JP2000083670A

JP2000083670A - ＤｓｂＡ／ＤｓｂＢ／ＤｓｂＣ／ＤｓｂＤ発現プラスミド

Info

Publication number: JP2000083670A
Application number: JP10255702A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Kurokawa; 洋一黒川; Hideki Yanagi; 秀樹柳; Takashi Yura; 隆由良
Original assignee: HSP KENKYUSHO KK
Current assignee: HSP KENKYUSHO KK
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 2000-03-28
Also published as: EP0992588A1; DE69913285D1; US6673569B1; EP0992588B1; DE69913285T2; CA2281035A1; ATE255637T1

Abstract

(57)【要約】【課題】外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常
な立体構造を保持して発現させうる技術を提供するこ
と。【解決手段】ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ
をコードする人工オペロン、前記オペロンを有する発現
プラスミド、前記発現プラスミドと外来タンパク質発現
ベクターとを含有した共形質転換体並びに前記共形質転
換体を用いる外来タンパク質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤｓｂＡ／Ｄｓｂ
Ｂ／ＤｓｂＣ／ＤｓｂＤ発現プラスミドに関する。さら
に詳しくは、外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ
正常な立体構造を保持して発現させうる、ＤｓｂＡ、Ｄ
ｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤをコードする人工オペ
ロン、該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミ
ドと外来タンパク質発現ベクターとを含有した共形質転
換体および該共形質転換体を用いることを特徴とする外
来タンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】真核生物由来のタンパク質の多くはジス
ルフィド結合を有しており、強い還元条件下にある大腸
菌の細胞質内で発現させたとき、本来の立体構造をとる
ことは通常期待できないことから、このようなタンパク
質の生産にはジスルフィド結合の形成に好ましい酸化的
環境にあるペリプラズムへの分泌発現が有効であると考
えられている。分泌発現には、このように本来の高次構
造をもったタンパク質が発現される可能性が高いことの
ほかに、菌体に対して毒性をもつタンパク質の発現が可
能になること、Ｎ−末端にメチオニンが付加していない
タンパク質の発現が可能になること、夾雑タンパク質が
少なく精製が容易であること等の利点も期待される。し
かしながら、異種タンパク質を大腸菌ペリプラズムへ分
泌発現させる試みは多数報告されているが、いかなる異
種タンパク質でも活性を有する形で発現させることがで
きるわけではない。これは、ジスルフィド結合の数が多
いタンパク質において、特に問題になっている。

【０００３】一方、大腸菌においては、ジスルフィド結
合の形成に関与するＤｓｂファミリータンパク質である
ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤの役割が
生化学的試験ならびにそれぞれの欠損株を用いた相補性
試験により推定されている〔Bardwell, J. C., Mol. Mi
crobiol. 14, 199-205, (1994); Sone, M. et al., J.
Biol. Chem., 272, 10349-10352, (1997); Rietsch, A.
et al, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 93, 13048-1305
3, (1996) 〕。

【０００４】まず、ＤｓｂＡがペリプラズムに移行して
きた新生ポリペプチド鎖内にジスルフィド結合を形成さ
せる。このとき形成されたジスルフィド結合は必ずしも
正しいものではなく、ＤｓｂＣが作用してジスルフィド
結合の開裂と架け換えを行ない、正しいジスルフィド結
合に校正する。ＤｓｂＡとＤｓｂＣはともにチオレドキ
シン様活性部位モチーフ（Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ）を
持ち、この中の２つのＣｙｓ残基が反応に関与すると考
えられている。ジスルフィド結合形成の過程でＤｓｂＡ
の活性中心の２つのＣｙｓ残基は基質ペプチド鎖に対
し、酸化的に作用して自らは還元される。ＤｓｂＣの活
性中心の２つのＣｙｓ残基は一旦形成された基質のジス
ルフィド結合を還元して開裂させ、自らは酸化される。
還元型のＤｓｂＡと酸化型のＤｓｂＣはもはや触媒能を
失ってしまうので、これらを再活性化する因子が必要と
なる。内膜タンパク質ＤｓｂＢおよびＤｓｂＤは、ペリ
プラズム側に持つチオレドキシン様モチーフを介してそ
れぞれＤｓｂＡを再酸化、ＤｓｂＣを再還元している。

【０００５】目的タンパク質のペリプラズムへの分泌発
現の改善を目指し、ＤｓｂＡあるいはＤｓｂＣを目的タ
ンパク質とともに過剰発現させる試みがこれまでにいく
つかなされているが、必ずしも成功しているとはいえな
い。例えば、Knappik らは、抗体フラグメントの分泌発
現において発現産物のフォールディングにＤｓｂＡは必
要ではあることを開示しているが、過剰発現させてもフ
ォールディングの効率は変わらないという問題点を有す
る〔Knappik, A. et al. Bio/Technol., 11, 77-83, (1
993)〕。また、WunderlichとGlockschuberによれば、ペ
リプラズムでのα- アミラーゼ／トリプシンインヒビタ
ーのフォールディングはＤｓｂＡの過剰発現で改善され
ず、還元型グルタチオンの存在下で１４倍向上すること
を開示している〔Wunderlich, M.とGlockschuber, R.,
J. Biol. Chem., 268, 24547-24550, (1993)〕。また、
Wulfing とPluckthum は、あるＴ細胞受容体フラグメン
トのペリプラズムでの可溶性発現にＤｓｂＡの過剰発現
が効果を示すことを開示しているが、ＤｓｂＡのほかに
熱ショックシグマ因子σ³²を同時に過剰発現させること
が必要である〔Wulfing, C. とPluckthum, A., J.Mol.
Biol., 242, 655-669, (1994) 〕。さらに最近、Jolyら
は、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＣの過剰発現によりインスリ
ン様成長因子Ｉ（IGF-I)のペリプラズムでの発現レベル
が２倍向上することを見出したが、予想に反して可溶性
の発現産物は減少するという問題点を有する〔Joly, J.
C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2773-2
777 (1998)〕。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、外来タンパク質を可溶
化した状態で、かつ正常な立体構造を保持して発現させ
うる、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤをコー
ドする人工オペロンを提供することを目的とする。ま
た、本発明は、前記オペロンを有する発現プラスミドを
提供することを目的とする。さらに本発明は、前記発現
プラスミドと外来タンパク質発現ベクターとを含有して
なる共形質転換体を提供することにある。さらに本発明
は、前記共形質転換体を用いる外来タンパク質の製造方
法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の主題は、ジスル
フィド結合の形成あるいは異性化を行なうタンパク質
（ＤｓｂＡあるいはＤｓｂＣ) に加えて、それらの反応
性を制御するタンパク質(ＤｓｂＢあるいはＤｓｂＤ)
を含むＤｓｂファミリータンパク質の発現ベクターを構
築し、外来タンパク質の分泌発現におけるこれらのタン
パク質の共発現の効果を調べたところ、驚くべく、ペリ
プラズムでの正確なジスルフィド結合形成が効率よく行
なわれ、さらに効率よく可溶性の発現産物を得ることが
できることを見出したことにある。

【０００８】即ち、本発明の要旨は、〔１〕Ｄｓｂ
Ａ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤをコードする人
工オペロン、〔２〕誘導可能なプロモーターを含む、
前記〔１〕記載の人工オペロン、〔３〕誘導可能なプ
ロモーターが、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒ
ａ、Ｐｚｔ−１およびＴ７からなる群より選ばれた、前
記〔２〕記載の人工オペロン、〔４〕前記〔１〕〜
〔３〕いずれか記載のオペロンを有し、ＤｓｂＡ、Ｄｓ
ｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤを発現する、発現プラス
ミド、〔５〕前記〔４〕記載の発現プラスミドと外来
タンパク質発現ベクターとを含有してなる共形質転換
体、〔６〕宿主として、大腸菌プロテアーゼ変異株を
用いる、前記〔５〕記載の共形質転換体、〔７〕外来
タンパク質が、インターフェロン、インターロイキン、
インターロイキン受容体、インターロイキン受容体拮抗
物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ
コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、
エリスロポエチン、トロンボポエチン、白血病抑制因
子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プ
ロインスリン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長
因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長
因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛
様体神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由
来神経栄養因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害因
子、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター、血液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロ
シダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、
リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンイン
ヒビター、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、
レプチン、免疫グロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清
アルブミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタン
パク質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産
物、転写調節因子およびウイルス構成タンパク質からな
る群より選ばれた前記〔５〕または前記〔６〕に記載の
共形質転換体、〔８〕前記〔５〕〜〔７〕いずれか記
載の共形質転換体を用いることを特徴とする、外来タン
パク質の発現方法、ならびに

〔９〕ＤｓｂＡ、Ｄｓｂ
Ｂ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤの発現量が外来タンパク質
の可溶化に適した量となる誘導条件下で共形質転換体の
培養を行なう、前記〔８〕記載の製造方法、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の人工オペロンは、Ｄｓｂ
ファミリータンパク質であるＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、Ｄｓ
ｂＣおよびＤｓｂＤをコードする遺伝子を含有すること
に１つの大きな特徴がある。前記遺伝子を含有すること
により、外来タンパク質と共発現させた場合に、該外来
タンパク質のジスルフィド結合の形成が正しく行なわ
れ、効率よく可溶性の発現産物を得ることができるとい
う優れた効果を発揮する。

【００１０】本発明において、Ｄｓｂファミリータンパ
ク質は、ジスルフィド結合の形成に関与するタンパク質
であり、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤが挙
げられる。前記ＤｓｂＡは、ペリプラズムに移行してき
た新生ポリペプチド鎖内にジスルフィド結合を形成さ
せ、前記ＤｓｂＣは、該ＤｓｂＡにより形成されたジス
ルフィド結合の開裂と架け換えを行ない、正しいジスル
フィド結合に校正する機能を有すると考えられている。
また、前記ＤｓｂＢおよびＤｓｂＤは、それぞれＤｓｂ
Ａを再酸化し、ＤｓｂＣを再還元する機能を有すると考
えられている。また、前記Ｄｓｂファミリータンパク質
をコードするｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓ
ｂＤ遺伝子は、オペロンを形成しておらず、それぞれの
発現は独立に調節されていると考えられる。

【００１１】前記Ｄｓｂファミリータンパク質として
は、大腸菌由来のタンパク質が挙げられるが、同様の機
能を有するものであれば、その起源は特に限定されるも
のではなく、例えば、Salmonella typhimurium、Pseudo
monas aeruginosa、Haemophilus influenzaeなどが挙げ
られる。大腸菌において外来蛋白質を安定化かつ可溶化
させて発現させるという観点から、大腸菌由来のＤｓｂ
ファミリータンパク質が好ましい。

【００１２】ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓ
ｂＤのアミノ酸配列は、それぞれ配列表中の配列番号：
１、３、５および７に示され、これらをコードする遺伝
子の塩基配列は、それぞれ、配列表中の配列番号：２、
４、６および８に示される。

【００１３】前記ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよび
ＤｓｂＤのアミノ酸配列は、さらに前記機能を有するポ
リペプチドであれば、それぞれのアミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸残基に、置換、欠失、付加また
は挿入などの変異が導入された配列であってもよい。ま
た前記変異は、前記機能を有するものであれば、２種以
上導入されていてもよい。

【００１４】前記ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよび
ｄｓｂＤ遺伝子の塩基配列は、前記機能を有するポリペ
プチドをコードするものであれば、それぞれの塩基配列
において、１個以上の塩基に、置換、欠失、付加または
挿入などの変異が導入された配列であってもよい。また
前記機能を有するポリペプチドをコードするものであれ
ば、前記変異が２種以上導入された配列であってもよ
い。また、前記機能を有するポリペプチドをコードする
ものであれば、配列表中の配列番号：２、４、６および
８を有する遺伝子にストリンジェントな条件下にハイブ
リダイズする遺伝子の塩基配列であってもよい。なお、
ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、モレキュラ
ークローニング：アラボラトリーマニュアル第２版
（Sambrook,J.ら著、 Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, 1989年発行）に記載の条件などが挙
げられる。

【００１５】前記遺伝子は、前記モレキュラークローニ
ング：アラボラトリーマニュアル第２版などに記載の
遺伝子工学的手法などにより得ることができる。

【００１６】具体的には、例えば、前記遺伝子にハイブ
リダイズするプローブを用いたスクリーニング法、適切
な制限酵素により目的遺伝子を含む断片を切り出しクロ
ーニングする方法、それぞれの遺伝子を増幅可能な配列
を有するプライマー対を用いたＰＣＲ法などにより、前
記遺伝子を得ることができる。

【００１７】以下、それぞれの遺伝子を増幅可能な配列
を有するプライマー対を用いたＰＣＲ法による遺伝子の
取得方法について説明する。

【００１８】ＰＣＲを行なう際に用いるプライマーとし
ては、例えば、前記遺伝子の塩基配列またはその相補的
な配列にストリンジェントな条件下にハイブリダイズ可
能な配列を有するプライマーなどが挙げられる。前記プ
ライマーにおいて、その塩基配列中には、操作性をよく
するために、制限酵素認識部位を有していてもよい。ｄ
ｓｂＡ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、例え
ば、配列表中の配列番号：９および１０に示すプライマ
ーなどが挙げられる。ｄｓｂＢ遺伝子を増幅するための
プライマーとして、例えば、配列表中の配列番号：１１
および１２に示すプライマーなどが挙げられる。ｄｓｂ
Ｃ遺伝子を増幅するためのプライマーとして、例えば、
配列表中の配列番号：１３および１４に示すプライマー
などが挙げられる。ｄｓｂＤ遺伝子を増幅するためのプ
ライマーとして、例えば、配列表中の配列番号：１５お
よび１６に示すプライマーなどが挙げられる。

【００１９】ＰＣＲ法によるクローニングに用いる鋳型
としては、例えば、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ遺伝子を含むｐ
ＳＫ２２０〔Kamitani, S. et al., EMBO J. 11, 57-6
2, (1992)〕、ｐＳＳ５１〔(Kishigami, S. and Ito,
K., Genes Cells I, 201-208,(1996)〕、ｄｓｂＣ、ｄ
ｓｂＤ遺伝子を含むＫｏｈａｒａｃｌｏｎｅのＮｏ．
４６８、６４８〔Kohara, Y. et al., Cell, 50, 495-5
08,(1987) 〕などが挙げられる。

【００２０】ＰＣＲ法を行なう際の反応液組成、反応温
度サイクルなどは、得られた増幅産物の有無を観察する
ことにより、適宜設定することができる。具体的には、
例えば、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣ遺伝子の増幅
は、５０ｐｍｏｌのプライマー、１０ｎｇの鋳型ＤＮ
Ａ、１ユニットのＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡（株）社
製）、０．２ｍＭｄＮＴＰ、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄、１ｍＭＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、０．００１％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣｌ₂お
よび１２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の
組成の反応液５０μｌを用い、９８℃、５秒間〜６５
℃、２秒間〜７４℃、３０秒間を１サイクルとして２５
サイクルの反応を行なうことができる。また、ｄｓｂＤ
遺伝子の増幅は、上記ＰＣＲ条件において、ＫＯＤＤ
ＮＡポリメラーゼにかえてＴａＫａＲａＬＡＴａｑ
^TM（宝酒造（株）社製）を用い、さらに全容量５０μｌ
の反応液〔組成：１０ｐｍｏｌのプライマー、２．５ｎ
ｇの鋳型ＤＮＡ、２．５ユニットのＴａＫａＲａＬＡ
Ｔａｑ、０．４ｍＭｄＮＴＰ、および×１０Ｔａ
ＫａＲａＬＡＢｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）〕を用
い、９４℃、１分間処理したのち、９８℃、２０秒間お
よび６８℃、３分間を１サイクルとして２５サイクルの
反応を行なうことができる。

【００２１】本発明のオペロンにおいては、前記Ｄｓｂ
ファミリータンパク質を発現するものであれば、前記ｄ
ｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤ遺伝子の順
番は、特に限定されるものではなく、例えば、ｄｓｂＡ
−ｄｓｂＢ−ｄｓｂＣ−ｄｓｂＤの順にタンデムに並ん
だポリシストロニックなオペロンなどが挙げられる。な
お、前記ｄｓｂＡ−ｄｓｂＢ−ｄｓｂＣ−ｄｓｂＤの順
にタンデムに並んだポリシストロニックなオペロンの塩
基配列を、配列表中の配列番号：１７に示す。

【００２２】また、前記ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣ
およびｄｓｂＤ遺伝子は、それぞれの構造遺伝子の上流
にリボソーム結合部位（ＳＤ配列）を有することが好ま
しく、それぞれの構造遺伝子の７〜１０ｂｐ上流に位置
することが好ましい。

【００２３】本発明のオペロンにおいては、前記遺伝子
は、プロモーターの制御下に存在してもよい。プロモー
ターの制御下に存在する前記オペロンの転写を制御する
プロモーターは、Ｄｓｂファミリータンパク質の発現量
を調節するという観点から、誘導可能なプロモーターで
あることが好ましい。誘導可能なプロモーターとして
は、例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒ
ａ、Ｐｚｔ−１、Ｐ_LおよびＴ７が挙げられる。前記ｌ
ａｃ、ｔａｃおよびｔｒｃは、いずれもイソプロピル−
β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用い
て誘導することができ、前記ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚ
ｔ−１は、それぞれ、３−インドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）、Ｌ−アラビノース、テトラサイクリンを用いて誘
導することができる。また前記Ｐ_Lは高温（４２℃）で
誘導することができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
によって特異的にかつ強力に転写されるＴ７プロモータ
ーも使用できる。この場合、ｌａｃプロモーター下流に
連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつλファー
ジを溶原化した大腸菌を用いることにより、ＩＰＴＧで
誘導が可能である。前記プロモーターの中では、誘導操
作性の容易さの観点から、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔ
ｒｐ、ａｒａ、Ｐｚｔ−１およびＴ７が好ましい。前記
プロモーターは、公知のベクターなどに含まれており、
制限酵素等を用いてベクターから適宜切り出して用いる
ことができる。

【００２４】本発明のオペロンにおいては、ｒｒｎＢＴ
１Ｔ２などに代表されるターミネーターを有することに
より、より安定にＤｓｂファミリータンパク質を発現さ
せることが可能になる。これらのターミネーターは、公
知のベクターなどに含まれており、制限酵素等を用いて
ベクターから適宜切り出して用いることができる。

【００２５】本発明の発現プラスミドは、ＤｓｂＡ、Ｄ
ｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤを発現するプラスミド
であり、前記オペロンを含有することに１つの大きな特
徴がある。

【００２６】本発明の発現プラスミドは、前記したよう
に、誘導可能なプロモーターにより本発明のＤｓｂファ
ミリータンパク質、すなわち、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、Ｄ
ｓｂＣおよびＤｓｂＤを発現することが好ましい。

【００２７】また、本発明の発現プラスミドを宿主に導
入するに際して、同一のプラスミド上に、前記オペロン
および目的とする外来タンパク質をコードする遺伝子を
有しているプラスミドを用いてもよく、オペロンまたは
外来タンパク質をコードする遺伝子を保持する別々のプ
ラスミド（以下、共発現型プラスミドという）を用いて
もよい。なかでも共発現型プラスミドが、外来タンパク
質ごとにプラスミドを作製する必要性がないことや宿主
内でのプラスミドの安定性などの観点から好ましい。

【００２８】外来蛋白質の発現レベルを低下させず、前
記Ｄｓｂファミリータンパク質の発現量や発現時期を最
適化するために、Ｄｓｂファミリータンパク質の発現と
目的蛋白質の発現は独立して制御できる方が有利であ
り、Ｄｓｂファミリータンパク質の発現に用いる誘導可
能なプロモーターとしては、目的蛋白質の発現に用いら
れるプロモーターと異なるものが好ましい。

【００２９】前記発現プラスミドとして共発現型プラス
ミドを用いる場合、宿主として用いる大腸菌内で目的蛋
白質の発現ベクターと不和合性を示さないレプリコンを
有するものであれば使用可能である。例えば、目的蛋白
質の発現ベクターとしてｐＢＲ３２２等ＣｏｌＥ１レプ
リコンをもつものを用いる場合、本発明のＤｓｂファミ
リータンパク質の発現に用いるプラスミドには、ｐＡＣ
ＹＣベクターに存在するｐ１５Ａレプリコンを使用する
ことができる。

【００３０】本発明の発現プラスミドの具体例として
は、共発現型プラスミドである、ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢ
ＣＤが挙げられる。前記ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤは、
図３に示すように、ｐＡＣＹＣ１８４ベクターの誘導体
のｐＡＲ３〔ペレツ（Ｐｅｒｅｚ）ら、Gene, 158, 141
-142 (1995）〕由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子
および、アラビノースで発現誘導可能なａｒａプロモー
ターを有し、さらに該プロモーターの下流にマルチクロ
ーニングサイトおよびｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア
社) 由来のｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターを含むプラ
スミドｐＡＲ５のマルチクローニングサイトにｄｓｂ
Ａ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤ遺伝子の順に挿
入したプラスミドである。前記ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣ
Ｄは、アラビノースの添加により、前記Ｄｓｂファミリ
ータンパク質を誘導発現させることができる。また、前
記ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤは、外来タンパク質をコー
ドする遺伝子を有する別のプラスミドと共存させること
により、該外来タンパク質のジスルフィド結合の形成が
正しく行なわれ、効率よく可溶性の発現産物を得ること
ができるものである。

【００３１】前記プラスミドの構築方法は、例えば、前
記モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュア
ル第２版などに記載の方法により行なうことができる。

【００３２】本発明のプラスミドは、形質転換の際に選
択が容易に行われるように、必要に応じて選択マーカー
遺伝子をさらに含んでもよい。かかる選択マーカー遺伝
子としては、アンピシリン耐性（Ａｍｐ^r）遺伝子、カ
ナマイシン耐性（Ｋｍ^r）遺伝子、クロラムフェニコー
ル耐性（Ｃｍ^r）遺伝子等が挙げられるが、共発現型プ
ラスミドにおいては、外来蛋白質発現ベクターに含まれ
る選択マーカー遺伝子とは異なることが望ましい。

【００３３】本発明の共形質転換体は、前記発現プラス
ミド（共発現型プラスミド）と外来タンパク質発現ベク
ターとを含有することに１つの大きな特徴を有する。

【００３４】前記共形質転換体は、前記ｐＡＲ５／ｄｓ
ｂＡＢＣＤに代表される発現プラスミド（共発現型プラ
スミド）と外来タンパク質をコードする遺伝子を保持す
る外来タンパク質発現ベクターとを共形質転換すること
により得られる。

【００３５】前記共形質転換体に用いる外来タンパク質
発現ベクターとしては、特に限定されないが、所望の外
来タンパク質を菌体の細胞質内で発現または菌体のペリ
プラズムに分泌させうるベクターであり、かつ前記発現
プラスミドと和合性を示すベクターなどが挙げられ、特
に誘導可能なプロモーターにより、目的の外来タンパク
質の発現が誘導されるベクターが好ましい。誘導可能な
プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが挙
げられるが、本発明のＤｓｂファミリータンパク質の誘
導発現に用いるプロモーター以外のプロモーターを選ぶ
ことにより、Ｄｓｂファミリタンパク質と目的の外来タ
ンパク質とを別々に発現誘導することができる。

【００３６】また、外来タンパク質発現ベクターは、必
要に応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる
選択マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げ
られるが、本発明の発現プラスミド（共発現型プラスミ
ド）に含まれる選択マーカー遺伝子以外のものを用いる
ことにより、共形質転換体の二重選別が可能となる。

【００３７】前記外来タンパク質発現ベクターとして
は、得られた外来タンパク質のジスルフィド結合の正し
い形成を行なう観点から、菌体のペリプラズムに分泌さ
せるベクターであることが好ましく、かかるベクターと
しては、例えば、目的とする外来タンパク質にＯｍｐ
Ａ、ＯｍｐＴ、ＭａｌＥ、β−ラクタマーゼなどのシグ
ナルペプチドが付加されたポリペプチドをコードする遺
伝子を有するベクターなどが挙げられる。前記ベクター
は、例えば、前記シグナルペプチドをコードする遺伝子
を遺伝子工学的に目的外来タンパク質をコードする遺伝
子上のＮ末端に対応する箇所に付加し、得られた遺伝子
を公知のベクターに組み込むことにより得ることができ
る。

【００３８】また、本発明の外来タンパク質発現ベクタ
ーにおいては、本発明の目的を妨げないものであれば、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などのタ
ンパク質との融合タンパク質としての発現；ヒスチジン
タグなどを付加したタンパク質としての発現などに代表
される目的外来タンパク質の精製を容易に行なうための
手法を可能にする配列を含んでもよい。

【００３９】本発明に用いられる宿主大腸菌としては、
具体的には、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、
ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０等の一般的に用いられる株、
ならびにｄｅｇＰ変異株、ｏｍｐＴ変異株、ｔｓｐ変異
株、ｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ変異株、ｈｓｌＶ／Ｕ変
異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異株、ｌｏｎ、ｃ
ｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重変異株等のプロテアー
ゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒｐｏＨ欠失変異株、ｒｐ
ｏＨミスセンス変異株等の変異株が挙げられる。

【００４０】本発明においては、外来タンパク質をより
安定に発現させる観点から、前記プロテアーゼ変異株、
具体的には、ｄｅｇＰ変異株、ｏｍｐＴ変異株、ｔｓｐ
変異株、ｌｏｎ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変
異株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三重
変異株のプロテアーゼ変異株が好ましい。

【００４１】ここで、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異
株としては、ｌｏｎ遺伝子およびｃｌｐＰＸ遺伝子に二
重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来のＫＹ２７８３
株〔Ｅ．ｃｏｌｉＫＹ２７８３と命名・表示され、平
成１０年２月３日（原寄託日）より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６
６））に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６２４４として寄
託されている〕が好ましい。

【００４２】また、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ
／Ｕ三重変異株とは、前記ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重
変異株において、さらにＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコ
ードするｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に変異を導入した変異株で
あり、ｌｏｎ遺伝子、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｈｓｌＶ
／Ｕ遺伝子に三重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来
のＫＹ２８９３株〔Ｅ．ｃｏｌｉＫＹ２８９３と命名
・表示され、平成１０年２月３日（原寄託日）より通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日
本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０
５−８５６６））に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６２４
３として寄託されている〕が好ましい。

【００４３】本発明において、発現させる外来タンパク
質としては、宿主内、特に大腸菌内で不安定化および／
または不溶化する外来タンパク質であれば、いかなるタ
ンパク質でも構わない。かかる外来タンパク質として
は、インターフェロン、インターロイキン、インターロ
イキン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポ
エチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成
長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリ
ン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小
板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細
胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄
養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養
因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害因子、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブ
ミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク
質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転
写調節因子およびウイルス構成タンパク質が挙げられ
る。

【００４４】本発明の発現プラスミドを外来タンパク質
発現ベクターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩
化カルシウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレー
ション法等の通常の方法が用いられる。共形質転換体の
スクリーニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じ
た薬剤により行なうことができる。外来タンパク質の発
現は、例えば、ウエスタンブロット解析等により確認す
ることができる。

【００４５】本発明の外来タンパク質の製造方法は、前
記共形質転換体を用いることを１つの大きな特徴とす
る。前記製造方法は、例えば、発現対象の外来タンパク
質の安定化および／または可溶化に適したＤｓｂファミ
リータンパク質の誘導条件下に共形質転換体を培養し、
Ｄｓｂファミリータンパク質および外来タンパク質を誘
導発現させたのち、菌体を集め、集めた菌体を破砕し、
外来タンパク質に応じた精製方法に従って、該外来タン
パク質を単離・精製することにより行なうことができ
る。

【００４６】前記誘導条件は、本発明の発現プラスミド
および外来タンパク質発現ベクターに用いられた誘導可
能なプロモーターにより異なるが、ＤｓｂＡ、Ｄｓｂ
Ｂ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤの発現量が外来タンパク質
の可溶化に適した量となる条件であればよい。例えば、
前記誘導条件は、以下のようにして決定することができ
る。

【００４７】まず、前記プロモーターの誘導物質を、種
々の添加濃度、添加時期を変化させて添加する。外来タ
ンパク質を発現させた菌体を集め、集めたそれぞれの菌
体を破砕し抽出物を得る。得られたそれぞれの抽出物
を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、クマシ
ーブリリアントブルー染色や銀染色などによりゲル中の
タンパク質に由来するバンドを可視化する。可視化され
たバンドのなかで、外来タンパク質に由来するバンドに
ついて、デンシトメトリーなどでその濃度を測定するこ
とにより適切な誘導条件を調べることができる。

【００４８】共形質転換体の培養は、宿主として用いた
菌により異なるため、特に限定されないが、種々の培養
時期、培養温度などを設定し、それぞれの培養条件下に
発現した外来タンパク質の量を前記誘導条件の決定と同
様に調べることにより決定することができる。

【００４９】外来タンパク質の分離精製方法は、例え
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーに代表されるタンパク質の精
製方法により行なうことができる。

【００５０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。

【００５１】実施例１Ｄｓｂファミリータンパク質を
コードする遺伝子のクローニングＤｓｂファミリータンパク質である、ＤｓｂＡ、Ｄｓｂ
Ｂ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤのそれぞれをコードする各
構造遺伝子：ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓ
ｂＤの各遺伝子のクローニングをＰＣＲ法により行なっ
た。プライマーとしては、各構造遺伝子の７〜１０ｂｐ
上流にリボソーム結合部位を付加するようデザインした
ものを用いた。ｄｓｂＡ遺伝子を増幅するためのプライ
マーとして、配列表中の配列番号：９および１０に示す
プライマーを、ｄｓｂＢ遺伝子を増幅するためのプライ
マーとして、配列表中の配列番号：１１および１２に示
すプライマーを、ｄｓｂＣ遺伝子を増幅するためのプラ
イマーとして、配列表中の配列番号：１３および１４に
示すプライマーを、ｄｓｂＤ遺伝子を増幅するためのプ
ライマーとして、配列表中の配列番号：１５および１６
に示すプライマーを用いた。なお、前記プライマーは塩
基配列中に以下に示す制限酵素認識部位を有するように
デザインした。

【００５２】プライマー（配列番号：９）：ＳａｃＩプライマー（配列番号：１０）：ＡｖａＩプライマー（配列番号：１１）：ＡｖａＩプライマー（配列番号：１２）：ＮｄｅＩプライマー（配列番号：１３）：ＮｄｅＩプライマー（配列番号：１４）：ＳａｌＩプライマー（配列番号：１５）：ＳａｌＩプライマー（配列番号：１６）：ＳｐｈＩ

【００５３】鋳型として、京都大学ウイルス研究所の秋
山芳展博士より入手した、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ遺伝子を
含むｐＳＫ２２０ (Kamitani, S. et al. (1992) EMBO
J. 11, 57-62) 、ｐＳＳ５１(Kishigami, S. and Ito,
K. (1996) Genes Cells I, 201-208) 、ｄｓｂＣ、ｄｓ
ｂＤ遺伝子を含むＫｏｈａｒａｃｌｏｎｅのＮｏ．４
６８、６４８〔Kohara, Y. et al., Cell, 50, 495-50
8, (1987)〕を用いた。

【００５４】ＰＣＲ条件を下記に示す。

【００５５】５０ｐｍｏｌのプライマー、１０ｎｇの鋳
型ＤＮＡ、１ユニットのＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡
（株）社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰ、６ｍＭ（ＮＨ
₄）₂ＳＯ₄、１ｍＭＫＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００、０．００１％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣ
ｌ₂および１２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）の組成の反応液５０μｌを得た。前記反応混合液を
ＧｅｎｅＡｍｐ^TM ＰＣＲシステム２４００（パーキン
・エルマー社製）にセットし、９８℃、５秒間〜６５
℃、２秒間〜７４℃、３０秒間を１サイクルとして２５
サイクルの反応を行なった。

【００５６】前記条件下にＰＣＲを行なった結果、ｄｓ
ｂＡ、ｄｓｂＢ遺伝子を含むｐＳＫ２２０、ｐＳＳ５１
を鋳型にして、それぞれｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ遺伝子に相
当すると考えられる約０．６および０．５ｋｂの断片の
特異的な増幅が認められた。一方、ｄｓｂＣ遺伝子を含
むＫｏｈａｒａｃｌｏｎｅＮｏ．４６８を鋳型とし
た場合は、ｄｓｂＣ遺伝子に相当すると考えられる約
０．７ｋｂの断片の特異的な増幅が認められたが、ｄｓ
ｂＤ遺伝子を含むＫｏｈａｒａｃｌｏｎｅＮｏ．６
４８を鋳型とした場合には、ｄｓｂＤ遺伝子に相当する
断片の増幅は全く認められなかった。

【００５７】そこで、ｄｓｂＤ遺伝子をクローニングす
るために、上記ＰＣＲ条件において、ＫＯＤＤＮＡポ
リメラーゼにかえてＴａＫａＲａＬＡＴａｑ^TM（宝
酒造（株）社製）を用い、さらに全容量５０μｌの反応
液〔組成：１０ｐｍｏｌのプライマー、２．５ｎｇの鋳
型ＤＮＡ、２．５ユニットのＴａＫａＲａＬＡＴａ
ｑ、０．４ｍＭｄＮＴＰ、および×１０ＴａＫａＲ
ａＬＡＢｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）〕を用い、９４
℃、１分間処理したのち、９８℃、２０秒間および６８
℃、３分間を１サイクルとして２５サイクルの反応を行
なった。鋳型として、ＫｏｈａｒａｃｌｏｎｅＮ
ｏ．６４８を用いた。その結果、ｄｓｂＤに相当すると
考えられる約１．５ｋｂの断片の増幅が認められた。

【００５８】前記の増幅断片の塩基配列を決定したとこ
ろ、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤのそ
れぞれの遺伝子が得られていることが明らかになった。
ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤの塩基配
列を、それぞれ配列表中の配列番号：２、４、６および
８に示す。

【００５９】ついで、前記のようにして得られた増幅断
片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のマ
ルチクローニングサイトに連結することにより、ｄｓｂ
Ａ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤを、それぞれ単
独でｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）に連結したプラスミド（それ
ぞれ、ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＡ、ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＢ、ｐＴ
７Ｂ／ｄｓｂＣおよびｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＤという）なら
びにｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤをタ
ンデムに連結して得られたオペロン（配列番号：１７）
をｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）に連結したプラスミド（以下、
ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＡＢＣＤという）を構築した。それぞ
れのプラスミドを図１に示す。

【００６０】実施例２発現ベクターの構築Ｄｓｂファミリータンパク質をコードする４つの遺伝子
（ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢ、ｄｓｂＣおよびｄｓｂＤ）は、
オペロンを形成しておらず、それぞれが独立して発現調
節を受けるものと考えられている。そこで、４つの遺伝
子がポリシストロニックなオペロンを形成し、これらの
発現がアラビノース添加により誘導可能な発現ベクター
を構築した。図２に構築の概略を示す。

【００６１】Ｄｓｂファミリータンパク質の構造遺伝子
を、モデルタンパク質構造遺伝子とは独立して発現でき
るようにするため、ペレツ (Perez)らにより構築された
ｐＡＣＹＣ１８４由来のｐＡＲ３〔Gene, 158, 141-142
(1995) 参照、（クロラムフェニコール耐性、アラビノ
ースで発現誘導可能）〕のｐＡＲ３のＰｓｔＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位に、様々な制限酵素の認識配列を有する合
成ＤＮＡ（配列番号：１８）を連結し、マルチクローニ
ングサイトを有するｐＡＲ４を得た。

【００６２】ついで、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア
社) をＰｖｕＩ処理し、ＭｕｎｇＢｅａｎＮｕｃｌ
ｅａｓｅを用いて末端を平滑化したのち、さらにＳａｃ
Ｉ処理することによりｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター
を含む断片を切り出した。得られた断片を前記ｐＡＲ４
のＳａｃＩ−ＮｒｕＩ部位に連結し、ｐＡＲ５を得た。
前記ｐＡＲ５は、ｐＢＲ３２２ｏｒｉを有するプラスミ
ドの共存下での発現が可能であり、アラビノースの添加
により、マルチクローニングサイトに挿入した外来遺伝
子由来の発現産物の発現量を調節することが可能であ
る。

【００６３】実施例３Ｄｓｂファミリータンパク質発
現プラスミドの構築および発現の確認実施例１で得られたｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）／ｄｓｂＡ〜
ＤならびにＡＢＣＤのそれぞれプラスミドからＳａｃＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を切り出し、該断片をそれぞれ前
記実施例２で得られたｐＡＲ５のマルチクローニングサ
イト内のＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位へ挿入した。得
られたＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤの
それぞれ１つずつをつないだ発現プラスミド（それぞ
れ、ｐＡＲ５／ｄｓｂＡ、ｐＡＲ５／ｄｓｂＢ、ｐＡＲ
５／ｄｓｂＣおよびｐＡＲ５／ｄｓｂＤという）、なら
びにこれら４つがタンデムに連結し、ポリシストロニッ
クなオペロンを形成した発現プラスミド（ｐＡＲ５／ｄ
ｓｂＡＢＣＤ) を図３に示す。

【００６４】前記のようにして得たプラスミドを用い
て、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して、Ｄｓｂファミリ
ータンパク質発現を試みた。ＰＥＧ−ＤＭＳＯ法により
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを得て、１．０×
１０^-2μｇの前記ｐＡＲ５／ｄｓｂＡ、ｐＡＲ５／ｄｓ
ｂＢ、ｐＡＲ５／ｄｓｂＣ、ｐＡＲ５／ｄｓｂＤおよび
ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤを用いて、形質転換を行なっ
た。形質転換体の選抜はクロラムフェニコール耐性能を
指標として行なった。

【００６５】ついで、得られた形質転換体を３７℃でク
ロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ含む５ｍｌのＬ培地
で培養し、Ｋｌｅｔｔｕｎｉｔｓ＝２０前後のときに
アラビノースを最終濃度が、０、２００、２０００μｇ
／ｍｌのそれぞれになるように添加した。２時間後に培
養液をサンプリングし、得られた培養液中に含まれる菌
体を集めた。菌体をＴＣＡ沈澱処理して全タンパク質画
分を得た。得られた全タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ解析を行なった。その結果を図４に示す。

【００６６】図４に示すように、ｐＡＲ５／ｄｓｂＣ、
ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤを用いた場合、ＤｓｂＣに相
当すると推定される分子量約２４０００のバンドがアラ
ビノース濃度に応じて顕著に増加することが確認され
た。

【００６７】その他のＤｓｂ産物に関しては、相当する
バンドの検出ができなかったが、ｄｓｂＡ、ｄｓｂＢお
よびｄｓｂＤの各欠損株の表現型に対する機能の相補能
の有無により、それぞれのＤｓｂファミリータンパク質
の発現を確認した。その結果、各Ｄｓｂ欠損株に対し
て、それぞれのＤｓｂファミリータンパク質の機能が相
補されていることが確認できた。

【００６８】実施例４外来タンパク質分泌発現用プラ
スミドｐＴｒｃ−ＯｍｐＡおよびｐＴｒｃ−ＯｍｐＴの
構築大腸菌発現プラスミドｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ（Ｍｕ
ｎｇＢｅａｎＮｕｃｌｅａｓｅで平滑化）−Ｅｃｏ
ＲＩ部位に、下記に示すＯｍｐＡまたはＯｍｐＴのシグ
ナルペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチド
（５’末端：平滑末端、３’末端：ＮａｅＩ、ＥｃｏＲ
Ｉサイト) を挿入したものをそれぞれｐＴｒｃ−Ｏｍｐ
ＡおよびｐＴｒｃ−ＯｍｐＴとした。

【００６９】ＯｍｐＡシグナル配列〔ＭＫＫＴＡＩＡＩ
ＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＮＡ、（配列番号：１９）〕を
コードするオリゴヌクレオチド：５’−ＡＴＧＡＡＡＡ
ＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣ
ＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧ
ＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＧＡＡＴＴＣ−３’ （配列番
号：２０）ＯｍｐＴシグナル配列〔ＭＲＡＫＬＬＧＩＶＬＴＴＰＩ
ＡＩＳＳＦＡ、（配列番号：２１）〕をコードするオリ
ゴヌクレオチド：５’−ＡＴＧＣＧＣＧＣＧＡＡＡＣＴ
ＧＣＴＧＧＧＴＡＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＧＡＣＣＣＣＧ
ＡＴＣＧＣＧＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣＴ
ＧＡＡＴＴＣ−３’ （配列番号：２２）

【００７０】実施例５ＮＧＦ−β分泌発現プラスミド
の構築ヒト神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）のＮ末端シグナル
配列部分を欠くアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（Ｒ
＆Ｄシステムズ社）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を実
施例４で得られたｐＴｒｃ−ＯｍｐＴのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ部位へ挿入した。ついで、得られたプラスミド
のＮａｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位へ、下記に示すＮＧＦのＮ
末端部分に相当する合成オリゴヌクレオチドリンカー
（平滑末端−ＥｃｏＲＩ部位）をポリヌクレオチドキナ
ーゼ処理した後に挿入し、ＮＧＦ−β分泌発現プラスミ
ドｐＴｒｃ−ＯｍｐＴ／ＮＧＦを得た。

【００７１】ＮＧＦリンカー：５’−ＡＧＣＡＧＣＴＣ
ＣＣＡＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＣＧＡＡ
ＴＴＣ−３’ （配列番号：２３）

【００７２】実施例６ＨＲＰ分泌発現プラスミドの構
築西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のｃＤＮＡ（Ｒ
＆Ｄシステムズ社）を鋳型に用い、構造遺伝子に相当す
る領域をＰＣＲ法により増幅し、得られた断片をＢａｍ
ＨＩ、ポリヌクレオチドキナーゼ処理したのちｐＴｒｃ
−ＯｍｐＡのＮａｅＩ−ＢａｍＨＩ部位へ挿入し、ＨＲ
Ｐ分泌発現プラスミドｐＴｒｃ−ＯｍｐＡ／ＨＲＰを得
た。ＰＣＲ法に用いたプライマーを下記に示す。

【００７３】プライマー：ＨＲＰ−Ｆ：５’−ＡＴＧＣＡＧＴＴＡＡＣＣＣＣＴＡ
ＣＡＴＴＣ−３’ （配列番号：２４）ＨＲＰ−Ｒ：５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴ
ＴＡＴＴＡ−３’ （配列番号：２５）

【００７４】実施例７ペリプラズムにおける外来タン
パク質発現へのＤｓｂＡＢＣＤの増強効果実施例５または６で得られたＮＧＦ−β分泌発現プラス
ミドまたはＨＲＰ分泌発現プラスミドとｐＡＲ５／ｄｓ
ｂＡＢＣＤを共発現させた菌体について、それぞれＤｓ
ｂＡＢＣＤの効果（菌体の生育への影響、産物の発現量
・局在性の変動) を調べた。Ｌ培地中、３７℃で生育さ
せた各菌体についてＤｓｂＡＢＣＤをアラビノース添加
（０〜２０００μｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ−βまたはＨＲＰ
をＩＰＴＧ（５０μＭ）添加によりそれぞれ誘導して、
蓄積したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタ
ンブロット法により解析した。なお、全タンパク質画分
は、実施例３と同様にして得た。また、ペリプラズム可
溶性画分は、等張のショ糖存在下に菌体をリゾチーム処
理する方法〔Koshland,D. and Botstein, D, Cell,20,
749-760,(1980) 〕によって得た。

【００７５】（１）ＮＧＦ発現に対する効果ｐＴｒｃ−ＯｍｐＴ／ＮＧＦとベクターのみのｐＡＣＹ
Ｃ１８４とを共存させた場合、アラビノース濃度を２０
０μｇ／ｍｌまで変化させても、菌の生育の阻害は見ら
れなかったが、２０００μｇ／ｍｌにすると菌の生育が
抑制される傾向があった。一方、ｐＴｒｃ−ＯｍｐＴ／
ＮＧＦとｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤとを共存させた場合
においては、菌の生育抑制は全く起こらず、アラビノー
ス濃度の上昇に伴い、最高約１０％程度生育速度の上昇
が見られた。

【００７６】次に、アラビノース濃度を変えたときのＮ
ＧＦ−βの全タンパク質中の発現量、あるいはペリプラ
ズム可溶性画分中に蓄積するＮＧＦ−βの量を調べるた
め、全タンパク質およびペリプラズム可溶性画分につい
て、それぞれＫｌｅｔｔｕｎｉｔｓ８０の培養液８
０μｌ相当の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を図
５に示す。

【００７７】図５に示すように、対照としてｐＴｒｃ−
ＯｍｐＴ／ＮＧＦとベクターｐＡＣＹＣ１８４とを共存
させた場合、アラビノース濃度を０〜２００μｇ／ｍｌ
に変化させてもＯｍｐＴ−ＮＧＦ−βの全タンパク質中
の発現量およびペリプラズム可溶性画分中の量共にほと
んど変化はなかったが、２０００μｇ／ｍｌではＯｍｐ
Ｔ−ＮＧＦ−β産物の発現量は著しく低下していた。ｐ
Ｔｒｃ−ＯｍｐＴ／ＮＧＦとｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤ
との共存下におけるＯｍｐＴ−ＮＧＦ−βの全発現量は
アラビノース濃度を０〜２０００μｇ／ｍｌの間で変化
させてもほとんど変化はなかった（およそ１〜２ｍｇ／
ｌ培養液）が、ペリプラズム可溶性画分におけるＯｍｐ
Ｔ−ＮＧＦ−βの量はアラビノース濃度の上昇に伴い増
大する傾向が見られ、発現したＯｍｐＴ−ＮＧＦ−βの
ほとんどがペリプラズム可溶性画分に検出されるように
なった。

【００７８】（２）ＨＲＰ発現に対する効果ＨＲＰ発現における、菌の生育をＫｌｅｔｔｕｎｉｔ
ｓにより調べた結果を図６に示す。また、アラビノース
濃度を変えたときのＨＲＰの全タンパク質中の発現量、
あるいはペリプラズム可溶性画分中に蓄積するＨＲＰ量
を調べるため、全タンパク質およびペリプラズム可溶性
画分をそれぞれＫｌｅｔｔｕｎｉｔｓ８０の培養液６
０μｌ相当の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を図
７に示す。

【００７９】図６に示すように、ｐＴｒｃ−ＯｍｐＡ／
ＨＲＰとｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤとを共存させた場
合、アラビノースを添加しない場合にはＩＰＴＧ添加約
２時間後には菌の生育が停止し、顕著な菌の生育阻害が
見られたが、アラビノースを添加した場合（最終濃度：
２００μｇ／ｍｌ）には、菌の生育阻害は解消され、Ｉ
ＰＴＧ添加４時間後においても菌の生育が停止すること
はなかった。ｐＴｒｃ−ＯｍｐＡ／ＨＲＰとベクターの
みのｐＡＲ３とを共存させた場合、菌の生育阻害は全く
改善されなかった。これらの結果より、ＯｍｐＡ−ＨＲ
Ｐ発現時の生育阻害解消は、ＤｓｂＡＢＣＤ発現に依存
することを示唆される。

【００８０】また、図７に示すように、ｐＴｒｃ−Ｏｍ
ｐＡ／ＨＲＰとｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤとを共存させ
た場合、ＯｍｐＡ−ＨＲＰの全タンパク質中の発現量
は、ｐＴｒｃ−ＯｍｐＡ／ＨＲＰとベクターのみのｐＡ
Ｒ３とを共存させた場合に比べ、約２〜３倍増加し、ペ
リプラズム可溶性画分中の発現量もｐＴｒｃ−ＯｍｐＡ
／ＨＲＰとｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤを共存させた場合
には、アラビノース濃度に応じ上昇した。

【００８１】実施例８誘導時間を延長したときのＨＲ
Ｐ産物の発現量、局在性の変動発現産物の量および局在性のタイムコースを調べるため
に、ｐＴｒｃ−ＯｍｐＡ／ＨＲＰとｐＡＲ５／ｄｓｂＡ
ＢＣＤとを共存させ、実施例６と同様にＯｍｐ−ＨＲＰ
およびＤｓｂＡＢＣＤを、ＩＰＴＧ添加により、誘導
し、共発現させた。なお、対照として、ｐＴｒｃ−Ｏｍ
ｐＡ／ＨＲＰとベクターのみのｐＡＲ３とを共存させた
系を用いた。ＩＰＴＧ添加後、０、３０、８５、１５
０、２４０分経過後に培養液のサンプリングを行ない、
培養液中に含まれるＯｍｐＡ−ＨＲＰ量の変動、および
局在性（全タンパク質、ペリプラズム可溶性画分、スフ
ェロプラスト画分）を調べた。なお、全タンパク質およ
びペリプラズム可溶性画分は、前記実施例３および７と
同様にして得た。また、スフェロプラスト画分はリゾチ
ーム法によりペリプラズム可溶性画分を抽出した残りの
画分として得た。全タンパク質、ペリプラズム可溶性画
分およびスフェロプラスト画分をそれぞれＫｌｅｔｔ
ｕｎｉｔｓ８０の培養液６０μｌ相当の試料をＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に供し、相対
的なＯｍｐＡ−ＨＲＰ発現量を測定した。結果を図８お
よび９に示す。なお、図８において、Ｗは全タンパク質
画分、Ｐはペリプラズム可溶性画分、Ｓはスフェロプラ
スト画分を示す。

【００８２】図８の結果より、ＯｍｐＡ−ＨＲＰとＤｓ
ｂＡＢＣＤとを共発現させた系では、ＩＰＴＧ添加約３
０分後にＯｍｐＡ−ＨＲＰの蓄積が始まり、１５０分後
には最大に達することが示される。この発現量ではＣＢ
Ｂ染色によってもＨＲＰを確認することができた。ま
た、図９の結果より、全発現ＨＲＰに示すペリプラズム
可溶性画分のＨＲＰの量は、８５分後では約１０％程度
であったが、驚くべきことに、２４０分後には約６０％
まで上昇することが示される。対照的に、ｐＴｒｃ−Ｏ
ｍｐＡ／ＨＲＰとベクターのみのｐＡＲ３とを共存させ
た系では、図９の結果より、ＩＰＴＧ添加から１５０分
後（対数増殖期から定常期への移行期）において、よう
やくＯｍｐＡ−ＨＲＰの蓄積が始まるが、ペリプラズム
への蓄積はほとんど起こらず、全発現量の３％程度であ
ることが示される。また、図６の結果より、この時、Ｏ
ｍｐＡ−ＨＲＰ発現に伴い生育阻害が生じ、生育が停止
することが示される。

【００８３】配列表フリーテキスト配列表の配列番号：１８中、塩基配列の５〜６０位の領
域において２本鎖を形成している。

【００８４】

【発明の効果】本発明により、ペリプラズムでの正確な
ジスルフィド結合形成が効率よく行なわれるため、効率
よく可溶性の発現産物を得ることができるという優れた
効果が奏される。

【００８５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> HSP Reseach Institute, Inc. <120> DsbA/DsbB/DsbC/DsbD expression plasmids <130> HSP-10-004 <160> 25

【００８６】 <210> 1 <211> 208 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe 5 10 15 Ser Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr 20 25 30 Leu Glu Lys Pro Val Ala Gly Ala Pro Gln Val Leu Glu Phe Phe 35 40 45 Ser Phe Phe Cys Pro His Cys Tyr Gln Phe Glu Glu Val Leu His 50 55 60 Ile Ser Asp Asn Val Lys Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met 65 70 75 Thr Lys Tyr His Val Asn Phe Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Glu 80 85 90 Leu Thr Gln Ala Trp Ala Val Ala Met Ala Leu Gly Val Glu Asp 95 100 105 Lys Val Thr Val Pro Leu Phe Glu Gly Val Gln Lys Thr Gln Thr 110 115 120 Ile Arg Ser Ala Ser Asp Ile Arg Asp Val Phe Ile Asn Ala Gly 125 130 135 Ile Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Ala Trp Asn Ser Phe Val Val 140 145 150 Lys Ser Leu Val Ala Gln Gln Glu Lys Ala Ala Ala Asp Val Gln 155 160 165 Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly Lys Tyr Gln Leu 170 175 180 Asn Pro Gln Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Asp Val Phe Val Gln 185 190 195 Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys 200 205

【００８７】 <210> 2 <211> 647 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atcggagaga gtagatcatg aaaaagattt ggctggcgct ggctggttta gttttagcgt 60 ttagcgcatc ggcggcgcag tatgaagatg gtaaacagta cactaccctg gaaaaaccag 120 ttgctggcgc gccgcaagtg ctggagtttt tctctttctt ctgcccgcac tgctatcagt 180 ttgaagaagt tctgcatatt tctgataacg tgaagaaaaa actgccggaa ggcgtgaaga 240 tgactaaata ccacgtcaac ttcatggggg gtgacctggg caaagagctg actcaggcat 300 gggctgtggc gatggcgctg ggcgtggaag acaaagtcac agttccgctg tttgaaggcg 360 tacaaaaaac ccagaccatt cgttcagcat ctgatatccg cgatgtattt atcaacgcag 420 gtattaaagg tgaagagtac gacgcggcgt ggaacagctt cgtggtgaaa tctctggtcg 480 ctcagcagga aaaagctgca gctgacgtgc aattgcgtgg tgttccggcg atgtttgtta 540 acggtaaata tcagctgaat ccgcagggta tggataccag caatatggat gtttttgttc 600 agcagtatgc tgatactgtg aaatatctgt ccgagaaaaa ataataa 647

【００８８】 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Leu Arg Phe Leu Asn Gln Cys Ser Gln Gly Arg Gly Ala Trp 5 10 15 Leu Leu Met Ala Phe Thr Ala Leu Ala Leu Glu Leu Thr Ala Leu 20 25 30 Trp Phe Gln His Val Met Leu Leu Lys Pro Cys Val Leu Cys Ile 35 40 45 Tyr Glu Arg Cys Ala Leu Phe Gly Val Leu Gly Ala Ala Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Ile Ala Pro Lys Thr Pro Leu Arg Tyr Val Ala Met Val 65 70 75 Ile Trp Leu Tyr Ser Ala Phe Arg Gly Val Gln Leu Thr Tyr Glu 80 85 90 His Thr Met Leu Gln Leu Tyr Pro Ser Pro Phe Ala Thr Cys Asp 95 100 105 Phe Met Val Arg Phe Pro Glu Trp Leu Pro Leu Asp Lys Trp Val 110 115 120 Pro Gln Val Phe Val Ala Ser Gly Asp Cys Ala Glu Arg Gln Trp 125 130 135 Asp Phe Leu Gly Leu Glu Met Pro Gln Trp Leu Leu Gly Ile Phe 140 145 150 Ile Ala Tyr Leu Ile Val Ala Val Leu Val Val Ile Ser Gln Pro 155 160 165 Phe Lys Ala Lys Lys Arg Asp Leu Phe Gly Arg 170 175

【００８９】 <210> 4 <211> 568 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 ctgcgcactc tatgcatatt gcagggaaat gattatgttg cgatttttga accaatgttc 60 acaaggccgg ggcgcgtggc tgttgatggc gtttactgct ctggcactgg aactgacggc 120 gctgtggttc cagcatgtga tgttactgaa accttgcgtg ctctgtattt atgaacgctg 180 cgcgttattc ggcgttctgg gtgctgcgct gattggcgcg atcgccccga aaactccgct 240 gcgttatgta gcgatggtta tctggttgta tagtgcgttc cgcggtgtgc agttaactta 300 cgagcacacc atgcttcagc tctatccttc gccgtttgcc acctgtgatt ttatggttcg 360 tttcccggaa tggctgccgc tggataagtg ggtgccgcaa gtgtttgtcg cctctggcga 420 ttgcgccgag cgtcagtggg attttttagg tctggaaatg ccgcagtggc tgctcggtat 480 ttttatcgct tacctgattg tcgcagtgct ggtggtgatt tcccagccgt ttaaagcgaa 540 aaaacgtgat ctgttcggtc gctaataa 568

【００９０】 <210> 5 <211> 236 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser 5 10 15 Gly Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala 20 25 30 Lys Met Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala 35 40 45 Gly Met Lys Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr 50 55 60 Asp Asp Gly Lys His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser 65 70 75 Gly Thr Ala Pro Val Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln 80 85 90 Leu Asn Ala Leu Glu Lys Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln 95 100 105 Glu Lys His Val Ile Thr Val Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr 110 115 120 Cys His Lys Leu His Glu Gln Met Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly 125 130 135 Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Gln Gly Leu Asp Ser 140 145 150 Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp Cys Ala Lys Asp Lys 155 160 165 Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys Ser Val Ala Pro 170 175 180 Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala Leu Gly Val 185 190 195 Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser Asn Gly 200 205 210 Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu Phe 215 220 225 Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys 230 235

【００９１】 <210> 6 <211> 720 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 ggaagattta tgaagaaagg ttttatgttg tttactttgt tagcggcgtt ttcaggcttt 60 gctcaggctg atgacgcggc aattcaacaa acgttagcca aaatgggcat caaaagcagc 120 gatattcagc ccgcgcctgt agctggcatg aagacagttc tgactaacag cggcgtgttg 180 tacatcaccg atgatggtaa acatatcatt caggggccaa tgtatgacgt tagtggcacg 240 gctccggtca atgtcaccaa taagatgctg ttaaagcagt tgaatgcgct tgaaaaagag 300 atgatcgttt ataaagcgcc gcaggaaaaa cacgtcatca ccgtgtttac tgatattacc 360 tgtggttact gccacaaact gcatgagcaa atggcagact acaacgcgct ggggatcacc 420 gtgcgttatc ttgctttccc gcgccagggg ctggacagcg atgcagagaa agaaatgaaa 480 gctatctggt gtgcgaaaga taaaaacaaa gcgtttgatg atgtgatggc aggtaaaagc 540 gtcgcaccag ccagttgcga cgtggatatt gccgaccatt acgcacttgg cgtccagctt 600 ggcgttagcg gtactccggc agttgtgctg agcaatggca cacttgttcc gggttaccag 660 ccgaaagaga tgaaagaatt cctcgacgaa caccaaaaaa tgaccagcgg taaataataa 720

【００９２】 <210> 7 <211> 489 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Met Gln Leu Pro Gln Gly Val Trp His Glu Asp Glu Phe Tyr Gly 5 10 15 Lys Ser Glu Ile Tyr Arg Asp Arg Leu Thr Leu Pro Val Thr Ile 20 25 30 Asn Gln Ala Ser Ala Gly Ala Thr Leu Thr Val Thr Tyr Gln Gly 35 40 45 Cys Ala Asp Ala Gly Phe Cys Tyr Pro Pro Glu Thr Lys Thr Val 50 55 60 Pro Leu Ser Glu Val Val Ala Asn Asn Ala Ala Pro Gln Pro Val 65 70 75 Ser Val Pro Gln Gln Glu Gln Pro Thr Ala Gln Leu Pro Phe Ser 80 85 90 Ala Leu Trp Ala Leu Leu Ile Gly Ile Gly Ile Ala Phe Thr Pro 95 100 105 Cys Val Leu Pro Met Tyr Pro Leu Ile Ser Gly Ile Val Leu Gly 110 115 120 Gly Lys Gln Arg Leu Ser Thr Ala Arg Ala Leu Leu Leu Thr Phe 125 130 135 Ile Tyr Val Gln Gly Met Ala Leu Thr Tyr Thr Ala Leu Gly Leu 140 145 150 Val Val Ala Ala Ala Gly Leu Gln Phe Gln Ala Ala Leu Gln His 155 160 165 Pro Tyr Val Leu Ile Gly Leu Ala Ile Val Phe Thr Leu Leu Ala 170 175 180 Met Ser Met Phe Gly Leu Phe Thr Leu Gln Leu Pro Ser Ser Leu 185 190 195 Gln Thr Arg Leu Thr Leu Met Ser Asn Arg Gln Gln Gly Gly Ser 200 205 210 Pro Gly Gly Val Phe Val Met Gly Ala Ile Ala Gly Leu Ile Cys 215 220 225 Ser Pro Cys Thr Thr Ala Pro Leu Ser Ala Ile Leu Leu Tyr Ile 230 235 240 Ala Gln Ser Gly Asn Met Trp Leu Gly Gly Gly Thr Leu Tyr Leu 245 250 255 Tyr Ala Leu Gly Met Gly Leu Pro Leu Met Leu Ile Thr Val Phe 260 265 270 Gly Asn Arg Leu Leu Pro Lys Ser Gly Pro Trp Met Glu Gln Val 275 280 285 Lys Thr Ala Phe Gly Phe Val Ile Leu Ala Leu Pro Val Phe Leu 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ile Gly Asp Val Trp Gly Leu Arg Leu Trp Ser 305 310 315 Ala Leu Gly Val Ala Phe Phe Gly Trp Ala Phe Ile Thr Ser Leu 320 325 330 Gln Ala Lys Arg Gly Trp Met Arg Ile Val Gln Ile Ile Leu Leu 335 340 345 Ala Ala Ala Leu Val Ser Val Arg Pro Leu Gln Asp Trp Ala Phe 350 355 360 Gly Ala Thr His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Leu Asn Phe Thr 365 370 375 Gln Ile Lys Thr Val Asp Glu Leu Asn Gln Ala Leu Val Glu Ala 380 385 390 Lys Gly Lys Pro Val Met Leu Asp Leu Tyr Ala Asp Trp Cys Val 395 400 405 Ala Cys Lys Glu Phe Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Asp Pro Gln Val 410 415 420 Gln Lys Ala Leu Ala Asp Thr Val Leu Leu Gln Ala Asn Val Thr 425 430 435 Ala Asn Asp Ala Gln Asp Val Ala Leu Leu Lys His Leu Asn Val 440 445 450 Leu Gly Leu Pro Thr Ile Leu Phe Phe Asp Gly Gln Gly Gln Glu 455 460 465 His Pro Gln Ala Arg Val Thr Gly Phe Met Asp Ala Glu Thr Phe 470 475 480 Ser Ala His Leu Arg Asp Arg Gln Pro 485

【００９３】 <210> 8 <211> 1474 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 cgtgcagctg ccgcaaggcg tctggcatga agatgagttt tacggcaaaa gcgagattta 60 ccgcgatcgg ctgacgcttc ccgtcaccat caaccaggcg agtgcgggag cgacgttaac 120 tgtcacctac cagggctgtg ctgatgccgg tttctgttat ccgccagaaa ccaaaaccgt 180 tccgttaagc gaagtggtcg ccaacaacgc agcgccacag cctgtgtctg ttccgcagca 240 agagcagccc accgcgcaat tgcccttttc cgcgctctgg gcgttgttga tcggtattgg 300 tatcgccttt acgccatgcg tgctgccaat gtacccactg atttctggca tcgtgctggg 360 tggtaaacag cggctctcca ctgccagagc attgttgctg acctttattt atgtgcaggg 420 gatggcgctg acctacacgg cgctgggtct ggtggttgcc gccgcagggt tacagttcca 480 ggcggcgcta cagcacccat acgtgctcat tggcctcgcc atcgtcttta ccttgctggc 540 gatgtcaatg tttggcttgt ttaccctgca actcccctct tcgctgcaaa cacgtctcac 600 gttgatgagc aatcgccaac agggcggctc acctggcggt gtgtttgtta tgggggcgat 660 tgccggactg atctgttcac catgcaccac cgcaccgctt agcgcgattc tgctgtatat 720 cgcccaaagc gggaacatgt ggctgggcgg cggcacgctt tatctctatg cgttgggcat 780 gggcctgccg ctgatgctaa ttaccgtctt tggtaaccgc ttgctgccga aaagcggccc 840 gtggatggaa caagtcaaaa ccgcgtttgg ttttgtgatc ctcgcactgc cggtcttcct 900 gctggagcga gtgattggtg atgtatgggg attacgcttg tggtcggcgc tgggtgtcgc 960 attctttggc tgggccttta tcaccagcct acaggctaaa cgcggctgga tgcgtattgt 1020 gcaaattatt ctgctggcag cggcattggt tagcgtgcgc ccacttcagg attgggcatt 1080 tggtgcgacg cataccgcgc aaactcagac gcatctcaac tttacacaaa tcaaaacggt 1140 agatgagtta aatcaggcgc tcgttgaagc caaaggcaaa ccggtgatgt tagatcttta 1200 tgccgactgg tgcgtcgcct gtaaagagtt tgagaaatac accttcagcg acccgcaggt 1260 gcaaaaagcg ttagcagaca cggtcttact tcaggccaac gtcacggcca acgacgcaca 1320 agatgtggcg ctgttaaagc atcttaatgt ccttggccta ccgacaattc tcttttttga 1380 cggacaaggc caggagcatc cacaagcacg cgtcacgggc tttatggatg ctgaaacctt 1440 cagcgcacat ttgcgcgatc gccaaccgtg ataa 1474

【００９４】 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 cggagctcat cggagagagt aga 23

【００９５】 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ggcccgggaa ttattatttt ttctcgga 28

【００９６】 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ggcccgggct gcgcactcta tgcatattgc aggg 34

【００９７】 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 ggcatatgga ttattagcga ccgaacagat cacg 34

【００９８】 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ggcatatgag gaggaagatt tatgaagaaa gg 32

【００９９】 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 ccgtcgacga ttattattta ccgctggtca ttttttggtg ttcg 44

【０１００】 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 ccgtcgacga ggccgacatg cagctgccgc aaggcgtctg gc 42

【０１０１】 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ccgcatgctt atcacggttg gcgatcgcgc 30

【０１０２】 <210> 17 <211> 3457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gagctcatcg gagagagtag atcatgaaaa agatttggct ggcgctggct ggtttagttt 60 tagcgtttag cgcatcggcg gcgcagtatg aagatggtaa acagtacact accctggaaa 120 aaccagttgc tggcgcgccg caagtgctgg agtttttctc tttcttctgc ccgcactgct 180 atcagtttga agaagttctg catatttctg ataacgtgaa gaaaaaactg ccggaaggcg 240 tgaagatgac taaataccac gtcaacttca tggggggtga cctgggcaaa gagctgactc 300 aggcatgggc tgtggcgatg gcgctgggcg tggaagacaa agtcacagtt ccgctgtttg 360 aaggcgtaca aaaaacccag accattcgtt cagcatctga tatccgcgat gtatttatca 420 acgcaggtat taaaggtgaa gagtacgacg cggcgtggaa cagcttcgtg gtgaaatctc 480 tggtcgctca gcaggaaaaa gctgcagctg acgtgcaatt gcgtggtgtt ccggcgatgt 540 ttgttaacgg taaatatcag ctgaatccgc agggtatgga taccagcaat atggatgttt 600 ttgttcagca gtatgctgat actgtgaaat atctgtccga gaaaaaataa taattcccgg 660 gctgcgcact ctatgcatat tgcagggaaa tgattatgtt gcgatttttg aaccaatgtt 720 cacaaggccg gggcgcgtgg ctgttgatgg cgtttactgc tctggcactg gaactgacgg 780 cgctgtggtt ccagcatgtg atgttactga aaccttgcgt gctctgtatt tatgaacgct 840 gcgcgttatt cggcgttctg ggtgctgcgc tgattggcgc gatcgccccg aaaactccgc 900 tgcgttatgt agcgatggtt atctggttgt atagtgcgtt ccgcggtgtg cagttaactt 960 acgagcacac catgcttcag ctctatcctt cgccgtttgc cacctgtgat tttatggttc 1020 gtttcccgga atggctgccg ctggataagt gggtgccgca agtgtttgtc gcctctggcg 1080 attgcgccga gcgtcagtgg gattttttag gtctggaaat gccgcagtgg ctgctcggta 1140 tttttatcgc ttacctgatt gtcgcagtgc tggtggtgat ttcccagccg tttaaagcga 1200 aaaaacgtga tctgttcggt cgctaataat ccatatgagg aggaagattt atgaagaaag 1260 gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct gatgacgcgg 1320 caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag cccgcgcctg 1380 tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc gatgatggta 1440 aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc aatgtcacca 1500 ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt tataaagcgc 1560 cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac tgccacaaac 1620 tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat cttgctttcc 1680 cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg tgtgcgaaag 1740 ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca gccagttgcg 1800 acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc ggtactccgg 1860 cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgaaagag atgaaagaat 1920 tcctcgacga acaccaaaaa atgaccagcg gtaaataata atcgtcgacg aggccgacat 1980 gcagctgccg caaggcgtct ggcatgaaga tgagttttac ggcaaaagcg agatttaccg 2040 cgatcggctg acgcttcccg tcaccatcaa ccaggcgagt gcgggagcga cgttaactgt 2100 cacctaccag ggctgtgctg atgccggttt ctgttatccg ccagaaacca aaaccgttcc 2160 gttaagcgaa gtggtcgcca acaacgcagc gccacagcct gtgtctgttc cgcagcaaga 2220 gcagcccacc gcgcaattgc ccttttccgc gctctgggcg ttgttgatcg gtattggtat 2280 cgcctttacg ccatgcgtgc tgccaatgta cccactgatt tctggcatcg tgctgggtgg 2340 taaacagcgg ctctccactg ccagagcatt gttgctgacc tttatttatg tgcaggggat 2400 ggcgctgacc tacacggcgc tgggtctggt ggttgccgcc gcagggttac agttccaggc 2460 ggcgctacag cacccatacg tgctcattgg cctcgccatc gtctttacct tgctggcgat 2520 gtcaatgttt ggcttgttta ccctgcaact cccctcttcg ctgcaaacac gtctcacgtt 2580 gatgagcaat cgccaacagg gcggctcacc tggcggtgtg tttgttatgg gggcgattgc 2640 cggactgatc tgttcaccat gcaccaccgc accgcttagc gcgattctgc tgtatatcgc 2700 ccaaagcggg aacatgtggc tgggcggcgg cacgctttat ctctatgcgt tgggcatggg 2760 cctgccgctg atgctaatta ccgtctttgg taaccgcttg ctgccgaaaa gcggcccgtg 2820 gatggaacaa gtcaaaaccg cgtttggttt tgtgatcctc gcactgccgg tcttcctgct 2880 ggagcgagtg attggtgatg tatggggatt acgcttgtgg tcggcgctgg gtgtcgcatt 2940 ctttggctgg gcctttatca ccagcctaca ggctaaacgc ggctggatgc gtattgtgca 3000 aattattctg ctggcagcgg cattggttag cgtgcgccca cttcaggatt gggcatttgg 3060 tgcgacgcat accgcgcaaa ctcagacgca tctcaacttt acacaaatca aaacggtaga 3120 tgagttaaat caggcgctcg ttgaagccaa aggcaaaccg gtgatgttag atctttatgc 3180 cgactggtgc gtcgcctgta aagagtttga gaaatacacc ttcagcgacc cgcaggtgca 3240 aaaagcgtta gcagacacgg tcttacttca ggccaacgtc acggccaacg acgcacaaga 3300 tgtggcgctg ttaaagcatc ttaatgtcct tggcctaccg acaattctct tttttgacgg 3360 acaaggccag gagcatccac aagcacgcgt cacgggcttt atggatgctg aaaccttcag 3420 cgcacatttg cgcgatcgcc aaccgtgata agcatgc 3457

【０１０３】 <210> 18 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Duplex is formed in the region from position 5 to 60 of the base s equence. <400> 18 agctcgcgaa gcttgcatgc tgcagtcgac atatgcccgg gtaccgagct cgcggccgca 60 tgca 64

【０１０４】 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 19 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ala Thr Val Ala Asn Ala 20

【０１０５】 <210> 20 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60 gccggctgaa ttc 73

【０１０６】 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 21 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Ser Phe Ala 20

【０１０７】 <210> 22 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 atgcgcgcga aactgctggg tattgtcctg acgaccccga tcgcgatcag ctcttttgcc 60 ggctgaattc 70

【０１０８】 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 agcagctccc atccgatctt ccaccgcggc gaattc 36

【０１０９】 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 atgcagttaa cccctacatt c 21

【０１１０】 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 ggggaattcg gatccttatt a 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＡ、ｐＴ７Ｂ／ｄｓ
ｂＢ、ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＣ、ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＤおよび
ｐＴ７Ｂ／ｄｓｂＡＢＣＤを示す図である。

【図２】図２は、発現ベクターの構築の概略図である。

【図３】図３は、ｐＡＲ５／ｄｓｂＡ、ｐＡＲ５／ｄｓ
ｂＢ、ｐＡＲ５／ｄｓｂＣ、ｐＡＲ５／ｄｓｂＤおよび
ｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤの発現ベクターを示す図であ
る。

【図４】図４は、Ｄｓｂファミリータンパク質発現のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。

【図５】図５は、アラビノース濃度を変えたときのＮＧ
Ｆ−βの全発現量、あるいは各分画に蓄積する産物量の
変動を示す図である。

【図６】図６は、ＨＲＰ発現における、菌の生育を示す
図である。

【図７】図７は、アラビノース濃度を変えたときのＨＲ
Ｐの全発現量、あるいは各分画に蓄積する産物量の変動
を示す図である。

【図８】図８は、ＩＰＴＧ添加後、０、３０、８５、１
５０、２４０分経過後のＯｍｐＡ−ＨＲＰ量の変動、お
よび局在性（全タンパク質、ペリプラズム可溶性画分、
スフェロプラスト画分）を示す図である。

【図９】図９は、図８の結果より測定された、相対的な
ＯｍｐＡ−ＨＲＰ発現量を示す図である。上図は対照の
結果を示す図であり、下図はｐＡＲ５／ｄｓｂＡＢＣＤ
を用いた結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA07 BA08 BA21 CA04 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG01 AG02 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AB01 AC10 AC14 AC20 BA02 BB15 CA24 CA28 CA44 4H045 AA20 BA10 BA32 CA30 CA40 DA01 DA21 DA89 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤ
ｓｂＤをコードする人工オペロン。
【請求項２】誘導可能なプロモーターを含む、請求項
１記載の人工オペロン。
【請求項３】誘導可能なプロモーターが、ｌａｃ、ｔ
ａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａ、Ｐｚｔ−１およびＴ７
からなる群より選ばれた、請求項２記載の人工オペロ
ン。
【請求項４】請求項１〜３いずれか記載のオペロンを
有し、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤｓｂＤを
発現する、発現プラスミド。
【請求項５】請求項４記載の発現プラスミドと外来タ
ンパク質発現ベクターとを含有してなる共形質転換体。
【請求項６】宿主として、大腸菌プロテアーゼ変異株
を用いる、請求項５記載の共形質転換体。
【請求項７】外来タンパク質が、インターフェロン、
インターロイキン、インターロイキン受容体、インター
ロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因子、顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ
コロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチ
ン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、
成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成長因
子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トラン
スフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因
子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経栄
養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフ
ィン、血管新生阻害因子、プロウロキナーゼ、組織プラ
スミノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテイ
ンＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドディ
スムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモ
シン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒビ
ター、リポコルチン、レプチン、免疫グロブリン、単鎖
抗体、補体成分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低酸
素誘導性ストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、プ
ロトオンコジーン産物、転写調節因子およびウイルス構
成タンパク質からなる群より選ばれた請求項５または請
求項６に記載の共形質転換体。
【請求項８】請求項５〜７いずれか記載の共形質転換
体を用いることを特徴とする、外来タンパク質の発現方
法。
【請求項９】ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣおよびＤ
ｓｂＤの発現量が外来タンパク質の可溶化に適した量と
なる誘導条件下で共形質転換体の培養を行なう、請求項
８記載の製造方法。