 1020
tatggaagcg gacttgtcaa tgcagaagcg gcaacacgc 1059
<210> 14
<211> 353
<212> PRT
<213> 克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)
<400> 14
Ala Glu Glu Ala Lys Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu
1 5 10 15
Ala Val Ser Glu Phe Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala
20 25 30
Ile Leu Ser Glu Glu Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe
35 40 45
Glu Thr Ile Pro Val Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp
50 55 60
Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu
65 70 75 80
Val Thr Thr Met Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln
85 90 95
Ala Pro Ala Ala His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val
100 105 110
Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn
130 135 140
Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys
165 170 175
Val Leu Gly Ala Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu
195 200 205
Gly Ser Pro Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala
210 215 220
Thr Ser Arg Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala
225 230 235 240
Gly Ser Ile Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly
245 250 255
Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala
260 265 270
Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro
275 280 285
Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His
290 295 300
Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser
305 310 315 320
Asn Val Gln Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly
325 330 335
Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr
340 345 350
Arg
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtgccgtgt ttagttttca 20
<210> 16
<211> 1070
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaattgccaa tcgctccgta tggaatgaag cagcagctac agcatactcg gcaaatgact 60
cgaaagaaac agaaagccaa aagaaagcag gcgctctgca aatgaccgtc aatgcgctcc 120
taatggctgc tgtcattatt gtattggcgg tcgacgtctt gccggccccg ctcgtattta 180
tgcttggcgt ggcactggcg ctgccgttta atttacggaa cgtagacgac caaatggaag 240
ccattaaaaa gcacgcacca aatgcgttaa tgatggcaac gatcatcatt gccgcaggct 300
gttttttagg aattttaaac gagtcgggaa tgctccaggc actagcagtc gatatagtcg 360
gcgtgcttcc acacgctgtt gtcccttata ttcatgtcat tatcggcttt tttggcgtcc 420
catttgactt aattttaagc acagatgcct attattttgc attgttgcca ctcgttgaac 480
agattgtaac cgaagtcgga gtttcttcta cttcagccgc atatgcgctc gtgatcggaa 540
acatcattgg tacatttgtt agccctcttg ctccggctgt atggctggca ttgcaactcg 600
caggccttga aatgggcaaa catatccgct attccttttt tatcatgtgg ggatttagca 660
tcgtcatgct tgtgatcgct tacatcctcg gcattattac atttgcataa aagcttcact 720
cagaaaaaaa tgcgtttgtc taccatttga agccgcatcg tcaggtgcgg cttttgatgt 780
tggcgacaaa agcaacagac tgagaaaaaa gattgttccc catgcctaaa ttcgtccgtc 840
atttctagcc aaccattgag catctatcca aagatacgct aacaccaaac ccctattatt 900
cgatttttgt gaatcatcca cactgattcg cccgaagtac gtcgaaataa tttttgatat 960
tggtccttaa ttctgacaaa ttgctccaga tttgcttgct atagtggacg tacgatatta 1020
atagggtggt ggcgagaatg atcagtaaag tgataaagac gtcagaagaa 1070
<210> 17
<211> 1058
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgtatattt tccctccaat atgaccatga tggtaacacg aaatcagatg gaggggaaac 60
gaatgaatgg gacattaagg caaattttgc tcatgaccga cgggcattcg aattacggcg 120
aagatcctgt agcgattgcg cgcttggccc aagagtatga cgttacggta aatgtaatcg 180
gcattactga tgaaaaccgc gaaaatgaaa aaggacttca agaggttgaa gcgattgctc 240
tagctggtgg aggggttagc gaaattgttt ttgccaggca actggccaaa acagttcaga 300
tggtaacaag aaaagcgatg acgcaaacac ttcacggtgt cgttaaccaa gaacttaaac 360
aaatattagg ccagaatgat gaaatggaag acttgccgcc ggaaaaacgc gggcaagtga 420
tggaagtagt ggatgatcta ggggagaaag tgctcttgga ggtacttgtg ttaatcgaca 480
cgagtgcaag catgacaaat aaattaccga tggtgcagga agcgttattg gatttgtcca 540
ttagtttaaa ttcccgttca ggggatacaa aattttctct gtattcattt cccgggaaaa 600
gaaagccgat tgaaaggttg cttgattgga cgccaaagct ccaatcacta actgcgactt 660
ttacgaaact gtcaacggcg ggaatgacac cgactggccc agctttgcaa gcagcactcc 720
aagtgtttga ggaaagacgg ggcaaaagga gattggaaga cgatgagaat gaacagcgcc 780
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aaaccttata agttgattcg aaaacttggg gcaggggtca ctggctatgt ttacttggca 900
gaaggagaaa cgggttcagt ggcgttaaag attggcacag aaccgatgtc aattacagca 960
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<211> 4110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 20
gtgtttcatt tcagggaatg c 21
Claims (10)
1.一种基于CRISPR-Cas9系统进行芽孢杆菌基因组编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）构建Cas9表达质粒或体外组装Cas9蛋白和sgRNA mRNA的复合物Cas9-sgRNA；
（2）PCR扩增无筛选标记、包含上下游同源臂的待编辑基因敲除盒或表达盒；
（3）将步骤（2）获得的PCR扩增片段与Cas9表达质粒或与Cas9-sgRNA复合物和温敏质粒共转化（转染）芽孢杆菌宿主细胞；
（4）去除芽孢杆菌中的Cas9表达质粒或温敏质粒，筛选得到芽孢杆菌工程菌，实现待编辑基因敲除或外源基因整合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述Cas9表达质粒由f1、f2和f3这三个片段融合而成，其中f1包含Cas9基因的启动子、温敏复制子、卡那霉素抗性基因、大肠杆菌复制子；f2包含Cas9基因；f3包含待编辑基因的特异性sgRNA转录盒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述f1片段中启动子的核苷酸序列为SEQ IDNO:1，温敏复制子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，卡那霉素抗性基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:3，大肠杆菌复制子的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；所述f2片段中Cas9基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5；所述f3片段中sgRNA转录盒的启动子序列为SEQ ID NO:6；sgRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述复合物Cas9-sgRNA的体外组装方法，包括：
（a）在大肠杆菌中表达Cas9蛋白，并进行纯化；
（b）体外转录得到待编辑基因的特异性sgRNA mRNA，并进行纯化；
（c）将纯化的Cas9蛋白与sgRNA mRNA按分子摩尔比1:3进行体外组装，获得复合物Cas9-sgRNA。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（a）中所述Cas9蛋白的核苷酸序列为SEQID NO:18；步骤（b）中所述体外转录得到的sgRNA mRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:19或SEQID NO:20。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述待编辑基因为aprE基因、nprE基因、spo0IIE基因或碱性蛋白酶基因。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述aprE基因敲除盒或碱性蛋白酶基因表达盒的上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:8，下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述nprE基因敲除盒的上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:11，下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:12。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述spo0IIE基因的上游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:16，下游同源臂的核苷酸序列为SEQ ID NO:17。
10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）或解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）中的任意一种。
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2020
- 2020-04-22 CN CN202010319490.7A patent/CN111893139A/zh active Pending
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