JPH09510611A - ポリペプチドの分泌促進 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＮＧＦポリペプチドの分泌効率を改善するのに有用なシグナルペプチド配列及び該配列をコードする核酸を提供する。Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドの製造方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドの分泌促進発明の分野 本発明は、ある種のポリペプチドの分泌を高めるのに有用な新規なシグナルペ プチド配列及び核酸配列に関する。本発明は更に、細菌細胞に由来する上記ポリ ペプチドの分泌効率を増すための方法に関する。 背景ポリペプチドの直接発現 医薬的に重要な多数のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術を用いて細菌のような 原核細胞で製造されている。（しばしばヒト組織から得られる）ポリペプチドを コードするＤＮＡが「宿主」細胞内に挿入され、そこで発現され、即ち細胞質内 でＤＮＡからポリペプチドに翻訳される。次いで、ポリペプチドが宿主細胞から 精製される。この手順はしばしば、ポリペプチドの「直接」発現と呼ばれている 。 ポリペプチドの直接発現はポリペプチドの製造方法としてはしばしば最も好都 合なものであるが、この方法に関連して問題が生じ得る。 例えば、ポリペプチドは宿主細胞内で合成されて蓄積し始めるので、ポリペプ チドは宿主細胞にとって有毒となり、 宿主細胞を死滅させ得る。更には、細胞内プロテアーゼが合成されると、ポリペ プチド分子を急速に分解し得る。更には、ポリペプチドの細胞内濃度が増すと、 宿主細胞機構は、宿主細胞が指令するポリペプチド合成終結により「フィードバ ック機構」を介して製造を停止させ得る。他の一つの可能性は、合成後に細胞質 内に残存するポリペプチドがアセチル化のような翻訳後修飾に付され得るという ことである。ポリペプチドの分泌 ポリペプチドの直接発現に関連する問題を克服するために、ポリペプチドの他 の発現方法が開発された。このような「間接発現」と称する方法では、ポリペプ チドが産生すると宿主細胞から分泌させることができる。この方法はポリペプチ ドの「分泌」又は「プロセシング」とも呼ばれる。分泌後、ポリペプチドは培地 から単離され得るか又はグラム陰性細菌の宿主細胞の場合は内側細胞膜と外側細 胞膜との間の区域であるペリプラスム間隙又は「ペリプラスム」から単離され得 る。従って、分泌を使用すれば、ポリペプチドの細胞内蓄積に関連する問題を軽 減するのに役立ち得る。 細菌細胞（又は他の細胞）によって天然に産生される数種のポリペプチドは、 該細胞から細胞外環境（又はグラム陰性細菌の場合はペリプラスム内）に分泌さ れる。ポリペプチドの細菌細胞からの分泌は、分泌させるべきポリペプチドを同 定しかつ分泌プロセスでポリペプチドを助けるシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ）タンパク質（Ｚｈｕ等，Ｐｈａｒｍ． Ｔｅｃｈ．， １９９３年４月，ペー ジ２８−３８；Ｓｉｍｏｎｅｎ等，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５７： １０９−１３７［１９９３］）として公知の数種の細胞内タンパク質の組織化（ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｏｎ）に関連するように思われる。 分泌ポリペプチドは通常以下の構造を有する：該ポリペプチドは（リーダーペ プチド、リーダー配列又はシグナル配列としても公知の）シグナルペプチドをア ミノ酸配列の一部分として含んでいる。シグナルペプチドは通常比較的小さなペ プチドであり、一般に翻訳中にポリペプチドのアミノ末端部分として合成される 。シグナルペプチドが結合したポリペプチドは「前駆体ポリペプチド」又は「未 成熟形態のポリペプチド」と呼ばれることもある。シグナルペプチドは細胞膜を 横断する全長ポリペプチドを指令する。 ポリペプチドの分泌過程でシグナルペプチドは切断される。その結果、細胞膜（ 又はグラム陰性細菌の場合は内側細胞膜、これについては以下で説明する）を横 断して「成熟」形態のポリペプチドだけが分泌される。シグナルペプチドは切断 されるので、成熟ポリペプチドは通常、前駆体ポリペプチドに比べて分子量が小 さい。 分泌される予定の大半の天然ポリペプチドをコードする核酸配列又は遺伝子は 、前駆体ポリペプチドのＤＮＡ配列を含んでおり、即ち遺伝子の５’末端はシグ ナルペプチドをコードする配列を含み、シグナル配列ＤＮＡの３’末端は、成熟 形態のポリペプチドをコードする配列の５’末端に結合している。従って、翻訳 中に、前駆体ポリペプチドはポリペプチドのアミノ末端にシグナル配列を含む単 一ユニットとして合成される。現在では多数の原核細胞シグナルペプチドが同定 されている（例えば、Ｇｅｎｎｉｔｙ等，Ｊ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｂｉｏｍ ｅｍｂ．， ２２：２３３−２６９［１９９０］を参照されたい）。 シグナルペプチドはしばしば、ある構造的特徴を共有している。例えば、原核 細胞源のシグナルペプチドの多くは約２０−３０アミノ酸長である。更には、シ グナルペプチ ドのアミノ末端は通常正電荷であり、シグナルペプチドの中心部分は通常疎水性 である（Ｐｕｇｓｌｅｙ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， ５７：５０−１ ０８［１９９３］）。このような類似性にもかかわらず、大腸菌のような数種の 原核生物で現在同定されている各分泌ポリペプチドは独特のシグナルペプチド配 列を有する。更には、全ての種類の細胞が全てのシグナルペプチド配列を「認識 する」わけではなく、従ってこの配列をプロセシングする能力を有するわけでは ない。特定のシグナルペプチドが認識され、従ってある種の原核細胞の細胞膜を 横断するポリペプチドを指令し得るが、真核細胞においては機能しない。 通常原核細胞によって分泌されないポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用い て分泌が起こるように遺伝子操作され得る。これは、ポリペプチドをコードする ＤＮＡの５’末端にシグナルペプチドをコードする天然又は合成ＤＮＡ配列が結 合している核酸構築物を生成することによって達成され得る。分泌のために選択 されるシグナルペプチド配列は、上記構築物を挿入して発現すべきである宿主細 胞によって認識され、従って該宿主細胞によってプロセシングされ得るものでな ければならない。従って、例えば天然に 分泌された細菌ポリペプチドから得られたシグナルペプチドをヒト組織のような 起源に由来するポリペプチドに結合して、ハイブリッド前駆体ポリペプチドを生 成することができる。該ポリペプチドは、シグナルペプチドを認識してプロセシ ングし得る上記細菌（及び他の原核）細胞種で合成されかつ該細胞種から分泌さ れ得る。ハイブリッド構築物を宿主細胞内に導入することができ、そうすると宿 主細胞はポリペプチドの製造及び分泌能力を有し得る。 （ポリペプチドが細胞から分泌されるかどうかは別として）、幾つかの因子が 、細菌細胞によって産生されるポリペプチドの実際の量を決定する。培養条件（ Ｊａｃｑｕｅｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２６：５９７−６０８ ［１９９２］）、翻訳開始速度（Ｇｏｌｄ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．， ５７：１９９−２３３［１９８８］）、及び（少なくとも一部は細胞 内プロテアーゼによる）細胞内でのポリペプチド分解速度のような因子も分泌さ れるポリペプチドの速度や量に影響するように思える。更には、成熟ポリペプチ ドのアミノ末端に存在するアミノ酸残基の種類が分泌に影響するように思われ、 上記残基の幾つかが正電荷の場合、分泌は低下するよ うに思えることが知見されている（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８８：９７５１−９７５４［１９９１］ ）。「Ｍｅｔを欠いた（Ｍｅｔ−ｌｅｓｓ）」ポリペプチド 細菌のような原核細胞では、組換えＤＮＡ技術を用いて、治療に有用なヒトポ リペプチドが多数製造されている。 組換えＤＮＡ技術を用いて原核細胞で製造された異種ポリペプチド（例えばヒ トポリペプチド）は常に天然形態のポリペプチドと同一というわけではない。こ の２種の形態の化学構造は僅かに異なり得る。例えば、組換えＤＮＡ技術を用い て細菌宿主細胞で製造された多数のヒトポリペプチドはアミノ末端にアミノ酸メ チオニン「Ｍｅｔ」（「アミノ末端Ｍｅｔ」）を有する。アミノ末端Ｍｅｔは通 常、ポリペプチドが天然に合成されるヒト細胞から、ポリペプチドが天然に検出 される血流又は他の細胞外体液中へのポリペプチドの分泌中に除去されるので、 天然形態のこれらの同一のヒトポリペプチドはアミノ末端Ｍｅｔを含まないこと がある。 ヒトポリペプチドが原核細胞で合成される場合、アミノ末端メチオニンは宿主 細胞細胞質メチオニンアミノ−ペプ チダーゼによって除去され得るが、ポリペプチドが宿主細胞で過発現される場合 、この除去又は切断が完璧であることはめったにない。ＮＧＦポリペプチド ＮＧＦ（神経成長因子）ファミリーのポリペプチド、即ち「ＮＧＦポリペプチ ド」は、神経系の多数の細胞や組織、及び神経系の成分の刺激を受ける組織で検 出される構造的及び機能的に関連する神経栄養因子群である。現在、ＮＧＦポリ ペプチドファミリーには、ポリペプチドＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＧ Ｆ（神経成長因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＮＴ−４（ニュー ロトロフィン−４；１９９３年１２月２３日公開のＰＣＴ ９３／２５６８４号 ；１９９２年４月２日公開のＰＣＴ ９２／０５２５４号；Ｈａｌｌｂｏｏｋ等 ， Ｎｅｕｒｏｎ，６：８４５−８５８［１９９１］に記載）及びＮＴ−５が含 まれる。これらのポリペプチドはあらゆる種類の神経細胞の成長、生存及び／又 は分化に機能することが実証されている。 ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＧＦ及びＮＴ−４は有意なアミノ酸配列の相同性を示 す。ＢＤＮＦ及びＮＧＦはアミノ酸 レベルでは約５５％相同で、ＮＴ−３はＢＤＮＦと約５８％、ＮＧＦとは約５７ ％相同である(Ｎａｒｈｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８：１３３ ０９−１７［１９９３］)。ＮＴ−４は成熟ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３とア ミノ酸配列レベルでそれぞれ約４６％、５５％及び５２％相同である（１９９２ 年４月２日公開のＰＣＴ ９２／０５２５４号；Ｈａｌｌｂｏｏｋ等， Ｎｅｕ ｒｏｎ，６：８４５−８５８［１９９１］も参照されたい）。ＮＧＦポリペプチ ドは数個のシステイン残基を含んでおり、これらのシステインの領域のアミノ酸 配列は比較的保存されている（Ｎａｒｈｉ等，上掲）。 ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４及びＢＤＮＦはそれぞれ神経系維持の役割を果た すために、生物学的に活性な形態で調製されると、様々な神経系の疾患や障害の 治療法として有用であると予想される。このような疾患としては、（外傷、外科 手術、感染、毒素暴露及び／又は栄養不良による）神経系の損傷、種々の神経障 害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、 ハンチントン舞踏病、家族性外振戦等が挙げられる。関連技術 １９９３年８月１０日付けで発行された米国特許第５，２３５，０４３号は、 完全に生物学的に活性なＮＧＦ（ＮＴ−３）／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養タ ンパク質の成熟ヒトメンバーの産生方法を記載しているようである。ポリペプチ ドはＯｍｐＡシグナルペプチドのようなシグナルペプチドを用いて宿主細胞から 分泌され得るということである。 １９８８年７月１２日付けで発行された米国特許第４，７５７，０１３号は、 細菌宿主でのポリペプチドの分泌に有用なクローニングプラスミドを記載してい る。該プラスミドは、他の核酸配列に加えて、大腸菌のＯｍｐＡタンパク質のシ グナルペプチドをコードするＤＮＡ断片を任意に含んでいる。このプラスミドに より細胞質膜を横断しての分泌が効率的になるようである。 １９８２年７月６日付けで発行された米国特許第４，３３８，３９７号は、細 菌宿主細胞で産生されたポリペプチドの分泌方法を記載している。この方法によ り「ｆ−ｍｅｔ」のような化学置換基を持たないタンパク質を産生することがで きるようである。 Ｔａｎｊｉ等（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７３： １９９７−２００５［１９９１］）は、ＯｍｐＡシグナルペプチドアミノ酸配列 でのある種のアミノ酸置換又は欠失を記載している。 Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等(Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ.，１７２：１２２５−１２ ３１［１９９０］)は疎水性レベルが変化したＯｍｐＡシグナルペプチド突然変 異体を記載している。突然変異体は大腸菌細胞膜を横断する２種のタンパク質の シグナルペプチドとして作用する特異な能力を備えていたようである。 Ｌｅｎｈａｒｄｔ等(Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ.，２６３：１０３００−０ ３［１９８８］)は、アミノ末端の正味電荷が変化したらしいＯｍｐＡシグナル ペプチド突然変異体を記載している。 Ｌｅｎｈａｒｄｔ等(Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ.，２６２：１７１６−１９ ［１９８７］）はＯｍｐＡシグナルペプチドの突然変異体の産生を記載している 。この突然変異体の疎水性領域は短くなり、ある種のタンパク質の分泌配列とし て作用する能力は変化したようである。 組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチドを多量に製造する際に遭遇する問題の ために、従来技術では、組換えＤＮ Ａ技術によって産生される上記ポリペプチドの収率を上げる方法を提供する必要 がある。更には、従来技術では、組換えポリペプチドを「Ｍｅｔを欠く」形態で 提供する必要がある。 従って、原核生物宿主細胞で産生されるＮＧＦポリペプチドの分泌効率を高め るのに役立つシグナルペプチド及び該シグナルペプチドをコードする核酸配列を 提供することが本発明の目的である。 ＮＧＦポリペプチドをＭｅｔを欠く形態で製造する方法を提供することが別の 目的である。 当業者には他の目的も自明であろう。 発明の要約 従って、本発明の一態様で、配列ＭＫＫＲＡＲＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶ ＡＨＡ（配列番号１）を含むシグナルペプチドを提供する。 他の態様では、シグナルペプチドは更に、ポリペプチドＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎ Ｔ−３、ＮＴ−４又はＮＴ−５をカルボキシル末端に含み得る。 本発明の他の態様で、配列番号２に記載する配列を含む核酸を提供する。 本発明の他の態様で、配列番号３に記載する核酸を提供する。 本発明の更に別の態様で、更にアミノ末端Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドを コードする核酸を３’末端に含んでいる配列番号２又は配列番号３に記載の核酸 を提供する。 本発明の更に別の態様で、アミノ末端Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドをコー ドする核酸が３’末端に結合している配列番号２又は配列番号３に記載の核酸を 含んでいるベクターを提供する。場合によって、ベクターはｐＣＦＭ１６５６／ ＢＤＮＦｏｐｔ３又はｐＣＦＭ１６５６／ＮＴ−３ｏｐｔ３であり得る。 本発明の他の態様で、ベクターが挿入されている原核生物宿主細胞を提供する 。 本発明の他の態様で、アミノ末端Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドをコードす る核酸が３’末端に結合している配列番号２又は配列番号３に記載の核酸を含ん でいるベクターを挿入した原核生物宿主細胞を培養し、分泌ＮＧＦポリペプチド を単離することからなるＭｅｔを欠く形態のＮＧＦポリペプチドの製造方法を提 供する。 図面の簡単な説明 図１は、大腸菌細胞由来のある種のポリペプチドの分泌を高めるのに有用な合 成シグナルペプチドＲＨのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。 図２はシグナルペプチドＲＨをコードする縮重ヌクレオチド配列を示す。「Ｒ 」はＡ又はＧを示し、「Ｗ」はＡ又はＴ／Ｕを示し、「Ｙ」はＣ又はＴ／Ｕを示 し、「Ｄ」はＡ、Ｇ又はＴ／Ｕを示す（配列番号２）。この配列は原核細胞での コドン使用が好ましくなるように設計された。 図３は、シグナルペプチドＲＨをコードするヌクレオチド配列ＲＨ１１（配列 番号３）を示す。 図４Ａ及び図４Ｂは、ＢＤＮＦの原核生物宿主細胞での製造及び発現に有用な ヒトＢＤＮＦアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列を示す。図４Ａ（配列番 号４）はＭｅｔ開始コドンを有する配列を示し、図４Ｂ（配列番号２２）はＡＴ Ｇ Ｍｅｔ開始コドンを含まない同一の配列を示す。 図５Ａ及び図５Ｂは、ＮＴ−３の原核生物宿主細胞での製造及び発現に有用な ヒトＮＴ−３アミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ配列を示す。図５Ａ（配列番 号５）はＭｅｔ開始コドンを有する配列を示し、図５Ｂ（配列番号２３）はＡＴ Ｇ Ｍｅｔ開始コドンを含まない配列を示す。 図６は、シグナルペプチドＲＨをコードする核酸配列が５’末端に結合した合 成ＢＤＮＦ核酸配列の製造に使用される戦略の概略図である。「ＳＰ」はシグナ ルペプチド配列を示し、選択した制限酵素を図示する。各核酸配列の相対寸法は 示されていない。 発明の詳細な説明 本発明は、ある種の合成シグナルペプチド配列が、ある原核生物宿主細胞から 分泌されるＮＧＦポリペプチドの量を増加するのに役立つという予想外の発見に 基づく。 本発明の説明 本発明では、原核生物宿主細胞で合成され発現される神経成長因子（ＮＧＦ） ファミリーのポリペプチドの発現や分泌を高めるためのシグナルペプチドＲＨの 使用を考察する。上記ポリペプチドは本明細書では「ＮＧＦポリペプチド」と称 する。 更には、本発明では、アミノ末端のメチオニンが欠失したＮＧＦポリペプチド の産生手段を提供する。このようなＮＧＦポリペプチドは本明細書では「Ｍｅｔ を欠く（Ｍｅｔ−ｌｅｓｓ）」ＮＧＦポリペプチドと称する。１．ＲＨ核酸配列の製造 シグナルペプチドＲＨをコードする考えられる全ての核酸配列が本発明の範囲 に包含される。ＲＨ用の部分縮重コドン核酸（即ち原核細胞でのコドン使用が好 ましくなるように設計された核酸）を図２に示す。ＲＨをコードする好ましい核 酸のひとつはＲＨ１１であり、その配列を図３に示す。 ＲＨをコードする核酸は、Ｅｎｇｅｌｓ等（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ ｌ．編， ２８：７１６−７３４［１９８９］）が記載するような従来技術でよ く知られた方法を用いて容易に製造され得る。好ましい合成方法は、標準的なホ スホアミダイト法を用いたポリマー支持（ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ）合成である。２．ＮＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡの製造 ヒト、ウシ及びブタを含むがこれらに限定はされない任意の哺乳動物源に由来 するＮＧＦポリペプチドの製造方法が本発明に包含される。好ましい由来はヒト である。本発明の範囲に包含されるＮＧＦポリペプチドには非制限的ではあるが 、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３、ＮＧ Ｆ−３とも称する）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＮＴ−４（ニューロトロフィン −４）、 ＮＴ−５（ニューロトロフィン−５）、及び現在知られているこのファミリーの メンバーによって示されるような有意なアミノ酸又は核酸配列の相同性によって 関連付けられるこのファミリーの他のメンバーが含まれる。 本明細書で考察するＮＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、従来技術 でよく知られた１つ以上の方法を用いて、適量を単離して入手することができる 。上記ＤＮＡを単離するのに有用な上記方法や別の方法は例えばＳａｍｂｒｏｏ ｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ［１９８９］） 及びＢｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙ：Ｇｕｉｄｅｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ， ｖｏｌ．１５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ［１９８７］）が記載している。 ＢＤＮＦの好ましい核酸配列は図４Ａ及び図４Ｂに記載されているものである 。ＮＴ−３の好ましい核酸配列は図 ５Ａ及び図５Ｂに記載されているものである。 ＮＧＦポリペプチドのアミノ酸配列が公知である場合、ポリペプチドをコード する有望で機能的な核酸が、各アミノ酸残基について公知の及び／又は好ましい コドンを用いて椎定され得る。 ＮＧＦポリペプチドの核酸配列が完全に既知であれば、その配列は、Ｅｎｇｅ ｌｓ等， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ２８， ｐｐ．７１６−７３４， １９８９に述べられているような化学合成法を用いて その全部または一部を合成することができる。上記のような合成法には特に、ホ スホトリエステル、ホスホアミダイト及びＨ−ホスホネート核酸合成法が含まれ る。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡは、典型的には数百塩基対（ｂｐ）も しくはヌクレオチドの長さを有する。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、そ れそれ約１００ヌクレオチド以下の長さを有する数個の断片として合成し得る。 得られた断片同士を後述するように連結して、ＮＧＦポリペプチドをコードする 完全長核酸を形成し得る。 あるいはまた、ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸は、適当な（即ち上記ポ リペプチドを発現させると考えられる 組織を供給源として調製した）ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを所望の核酸 と選択的にハイブリダイズする１種以上の核酸プローブ（クローン化するべき核 酸に対して許容可能なレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡま たはゲノムＤＮＡ断片等）を用いてスクリーニングすることによって取得可能で ある。 ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を得る適当な方法にはポリメラーゼ連鎖 反応法（ＰＣＲ）も有る。しかし、この方法を用いて成功するにはＮＧＦポリペ プチドをコードする核酸配列に関して、核酸配列の増幅に有用である適当なオリ ゴヌクレオチドプライマーを設計するのに十分な情報が入手可能でなければなら ない。 ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸の調製のために選択した方法がオリゴヌ クレオチドプライマーまたはプローブの使用を必要とする場合（例えばＰＣＲ、 ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング）、プローブまたはプライマ ーとして選択するオリゴヌクレオチド配列は適当な長さを有し、かつライブラリ ースクリーニングまたはＰＣＲの間に生起する非特異的結合の量を最小限とする ように十分明確であるべきである。プローブまたはプライマー の実際の配列は普通、別の生物に由来する同一または類似遺伝子から得られる保 存型の、もしくは高相同性の配列または領域に基づく。場合によっては、プロー ブまたはプライマーは縮重型であり得る。 ＮＧＦポリペプチドのアミノ酸配列しか既知でない場合は、各アミノ酸残基に 関して好ましい既知のコドンを用いて、上記ポリペプチド配列をコードする可能 な機能性核酸を推定し得る。推定した核酸は上述の方法を用いて化学的に合成す ることができる。 本発明は、ＮＧＦポリペプチド突然変異配列の調製を含む。本明細書中に用い た「突然変異配列」という語は、野生型配列に比較して一つ以上のヌクレオチド 置換、欠失及び／または挿入を有する配列を意味する。ヌクレオチドの置換、欠 失及び／または挿入は、そのアミノ酸配列が野生型のアミノ酸配列と異なるＮＧ Ｆポリペプチドをもたらし得る。上記のような突然変異体の調製は当業者に良く 知られており、例えばＷｅｌｌｓ等， Ｇｅｎｅ ３４， ｐ．３１５， １９ ８５及びＳａｍｂｒｏｏｋ等，上掲書に記載されている。３．ＮＧＦポリペプチド前駆体の製造 ＮＧＦポリペプチド前駆体（即ちシグナルペプチド配列を有する形態）をコー ドする核酸は、様々な方法のうちのいずれか任意のものを用いて調製可能である 。或る方法では、ＲＨをコードする核酸をＮＧＦポリペプチドをコードする核酸 に直接連結し得、ただしその際ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸はアミノ末 端メチオニンのためのコドンを有しないことが条件となる。２個の核酸の連結は 、平滑末端連結によって、またはリガーゼ酵素を用い、かつ製造元のプロトコル に従ってＲＨ核酸の３′末端に適当な制限エンドヌクレアーゼ部位を設計するこ とによって、またはＳａｍｂｒｏｏｋ等，上掲書に記載されているような、当業 者に良く知られた方法によって行ない得る。 あるいはまた、ＲＨをコードする核酸はＮＧＦポリペプチド核酸配列に、ＰＣ Ｒを用いて結合させることができる。その場合、完全なＲＨ配列に加えて該配列 の３′末端に配置された、ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸配列のＭｅｔコ ドン（普通ＡＴＧ）を除いた最初の（即ち５′末端の）５〜７コドンから成る追 加の１５〜２１ヌクレオチドを有するＲＨ核酸を第一のＰＣＲプライマーとして 用いる。 ＲＨ核酸とＮＧＦ核酸の５′末端部分とを組み合わせた プライマーは、標準的なホスホアミダイト化学合成法などの良く知られた方法を 用いて合成する。第二のＰＣＲプライマーは、ＮＧＦ核酸の最後の、即ち該核酸 の３′末端に位置する６〜８コドン（１８〜２４ヌクレオチド）と相補的な核酸 であり得る。ＰＣＲを用いる場合はこのようにして、ＮＧＦポリペプチドをコー ドする完全長核酸から該核酸のアミノ末端Ｍｅｔコドンを除いた核酸に結合した ＲＨから成る核酸配列を生成させ得る。 ＮＧＦ前駆ポリペプチドをコードする核酸の調製に有用な別の一方法でもＰＣ Ｒを用いる。この方法ではまず、ＮＧＦポリペプチドをコードする完全長核酸（ アミノ末端Ｍｅｔコドンを含み得る）をクローニングまたは発現ベクターに挿入 する。その後ＰＣＲを用いて、ＮＧＦポリペプチドをコードする完全長核酸に結 合したＲＨ配列を有する核酸を調製する。ＰＣＲプライマーは先に述べたものに 類似する。ＰＣＲに用いる一方のプライマーは、ＮＧＦポリペプチドをコードす る核酸の領域の３′側に位置するベクター配列と相補的である。他方のプライマ ーは５′→３′方向に順次、ベクター配列の、ＮＧＦコーディング配列の５′側 に隣接する部分（約１２〜２５ヌクレオチド）； ＲＨ シグナルペプチドをコードする完全長ヌクレオチド配列；及びＮＧＦポリペプチ ドのアミノ末端Ｍｅｔを除いた最初の５〜８アミノ酸をコードするヌクレオチド 配列を有する。このプライマーを、ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸挿入部 分を保持したベクターにハイブリダイズさせると、ベクター配列部分、及びＮＧ Ｆポリペプチドをコードする配列部分は該プライマーとハイブリダイズし得るが 、ＲＨ配列部分はハイブリダイズし得ない。ＲＨ部分はループ構造を形成し得る 。 この方法で用いるもう一方のＰＣＲプライマーは、ＮＧＦポリペプチドをコー ドする核酸の最後の６〜８コドン（１８〜２４ヌクレオチド）と相補的であるか 、またはベクター配列の、ＮＧＦ核酸配列の３′側に位置する部分と相補的であ る核酸配列であり得る。 ＰＣＲの際、増幅核酸生成物は５′→３′方向に、５′側ベクター配列部分、 ＲＨシグナルペプチド配列、ＮＧＦポリペプチドをコードする完全長核酸配列か らアミノ末端Ｍｅｔコドンを除いた配列、及び３′側ベクター配列部分を有する 。ＰＣＲ後、ＰＣＲ生成物を適当な制限酵素で切断して、ＮＧＦポリペプチドの 前駆形態をコードする核酸 を生じさせ得、それによって分泌時にＲＨシグナルペプチドが切断された後、ア ミノ末端Ｍｅｔを欠いた（または無Ｍｅｔ）ＮＧＦポリペプチドが得られる。４．ベクターの調製／選択 選択された原核宿主細胞において機能する任意の発現ベクターを用い得るが、 ただし当該ベクターはＮＧＦ前駆ポリペプチドの発現を保証する必要な核酸成分 もしくは要素を総て有するものとする。 典型的には、ベクターはプロモーター、複製開始要素、転写終結要素、リボソ ーム結合部位要素、発現させるべきポリペプチドをコードする核酸の挿入のため のポリリンカー領域、及び選択マーカー要素を有する。 Ａ．プロモーター要素 プロモーターは、同種（即ち宿主細胞と同じ原核細胞種及び／または株に由来 ）であっても、異種（即ち原核宿主細胞種または株以外の供給源に由来）であっ ても、また合成されたものであってもよい。従って、プロモーターの供給源は、 宿主細胞において機能し、かつ宿主細胞によって調節され得るプロモーターが得 られるのであれば任意の単細胞原核もしくは真核生物、任意の脊椎もしくは無脊 椎動 物、または任意の植物であり得る。好ましい本発明のプロモーターは、バクテリ オファージλ起源のもの、即ちＰ_RもしくはＰ_Lプロモーターといったλプロモー ター、Ｔ₅プロモーターまたはＴ₇プロモーターなどの誘導プロモーター； ｌａ ｃ、ｔａｃ（ｔｒｐプロモーターとｌａｃプロモーターとの複合体）、ｔｒｐ及 びｔｎａなどの細菌プロモーターである。最も好ましいプロモーターはＰ_Lプロ モーターである。 本発明に有用なプロモーター核酸配列は、当業者に良く知られた幾つかの方法 のうちの任意のもので取得可能である。典型的には、本発明に有用なプロモータ ーはマッピングによって、及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって予 め同定されるので、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適正な供給源組織か ら単離することができる。場合によっては、プロモーターは配列決定されている 。そのＤＮＡ配列が既知であるプロモーターは、先に述べた核酸合成またはクロ ーニング法を用いて合成し得る。 プロモーター配列の全体または一部が既知である場合は、プロモーターはＰＣ Ｒを用いることによって、及び／またはゲノムライブラリーを適当なオリゴヌク レオチドで、及 び／または同じ種または別の種由来の適当なプロモーター配列断片でスクリーニ ングすることによって得ることができる。 プロモーター配列が未知である場合は、例えばコーディング配列や、更には１ 個以上の別の遺伝子を含み得る比較的大型のＤＮＡ片からプロモーターを含むＤ ＮＡ断片を単離し得る。この単離は、入念に選択した１種以上の酵素を用いて制 限エンドヌクレアーゼ消化を行ない、それによって適正なＤＮＡ断片を単離する ことにより実施可能である。 たは当業者に公知の他の方法によって所望の断片を単離し得る。上記単離の実施 に適した酵素の選択は、当業者には直ちに明白であろう。 Ｂ．複製開始要素 この成分は典型的には、市販の原核発現ベクターの一部であり、宿主細胞にお けるベクターの増幅を補佐する。ベクターを所定のコピー数まで増幅することは 場合によっては、ＮＧＦポリペプチドの最適発現のために重要であり得る。選択 したベクターが複製開始点を有しない場合は、既知配列に基づいて化学的に合成 した複製開始点をベクター 中に連結し得る。 Ｃ．転写終結要素 この要素は典型的には、ＮＧＦポリペプチドコーディング配列の３′末端側に 位置し、ＮＧＦポリペプチドの転写を終結させるべく機能する。原核細胞の転写 終結要素は普通、高ＧＣ含量断片にポリＴ配列が後続したものである。この要素 はライブラリーから容易にクローン化でき、更にはベクターの一部として市販も されているが、先に述べたような核酸合成法を用いても容易に合成可能である。 Ｄ．選択マーカー要素 選択マーカー遺伝子は、選択培地中で増殖させる宿主細胞の生存及び増殖に必 要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質 または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたカナマイシンに対 する耐性を原核宿主細胞に付与し、（ｂ）細胞の栄養要求性欠陥を補い、または （ｃ）複合培地からは摂取できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコード する。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺 伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。 Ｅ．リボソーム結合部位要素 通常シャイン−ダルガノ配列と呼称されるこの要素は、ｍＲＮＡの翻訳開始に 必要である。この要素は典型的には、プロモーターの３′側で、かつ合成するべ きポリペプチドのコーディング配列の５′側である位置に配置する。シャイン− ダルガノ配列には様々なものが有るが、典型的なのはポリプリン（即ち高ＡＧ含 量配列）である。多くのシャイン−ダルガノ配列が同定されており、それらはい ずれも先に述べた方法を用いて容易に合成可能である。 上述の諸要素、及び本発明に有用な他の要素は総て当業者に良く知られており 、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ， ＮＹ， １９８９及びＢｅｒｇｅｒ等編， “Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９８７に記載 されている。 Ｆ．ベクターの構築 本発明の実施に最も有用なベクターは、選択された原核宿主細胞と相容性であ る任意の発現ベクターである。 場合によっては、先に掲げた様々なベクター要素のうちの幾つかは、いずれも 原核宿主細胞に適し、かつ本発明の実施での使用に適するｐＵＣ１８、ｐＵＣ１ ９、ｐＧＥＭベクター(Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ) 、ｐＢＩＩＳＫ＋／−（Ｓｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ， ＣＡ）などのｐＢｌｕ に存在し得る。 用いるべきベクター中に１種以上の要素が未だ存在しない場合は、当該要素を 個別に取得してベクター中に連結し得る。各要素の取得に用いる方法は当業者に 良く知られており、先に示した方法（即ちＤＮＡ合成、ライブラリースクリーニ ング等）と同等である。 好ましい本発明のベクターはｐＣＦＭ１６５６（ブダペスト条約に基づき１９ ９３年２月２４日付でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ， ＭＤ ２０８５２に受託番号第６９５７６ クター、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９である。プラスミドｐＣＦＭ１６５６はプラ スミドコピー数の増加に約３０〜約４２℃の培養温度を必要とし、温度が約４２ ℃を越えて上昇するとＰＬプロモーターのＣＩ８５７リプレッサー要素は不活性 となる。 本発明の実施に用いる最終的なベクターは典型的には、市販ベクターなどの出 発ベクターから構築する。このベクターが、完成ベクター中に含まれるべき要素 のうちの幾つかを有しない場合も有る。所望の要素が出発ベクター中に一つも存 在しない場合は、ベクターを１種以上の適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し 、それによってベクター中に連結するべき要素の末端とベクターの末端とを連結 のために相容性とすることにより、各要素を個別にベクター中に連結し得る。場 合によっては、十分な連結を実現するべく、互いに結合させるべき末端を「平滑 化」する必要が生じ得る。平滑末端形成は、最初に４種全部のヌクレオチドの存 在下にクレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて「 付着末端」を充填することによって行なう。この操作は当業者に良く知られてお り、例え ばＳａｍｂｒｏｏｋ等，上掲書に記載されている。 あるいは他の場合には、ベクターに挿入するべき要素のうちの二つ以上をまず 互いに結合させ（それらの要素が互いに隣接して配置されるべきである場合）、 その後ベクター中に連結し得る。 更に別のベクター構築法では、様々な要素の連結を総て一つの反応混合物中で 同時に生起させる。この方法では、要素の不適正な連結または挿入に起因して多 くのナンセンスベクターまたは非機能性ベクターが生じるが、制限エンドヌクレ アーゼ消化によって機能性ベクターを同定及び選択することができる。 ベクターを構築し、このベクターの適正な部位にＮＧＦ核酸を挿入した後、完 成ベクターを増幅及びＮＧＦポリペプチド発現のために原核宿主細胞へ挿入し得 る。通常用いる原核細胞は、ベクター上のプロモーターと相容性である任意の大 腸菌株であり、前記相容性とはプロモーターが大腸菌細胞内で機能することを意 味する。選択した株は好ましくは、プロモーターをＮＧＦポリペプチドの発現が 適正に誘導されるように制御する調節要素を提供する。大腸菌株ＦＭ−５（ブダ ペスト条約に基づき１９８９年５月１９ 日付でＡＴＣＣに受託番号第５３９１１号の下に寄託）、ＤＨ５−α、ＪＭ−１ ０１等のような株が適当である。加えて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属など他のグラ ム陰性菌、並びにＢａｃｉｌｌｕｓ属などのグラム陽性菌及び他の原核生物も宿 主細胞として適当であり得る。 選択した宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」または「トランスフェク ション」とも呼称）は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロ インジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法といった 方法を用いて実施し得る。いずれの方法を選択するかは、用いるべき宿主細胞の 種類にも依存する。上記その他の適当な方法は当業者に良く知られており、例え ばＳａｍｂｒｏｏｋ等，上掲書に記載されている。 ベクターを保持する（即ち形質転換された）宿主細胞は、当業者に良く知られ た標準的な培地を用いて培養し得る。培地には普通、細胞の増殖及び生存に必要 なあらゆる栄養素を含有させる。大腸菌細胞の培養に適する培地は、例えばＬｕ ｒｉａブイヨン（ＬＢ）及び／またはＴｅｒｒｉｆｉｃブイヨン（ＴＢ）である 。典型的には、形質転換細胞のみの選択的増殖に有用な抗生物質または他の化合 物を補 助成分として培地に添加する。用いるべき化合物は、宿主細胞を形質転換したプ ラスミド上に存在する選択マーカー要素に従って決まる。例えば、選択マーカー 要素がカナマイシン耐性であれば、培地に添加する化合物はカナマイシンとなる 。５．分泌の評価 宿主細胞から分泌され、それによってＭｅｔを欠いた成熟形態に変換されるＮ ＧＦポリペプチドの量は、当業者に公知の標準的な方法を用いて評価可能である 。そのような方法には、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、及び／または活 性アッセイが非限定的に含まれる。 上記アッセイのうちの幾つかの実施では、最初にポリペプチドを抽出するべく 宿主細胞培養物質を操作しなければならない場合が有る。典型的には、宿主細胞 によって分泌される、プロセシングされた、もしくは成熟したポリペプチドの量 は発現されたポリペプチドの総量（成熟ポリペプチド量に前駆ポリペプチド量を 加えたもの）と比較される。宿主細胞の抽出物は、Ｃｕｌｌ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８２， ｐｐ．１４７−１５３， １９９０に記載されているような、この分 野で標準的な方法を用いて調製可能である。用いた宿主細胞が細胞質膜を一つし か有しないグラム陽性菌または他の原核生物である場合、分泌されたポリペプチ ドは細胞培養培地中に見出され得る。宿主細胞が（内膜と外膜との）二つの膜を 有する大腸菌などのグラム陰性菌または他の原核生物である場合は、分泌された ポリペプチドの大部分はペリプラズム間隙、即ち内膜と外膜との間の空間内に見 出され得る。 プロセシングを受けていない形態（即ち前駆形態）のＮＧＦポリペプチドの回 収には典型的には、宿主細胞からのポリペプチドの抽出が必要となる。ゲル電気 泳動、ウェスタンブロット分析及びドットブロット分析など、ほとんどの分析法 に関して、ＮＧＦ前駆ポリペプチドを精製する必要はない。単に、上記前駆体を 保有する宿主細胞を遠心機でのペレット化により回収し、これを標準的な方法で 溶解させればよい。細胞破片（膜、細胞壁物質等）は遠心機でのペレット化によ って分離し得、得られた可溶性画分はその後の分析のためにゲルまたはドットブ ロット上に直接添加し得る。 プロセシングされた、もしくは分泌された形態のＮＧＦポリペプチドの回収に 用いる方法は、ポリペプチドがペリプラズム内に存在するか（グラム陰性菌）、 それとも培地中に存在するか（グラム陽性菌及び他の原核生物）によって決まる 。 ＮＧＦポリペプチドが培地中に見出されると考えられる場合は、培地のアリコ ートをゲル電気泳動、ドットブロット分析及び／または免疫沈降に直接用い得る 。 ＮＧＦポリペプチドが主としてペリプラズム間隙内に見出されると考えられる 場合は、プロセシングされたポリペプチドが封入体のような複合体を形成する場 合はその封入体を含めたペリプラズムの内容物を宿主細胞から、当業者に公知で ある任意の標準的技術を用いて抽出し得る。例えば、フレンチプレス、ホモジネ ート化、及び／または音波処理によって、宿主細胞を溶解させてペリプラズムの 内容物を放出させることが可能である。ホモジネートは次いで遠心し得る。 ＮＧＦポリペプチドがペリプラズム内で封入体を形成した場合、この封入体は しばしば内側及び／または外側の細胞膜に結合し得、即ち主として遠心後のペレ ット物質中に 見出される。得られたペレット物質をグアニジンまたは尿素といったカオトロピ ック物質で処理すれば、封入体の放出、解離及び可溶化が実現し得る。可溶形態 となったＮＧＦポリペプチドはゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて分析すること ができる。ＮＧＦポリペプチドを単離することが望ましい場合、この単離は後述 する、またＭａｒｓｔｏｎ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １８２， ｐｐ．２６ ４−２７５， １９９０に記載されているような標準的方法を用いて可能である 。 宿主細胞のペリプラズム内でＮＧＦポリペプチド封入体がさほど形成されない 場合は、ＮＧＦポリペプチドは主として細胞ホモジネートの遠心後の上清中に見 出され、この上清からのＮＧＦポリペプチドの単離は後述するような方法を用い て可能である。 前駆形態及び／または成熟形態のＮＧＦポリペプチドの一部または全部を単離 することが好ましいという情況下では、当業者に良く知られた標準的な方法を用 いて精製を行ない得る。そのような方法には、電気泳動とその後のエレクトロエ リューションとによる分離、様々な種類のクロマトグラフィー（イムノアフィニ ティー、モレキュラーシー ブ、及び／またはイオン交換）、及び／または高速液体クロマトグラフィーが非 限定的に含まれる。場合によっては、精製の完璧を期して上記のような方法を２ 種以上用いることが好ましいこともある。 本発明は、以下の実施例を参照すればより容易に理解することができる。これ らの実施例は全く、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。 実施例１：ＢＤＮＦの分泌 Ａ．ＤＮＡ構築物の作製 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で発現させるためにヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） を以下のように作製した。先ず、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で改良された発現が得られ るように合成ＢＤＮＦ遺伝子を設計した。該遺伝子は天然産生ヒトＢＤＮＦ核酸 配列に比べて１個以上の塩基が改変された数個のコドンを有していた。ＢＤＮＦ ｏｐｔ３と称される該合成遺伝子の配列を図４に示す。該遺伝子はその５′末端 でメチオニン（ＡＴＧ）をコードする。 標準ホスホアミダイト化学合成法を用いるポリマー支持合成（ｐｏｌｙｍｅｒ −ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によりＢＤＮＦｏｐｔ３を作製し た。ＢＤＮＦｏ ｐｔ３は長いので、４つの分離したセグメントとして合成した。セグメント１は 、１０４個の塩基からなり、ベクター配列に対応する５′非翻訳配列部分、Ｘｂ ａＩ制限部位、ＡＴＧ開始コドン及びＢＤＮＦｏｐｔ３核酸配列の最初の７６個 の塩基を含んでいる。セグメント２は、ＢＤＮＦｏｐｔ３の次の１１７個の塩基 を含み、セグメント３は、ＢＤＮＦｏｐｔ３の次の１０７個の塩基を含み、セグ メント４は、ＴＡＡ終結コドン、ＢａｍＨＩ制限部位配列及び５個の追加のヌク レオチドと共に、ＢＤＮＦｏｐｔ３の残りの５７個の塩基を含んでいる。標準連 結反応プロトコルを用いてこれらのセグメントを連結した。連結反応の前に、３ 個のオリゴヌクレオチドをＢＤＮＦｏｐｔ３遺伝子フラグメントにハイブリダイ ズして、これら４個の遺伝子セグメントが適切な順序で連結されることを確実に した。用いた３個のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、ＢＤＮＦｏｐｔ３遺伝子フ ラグメントの結合部の１つにまたがっている。該オリゴヌクレオチドのそれぞれ の核酸配列を以下に示す： セグメントを連結した後、全長の一本鎖ＢＤＮＦｏｐｔ３遺伝子を含む連結反 応混合物からの小部分を、該遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用の鋳型として用い た。ＰＣＲ増幅に用いたプライマーは： であった。 以下の条件を用いて２５サイクルのＰＣＲを実施した：９４℃で１分間の変性 ；５５℃で１分間のアニーリング；及び７２℃で２分間の伸長。増幅したフラグ メントを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIキット（Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてアガロースゲルから精製し、制限酵素ＸｂａＩ及び ＢａｍＨＩで消化した。次いで、該フラグメントを、前もってＸｂａＩ及びＢａ ｍＨＩで切断しておいたベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ受託番号６９５７ ６）に挿入した。全長のＢＤＮＦｏｐｔ３遺伝子を含む該ベクターＰＣＦＭ１６ ５６／ＢＤＮＦｏｐｔ３を鋳型として用い、分泌可能形態のＢＤＮＦｏｐｔ３遺 伝子（即ち、シグナル配列を含む）を作製した。分泌可能形 態のＢＤＮＦｏｐｔ３の作製に用いたクローニング法を図６に示す。 ポリマー支持合成法及び標準ホスホアミダイト化学合成法を用いて、図２に示 されているシグナルペプチド配列をコードする縮重オリゴヌクレオチド配列を作 製した。各配列は、その５′末端に、ｐＣＦＭ１６５６／ＢＤＮＦｏｐｔ３のＢ ＤＮＦｏｐｔ３遺伝子配列の５′に位置するｐＣＦＭ１６５６ベクター配列の約 ２４個の塩基を含み、またその３′末端に、ＢＤＮＦｏｐｔ３の最初の６個のア ミノ酸（Ｍｅｔを含まない形態の分泌型ＢＤＮＦｏｐｔ３を作製するために省か れたアミノ末端メチオニンを除く）をコードする約１８個の塩基を含んでいた。 分泌型ＢＤＮＦｏｐｔ３を作製するために、縮重ＲＨシグナルペプチドコドン を含むオリゴヌクレオチド、及びＢＤＮＦｏｐｔ３遺伝子の３′末端から下流の ベクター配列と相補的な第２オリゴヌクレオチド（配列番号：１１として以下に 示されている）をｐＣＦＭ１６５６／ＢＤＮＦｏｐｔ３にアニーリングした。 次いでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、その ５′末端でＲＨシグナルペプチド配列をコードする核酸に結合した全長のＢＤＮ ＦｏＰｔ３配列をコードする遺伝子を合成した。試薬及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から得たｔａｑＤＮ Ａポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。２５サイクルのＰＣＲを以下のよう に実施した：９４℃で１分間の変性；５０℃で１分間のアニーリング；及び７２ ℃で２分間の伸長。ＰＣＲの後、ＰＣＲ産物（ＢＤＮＦｏｐｔ３＋ＲＨシグナル ペプチドをコードする約５７４個の塩基対）を０．８％アガロースゲル上で泳動 させ、５７４個の塩基対のフラグメントをゲルから切断し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIキット（Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ．）を用い、製造業者の指示に従って精製し た。精製したフラグメントをＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化して、ＲＨシグナルペ プチドとＢＤＮＦｏｐｔ３遺伝子の５′側の約１／３とをコードする約２００個 の塩基対のＤＮＡフラグメントを作製した。ベクターｐＣＦＭ１６５６／ＢＤＮ Ｆｏｐｔ３をＸｂａＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＢＤＮＦｏｐｔ３の５′末端をコ ードする小フラグメントを除去し、この切断されたベクターに２００個の塩基対 のＲＨ／ＢＤＮＦｏｐｔ３配列を連結した。 連結反応は、リガーゼ緩衝液及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉ ｎｃ．から得た酵素を用い、製造業者の指示に従って約１６℃で一晩実施した。 連結後、プラスミドをコンピテントＥ．ｃｏｌｉＫ−１２細胞株ＦＭ−５（Ａ ＴＣＣ受託番号５３９１１）に挿入（形質転換）した。プラスミドの挿入は、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら，前掲書に記載の標準塩化カルシウム法を用いて行った。形質 転換した細胞を、約５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む標準Ｌｕｒｉａブロス （「ＬＢ」）寒天プレート上約３０℃で一晩培養した。培養後、１６個の別個の コロニーを選択し、約５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢに接種し、振盪 培養器上約３０℃で一晩培養した。培養後、細胞を、カナマイシンを含む標準Ｔ ｅｒｒｉｆｉｃブロス（「ＴＢ」；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）に約１：１０に 希釈し、約３０℃で約０．５〜０．８ＯＤ６００の密度になるまで増殖させ、温 度を約４２℃に上げてＢＤＮＦｏｐｔ３の発現及び分泌を誘発させた。約４時間 後、約１ｍｇの湿潤細胞集団をペレット化し、次いで、約１００μｌの標準トリ ス−グリシン ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性／還元緩衝液（６２．５ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ，ｐＨ６．８，２％ ＳＤＳ，０．００２５％ ブロモフェノールブルー，１０％グリセロール，２． ５％β−メルカプトエタノール）中で約１０分間煮沸して溶解した。次いで、約 １０μｌの該混合物を標準ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（約１８％アクリルア ミド）上で泳動させた。ゲルは、約１３０ボルトの定電圧下に約２．５時間泳動 させた。ゲル、試料緩衝液及び泳動用緩衝液はいずれもＮＯＶＥＸ,Ｉｎｃ.(Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)から購入し、製造業者の指示に従って使用した。 対照系として、ＲＨ／ＢＤＮＦｏｐｔ３核酸の作製について上記したものと同 じ手順を用い、ＯｍｐＡのシグナルペプチドをコードする核酸をＢＤＮＦｏｐｔ ３遺伝子に結合した。ＯｍｐＡシグナルペプチドの作製に用いたオリゴヌクレオ チド配列は、 であった。 ＲＨオリゴヌクレオチドの場合と同様に、ＯｍｐＡオリゴヌクレオチドは、そ の５′末端に、ｐＣＦＭ１６５６ベ クター配列の約２４個の塩基を含み、またその３′末端に、ＢＤＮＦｏｐｔ３の 最初の６個のアミノ酸（アミノ末端Ｍｅｔを除く）をコードする約１８個の塩基 を含んでいた。 Ｂ．シグナルペプチド核酸配列の分析 ＲＨシグナルペプチドをコードする種々のヌクレオチド配列の効率を、産生さ れた総ＢＤＮＦｏｐｔ３タンパク質（プロセシングしたもの＋プロセシングして いないもの）に対するプロセシングしたＢＤＮＦｏｐｔ３（ＢＤＮＦｏｐｔ３ポ リペプチドからシグナルペプチドを切断したもの）の量の百分率として分析した 。２形態のＢＤＮＦｏｐｔ３を比較するために、ＳＤＳゲルをクーマシーブルー で染色し、染色後に走査して各形態の相対量を測定した。プロセシングしていな いＢＤＮＦｏｐｔ３前駆ポリペプチドの分子量は約１５．８ｋＤであるのに対し 、プロセシング形態のＢＤＮＦｏｐｔ３の分子量は約１３．５ｋＤである。従っ て、２形態のＢＤＮＦｏｐｔ３は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル上で明確 に異なるバンドを示す。 いくつかのＲＨ／ＢＤＮＦｏｐｔ３ポリペプチドについて、両バンド（即ち、 プロセシング及び非プロセシングＢＤＮＦｏｐｔ３）とも、ゲルをクーマシーブ ルーで染色し、 ゲルをウエスターンブロットして、ポリクローナル抗ＢＤＮＦ抗体を用いてウエ スターンブロット上でＢＤＮＦｏｐｔ３を検出することにより視覚的に識別でき た。ＲＨ核酸配列の一つであるＲＨ１１は、視覚的検査により、ＲＨ１２のよう な他のＲＨ核酸配列及びＯｍｐＡ核酸配列に比べて、より多くのプロセシングＢ ＤＮＦｏｐｔ３を有しているように見えた。Ｕｌｔｒａｓｃａｎ ＸＬ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）を用いてゲルを走査し、異なるＲＨシグナルペプチド核 酸配列及びＯｍｐＡシグナルペプチド核酸配列についてプロセシング及び非プロ セシングＢＤＮＦの相対量を測定した。ＲＨ１１，ＲＨ１２及びＯｍｐＡ核酸配 列の走査結果を以下の表１に示す。該結果を、ゲルの走査から得られた曲線下の 面積〔吸光度×ゲル上のタンパク質バンドの幅（ｍｍ）〕として表す。 表から明らかなように、ＲＨ１１シグナルペプチド核酸 配列を用いると、ＯｍｐＡ又はＲＨ１２配列を用いた場合に比べてＢＤＮＦｏｐ ｔ３のより効果的なプロセシングが得られる。 実施例２：ＮＴ−３の分泌 Ａ．ＤＮＡ構築物の作製 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で発現させるためにヒトＮＴ−３をコードする合成遺伝子 を作製した。好ましい細菌コドンを用い、これらの細胞中で改良された発現が得 られるように遺伝子を設計した。この合成遺伝子の配列を図５に示す。 標準ホスホアミダイト化学合成法を用い、ポリマー支持合成により、ＮＴ−３ ０ｐｔ３と称される合成遺伝子を作製した。ＮＴ−３ｏｐｔ３は長いので、長さ が９４〜１０４個のヌクレオチドの範囲の４つの分離した核酸フラグメントとし て作製した。ＮＴ−３ｏｐｔ３遺伝子の５′部分をコードするフラグメントは、 ＡＴＧ開始コドンの５′末端にＸｂａＩ部位を付与する非コード配列部分を含ん でいた。ＮＴ−３０ｐｔ３遺伝子の３′部分をコードするフラグメントは、３′ 末端にＢａｍＨＩ制限部位を付与する非コード配列部分を含んでいた。 合成後、その配列が各連結結合部の周りの領域と相補的 なオリゴヌクレオチド結合部核酸を用いてフラグメントを連結した。アニーリン グ及び連結反応は標準プロトコルを用いて実施した。結合配列として用いたオリ ゴヌクレオチド配列を以下に示す： 全長の一本鎖ＮＴ−３ｏｐｔ３遺伝子を含む連結反応混合物の小部分を、ＮＴ −３ｏｐｔ３遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用の鋳型として用いた。以下の２つ のオリゴヌクレオチドをこのＰＣＲのプライマーとして用いた： ２５サイクルのＰＣＲを以下のように実施した：９４℃で１分間の変性；５５ ℃で１分間のアニーリング；及び７２℃で２分間の伸長。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIキット（Ｂｉｏ １０１）を用い、増幅されたフラグメントをアガロースゲル から精製し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いで、前もってＸｂａＩ及び ＢａｍＨＩで切断しておいたベクターｐＣＦＭ１６５６に挿入した。ＮＴ−３ｏ ｐｔ３遺 伝子を含むこのプラスミドを用い、ＲＨシグナルペプチド配列をコードする核酸 を含むＮＴ−３ｏｐｔ３遺伝子を作製した。用いた手順は、実施例１にＢＤＮＦ ｏｐｔ３について記載し且つ図６に示したものと同様であった。 標準ホスホアミダイトＤＮＡ合成法を用い、図２に示されているＲＨシグナル ペプチド配列をコードする部分的に縮重されたオリゴヌクレオチド配列を合成し た。各配列は、その５′末端に、ｐＣＦＭ１６５６ベクター配列の約２４個の塩 基を含んでいた。各配列は、その３′末端に、ＮＴ−３ｏｐｔ３の最初の６個の アミノ酸（アミノ末端にＭｅｔを含まない形態の分泌型ＮＴ−３ｏｐｔ３を作製 するために省かれた最初のメチオニンアミノ酸残基を除く）をコードする１８個 の塩基を含んでいた。 分泌型ＮＴ−３ｏｐｔ３を作製するために、ＰＣＲ用に、縮重ＲＨシグナルペ プチドコドンを含むオリゴヌクレオチド配列を、ｐＣＦＭ１６５６／ＮＴ−３ｏ ｐｔ３ベクターにアニーリングした。同時に、ＮＴ−３ｏｐｔ３遺伝子から下流 のベクター配列の３′末端と相補的な第２オリゴヌクレオチド配列をｐＣＦＭ１ ６５６／ＮＴ−３ｏｐｔ３にアニーリングした。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣ Ｒ）を用い、その５′末端でＲＨシグナルペプチド配列をコードする核酸に結合 した全長のＮＴ−３ｏｐｔ３配列をコードする遺伝子を合成した。 試薬及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ，Ｉｎｃ．から得たｔａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。２５ サイクルのＰＣＲを以下のように実施した：９４℃で１分間の変性；５０℃で１ 分間のアニーリング；及び７２℃で２分間の伸長。ＰＣＲの後、ＰＣＲ産物(Ｎ Ｔ−３ｏｐｔ３及びＲＨシグナルペプチドをコードする約５７４個の塩基対)を ０.８％アガロースゲル上で泳動させ、約５７４個ののＲＨ／ＮＴ−３ｏｐｔ３ ヌクレオチドフラグメントをゲルから切断し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ IIキット（ Ｂｉｏ １０１，Ｉｎｃ．）を用い、製造業者の指示に従って精製した。精製し たフラグメントをＸｂａＩ及びＨｉｎｄIIIで消化して、ＲＨシグナルペプチド 及びＮＴ−３遺伝子の５′部分をコードする約３７１ｂｐのＤＮＡフラグメント を作製した。ベクターｐＣＦＭ１６５６／ＮＴ−３ｏｐｔ３をＸｂａＩ及びＨｉ ｎｄIIIで消化し、ＮＴ−３ｏｐｔ３の５′末端をコードするフラグメントを除 去し、約３７１個の塩基対のＲＨ／Ｎ Ｔ−３ｏｐｔ３ＤＮＡ配列（ＰＣＲにより産生された）を用いた連結反応により 置換した。連結反応は、リガーゼ緩衝液及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ,Ｉｎｃ．から得た酵素を用い、製造業者の指示に従って、１６℃で一晩 実施した。 連結後、プラスミドを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２細胞株ＦＭ−５ （ＡＴＣＣ受託番号５３９１１）に挿入（形質転換）した。プラスミドのＥ．ｃ ｏｌｉ細胞への挿入は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲書に記載の標準塩化カルシウ ム法を用いて実施した。形質転換した細胞を、約５０μｇ／ｍｌのカナマイシン を含む標準Ｌｕｒｉａブロス（「ＬＢ」）寒天プレート上約３０℃で一晩培養し た。培養後、１３個の別個のコロニーを選択し、約５０μｇ／ｍｌのカナマイシ ンを含むＬＢに接種し、約３０℃で一晩培養した。培養後、細胞を、カナマイシ ンを含む標準Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（「ＴＢ」；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲） に約１：１０に希釈し、約３０℃で約０．５〜０．８ ＯＤ６００の密度になる まで増殖させ、温度を約４２℃に上げて、ＮＴ−３ｏｐｔ３の発現及び分泌を誘 発させた。約４時間後、約１ｍｇの湿潤細胞集団をペレット化し、次いで、 約１００μｌの標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ変性／還元緩衝液（実施例１に記載のもの ）中で約１０分間煮沸して溶解した。次いで、約１０μｌの該混合物を標準ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル（約１８％アクリルアミド）上で泳動させた。ゲルは 、約１３０ボルトの定電圧下に約２．５時間泳動させた。ゲル、試料緩衝液及び 泳動用緩衝液はいずれもＮＯＶＥＸ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か ら購入し、製造業者の指示に従って使用した。 Ｂ．シグナルペプチド核酸配列の分析 ＲＨシグナルペプチドをコードする種々のヌクレオチド配列の効率を、発現さ れたＮＴ−３ｏｐｔ３全量（プロセシング＋非プロセシングＮＴ−３ｏｐｔ３） に対するプロセシングＮＴ−３ｏｐｔ３（ＮＴ−３ｏｐｔ３ポリペプチドからシ グナルペプチドを切断したもの）の量の百分率として分析した。２形態のＮＴ− ３ｏｐｔ３を比較するために、ＳＤＳゲルをクーマシーブルーで染色し、染色後 に走査して、各形態の相対量を測定した。非プロセシングＮＴ−３ｏｐｔ３前駆 ポリペプチドの分子量は約１５．９ｋＤであるのに対し、プロセシング形態のＮ Ｔ−３ｏｐｔ３の分子量は約１３．６ｋＤである。従って、２形態のＮＴ− ３ｏｐｔ３は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル上で明確に異なるバンドを示 す。 いくつかのＲＨ／ＮＴ−３ｏｐｔ３ポリペプチドについて、バンドは、ゲルを クーマシーブルーで染色し、ゲルをウエスターンブロットして、ポリクローナル 抗ＮＴ−３ｏｐｔ３抗体を用いてウエスターンブロット上でＮＴ−３ｏｐｔ３を 検出することにより、視覚的に識別できた。２つのＲＨ核酸配列、ＲＨ３、ＲＨ ５と、ＲＨ１１は、視覚的検査により、他のＲＨ核酸配列に比べて、より高い割 合のプロセシングＮＴ−３ｏｐｔ３を有しているように見えた。ＲＨ３（配列番 号：１８）、ＲＨ４（配列番号：１９）、ＲＨ５（配列番号：２０）及びＲＨ６ （配列番号：２１）を以下に示す（ＲＨＩＩの配列は図３に示されている）： ＲＨ３： ＲＨ４： ＲＨ５： ＲＨ６： ゲルを実施例１に記載のように走査して、数個の異なるＲＨシグナルペプチド 核酸配列についてプロセシング及び非プロセシングＮＴ−３ｏｐｔ３の相対量を 測定した。核酸配列の活性についての走査結果を以下の表２に示す。該結果を、 ゲルの走査から得られた曲線下の面積〔吸光度×ゲル上のタンパク質バンドの幅 （ｍｍ）〕として表す。 本明細書に引用した全ての文献は特定的に参考として組み込むものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 モリス，チヤールズ・エフ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、 ニユーベリー・パーク、ダニエル・ストリ ート・3393 (72)発明者 ツアイ，ラリー・ビイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・91301、 アグーラ・ヒルズ、ナポウリアン・アベニ ユー・5535

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列ＭＫＫＲＡＲＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＨＡ（配列番号１）を 含むペプチド。 ２．更にポリペプチドＢＤＮＦをカルボキシル末端に含む請求項１に記載のペプ チド。 ３．更にポリペプチドＮＴ−３をカルボキシル末端に含む請求項１に記載のペプ チド。 ４．更にポリペプチドＮＧＦをカルボキシル末端に含む請求項１に記載のペプチ ド。 ５．更にポリペプチドＮＴ−４をカルボキシル末端に含む請求項１に記載のペプ チド。 ６．配列番号２の配列を含む核酸。 ７．配列番号３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１ からなる群の中から選択される配列を含む核酸。 ８．配列番号３の配列を含む核酸。 ９．配列番号１８の配列を含む核酸。 １０．配列番号１９の配列を含む核酸。 １１．配列番号２０の配列を含む核酸。 １２．配列番号２１の配列を含む核酸。 １３．Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を３’末端に更に含む 請求項６に記載の核酸。 １４．ＮＧＦポリペプチドがＢＤＮＦである請求項１３に記載の核酸。 １５．ＮＧＦポリペプチドがＮＴ−３である請求項１３に記載の核酸。 １６．ＮＧＦポリペプチドがＮＧＦである請求項１３に記載の核酸。 １７．ＮＧＦポリペプチドがＮＴ−４である請求項１３に記載の核酸。 １８．Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を３’末端に更に含む 請求項８に記載の核酸。 １９．ＮＧＦポリペプチドがＢＤＮＦである請求項１８に記載の核酸。 ２０．ＮＧＦポリペプチドがＮＴ−３である請求項１８に記載の核酸。 ２１．ＮＧＦポリペプチドがＮＧＦである請求項１８に記載の核酸。 ２２．ＮＧＦポリペプチドがＮＴ−４である請求項１８に記載の核酸。 ２３．Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を３’末端に更に含む 請求項９に記載の核酸。 ２４．ＮＴ−３である請求項２３に記載のＮＧＦポリペプチド。 ２５．Ｍｅｔを欠くＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を３’末端に更に含む 請求項１１に記載の核酸。 ２６．ＮＴ−３である請求項２５に記載のＮＧＦポリペプチド。 ２７．請求項６、７、８、９、１０、１１又は１２に記載の核酸を含むベクター 。 ２８．請求項１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、 ２３、２４、２５又は２６に記載の核酸を含むベクター。 ２９．ベクターｐＣＦＭ１６５６／ＢＤＮＦｏｐｔ３。 ３０．ベクターｐＣＦＭ１６５６／ＮＴ−３ｏｐｔ３。 ３１．請求項２８、２９又は３０に記載のベクターが挿入されている原核生物宿 主細胞。 ３２．（ａ）請求項２９、３０又は３１に記載の原核生物宿主細胞を培養し、 （ｂ）分泌ＮＧＦポリペプチドを分離する ことからなるＭｅｔを欠く形態のＮＧＦポリペプチドの製造方法。