JP5960607B2 - 変異体spr遺伝子及び野生型Tsp遺伝子を含む細菌宿主系統 - Google Patents
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Description
配列番号1は、開始コドンの上流の6個のヌクレオチドATGAACを含んでいる野生型Tsp遺伝子のDNA配列である。
S430に対する変異、又は
D441に対する変異、又は
K455に対する変異、又は
S430及びD441に対する変異、又は
S430及びK455に対する変異、又は
D441及びK455に対する変異、又は
S430、D441、及びK455に対する変異。
S430A、若しくはS430C、及び/又は
D441A及び/又は
K455A若しくはK455H、若しくはK455R。
C94に対する変異、又は
H145に対する変異、又は
H157に対する変異、又は
C94及びH145に対する変異、又は
C94及びH157に対する変異、又は
H145及びH157に対する変異、又は
C94、H145、及びH157に対する変異
を含んでいてよい。
N31に対する変異、又は
R62に対する変異、又は
I70に対する変異、又は
Q73に対する変異、又は
S95に対する変異、又は
V98に対する変異、又は
Q99に対する変異、又は
R100に対する変異、又は
L108に対する変異、又は
Y115に対する変異、又は
D133に対する変異、又は
V135に対する変異、又は
L136に対する変異、又は
G140に対する変異、又は
R144に対する変異、又は
G147に対する変異
を含んでいてよい。
S95及びY115、又は
N31、Q73、R100及びG140、又は
Q73、R100及びG140、又は
R100及びG140、又は
Q73及びG140、又は
Q73及びR100、又は
R62、Q99及びR144、又は
Q99及びR144
に対する複数の変異を含んでいる。
S95F及びY115F
N31Y、Q73R、R100G、及びG140C、
Q73R、R100G、及びG140C、
R100G及びG140C、
Q73R及びG140C、
Q73R及びR100G、
R62C、Q99P及びR144C、又は
Q99P及びR144C。
タンパク質のフォールディングを促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、FkpA、Skp、SirA、PPiA、及びPPid、並びに/或いは、
タンパク質の分泌又は翻訳を促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY、及びLep、並びに/或いは、
ジスルフィド結合の形成を促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
タンパク質のフォールディングを促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、FkpA、Skp、SurA、PPiA、及びPPiD、
タンパク質の分泌又は翻訳を促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY、及びLep、並びに
ジスルフィド結合の形成を促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
a.変異spr遺伝子、
b.野生型の非組換え染色体Tsp遺伝子、
c.シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性、及び/又は変異OmpTを有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子(変異OmpT遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である)、
を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
a.変異spr遺伝子、
b.野生型の非組換え染色体Tsp遺伝子、
c.変異ptr遺伝子(変異ptr遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIをコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子であり、且つ/又は変異OmpTであり、変異OmpT遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である)、
を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞を提供する。
a.変異spr遺伝子、
b.野生型の非組換え染色体Tsp遺伝子、
c.シャペロン活性及び低減したプロテアーゼ活性を有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子、
d.変異ptr遺伝子(変異ptr遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するProteaseIIIタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子である)、
e.任意選択によって変異OmpT(変異Ompt遺伝子は、低減したプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である)、
を含んでいる細胞を提供する。
His105に対する変異、又は、
Asp135に対する変異、又は、
Ser210に対する変異、又は、
His105及びAsp135に対する変異、又は、
His105及びSer210に対する変異、又は、
Asp135及びSer210に対する変異、又は、
His105、Asp135、及びSer210に対する変異。
タンパク質のフォールディングを促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、FkpA、Skp、SurA、PPiA、及びPPiD、並びに/又は
タンパク質の分泌又は転位置を促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY、及びLep、並びに/又は
ジスルフィド結合形成を促進することができる1つ又は複数のタンパク質、例えば、DsbA、DsbB、DsbD、DsbG
も発現する実施形態において、1つ又は複数のさらなるタンパク質を、DsbCをコードするポリヌクレオチド及び/又は対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列として同じベクター中に挿入された1つ又は複数のポリヌクレオチドから発現させてもよい。或いは、1つ又は複数のポリヌクレオチドを別々のベクター中に挿入してもよい。
プラスミド、例えば、pBR322若しくはpACYC184、及び/又は
ウイルスのベクター、例えば、細菌のファージ
転位性遺伝要素、例えば、トランスポゾン
が含まれる。
細胞系統MXE001(ΔTsp)の生成
MXR001系統を以下の通り生成した:
Tspカセットを、SalI、NotI制限フラグメントとして、同様に制限したpKO3プラスミド中に移動させた。pKO3プラスミドは、温度感受性変異体のpSC101複製開始点(RepA)を、染色体の組入れ事象に対して強化及び選択するためのクロラムフェニコールマーカーと一緒に用いる。レバンスクラーゼをコードするsacB遺伝子は、ショ糖上で増殖させた大腸菌に致死的であり、したがって(クロラムフェニコールマーカー及びpSC101開始点と一緒に)用いて脱組込み(de−integration)及びプラスミドキュアリング事象に対して強化及び選択するのに用いられる。この方法は以前に記載されている(Hamiltonら、1989年、Journal of Bacteriology、171巻、4617〜4622頁、及びBlomfieldら、1991年、Molecular Microbiology、5巻、1447〜1457頁)。pKO3系は全ての選択マーカーを、挿入された遺伝子以外の宿主ゲノムから除去する。
EcoRI及びAseI制限マーカーを含んでいる、配列番号3に示すノックアウト変異Tsp遺伝子を含んでいるpMXE191。
5μl バッファー×1 (Roche)
1μl dNTP混合物(Roche、10mM混合物)
1.5μl 5’オリゴ(5pmol)
1.5μl 3’オリゴ(5pmol)
2μl 細胞可溶化物
0.5μl Taq DNAポリメラーゼ(Roche 5U/μl)
38.5μl H2O
PCRサイクル
94℃ 1分
94℃ 1分)
55℃ 1分)30サイクル繰返し
72℃ 1分)
72℃ 10分
spr変異体の生成
spr変異を、相補性アッセイを用いて生成し選択した。
1.V98E
2.D133A
3.V135D
4.V135G
5.G147C
6.S95F及びY115F
7.I70T
8.N31T、Q73R、R100G、G140C
9.R62C、Q99P、R144C
10.L108S
11.L136P
spr変異を有する変異体大腸菌細胞系統の生成
例2で同定した1から5の個々の変異、並びにspr(C94A、H145A、H157A)及びW174Rの3つの触媒三残基の変異を用いて、複合のΔTsp/変異体spr系統を作製するための例1からの野生型の非組換え染色体Tsp遺伝子を有するspr変異系統又はMXE001(ΔTsp)系統を作り出すために、いずれかの野生型W3110大腸菌系統(遺伝子型:F−LAM−IN(rrnD−RRnE)1rph1(ATCC no.27325))を用いて新たな系統を生成した。
pMXE336、pK03 spr S95F (−SalI)
pMXE337、pK03 spr Y115F (−SalI)
pMXE338、pK03 spr G147C (−SalI)
pMXE339、pK03 spr D133A (−SalI)
pMXE340、pK03 spr V135D (−SalI)
pMXE341、pK03 spr V135G (−SalI)
pMXE342、pK03 spr V98E (−SalI)
pMXE343、pK03 spr C94A (−SalI)
pMXE344、pK03 spr H145A (−SalI)
pMXE345、pK03 spr H157A (−SalI)
pMXE346、pK03 spr W174R (−SalI)
Fab’及びDsbC共発現用のプラスミドの生成
抗TNF Fab’の重鎖及び軽鎖配列の両方(配列番号13に示す軽鎖配列及び配列番号14に示す重鎖配列を有する抗TNF Fab’)、並びにDsbCをコードする配列を含んでいるプラスミドを構築した。
大腸菌系統における抗TNF Fab’又は抗TNF Fab’及びDsbCの発現
抗TNF Fab’及びDsbCの発現
野生型W3110細胞系、例1において提供したMXE001系統、及び例3において提供した変異体系統MXE012(H145Aspr変異体系統)を、例4において生成したプラスミドで形質転換した。
例3において提供した野生型W3110細胞系、spr変異体系統MXE008、MXE012、MXE017及びMXE012(H145A spr変異体系統)及び例1において提供したMXE001の系統を、CDP870Fab’に対する発現ベクター(配列番号13に示す軽鎖配列及び配列番号14に示す重鎖配列を有する抗TNF Fab’)であるプラスミドpMXE117(pTTO CDP870又は40.4 IGS17)で形質転換したが、この発現ベクターは、Sambrookら、1989年、「Molecular cloning:a laboratory manual.」、CSHL press、N.Y.に見ることができる従来の制限クローニング法を用いて構築されたものである。プラスミドpMXE117(pTTO CDP870又は40.4 IGS17)は以下の特徴:強力なtacプロモーター及びlacオペレーター配列を含んでいた。Fab軽鎖及び重鎖遺伝子を、単一のジシストロン性メッセージとして転写した。大腸菌OmpAタンパク質からのシグナルペプチドをコードするDNAを、ポリペプチドの大腸菌ペリプラズムへの移動を指示する軽鎖及び重鎖両方の遺伝子配列5’末端に融合させた。転写を二重転写ターミネーターrrnB t1t2を用いて終結させた。lacIq遺伝子は構成的に発現されるLacIリプレッサータンパク質をコードしていた。これは、アロラクトース又はIPTGの存在によって抑制解除が誘導されるまで、tacプロモーターからの転写を抑制した。用いた複製開始点はp15Aであり、低コピー数を維持した。プラスミドは、抗生物質選択用にテトラサイクリン耐性遺伝子を含んでいた。
フラスコ振盪培養物を用いた変異大腸菌系統における抗TNF Fab’の発現
抗TNF Fab’を発現する、例5によって生成された以下の系統:W3110、MXE001、MXE012、及びMXE017を、Fab’の増殖及び発現を比較するフラスコ振盪実験において試験した。
5mlフラスコ振盪実験
単一のコロニーを拾って、10μg/mlのテトラサイクリンを加えた5mlLB中に入れ、250rpmで振盪しながら30℃で一夜増殖させた。
一夜の培養物を用いて、100mlプラステトラサイクリンに接種して0.1OD600(即ち、4のODに対して100/4×0.1=100ml中に2.5ml)とした。
このマスター培養物を用いて、各時間点に対して培養試験管3×5mlを準備した。基準培養物1本をOD測定用の試料に準備した。
最初は増殖を肉眼でモニタリングしながら培養物を30℃、250rpmで振盪し、次いで対照の培養物をサンプリングすることによって、0.5OD600の培養物を捕らえた(通常約2時間)。培養物が0.5を超えるODを達成したら、IPTGを各培養試験管に加えて濃度200μM(0.04Mを25μl)とした。
誘導後必要とされる時間点(例えば、1時間、2時間)に培養試験管を取り除き、氷上に維持した。
13200rpmで5分間遠心分離後、細胞ペレットをペリプラズマ抽出バッファー(100mM Tris.Cl/10mM EDTA pH7.4)200μl中に再懸濁した。ペリプラズマ抽出物を250rpm、30℃で一夜撹拌した。翌日、抽出物を13200rpmで10分間遠心分離し、上清をデカントして捨て、「ペリプラズマ抽出物」として−20℃で貯蔵した。使用済みの細胞ペレットは廃棄した。
96ウェルELISAプレートを、PBS中2μg/mlのAB141(ウサギ抗ヒトCH1、UCB)で4℃一夜コーティングした。試料/コンジュゲートバッファー(PBS、BSA 0.2%(w/v)、Tween20 0.1%(v/v))300μgで3回洗浄後、プレート上で試料/コンジュゲートバッファー100μl中試料及び標準の1/2段階希釈を行い、プレートを室温で1時間、250rpmで撹拌した。洗浄バッファー(PBS、Tween20 0.1%(v/v))300μlで3回洗浄後、試料/コンジュゲートバッファー中1/1000希釈後、リビーリング(revealing)抗体6062(ウサギ抗ヒトκHRPコンジュゲートしたもの、The Binding Site、Birmingham、英国)100μlを加えた。次いで、プレートを室温で1時間、250rpmで撹拌した。洗浄バッファー3×300μlで洗浄後、TMB基質100μlを加え(TMB溶液の50:50混合物(Calbiochm):dH2O)、自動プレートリーダーを用いてA630を記録した。好適なアイソタイプの精製Fab’標準と比較することによって、ペリプラズマ抽出物中のFab’の濃度を算出した。
高密度発酵を用いた抗TNF Fab’又は抗TNF Fab’及びDsbCを発現する大腸菌系統の増殖
例5によって生成した以下の系統を、抗TNFα Fab’の増殖及び発現を比較する発酵実験において試験した。
例5において生成した抗TNF Fab’を発現する系統:
W3100
MXE012(H145A spr変異体系統)
例5において生成した抗TNF Fab’及びDsbCを発現する系統:
W3100
MXE012(H145A spr変異体系統)
発酵増殖培地は、NaH2PO4・H2O 3.86g/l及びグリセロール112g/lを有するSM6E培地(Humphreyら、2002年、Protein Expression and Purification、26巻、309〜320頁に記載)をベースとした。
接種培養物を、テトラサイクリン10μg/mlを補った同じ培地中で増殖させた。培養物をおよそ22時間、撹拌しながら30℃でインキュベートした。
発酵槽(総容積2.5リットル)に、接種培養物を0.3〜0.5OD600に接種した。温度は増殖相の間は30℃に維持し、誘導前に25℃に下げた。溶存酸素濃度を、可変性の撹拌及びエアフローによって空気飽和を30%上回って維持した。15%(v/v)NH4OH及び10%(v/v)濃H2SO4で自動滴定することによって、培養物のpHを7.0で制御した。10%(v/v)Struktol J673溶液(Schill and Seilacher)を加えることによって泡立ちを制御した。発酵の様々な段階で数々の添加を行った。バイオマス濃度がおよそ40OD600に到達したらマグネシウム塩及びNaH2PO4・H2Oを加えた。誘導相の前及び間にNaH2PO4・H2Oのさらなる添加を行って、確実にリン酸塩が過剰に維持されるようにした。発酵の初期に存在したグリセロールが枯渇したら(およそ75OD600)、80%(w/w)の継続的なグリセロールの供給を適用した。発酵における同じ時点に170μMのIPTGの供給を適用した。IPTG供給の開始を誘導の開始と理解した。発酵は、典型的に、グリセロール供給速度(0.5から2.5ml/hの間の範囲)で64〜120時間行った。
600nmでの培養物の光学密度を測定することによってバイオマス濃度を決定した。
細胞を、遠心分離によって培養物試料から回収した。さらなる分析用に上清の分画を(−20℃で)保持した。細胞ペレット分画を、抽出バッファー(100mM Tris−HCl、10mM EDTA、pH7.4)中、元の培養体積に再懸濁した。およそ16時間、60℃でインキュベートした後、遠心分離によって抽出物を澄明にし、上清分画を分析用に(−20℃で)保持した。
ペリプラズム抽出物及び培養物上清中のFab’濃度を、Humphreysら、2002年、Protein Expression and Purification、26巻、309〜320に記載されている通り、Fab’アセンブリーELISAによって、タンパク質G HPLCを用いて決定した。HiTrap タンパク質G HP1mlカラム(GE−Healthcare又は同等物)に分析物(およそ中性のpH、30℃、0.2μmろ過)を2ml/分でローディングし、カラムを20mMリン酸塩、50mM NaCl、pH7.4で洗浄し、次いで50mMグリシン/HCl pH2.7の注入を用いてFab’を溶出した。溶出されたFab’をAgilient1100又は1200HPLCシステム上A280によって測定し、既知濃度の精製Fab’タンパク質の検量線を参照することによって定量した。
系統におけるDNA漏出及び総タンパク質量の決定
dsDNAアッセイ
W3110、MXE001、MXE008、及びMXE012系統の上清中への二本鎖DNAの漏出を、Quant−IT Picogreen dsDNAアッセイキット(Invitrogen、Ref:P11496)を用いて決定した。1〜1000μg/mLの範囲に提供されたDNA標準を希釈することによって、検量線を調製した。蛍光の読みが方法の直線範囲に入るように(500から1000倍)、試料をTEバッファー中希釈した。96ウェルプレートにおいて、希釈試料又は標準100μLを、Picogreen試薬100μLと混合し、プレートを光線から保護して室温で5分間インキュベートした。蛍光の計数値を、励起フィルタ485nm、及び発光フィルタ535nmを用いて0.1秒間測定した。結果を図7に示す。
W3110、MXE001、MXE008、及びMXE012系統の総タンパク質濃度を、Coomassie Plus Bradfordアッセイキット(Pierce、Ref:23236)を用いて決定した。ウシ血清アルブミン標準を25〜1000μg/mLの範囲にわたって希釈することによって、検量線を作成した。光学密度が方法の直線範囲内に入るように試料を水で希釈し(5から10倍)、試料又は標準の33μLをクーマシー試薬1mLと混合した。室温で10分間インキュベートした後、クーマシー試薬をブランクとして分光光度計上でOD595nmを読んだ。総タンパク質濃度を検量線に基づいて算出した。結果を図8に示す。
大規模発酵を用いた抗TNF Fab’及びDsbCを発現する大腸菌系統の増殖
例5によって生成した以下の系統を、抗TNFα Fab’の系統の増殖及び生存性並びに発現を比べる発酵実験において試験した:
例5において生成される抗TNF Fab’及びDsbCを発現するMXE012(spr H145A変異体)
抗TNF Fab’及びDsbC細胞を発現するMXE012を、最初に、フラスコ振盪培養物中酵母菌抽出物及びペプトンの複合培地を用いて増殖させた。次いで、細胞を、化学的に規定された培地を用いて接種段階の発酵槽に移した。細胞を、規定された移行点まで栄養非制限の条件下で増殖させた。次いで、細胞を、同様の化学的に規定された培地を用いて、およそ230Lの最終体積で250L生成発酵槽に移した。培養物を最初に、炭素源が枯渇するまで、バッチモード中で増殖させた。炭素源が枯渇した後、炭素源を限定する供給を、指数関数的に増大する速度で供給した。規定された量の炭素源を加えた後、フィード溶液を添加する速度を下げ、IPTGを加えてFab’の発現を誘導した。次いで、発酵を続け、Fab’をペリプラズム中に蓄積させた。誘導後の規定された時点で、遠心分離によって培養物を回収し、回収した細胞をTris及びEDTAバッファー中に再懸濁し、59℃に加熱することによって、Fab’を細胞から抽出した。
大規模発酵を用いた抗TNF Fab’及びDsbCを発現する大腸菌系統の増殖
例5において生成した抗TNF Fab’及びDsbCを発現するMXE012
Claims (16)
- H145Aの変異を有する変異体sprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、
非組換えの野生型染色体Tsp遺伝子を含み、そして
変異spr遺伝子以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である、
組換えグラム陰性細菌細胞。 - H145Aの変異を有する変異体sprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子を含んでいる組換えグラム陰性細菌細胞であって、
非組換えの野生型染色体Tsp遺伝子を含み、そして
以下の変異遺伝子:
a.シャペロン活性及び50%以下のプロテアーゼ活性を有するDegPタンパク質をコードする変異DegP遺伝子、
b.50%以下のプロテアーゼ活性を有するProtease IIIタンパク質をコードする、又はノックアウト変異ptr遺伝子である、変異ptr遺伝子、
c.50%以下のプロテアーゼ活性を有するOmpTタンパク質をコードする、又はノックアウト変異OmpT遺伝子である、変異OmpT遺伝子
の1つ又は複数をさらに含み、
上記変異以外、野生型細菌細胞に対して同質遺伝子である、
組換えグラム陰性細菌細胞。 - 大腸菌(E.coli)である、請求項1又は2に記載の細胞。
- DsbCをコードする組換えポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含んでいる、請求項1から3までのいずれか一項に記載の細胞。
- 対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含んでいる、請求項1から4までのいずれか一項に記載の細胞。
- DsbCをコードする組換えポリヌクレオチド及び対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含んでいる、請求項1から3までのいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ベクターが、DsbCをコードする組換えポリヌクレオチド及び対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターを含んでいる、請求項6に記載の細胞。
- 対象のタンパク質が、抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントである、請求項5から7までのいずれか一項に記載の細胞。
- 抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントがTNFに特異的である、請求項8に記載の細胞。
- H145Aの変異を有する変異体sprタンパク質をコードする変異体spr遺伝子、野生型Tsp遺伝子、及びTNFに特異的な抗体又はその抗原結合性フラグメントである対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる、組換えグラム陰性細菌細胞。
- DsbCをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでいる、請求項10に記載の細胞。
- 請求項5から11までのいずれか一項に記載の組換えグラム陰性細菌細胞を、培養培地中、対象のタンパク質を発現させるのに有効な条件下で培養するステップと、組換えグラム陰性細菌細胞のペリプラズム及び/又は培養培地から対象のタンパク質を回収するステップとを含む、対象のタンパク質を生成するための方法。
- 対象のタンパク質がペリプラズム及び/又は上清から回収される、請求項12に記載の方法。
- 細胞がDsbCをコードする組換えポリヌクレオチドを含んでおり、細胞がDsbCをコードする組換えポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で培養される、請求項12又は13に記載の方法。
- 対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及びDsbCをコードする組換えポリヌクレオチドの発現が、培養培地に誘導因子を加えることによって誘発される、請求項14に記載の方法。
- 対象のタンパク質をDsbCから分離するステップをさらに含む、請求項14又は請求項15に記載の方法。
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