JP2023549432A - 不能なラムノース代謝を有する宿主細胞において組み換えタンパク質を産生する方法、ならびにその発現ベクター、宿主細胞、および組み換えタンパク質 - Google Patents

不能なラムノース代謝を有する宿主細胞において組み換えタンパク質を産生する方法、ならびにその発現ベクター、宿主細胞、および組み換えタンパク質 Download PDF

Info

Publication number
JP2023549432A
JP2023549432A JP2023546386A JP2023546386A JP2023549432A JP 2023549432 A JP2023549432 A JP 2023549432A JP 2023546386 A JP2023546386 A JP 2023546386A JP 2023546386 A JP2023546386 A JP 2023546386A JP 2023549432 A JP2023549432 A JP 2023549432A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotide sequence
sequence
seq
dna construct
ranibizumab
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023546386A
Other languages
English (en)
Inventor
ヴィクストレーム、ダーヴィド
イスマイル、ヌルジャン
サミュエルソン、パトリック
ミルザデ、キアバッシュ
グディス、サンソッシュ
カードフ、マリア
セケール、キャスリーン
サリフ、タグリード
バラシュキエヴィチュ、マリウシュ
バシリ、シアバッシュ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xbrane Biopharma AB
Stada Arzneimittel AG
Original Assignee
Xbrane Biopharma AB
Stada Arzneimittel AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xbrane Biopharma AB, Stada Arzneimittel AG filed Critical Xbrane Biopharma AB
Publication of JP2023549432A publication Critical patent/JP2023549432A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、細菌宿主細胞において組み換えタンパク質を発現させるのに適切なＤＮＡ構築物であって、ＤＮＡ構築物は、ｒｈａＢＡＤプロモータ、ＲｈａＲ転写活性化因子、ＲｈａＳ転写活性化因子、抗生物質耐性マーカ、抗生物質耐性マーカをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータ、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ、ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ、およびｐＭＢ１複製の起点をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物に関する。ＤＮＡ構築物は、ｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結された、組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含んでもよい。本発明は、ＤＮＡ構築物を含むベクターおよび細菌宿主細胞、ならびに細菌宿主細胞をラムノースに曝露し、それによって組み換えタンパク質の発現を誘導することによる、組み換えタンパク質を産生する方法にさらに関する。

Description

本発明は、細菌宿主細胞において組み換えタンパク質を発現させるのに適切なＤＮＡ構築物であって、ＤＮＡ構築物は、ｒｈａＢＡＤプロモータ、ＲｈａＲ転写活性化因子、ＲｈａＳ転写活性化因子、抗生物質耐性マーカ、少なくとも１種のターミネータ、および複製の起点をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物に関する。ＤＮＡ構築物は、抗生物質耐性マーカをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモータ、およびｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結された、組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列も含んでもよい。少なくとも１種のターミネータは、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータであり得る。組み換えタンパク質はラニビズマブであり得る。本発明は、ＤＮＡ構築物を含むベクターおよび細菌宿主細胞、ならびに細菌宿主細胞をラムノースに曝露し、それによって組み換えタンパク質の発現を誘導することによる、組み換えタンパク質を産生する方法にさらに関する。
ラムノースの代謝は、Ｌ－ラムノースがパーミアーゼＲｈａＴを介して細胞内に取り込まれ、次いでＬ－ラムノースイソメラーゼ（ＲｈａＡ）によってＬ－ラムヌロースに異性化され、次いでＬ－ラムヌロースはラムヌロキナーゼ（ＲｈａＢ）によってさらにリン酸化され、最終的にラムヌロース－１－リン酸アルドラーゼ（ＲｈａＤ）によって加水分解されて、ジヒドロキシアセトンリン酸およびＬ－ラクトアルデヒドを与えることを伴う［１］。遺伝子ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、およびｒｈａＤは、ｒｈａＢＡＤと称されるオペロンを形成し、ｒｈａＢＡＤプロモータの助けで転写される［１］。他のシステムと比較して、ラムノース代謝経路は、下で説明されるように、ＲｈａＳおよびＲｈａＲとして公知の２種の転写活性化因子が調節に要されるという事実によって区別される［１］。
ｒｈａＢＡＤオペロンは、それらそれぞれの転写開始部位を分離するおよそ２４０ｂｐのＤＮＡを有する、ｒｈａＳＲオペロンから分岐して、上述のｒｈａＢ、ｒｈａＡ、およびｒｈａＤ遺伝子を転写する正の調節性異化オペロンである［１］。ｒｈａＳＲオペロンはＲｈａＳおよびＲｈａＲをコードし、二量体ＲｈａＳおよびＲｈａＲタンパク質の各単量体は、２つのヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフを含有し、ＤＮＡの２つの大きな溝と接する。ＲｈａＲは、ｒｈａＳＲ転写開始部位に対して－３２～－８２塩基におよぶプロモータＤＮＡに結合することによって、ｒｈａＳＲの転写を調節する［１］。ｒｈａＳＲ発現に続いて、ＲｈａＳは、転写開始部位に対して－３２～－８１塩基におけるｒｈａＢＡＤオペロンの上流にあるＤＮＡに結合して、ｒｈａＢＡＤ発現を増加させる［１］。さらに、ｒｈａＳＲ－ｒｈａＢＡＤ遺伝子間領域は、ｒｈａＢＡＤオペロンの転写開始部位に対して－９２．５（ＣＲＰ１）の位置にＣＲＰ結合部位、ならびにｒｈａＳＲオペロンの転写開始部位に対して－９２．５（ＣＲＰ２）、－１１５．５（ＣＲＰ３）、および－１１６．５（ＣＲＰ４）の位置にＣＲＰ結合部位を含有する［１］。サイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて１００種を上回るプロモータの発現を調節する。
ＲｈａＳ、ＲｈａＲ、およびｒｈａＢＡＤプロモータをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、当技術分野において公知である。特許文献１は、ＲｈａＳ、ＲｈａＲ、およびｒｈａＢＡＤプロモータをコードするＤＮＡ配列を含むｐＴＡＣＯ－およびｐＬＥＭＯ由来プラスミド（すなわち、ＤＮＡ構築物）を開示する。しかしながら、特許文献１は、不能なラムノース代謝を有する宿主細胞を使用することについては無言である。
ＲｈａＳ、ＲｈａＲ、およびｒｈａＢＡＤプロモータをコードするＤＮＡ配列を含むｐＲｈａ由来プラスミドに基づくＤＮＡ構築物も、当技術分野において、例えばジャカローネら（Ｇｉａｃａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．）［５］またはイェルムら（Ｈｊｅｌｍ ｅｔ ａｌ．）［２］から公知である。Ｇｉａｃａｌｏｎｅらは、例えばプラスミドｐＲｈａ６７ＡおよびｐＲｈａ１０９Ａを記載し、一方でＨｊｅｌｍらはプラスミドｐＲｈａ６７Ｋを開示する。
ＲｈａＳ、ＲｈａＲ、およびｒｈａＢＡＤプロモータをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、当技術分野において公知であるものの、組み換えタンパク質、特にモノクローナル抗体またはそのフラグメントのとりわけ産業規模の産生において、依然として多くの課題がある。主な課題は：
（ｉ）宿主細胞が、膜、タンパク質、および核酸等の細胞高分子への損傷をもたらすストレスに供されること；
（ｉｉ）宿主細胞の成長不良；
（ｉｉｉ）産生された組み換えタンパク質の活性不良；ならびに／または
（ｉｖ）低収量の組み換えタンパク質を獲得すること
である。
したがって、改善されたＤＮＡ構築物、ならびに、特にそのような組み換えタンパク質が治療的適用を意図される場合の、高収量のモノクローナル抗体またはそのフラグメント等の組み換えタンパク質の効率的な産生に適切な宿主細胞および方法の必要性がある。
米国特許第８１３８３２４号明細書
ゆえに、本発明の目的は、改善されたＤＮＡ構築物、ならびに、特にそのような組み換えタンパク質が治療的適用を意図される場合の、高収量の、細菌宿主細胞におけるモノクローナル抗体またはそのフラグメント等の組み換えタンパク質の効率的な産生に適切な細菌宿主細胞および方法を提供することであった。組み換えタンパク質はラニビズマブであり得る。
本発明の第１の態様は、細菌宿主細胞においてラニビズマブを発現させるためのＤＮＡ構築物であって、ラニビズマブは、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、ＤＮＡ構築物は、ラニビズマブをコードするヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡ構築物は、ラニビズマブの軽鎖および／またはラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列に転写方向で作動可能に連結されている、シグナルペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列をさらに含み、ＤＮＡ構築物は、
－ ｒｈａＢＡＤプロモータ、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカ、
－ 少なくとも１種のターミネータ、および
－ ｐＭＢ１複製の起点
をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物に関する。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、
－ 抗生物質耐性マーカが、カナマイシン耐性マーカ、好ましくは配列番号１２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
－ 抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータが、ＡｍｐＲプロモータ、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモータであり；
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ；
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ；および／または
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｐＭＢ１複製の起点
によって特徴付けられる。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、
－ 配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカである抗生物質耐性マーカ；
－ 抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモータであり；
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ；
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ；および／または
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列を含むｐＭＢ１複製の起点
によって特徴付けられる。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、
－ 配列番号８のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｒｈａＢＡＤプロモータ；
－ 配列番号９のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＲｈａＲ転写活性化因子；
－ 配列番号１１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＲｈａＳ転写活性化因子；
－ 抗生物質耐性マーカが、配列番号１２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
－ 配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモータ；
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ；
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ；および
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むｐＭＢ１複製の起点
によって特徴付けられる。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、
－ 配列番号８のヌクレオチド配列を含むｒｈａＢＡＤプロモータ；
－ 配列番号９のヌクレオチド配列を含むＲｈａＲ転写活性化因子；
－ 配列番号１１のヌクレオチド配列を含むＲｈａＳ転写活性化因子；
－ 抗生物質耐性マーカが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
－ 配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモータ；
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ；
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ；および
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列を含むｐＭＢ１複製の起点
によって特徴付けられる。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰａｅＲ７１、ＢｂｓＩ、ＳｔｙＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、ＳｂｆＩ、ＳｐｈＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩによって切断可能な１７箇所の制限部位を含む多重クローニングサイトを含む。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
好ましい実施形態において、ラニビズマブをコードするヌクレオチド配列は、ｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結されている。
好ましい実施形態において、ラニビズマブをコードするヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに好ましい実施形態において、ラニビズマブをコードするヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか一方または両方に転写方向で作動可能に連結されている。
一実施形態において、シグナルペプチドはＰｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼＢ）である。好ましい実施形態において、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；より好ましくは、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号７の配列を含む。
１つの実施形態において、結果として生じたＰｅｌＢシグナルペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列：
を含む［６］。
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号１７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に従ったＤＮＡ構築物のいずれかを含む発現ベクターに関する。
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に従ったＤＮＡ構築物または本発明の第２の態様に従った発現ベクターを含む細菌宿主細胞であって、細菌宿主細胞は、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細胞である、細菌宿主細胞に関する。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、（ｉ）ＲｈａＢを不活性の状態にする、ｒｈａＢ遺伝子の核酸配列における変異を含む染色体、または（ｉｉ）ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列が欠失している染色体、のいずれかを含む。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列にフレームシフト変異を含む染色体を好ましくは含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞である。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列を含む染色体を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞であり、任意選択で、細菌宿主細胞の染色体は、ＲｈａＴをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様に従った細菌宿主細胞をラムノースに曝露し、それによってラニビズマブの発現を誘導する工程を含む、ラニビズマブを産生する方法に関する。好ましい実施形態において、方法は、細菌宿主細胞からラニビズマブを回収する工程をさらに含み；任意選択で、回収されたラニビズマブを、好ましくは１つまたは複数のクロマトグラフィー工程によって精製する１つまたは複数の工程をさらに含む。
本発明の第５の態様は、
ラニビズマブタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結されるように、組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物にクローニングする工程；および
ａ．結果として生じたヌクレオチド配列を、ラムノース代謝を不能にする変異または改変を含む染色体を含む細菌宿主細胞に導入する工程、
を含む、ラニビズマブを産生する方法に関する。
好ましい実施形態において、方法は、細菌宿主細胞をラムノースに曝露し、それによって組み換えタンパク質の発現を誘導する工程をさらに含む。
別の実施形態において、方法は、細菌宿主細胞からラニビズマブを回収する工程をさらに含み；任意選択で、回収されたラニビズマブを、好ましくは１つまたは複数のクロマトグラフィー工程によって精製する１つまたは複数の工程をさらに含む。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細胞、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞である。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、（ｉ）ＲｈａＢを不活性の状態にする、ｒｈａＢ遺伝子のヌクレオチド配列における変異を含む染色体、または（ｉｉ）ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列が欠失している染色体、のいずれかを含む。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列にフレームシフト変異を含む染色体を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞である。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列を含む染色体を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞であり、任意選択で、細菌宿主細胞の染色体は、ＲｈａＴをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
好ましい実施形態において、ラニビズマブをコードするヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み；好ましくは、組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。
好ましい実施形態において、配列番号５および／または配列番号６を含むヌクレオチド配列は、配列番号５および／または配列番号６のヌクレオチド配列に転写方向で作動可能に連結されている、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
好ましい実施形態において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、好ましくは、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；好ましくは、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号７の配列を含み、ラニビズマブの軽鎖および／または重鎖をコードするヌクレオチド配列に融合される。
好ましい実施形態において、細菌宿主細胞に導入される対象となる、結果として生じたヌクレオチド配列は、配列番号１７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む。
本発明の第６の態様は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞であり、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列にフレームシフト変異を含む染色体を含む、細菌宿主細胞に関する。一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０宿主細胞は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列を含む染色体を含む。さらなる実施形態において、細菌宿主細胞の染色体は、ＲｈａＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の様々な態様（およびその実施形態）についての上で示される配列番号１～１８のうちの１つまたは複数は、それと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によって置き換えられ得る。本明細書において使用される「配列同一性」という用語は、アミノ酸またはヌクレオチド配列に関して使用され、配列同一性は、指定された配列の全長にわたるものである。ゆえに、配列は、指定されたアミノ酸またはヌクレオチド配列と配列が少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセント同一であり得る。ゆえに、本発明のそのような配列は、本発明の配列に対する単一のまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の変更（付加、置換、挿入、または欠失）を含む。アミノ酸レベルにおいて、上で規定される配列同一性を有する好ましい配列は、本発明の配列に、最高５つ、例えば１つのみ、２、３、４、または５つ、好ましくは１、２、または３つ、より好ましくは１つまたは２つの、変更されたアミノ酸を含有する。
ＫＴＸＨＩＳに関するプラスミドマップの図。 ＫＴＸＨＩＳの多重クローニングサイト（ＭＣＳ）のヌクレオチド配列の図。 ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣのプラスミドマップの図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における滴定可能性比較の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における滴定可能性比較の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における滴定可能性比較の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における滴定可能性比較の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したＣａｐｔｏ Ｌ樹脂ウェスタンブロットを用いた、収穫された材料から浄化されホモジナイズされた溶解物サンプルからの小規模バッチ精製の図。ゲルローディング：ＸＢ１７／６７Ａ（低い収量に起因して、０．２μｇのみの産物をアプライした）を除いて、３μｇの産物をアプライした。１８．４～１１６ｋＤａのマーカ。 アフィニティーＨＰＬＣ力価データの要約の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における発現の制御の比較の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における発現の制御の比較の図。 抗ＦＡＢ抗体を使用したウェスタンブロット－小規模実験における発現の制御の比較の図。
詳細な説明
本発明は、組み換えタンパク質のＬ－ラムノースｒｈａＢＡＤプロモータに基づく産生を調節することに関する。
より具体的には、本発明は、
ａ．組み換えタンパク質、好ましくはラニビズマブをコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列がｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結されるように、ＤＮＡ構築物にクローニングする工程、および
ｂ．結果として生じたヌクレオチド配列を、ラムノース代謝を不能にする変異または改変を含む染色体を含む細菌宿主細胞に導入する工程
を含む、組み換えタンパク質、好ましくはラニビズマブを産生することに関する。
上の方法に開示されるＤＮＡ構築物は、ｒｈａＢＡＤプロモータをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明の一実施形態において、ｒｈａＢＡＤプロモータのヌクレオチド配列は、配列番号８の配列：
を含む（配列は、図１および３において「ｒｈａＢＡＤ」と称される）。
ＤＮＡ構築物は、ＲｈａＲ転写活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明の一実施形態において、ＲｈａＲ転写活性化因子のヌクレオチド配列は、配列番号９の配列：
を含む（配列は、図１および３において「ｒｈａＲ」と称される）。
ＤＮＡ構築物は、欠けた終止コドンが理由でＲｈａＲとインフレームにあるＲｈａＲ転写活性化因子の伸長をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。本発明の一実施形態において、ＲｈａＲ転写活性化因子の伸長のヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列：
を含む（配列は、図１および３において「ｒｈａＲ伸長（ｒｈａＲ ｅｘｔｅｎｄｅｄ）」と称される）。
ＤＮＡ構築物は、ＲｈａＳ転写活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明の一実施形態において、ＲｈａＳ転写活性化因子のヌクレオチド配列は、配列番号１１の配列：
を含む（配列は、図１および３において「ｒｈａＳ」と称される）。
ＤＮＡ構築物は、「抗生物質耐性マーカ」または「選択マーカ」をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。そのようなマーカは、産物が抗生物質（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、カナイシン、ネオマイシン）に対する耐性、または選択培地（例えば、ｕｒａ（ウラシル）、ｌｅｕ（ロイシン）、ｔｒｐ（トリプトファン）、ｈｉｓ（ヒスチジン））で成長する能力を付与する遺伝子を含有するＤＮＡのフラグメントである。通常、プラスミドは、細菌細胞にプラスミドを維持させる抗生物質耐性マーカを含有する。本発明の一実施形態において、ＤＮＡ構築物は、カナマイシン耐性マーカのヌクレオチド配列を含んでもよい。本発明の具体的な実施形態において、カナマイシン耐性を付与するためのヌクレオチド配列は、配列番号１２の配列：
を含む（配列は、図１および３において「ＫａｎＲ」と称される）。
ＤＮＡ構築物は、抗生物質耐性マーカをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。そのようなプロモータは、以前の段落において論じられた抗生物質耐性マーカの発現を増加させ得る。本発明の一実施形態において、アンピシリン耐性に対するプロモータは、アンピシリン耐性マーカの発現を促進し得るだけでなく、カナマイシン耐性マーカの発現も促進し得るＡｍｐＲプロモータである。本発明の具体的な実施形態において、ＡｍｐＲプロモータの核酸配列は、配列番号１３の配列：
を含む（配列は、図１および３において「ＡｍｐＲプロモータ」と称される）。
ＤＮＡ構築物は、少なくとも１種のターミネータをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。ＤＮＡ構築物は、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータの両方をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。ｒｒｎＢ Ｔ１およびＴ２ターミネータは、両方とも、単離された形態の効率的な転写ターミネータであるが、しかしながら、一緒に使用される場合、ｒｒｎＢ Ｔ１およびＴ２ターミネータは、転写をより効率的に終結させ得る。
本発明の具体的な実施形態において、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータのヌクレオチド配列は、配列番号１４の配列：
を含む。
本発明の具体的な実施形態において、ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータのヌクレオチド配列は、配列番号１５の配列：
を含む。
ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ複製が始動される特定のヌクレオチド配列である複製の起点をさらに含んでもよい。ＤＮＡ複製は、双方向にまたは一方向にこの地点から進み得る。一部のよく使用される複製の起点は、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３２２、Ｒ６Ｋ、ｐ１５Ａ、およびｐＵＣである。本発明の一実施形態において、複製の起点は、ｐＭＢ１またはその誘導体である。本発明の具体的な実施形態において、ｐＭＢ１の核酸配列は、配列番号１６の配列：
を含む。
本発明の代替的な実施形態において、ＤＮＡ構築物は、
－ ｒｈａＢＡＤプロモータ、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカ、
－ 少なくとも１種のターミネータ、および
－ 複製の起点
のうちの１種または複数をコードするヌクレオチド配列を含む発現プラスミドであり、ＤＮＡ構築物は、任意選択で、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰａｅＲ７１、ＢｂｓＩ、ＳｔｙＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、ＳｂｆＩ、ＳｐｈＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩによって切断可能な１７箇所の制限部位を含む多重クローニングサイトを含む。任意選択で、ＤＮＡ構築物は、抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータをコードするヌクレオチド配列、ならびに／またはｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
本発明の一実施形態において、上で開示される発現プラスミドは、
－ ｒｈａＢＡＤプロモータ、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカ、
－ 少なくとも１種のターミネータ、および
－ 複製の起点
をコードするヌクレオチド配列を含む。
任意選択で、ＤＮＡ構築物は、抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータをコードするヌクレオチド配列、ならびに／またはｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
本発明の一実施形態において、上で開示される発現プラスミドは、
－ ｒｈａＢＡＤプロモータ、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ カナマイシン耐性マーカ、
－ ＡｍｐＲプロモータ、
－ 少なくとも１種のターミネータ、および
－ ｐＭＢ１複製の起点
をコードするヌクレオチド配列を含む。
任意選択で、ＡｍｐＲプロモータをコードするヌクレオチド配列は、カナマイシン耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、かつ／またはＤＮＡ構築物は、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
本発明の一実施形態において、上で開示される発現プラスミドは、
－ 配列番号８のヌクレオチド配列を含むｒｈａＢＡＤプロモータ、
－ 配列番号９のヌクレオチド配列を含むＲｈａＲ転写活性化因子、
－ 配列番号１１のヌクレオチド配列を含むＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカ、
－ 配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモータ、
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ、
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ、および
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列を含むｐＭＢ１複製の起点
をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の一実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むプラスミドであり、ＤＮＡ構築物は、本発明においてＫＴＸＨＩＳとも称される。
上で記載されるＤＮＡ構築物にクローニングされる対象となる、組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、モノクローナル抗体またはそのフラグメント、好ましくはラニビズマブまたはそのフラグメントをコードする核酸を含んでもよい。本発明の具体的な実施形態において、ラニビズマブをコードする核酸は、ラニビズマブの重鎖および軽鎖をコードする核酸を含む。ラニビズマブは、加齢に関連した失明のよく見られる形態である「滲出」型の加齢黄斑変性症を治療するために承認されている、抗血管新生性であるモノクローナル抗体フラグメント（Ｆａｂ）である。
本発明の具体的な実施形態において、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６の配列：
を含む。
本発明の具体的な実施形態において、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５の配列：
を含む。
本発明のさらなる実施形態において、ラニビズマブの重鎖および軽鎖をコードする核酸は、ラニビズマブの重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列のいずれか一方または両方に作動可能に連結された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であり得る。本発明の具体的な実施形態において、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７の配列：
を含む。
結果として生じたヌクレオチド配列（すなわち、ＤＮＡ構築物に、組み換えタンパク質、好ましくはラニビズマブをコードするヌクレオチド配列をクローニングすることの産物）は、好ましくは、本発明においてＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣとも称される配列番号１７のヌクレオチド配列である。
組み換えタンパク質を産生するために使用される対象となる細菌宿主細胞は、ラムノース代謝を不能にする（ｄｉｓａｂｌｅ）変異または改変を有する染色体を含む。細菌宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞であり得る。好ましい実施形態において、細菌宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細胞、より好ましくは、細菌宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞である。不能なラムノース代謝は、ＲｈａＢを不活性の状態にする、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における変異によって達成される。代替的に、不能なラムノース代謝は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列が欠失している染色体を有する細菌宿主細胞を使用することによって達成され；これは、例えば、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列を欠失させることによって達成され得る。好ましくは、細菌宿主細胞の染色体は、ＲｈａＴをコードする核酸配列を含む、すなわちＲｈａＴ遺伝子は無傷である。
本発明の一実施形態において、不能なラムノース代謝は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列におけるフレームシフト変異によって達成される。そのような変異は、配列番号２のヌクレオチド配列：
を含む染色体を有する細菌宿主細胞をもたらす。
配列番号２のヌクレオチド配列を含む染色体を有する細菌宿主細胞は、本発明においてＸｄｅｖＫと称される。
本発明の１つの実施形態において、ＸｄｅｖＫ宿主細胞を開発するための方法は、
ａ）ｐＲｈａＢＦＳプラスミドを構築する工程、および
ｂ）ＲｈａＢフレームシフト変異体を構築する工程、
を含む。
ｐＲｈａＢＦＳプラスミドを構築することに関して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１系統の染色体からｒｈａＢＡＤオペロンの一部をＰＣＲ増幅するための２種のプライマー（丸括弧内にプライマーの名前）は、好ましくは：
－ （ＳＢａｍＨＩ１６８０－配列番号１９）
－ （ＢＳａｌＩ１６８１－配列番号２０）
である。
以下の実施形態も網羅される。
１．細菌宿主細胞において組み換えタンパク質を発現させるのに適切なＤＮＡ構築物であって、
－ ｒｈａＢＡＤプロモータ、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカ、
－ 該抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータ、
－ ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータ、
－ ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータ、および
－ ｐＭＢ１複製の起点
をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ構築物。
２．－ 前記抗生物質耐性マーカが、カナマイシン耐性マーカ、好ましくは配列番号１２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
－ 前記抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータが、ＡｍｐＲプロモータ、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモータであり；
－ 前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータが、配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；
－ 前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータが、配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；かつ／または
－ 前記ｐＭＢ１複製の起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、
実施形態１に記載のＤＮＡ構築物。
３．－ 前記抗生物質耐性マーカが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
－ 前記抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモータであり；
－ 前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み；かつ／または
－ 前記ｐＭＢ１複製の起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、
実施形態１または２に記載のＤＮＡ構築物。
４．－ 前記ｒｈａＢＡＤプロモータが、配列番号８のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号８のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記ＲｈａＲ転写活性化因子が、配列番号９のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号９のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記ＲｈａＳ転写活性化因子が、配列番号１１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１１のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記抗生物質耐性マーカが、配列番号１２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
－ 前記ＡｍｐＲプロモータが、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータが、配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータが、配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１５のヌクレオチド配列を含み；
－ 前記ｐＭＢ１複製の起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、
実施形態１～３のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
５．制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰａｅＲ７１、ＢｂｓＩ、ＳｔｙＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、ＳｂｆＩ、ＳｐｈＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩによって切断可能な１７箇所の制限部位を含む多重クローニングサイトを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
６．配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
７．前記組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含むＤＮＡ構築物であって、該組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記ｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結されており、該組み換えタンパク質はモノクローナル抗体またはそのフラグメントであり；好ましくは該組み換えタンパク質はラニビズマブまたはそのフラグメントであり；より好ましくは該組み換えタンパク質は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含むラニビズマブである、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物。
８．前記組み換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含み；好ましくは、該組み換えタンパク質をコードする該ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態７に記載のＤＮＡ構築物。
９．前記組み換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか一方または両方に転写方向で作動可能に連結されている、シグナルペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、該シグナルペプチドはＰｅｌＢであり；より好ましくは、該ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；最も好ましくは、該ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号７の配列を含む、実施形態８に記載のＤＮＡ構築物。
１０．配列番号１７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む、実施形態９に記載のＤＮＡ構築物。
１１．実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物を含む、発現ベクター。
１２．実施形態１～１０のいずれか１つに記載のＤＮＡ構築物または実施形態１１に記載の発現ベクターを含む細菌宿主細胞であって、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細胞である、細菌宿主細胞。
１３．（ｉ）ＲｈａＢを不活性の状態にする、ｒｈａＢ遺伝子のヌクレオチド配列における変異を含む染色体、または（ｉｉ）ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列が欠失している染色体、のいずれかを含む、実施形態１２に記載の宿主細胞。
１４．ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列にフレームシフト変異を含む染色体を好ましくは含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞である、実施形態１２または１３に記載の宿主細胞。
１５．前記宿主細胞は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列を含む染色体を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞であり；任意選択で、該宿主細胞の該染色体は、ＲｈａＴをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載の宿主細胞。
１６．実施形態１２～１５のいずれか１つに記載の細菌宿主細胞をラムノースに曝露し、それによって前記組み換えタンパク質の発現を誘導する工程を含む、組み換えタンパク質を産生する方法。
１７．前記細菌宿主細胞から前記組み換えタンパク質を回収する工程をさらに含み；任意選択で、該回収された組み換えタンパク質を、好ましくは１つまたは複数のクロマトグラフィー工程によって精製する１つまたは複数の工程をさらに含む、実施形態１６に記載の方法。
本発明は、下の非限定的な実施例の節における実施例１～８に例示される複数の態様を有する。ＸｄｅｖＫ宿主細胞および／またはＫＴＸＨＩＳプラスミドの使用に関するこれらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、単なる例示として与えられることが理解されるべきである。本発明の上で開示される実施形態および以下の実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を突き止めることができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変化および改変を行って、それを様々なタイプの治療用抗体および免疫グロブリンに適応させることができる。ゆえに、本明細書に示されかつ記載されるものに加えた本発明の様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかであろう。そのような改変も、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。そのような改変の例は、上で示される配列番号１～１８のうちの１つまたは複数が、それと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によって置き換えられ得るということである。
実施例
実施例１は、ＸｄｅｖＫ宿主細胞の構築に関する。
実施例２は、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣ発現ベクターの構築に関する。
実施例３は、実施例２における発現ベクターによって発現されるラニビズマブの軽鎖および重鎖に関する。
実施例４は、先行技術文献に記載される方法によって産生されるラニビズマブの力価（ｔｉｔｅｒ）と比較した場合の、本発明に従って産生されるラニビズマブの優れた力価を示している。
実施例５は、本発明に従って産生されるラニビズマブがバクテリオファージ不含であることを示している。
実施例６は、先行技術宿主細胞および／またはプラスミドと比較した場合の、本発明の優れた滴定可能性（ｔｉｔｒａｔａｂｉｌｉｔｙ）を示した比較実験である。
実施例７は、先行技術宿主細胞および／またはプラスミドと比較した場合の、本発明の優れた品質、純度、および力価を示した比較実験である。
実施例８は、先行技術宿主細胞および／またはプラスミドと比較した場合の、本発明の発現の優れた制御を示した比較実験である。
系統開発
ＸｄｅｖＫ宿主細胞は、それがラムノースを炭素供給源として利用することを不可能にする、ＲｈａＢの染色体コピーにおけるフレームシフトを有するＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３３１０誘導体である。関心対象の組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ＫＴＸＨＩＳプラスミドにクローニングされかつラムノース誘導性プロモータの制御下で発現されるラムノース誘導性システムに対する系統として、ＸｄｅｖＫ宿主細胞を開発した。
ＸｄｅｖＫ宿主細胞に対する開始系統はＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０であり、ＸｄｅｖＫ宿主細胞を産生する同様の方法は、「産生系統Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０の構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ３１１０）」と題された節においてウィルムスら（Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．）［３］に記載される。
ＸｄｅｖＫ宿主細胞を開発するための方法は、
ｃ）ｐＲｈａＢＦＳプラスミドを構築する工程、および
ｄ）ＲｈａＢフレームシフト変異体を構築する工程
を含む。
工程（ａ）－ｐＲｈａＢＦＳプラスミドの構築：
以下の２種のプライマーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１系統の染色体からｒｈａＢＡＤオペロンの一部をＰＣＲ増幅した（丸括弧内にプライマーの名前）。
－ （ＳＢａｍＨＩ１６８０）
－ （ＢＳａｌＩ１６８１）
ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化されているｐＬｅｍｏプラスミド（米国特許第８１３８３２４号明細書に記載されるｐＬｅｍｏ等）にライゲートした。インサートを有するｐＬｅｍｏプラスミドを、次いでＣｌａＩで消化した。消化物をＴ４ポリメラーゼとインキュベートして平滑末端にし、次いでライゲートした。２つの付加的な塩基を有する挿入されたｒｈａＢＡＤオペロンゲノム領域を有する、結果として生じたｐＬｅｍｏプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩとインキュベートした。２つの付加的な塩基を有するｒｈａＢＡＤオペロンゲノム領域を含有するフラグメントを精製し、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化されたｐｍａｋ７０５プラスミドとライゲートした。ライゲーションにより生じたプラスミドをｐＲｈａＢＦＳと名付け、配列をシーケンシングによって検証した。
工程（ｂ）－ＲｈａＢフレームシフト変異体の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞を、遺伝子置き換えプラスミドｐＲｈａＢＦＳで形質転換し、次いでクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天ｖｅｇｉｔｏｎｅ上に播種し、３０℃で２０時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、ＬＢ ｖｅｇｉｔｏｎｅ中に入れ、ＯＤ６００が０．５に到達するまで３０℃で成長させた。５μｌを、培養物からクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天ｖｅｇｉｔｏｎｅプレートに移し、４３℃で１６時間インキュベートした。コロニーを、ＰＣＲを使用して、染色体への正しいインサートについて試験した。正しいインサートを有するコロニーを、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ ｖｅｇｉｔｏｎｅ中で飽和まで３回成長させ、次いでＬＢ ｖｅｇｉｔｏｎｅ中で２０時間成長させた。次いで、１μｌをＬＢ ｖｅｇｉｔｏｎｅプレート上に播種した。ＬＢ ｖｅｇｉｔｏｎｅプレートを、１％ラムノースを補給されたマッコンキー寒天プレート上へのレプリカ播種の鋳型として使用して、細胞がラムノースを炭素供給源として利用できないことを検証した。１つのコロニーを採取し、ＬＢ ｖｅｇｉｔｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ）中で成長させ、次いで等分し、ＸｄｅｖＫ発現系統と名付けた。ＸｄｅｖＫ由来のｒｈａＢ遺伝子の染色体コピーをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をシーケンシングし、２つの塩基（ＣＧ）の正しい挿入を確認した（配列番号２における下線を引かれたＣＧ塩基を参照されたい）：
ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣ
配列番号７のヌクレオチド配列を含むＰｅｌＢシグナルペプチドを、ラニビズマブの軽鎖および重鎖の両方をコードする核酸の前に融合し、次いでＫＴＸＨＩＳ発現プラスミドにクローニングした。結果として生じたヌクレオチド配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含み、本発明においてＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと称される。さらに、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣのプラスミドマップは、図３に例示される。
配列番号１７のヌクレオチド配列は下に開示され、ＰｅｌＢシグナル配列に融合された軽鎖をコードする核酸の配列は下線を引かれ、ＰｅｌＢシグナル配列に融合された重鎖をコードする核酸の配列は太字である（ラニビズマブの軽鎖および重鎖に対するＰｅｌＢの配置に関しては図３も参照されたい）：
組み換えタンパク質－ラニビズマブ
発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣによって発現されるラニビズマブの軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３の配列：
を含む。
発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣによって発現されるラニビズマブの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号４の配列：
を含む。
さらに、結果として生じたＰｅｌＢシグナルペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列：
を含む［６］。
先行技術力価と比較した、本発明に従って産生されるラニビズマブの優れた力価
ラニビズマブを含む３つの異なるバッチを、下で記載される方法に従って産生した。
最小培地を調製し、振とうフラスコから、発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣを含むＸｄｅｖＫ宿主細胞の一晩の培養物を接種した。発酵温度を３０℃に設定し、培養物をバッチ相で２２時間成長させた。この相の後に１０時間の成長相が続いた。温度を２８．５℃に調整し、次いで、グルコース供給を制御することによって成長速度を減少させた。発酵槽に注入される５００μＭのラムノースにより、培養を誘導した。誘導相を通じた連続的誘導のために、グルコース供給にラムノースも補給した。３６時間の誘導の後に材料を収穫した。総発酵時間は６８時間であり、収穫された容量は８５３０ｍｌであった。
収穫の後、すべての材料、培地、および細胞をホモジナイズした。５５００ｍｌを－８０℃に保管し、３０００ｍｌを浄化し、ＴＦＦを使用して洗浄した。産物の放出の増加のために、初回容量の３倍の容量で細胞を洗浄した。ラニビズマブを含む結果として生じた産物を、クマールら（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．）［４］（クマールら（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．）における第２．４節および第３．２節を参照されたい）において使用されたクロマトグラフィー法でもあるｃａｐｔｏ Ｌアフィニティークロマトグラフィーを使用することによって精製し、次いで精製されたラニビズマブの濃度を判定した。
第１、第２、および第３のバッチは、それぞれ５３１ｍｇ／Ｌ、４８７ｍｇ／Ｌ、および５１８ｍｇ／Ｌのラニビズマブ力価を含んだ。
比較として、先行技術文献のＫｕｍａｒら（同様の精製法を開示する）において、ラニビズマブ力価は、この文献［４］の図６および要約に示されるように、５ｍｇ／Ｌ～２５ｍｇ／Ｌに及ぶ。
その結果として、本発明に従った方法（ならびに、その中のＸｄｅｖＫ宿主細胞および発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣの使用）は、先行技術方法と比較した場合に、予想外により高いレベルのラニビズマブ力価を提供する。
細胞バンク
ＸｄｅｖＫをＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣで形質転換した。単一コロニーを採取し、規定バイオリアクター培地（ＤＢＭ：Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ）中で一晩成長させ、翌日２０％グリセロールを添加し、培養物を等分し、－８０℃に保管した。１つのアリコート（５０μｌ）を使用して、１００ｍｌの規定バイオリアクター培地（ＤＢＭ）に接種し、３０℃で２４時間培養し、温度を３５℃に変え、細胞を付加的に６時間培養してＯＤを増加させた。ＯＤ Ａ６００ｎｍ＝４，４４。２０％のグリセロールを添加し、培養物を等分し（１００μｌアリコート）、ＲＣＢ１００として－８０℃において凍結した。
系統のアリコートを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおけるファージ試験および微生物純度試験のために送付した。報告書は、「ＲＣＢ１００は、溶原性プロファージおよび遊離バクテリオファージの両方について試験した場合に、バクテリオファージ不含であると結論付けられた。遊離バクテリオファージの数の限界は、一晩の培養物ｍＬあたり１プラーク形成単位未満である」と述べた。
優れた滴定可能性を示した比較実験
材料および方法
以下の３種の系統を比較実験において使用した：
１．上の実施例１に記載されるＸｄｅｖＫ宿主細胞；言い換えれば、それは、
－ Ｆ－、λ－、ＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１、ｒｐｈ－１の遺伝子型を有するＷ３１１０系統バックグラウンドを有し；
－ Ｋ－系統誘導体でありかつＲｈａＢ遺伝子における変異を含有し、それがラムノースを分解するのを不可能にしかつラムノースを炭素供給源として使用するのを不可能にする、
系統である。
２．
－ 遺伝子型：Ｆ－ｄｏｍｐｔ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－、ｍＢ－）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）を有するＢＬ２１（ＤＥ３）系統であり；
－ Ｂ－系統誘導体でありかつＲｈａＢ遺伝子における変異およびラムノース輸送体遺伝子（ＲｈａＴ）の欠失を含有し、それがラムノースを活発に輸送して分解するのを不可能にし、かつラムノースを炭素供給源として使用するのを不可能にし；
－ 染色体に挿入されたＤＥ３プロファージの一部を含有し、ｌｏｎプロテアーゼまたはＯｍｐＴプロテアーゼを発現しない、
イェルムら（Ｈｊｅｌｍ ｅｔ ａｌ．）［２］に記載されるＸＢ２１０；ならびに
３．Ｅ．ｃｏｌｉ野生型Ｋ－系統である、ジャカローネら（Ｇｉａｃａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．）［５］に記載されるＭＧ１６５５。
以下の４種の発現プラスミドを使用して、ラニビズマブに対する核酸配列を発現させた、すなわちラニビズマブの重鎖および軽鎖をコードする配列を、以下の発現プラスミドにクローニングした：
１．ＫＴＸＨＩＳ；
２．ジャカローネら（Ｇｉａｃａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．）［５］に記載されるｐＲｈａ１０９Ａ；
３．ジャカローネら（Ｇｉａｃａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．）［５］に記載されるｐＲｈａ６７Ａ；および
４．イェルムら（Ｈｊｅｌｍ ｅｔ ａｌ．）［２］に記載されるｐＲｈａ６７Ｋ。
結果として生じた発現ベクターを、全シーケンシングによって確認した。
さらに、結果として生じた発現ベクターを、ＸｄｅｖＫ、ＸＢ２０１、およびＭＧ１６５５系統（すなわち、宿主細胞）に導入して、系統およびプラスミドの種々の組み合わせを試験して、滴定可能性、力価、品質、および発現の制御に対する影響を理解した。
滴定可能性比較のための実験セットアップ
ラニビズマブの重鎖および軽鎖を含む発現ベクターを、標準的プロトコールを使用してＸｄｅｖＫ、ＸＢ２０１、およびＭＧ１６５５に形質転換した。構築物に応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する３ｍｌのＬＢ－ｖｅｇ液体培地に単一コロニーを接種することによって、一晩の培養物を調製した。培養物を、振とうしながら１５ｍｌファルコンチューブにて３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、培養物を、２４ウェル成長プレートにて５ｍｌのＬＢ－ｖｅｇ＋抗生物質に戻し希釈し（ｂａｃｋ－ｄｉｌｕｔｅｄ）（１：５０）、およそ０．３～０．５のＯＤ６００に到達するまで、前のとおりインキュベートした。５、５０、１００、２５０、５００、５０００μＭラムノースの添加によって発現を誘導し、振とうしながらの３０℃で５時間のインキュベーションが後に続いた。０，２単位のＯＤ６００に相当する容量の細胞を回収し、２０μｌの２×Ｌａｅｍｌｌｉローディングバッファーに再懸濁し、５分間煮沸し、その後７．５μｌを１２％ミニＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。次いで、ウェスタンブロット分析のために、ゲルを直ちにニトロセルロース／ＰＶＤＦ膜に移し、抗Ｆａｂ抗体を使用してプローブした。
結果および考察－滴定可能性
図４ａ、４ｂ、４ｃ、および４ｄは、滴定可能性比較に対するウェスタンブロットを示している。対照レーンのそれぞれは、精製ラニビズマブがロードされている。
図４ａは、
－ ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積；および
－ ｐＲｈａ６７Ｋ（６７Ｋ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積
を示している。
図４ｂは、
－ ｐＲｈａ６７Ｋ（６７Ｋ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸＢ２０１における、発現したラニビズマブの蓄積；および
－ ｐＲｈａ６７Ａ（６７Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積
を示している。
図４ｃは、
－ ｐＲｈａ１０９Ａ（１０９Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積；および
－ ｐＲｈａ６７Ａ（６７Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＭＧ１６５５における、発現したラニビズマブの蓄積
を示している。
図４ｄは、
－ ＸｄｅｖＫおよびＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣセットアップの併用における滴定可能性を可視化するための、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積を示した実験の繰り返し
を示している。
図４ａ、４ｂ、４ｃ、および４ｄは、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫを用いたセットアップが、
－ ラニビズマブの発現は、５、５０、１００、２５０、５００、５０００μＭラムノースの添加につき、ＸｄｅｖＫ／ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣに対して漸進的に増加し；
－ ラニビズマブの発現は、任意の他の組み合わせにおいて漸進的に増加しない（例えば「ショルダー」、すなわち漸進的な増加、しかしその後漸進的な減少を生じさせるＸＢ２０１／６７Ｋの組み合わせを参照されたい）、
という理由で、滴定可能性を比較した場合に、他のセットアップよりも優れた技術的効果を有することを明白にかつ明確に示している。
さらに、図４ａ、４ｂ、４ｃは、ｐＲｈａ１０９ＡまたはｐＲｈａ６７Ａプラスミドに基づく発現ベクターを持つ細胞が、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣ、またはｐＲｈａ６７Ｋプラスミドに基づく発現ベクターのいずれかを使用した他のセットアップよりも少なくとも１００倍少ない、ごく少量のラニビズマブを蓄積したことも示している（該倍変化は、ロードされた陽性対照の量を比較することによって観察された）。
－ ＭＧ１６５５、およびｐＲｈａ１０９Ａプラスミドに基づく発現ベクター（図６を参照されたい）、
－ ＭＧ１６５５、およびｐＲｈａ６７Ｋプラスミドに基づく発現ベクター（図７ｂを参照されたい）、
－ ＭＧ１６５５およびＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣ（図７ｂを参照されたい）
の組み合わせは、ラニビズマブの検出可能な産生を生じさせず、それゆえ、滴定可能性実験は、該組み合わせに対して行われなかったことに留意すべきである。
これゆえ、結論として、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫは、先行技術から公知のセットアップと比較して優れた滴定可能性を提供する。ゆえに、これは、組み換えタンパク質産生速度の正確な調整を可能にし、それゆえ、組み換えタンパク質産生速度は正確にかつ安定に設定され得る。
優れた品質および力価を示した比較実験
力価および品質実験のための実験セットアップ
ラニビズマブの重鎖および軽鎖を含む発現ベクターを、標準的プロトコールを使用してＸｄｅｖＫ、ＸＢ２０１、およびＭＧ１６５５に形質転換して、系統およびプラスミドのそれぞれの組み合わせの研究細胞バンク（ＲＣＢ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を産生した。前培養物（振とうフラスコ中）にＲＣＢの単一バイアルから接種し、既定リアクター培地；１７．１ｍＬ無菌６０％（ｖ／ｗ）グルコース溶液、２．４３２ｍＬ ２．５Ｍ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍＬ ５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン溶液に添加されたリン酸２水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）４．５ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）３．０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）３．７５ｇ／Ｌ、クエン酸３ナトリウム２水和物（ＨＯＣ（ＣＯＯＮａ）（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２・２Ｈ２Ｏ）１．８８ｇ／Ｌ、塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）０，０５２５ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．０１５８ｇ／Ｌ、硫酸銅（ＩＩ）５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）０．００３９７ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１水和物（ＭｎＳＯ４・１Ｈ２Ｏ）０．０１９８ｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）０．０２０７ｇ／Ｌ、中で一晩（Ｏ／Ｎ）成長させた。１．５ｍＬ ２５％水酸化アンモニウム溶液を添加することによって、ｐＨを調整した（おおよそ６．９５まで）。ＤＡＳボックス発酵槽を、既定リアクター培地を用いて調製し、Ｏ／Ｎ前培養物を接種した。培養物に６０％（ｖ／ｗ）無菌グルコースを供給することによって、細胞成長を制御した。誘導因子としてのラムノースの添加により、産生相を始動した。必要な場合には、供給プロファイルを調整し、塩を培養物に添加した。２０～４２時間の誘導の後に細胞を収穫し、その後にバッチ精製が続いた。収穫サンプルを、事前に凍結させた水を有するウェルを含有する９６ウェル深底マイクロタイタープレートに添加して、サンプルの冷却を保証した。空のウェルをＭｉｌｌｉＱ水（ＭＱ）で満たした。超音波処理を、サイクルの合間に３０秒間の休止を有して、それぞれ４０％の振幅で２０秒間の３サイクルに対して、ｓｏｎｉｃｓ ｖｉｂｒａ－ｃｅｌｌ装置で２４－エレメントプローブを使用して実施した。超音波処理されたサンプルを２ｍＬスピンチューブに移し、遠心分離機５４３０Ｒにおいて４℃で２００００×ｇにて２０分間遠心分離した。上清をピペッティングによって慎重に取り出し、事前に平衡化されたＣａｐｔｏ Ｌアフィニティー樹脂の５０％スラリーに添加した。平衡化は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２（ＥＱ）を用いて３回実施されていた。１．９ｍＬの上清を使用して１００μＬのＣａｐｔｏ Ｌスラリーをロードし、それは９．５ｍＬ／ｍＬ樹脂のロード率に相当する。上清および樹脂を、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃにて１５００ｒｐｍで振とうしながら、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートし、その後にＲＴで２０００×ｇでの１分間の遠心分離が続いた。上清を捨てた。５００μＬのＥＱを添加し、上記のように２０００×ｇでの遠心分離によって樹脂を分離することによって、樹脂を２回洗浄した。３００μＬのＥＱを使用した３回目の洗浄工程の間、樹脂を、４００μＬに適切な酢酸セルロースフィルタースピンカップに移し、上記のように遠心分離した。４回目の洗浄工程を、１５０μＬ ＥＱを用いて実施した。スピンカップを新しい回収チューブに移し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．０を用いた溶出を、合計でμＬ樹脂あたり０．４μＬ（例えば、使用された５０μＬスラリーに対して３×４０μＬ）を使用して３サイクルで実施した。溶出液におけるタンパク質濃度を、アフィニティーＨＰＬＣセットアップを使用して分析した。サンプルの品質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＣＸ－ＨＰＬＣによって分析した。
力価および品質実験に関する結果および考察
サンプルを、図５に例示されるようにＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。検出可能な品質の差、バンドパターンの増加、または遊離軽鎖もしくは重鎖の量の増加は検出され得なかった。しかしながら、ｐＲｈａ６７Ａプラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統を使用したセットアップは、ごく少量の材料しか与えず、バンドは検出され得なかった。さらに、ｐＲｈａ１０９Ａプラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫを使用したセットアップは、ごく不良に成長し、それゆえより短い誘導時間の後に収穫された（２０時間の、一方ですべての他のサンプルは４２時間後に収穫された）。
産生された材料の量をアフィニティーＨＰＬＣを使用して査定し、図６に要約し、それは、最も高い収量を産生したセットアップが、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統であったことを明白に示す。
バッチ精製された材料の品質をＳＣＸ－ＨＰＬＣを用いて査定し、表１に要約している。ｐＲｈａ６７Ａプラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統を用いたセットアップから分析された材料は、このセットアップが、分析するのが難しい極めて少量の材料しか産生しないことから信頼性がない。ｐＲｈａ１０９Ａプラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統を用いたセットアップからの材料を、細胞が他の細胞と比較して非常にゆっくり成長することから、より短い誘導時間の後に収穫した。表１に要約されたＳＣＸ ＨＰＬＣデータは、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統において産生されかつそれから精製された材料の品質が、他のセットアップと比較して優れた純度（すなわち、品質）のものであることを明白に示している。
これゆえ、結論として、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統は、産生されたラニビズマブの品質および産生されたラニビズマブの収量の両方において、他のセットアップと比較して優れている。
発現の優れた制御を示した比較実験
発現の制御を査定するための実験セットアップ
ラニビズマブの重鎖および軽鎖を含む発現ベクターを、標準的プロトコールを使用してＸｄｅｖＫおよびＭＧ１６５５に形質転換した。使用されたプラスミドに応じて１００μｇ／ｍｌアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する３ｍｌのＬＢ－ｖｅｇ液体培地に単一コロニーを接種することによって、一晩の培養物を調製した。培養物を、振とうしながら１５ｍｌファルコンチューブにて３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、培養物を、２４ウェル成長プレートにて５ｍｌのＬＢ－ｖｅｇ＋抗生物質に戻し希釈し（１：５０）、およそ０．３～０．５のＯＤ６００に到達するまで、前のとおりインキュベートし、種々の発現条件を分析した。培養物の１つのセットを、０．２％グルコースの存在下で成長させた。培養物のサブセットにおいて、２５０μＭラムノースの添加によって発現を誘導し、振とうしながら３０℃でインキュベートした。０，２単位のＯＤ６００に相当する容量の細胞を２４時間後に回収し（スピンダウンし）、２０μｌの２×Ｌａｅｍｌｌｉローディングバッファーに再懸濁し、５分間煮沸し、１２％ミニＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（７，５μｌ）。次いで、ゲルを直ちにニトロセルロース／ＰＶＤＦ膜に移し、抗Ｆａｂ抗体を使用してプローブした。
発現の制御に関する結果および考察
図７ａ、７ｂ、および７ｃは、発現制御の比較のためのウェスタンブロットを示している。対照レーンのそれぞれは、ラニビズマブがロードされている。各セットアップからのレーン１におけるサンプルは、０．２％グルコースの存在下で成長し、２５０μｍラムノースを用いて誘導された。各セットアップからのレーン２におけるサンプルは、０．２％グルコースの存在下で成長した。各セットアップからのレーン３におけるサンプルは、２５０μｍラムノースを用いて誘導された。各セットアップからのレーン４におけるサンプルは、いかなる添加もなしで成長した。
図７ａは、
－ ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積；および
－ ｐＲｈａ６７Ｋ（６７Ｋ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積；および
－ ｐＲｈａ６７Ａ（６７Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積
を示している。
図７ｂは、
－ ｐＲｈａ１０９Ａ（１０９Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＸｄｅｖＫにおける、発現したラニビズマブの蓄積；
－ ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせた系統ＭＧ１６５５における、発現したラニビズマブの蓄積；
－ ｐＲｈａ６７Ｋ（６７Ｋ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＭＧ１６５５における、発現したラニビズマブの蓄積
を示している。
図７ｃは、
－ ｐＲｈａ６７Ａ（６７Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＭＧ１６５５における、発現したラニビズマブの蓄積；および
－ ｐＲｈａ１０９Ａ（１０９Ａ）プラスミドに基づく発現ベクターと組み合わせた系統ＭＧ１６５５における、発現したラニビズマブの蓄積
を示している。
図７ａ～７ｃにおける異なるセットアップ間でラニビズマブの蓄積を比較した場合、レーン３に示される２５０μＭラムノースの添加によって誘導されるラニビズマブの最も高い発現が、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統において検出されたことは明白である。
興味深いことに、図７ｂおよび７ｃにおけるレーン３に示されるように、ＭＧ１６５５系統を伴うセットアップのいずれも、ラニビズマブの目に見える発現をもたらさなかった。
さらに、レーン３においてラニビズマブの発現をもたらしたセットアップ（すなわち、ＸｄｅｖＫ系統が使用されたセットアップ）のうち、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統は、レーン２に示される０．２％グルコースの存在下で成長した場合、ラニビズマブの最も低い発現をもたらした。これは、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統が、誘導因子の非存在下において漏れやすい発現の傾向が低いことを示唆する。漏れやすい発現（Ｌｅａｋｅｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、細胞の成長に負の効果を有し得、より低い全体的収量につながる。漏れやすい発現は、産生された材料の品質にも影響を及ぼし得、下流の精製工程における取り扱いにとって問題となり得る、蓄積した発現タンパク質の異なる種の混合につながり、それゆえより低い収量および複雑な精製過程につながり得る。
これゆえ、ＫＴＸＨＩＳ－ＰｅｌｂＬＣ－ＰｅｌｂＨＣと組み合わせたＸｄｅｖＫ系統におけるラニビズマブ発現の制御は、他のセットアップと比較した場合に優れている。
結論として、実施例４、６、７、および８に示される実験結果は、本発明が、先行技術発現ベクターおよび／または宿主細胞と比較した場合に、以下の利点および予想外の効果を提供し、それゆえ、組み換えタンパク質の産業的産生に特に適切であることを実証する。
－ 優れた滴定可能性（実施例６）；
－ 優れた純度および品質（実施例７）；
－ 優れた力価（実施例４、７、および８）；および
－ 発現の優れた制御（実施例８）。
参考文献
１．ホルクロフト（Ｈｏｌｃｒｏｆｔ） ＣＣら、環状ＡＭＰ受容体タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットＣ末端ドメインおよびｒｈａＲによるｒｈａＳＲでの活性化の相互依存性（Ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ｒｈａＳＲ ｂｙ ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ， ａｎｄ ｒｈａＲ．）、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２０００；１８２（２３）：６７７４－６７８２
２．イェルム（Ｈｊｅｌｍ），Ａ．ら．、１－ラムノースＰＢＡＤプロモータに基づく膜および分泌タンパク質の産生のための大腸菌の調整（Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌ－Ｒｈａｍｎｏｓｅ ＰＢＡＤ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）、ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１７；６ ６：９８５－９９４
３．ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ），Ｂ．ら、大腸菌ｒｈａＢＡＤプロモータを用いた発現系によるＬ－Ｎ－カルバモイル酵素の高細胞密度発酵生産（Ｈｉｇｈ－ｃｅｌｌ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ－Ｎ－ｃａｒｂａｍｏｙｌａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｈａＢＡＤ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２００１；７３：９５－１０３
４．クマール（Ｋｕｍａｒ），Ｄ．ら、大腸菌によるＦａｂフラグメント製造のためのＱｂＤに基づく培地開発（ＱｂＤ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ．）、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１９；６，２９．
５． ジャカローネ（Ｇｉａｃａｌｏｎｅ） ＭＪら、ラムノースベースで厳密に制御された可変プロモーターシステムを用いた大腸菌での毒性タンパク質発現（Ｔｏｘｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｈａｍｎｏｓｅ－ｂａｓｅｄ ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．、２００６；４０（３）：３５５－３６４．
６． チェ（Ｃｈｏｉ）， Ｊ．Ｈ．ら、大腸菌を用いた組換えタンパク質の分泌・細胞外生産（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．）、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００４；６４，６２５－６３５

Claims (20)

  1. 細菌宿主細胞においてラニビズマブを発現させるためのＤＮＡ構築物であって、ラニビズマブは、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、該ＤＮＡ構築物は、ラニビズマブをコードするヌクレオチド配列を含み、該ＤＮＡ構築物は、ラニビズマブの該軽鎖および／またはラニビズマブの該重鎖をコードするヌクレオチド配列に転写方向で作動可能に連結されている、シグナルペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列をさらに含み、
    該ＤＮＡ構築物は、
    － ｒｈａＢＡＤプロモータ、
    － ＲｈａＲ転写活性化因子、
    － ＲｈａＳ転写活性化因子、
    － 抗生物質耐性マーカ、
    － 少なくとも１種のターミネータ、および
    ａ．ｐＭＢ１複製の起点
    をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、ＤＮＡ構築物。
  2. 前記ＤＮＡ構築物は、前記抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  3. 前記ＤＮＡ構築物は、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータおよびｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物。
  4. － 前記抗生物質耐性マーカが、カナマイシン耐性マーカ、好ましくは配列番号１２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
    － 前記抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記プロモータが、ＡｍｐＲプロモータ、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモータであり；
    － 前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータが、配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；
    － 前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータが、配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；かつ／または
    － 前記ｐＭＢ１複製の起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、
    請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
  5. － 前記抗生物質耐性マーカが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
    － 前記抗生物質耐性マーカをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモータであり；
    － 前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；
    － 前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み；かつ／または
    － 前記ｐＭＢ１複製の起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、
    請求項３または４に記載のＤＮＡ構築物。
  6. ａ．前記ｒｈａＢＡＤプロモータが、配列番号８のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号８のヌクレオチド配列を含み；
    ｂ．前記ＲｈａＲ転写活性化因子が、配列番号９のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号９のヌクレオチド配列を含み；
    ｃ．前記ＲｈａＳ転写活性化因子が、配列番号１１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１１のヌクレオチド配列を含み；
    ｄ．前記抗生物質耐性マーカが、配列番号１２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカであり；
    ｅ．前記ＡｍｐＲプロモータが、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１３のヌクレオチド配列を含み；
    ｆ．前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネータが、配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；
    ｇ．前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネータが、配列番号１５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１５のヌクレオチド配列を含み；
    ｈ．前記ｐＭＢ１複製の起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１６のヌクレオチド配列を含む、
    請求項３または４に記載のＤＮＡ構築物。
  7. ラニビズマブをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ｒｈａＢＡＤプロモータに作動可能に連結されている、請求項１～６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
  8. ラニビズマブをコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号５の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
  9. ラニビズマブをコードする前記ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号５の配列を含む、ラニビズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、および／または（ｉｉ）配列番号６の配列を含む、ラニビズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
  10. シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか一方または両方に転写方向で作動可能に連結されている、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
  11. 前記シグナルペプチドがＰｅｌＢである、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
  12. 前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは、該ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は配列番号７の配列を含む、請求項１１に記載のＤＮＡ構築物。
  13. 前記ＤＮＡ構築物は、配列番号１７の配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む、請求項１１または１２に記載のＤＮＡ構築物。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含む、発現ベクター。
  15. 請求項１～１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物または請求項１４に記載の発現ベクターを含む細菌宿主細胞であって、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２細胞である、細菌宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞は、（ｉ）ＲｈａＢを不活性の状態にする、ｒｈａＢ遺伝子のヌクレオチド配列における変異を含む染色体、または（ｉｉ）ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列が欠失している染色体、のいずれかを含む、請求項１５に記載の宿主細胞。
  17. 前記宿主細胞は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列にフレームシフト変異を含む染色体を好ましくは含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞である、請求項１５または１６に記載の宿主細胞。
  18. 前記宿主細胞が、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列を含む染色体を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０細胞であり；任意選択で、該宿主細胞の該染色体は、ＲｈａＴをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  19. 請求項１５～１８のいずれか１項に記載の細菌宿主細胞をラムノースに曝露し、それによってラニビズマブの発現を誘導する工程を含む、ラニビズマブを産生する方法。
  20. 前記細菌宿主細胞からラニビズマブを回収する工程をさらに含み；任意選択で、該回収されたラニビズマブを、好ましくは１つまたは複数のクロマトグラフィー工程によって精製する１つまたは複数の工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
JP2023546386A 2020-10-09 2021-10-08 不能なラムノース代謝を有する宿主細胞において組み換えタンパク質を産生する方法、ならびにその発現ベクター、宿主細胞、および組み換えタンパク質 Pending JP2023549432A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20201096.3A EP3981879A1 (en) 2020-10-09 2020-10-09 Method of producing a recombinant protein in a host cell which has a disabled rhamnose metabolism as well as expression vectors, host cells and recombinant proteins thereof
EP20201096.3 2020-10-09
PCT/EP2021/077820 WO2022074182A1 (en) 2020-10-09 2021-10-08 Method of producing a recombinant protein in a host cell which has a disabled rhamnose metabolism as well as expression vectors, host cells and recombinant proteins thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023549432A true JP2023549432A (ja) 2023-11-24

Family

ID=72826766

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023546386A Pending JP2023549432A (ja) 2020-10-09 2021-10-08 不能なラムノース代謝を有する宿主細胞において組み換えタンパク質を産生する方法、ならびにその発現ベクター、宿主細胞、および組み換えタンパク質

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230340096A1 (ja)
EP (2) EP3981879A1 (ja)
JP (1) JP2023549432A (ja)
KR (1) KR20230079228A (ja)
CN (1) CN116323950A (ja)
AU (1) AU2021357360A1 (ja)
CA (1) CA3193217A1 (ja)
IL (1) IL301642A (ja)
MX (1) MX2023003819A (ja)
WO (1) WO2022074182A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022349814A1 (en) * 2021-09-24 2024-05-02 Xbrane Biopharma Ab Dna constructs and host cells for expressing recombinant protein

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8293503B2 (en) * 2003-10-03 2012-10-23 Promega Corporation Vectors for directional cloning
US20080206817A1 (en) * 2004-12-07 2008-08-28 Johann Brass Rhamnose Promoter Expression System
WO2009106635A1 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Xbrane Bioscience Aktiebolag Expression system for proteins
ES2529442T3 (es) * 2010-09-28 2015-02-20 Abera Bioscience Ab Proteína de fusión para la expresión de proteínas secretoras

Also Published As

Publication number Publication date
EP4204570A1 (en) 2023-07-05
WO2022074182A9 (en) 2022-06-16
EP3981879A1 (en) 2022-04-13
CA3193217A1 (en) 2022-04-14
WO2022074182A1 (en) 2022-04-14
KR20230079228A (ko) 2023-06-05
IL301642A (en) 2023-05-01
CN116323950A (zh) 2023-06-23
AU2021357360A1 (en) 2023-05-04
US20230340096A1 (en) 2023-10-26
MX2023003819A (es) 2023-08-16
AU2021357360A9 (en) 2023-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6571707B2 (ja) 発現系
AU2017202434B2 (en) Bacterial host strain expressing recombinant DsbC and having reduced Tsp activity
JP5960607B2 (ja) 変異体ｓｐｒ遺伝子及び野生型Ｔｓｐ遺伝子を含む細菌宿主系統
JP5896569B2 (ja) 変異体ｓｐｒ遺伝子を含み低減したＴｓｐ活性を有する細菌宿主系統
JP2000050888A (ja) 栄養要求性を相補することによる、抗生物質によらない選抜に基づく新規の大腸菌／宿主ベクタ―系
US20080233614A1 (en) Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli
JP2023549432A (ja) 不能なラムノース代謝を有する宿主細胞において組み換えタンパク質を産生する方法、ならびにその発現ベクター、宿主細胞、および組み換えタンパク質
US9845475B2 (en) Expression vector
CN112689676A (zh) 用于无质粒产生目的蛋白的诱导型表达系统

Legal Events

Date Code Title Description
A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20230522