JPH05292952A - 化学物質の生合成による製造方法 - Google Patents
化学物質の生合成による製造方法Info
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- JPH05292952A JPH05292952A JP4315533A JP31553392A JPH05292952A JP H05292952 A JPH05292952 A JP H05292952A JP 4315533 A JP4315533 A JP 4315533A JP 31553392 A JP31553392 A JP 31553392A JP H05292952 A JPH05292952 A JP H05292952A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】ポリペプチド前駆体をコードするプラスミドに
よりトランスホームした細菌宿主であって、発現したポ
リペプチド前駆体と反応し、少なくとも１つのデヒドロ
アミノ酸および／または少なくとも１つのランチオン結
合を含むポリペプチドを生産しうる多酵素複合体を含む
宿主を提供する。 【構成】 外来のポリペプチド前駆体をコードするヌク
レオチド配列を含むプラスミドでトランスホームした細
菌宿主細胞であって、該宿主が該ポリペプチド前駆体を
発現し得、かつ、該ポリペプチド前駆体と反応して該宿
主にとって外来のポリペプチドであって、少なくとも１
つのデヒドロアミノ酸、少なくとも１つのランチオン結
合、または少なくとも１つのデヒドロアミノ酸および少
なくとも１つのランチオン結合を含むポリペプチドを生
産しうる多酵素複合体を含む宿主。
よりトランスホームした細菌宿主であって、発現したポ
リペプチド前駆体と反応し、少なくとも１つのデヒドロ
アミノ酸および／または少なくとも１つのランチオン結
合を含むポリペプチドを生産しうる多酵素複合体を含む
宿主を提供する。 【構成】 外来のポリペプチド前駆体をコードするヌク
レオチド配列を含むプラスミドでトランスホームした細
菌宿主細胞であって、該宿主が該ポリペプチド前駆体を
発現し得、かつ、該ポリペプチド前駆体と反応して該宿
主にとって外来のポリペプチドであって、少なくとも１
つのデヒドロアミノ酸、少なくとも１つのランチオン結
合、または少なくとも１つのデヒドロアミノ酸および少
なくとも１つのランチオン結合を含むポリペプチドを生
産しうる多酵素複合体を含む宿主。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、化学物質の生合成、よ
り具体的にはデヒドロアミノ酸残基、および／またはチ
オエーテル結合を含む化学物質の生合成に関する。ま
た、本発明は、該化学物質の生合成に関する酵素を生産
するための組み換え遺伝学の利用に関する。
り具体的にはデヒドロアミノ酸残基、および／またはチ
オエーテル結合を含む化学物質の生合成に関する。ま
た、本発明は、該化学物質の生合成に関する酵素を生産
するための組み換え遺伝学の利用に関する。
【０００２】
【従来技術】ニシン、ズブチリン、ズラマイシン、シナ
マイシン、アンコベニン、Ｒｏ０９−０１９８およびエ
ピデルミン等のポリペプチド抗生物質は、デヒドロアミ
ノ酸およびランチオニン結合を含んでいる。これらのポ
リペプチドは、種々の各微生物株から生産される。例え
ば、ニシンはストレプトコッカス ラクチン（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｎ）、ズブチリンは枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養す
ることにより生産しうる。
マイシン、アンコベニン、Ｒｏ０９−０１９８およびエ
ピデルミン等のポリペプチド抗生物質は、デヒドロアミ
ノ酸およびランチオニン結合を含んでいる。これらのポ
リペプチドは、種々の各微生物株から生産される。例え
ば、ニシンはストレプトコッカス ラクチン（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｎ）、ズブチリンは枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養す
ることにより生産しうる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】今日まで、これらの抗
生物質の生合成に関する遺伝学的基礎は明らかになって
いない。すなわち、例えばこれらの抗生物質の生合成、
特にこれらの中に見られる異常アミノ酸の生成がリボゾ
ーム合成によるものか、多酵素複合体(complex)による
ものかは分かっていない。さらに、これらの抗生物質の
前駆体タンパク質が明確な構造遺伝子にコードされてい
るのか、または、より大きいタンパク質の分解産物なの
かが分かっていない。
生物質の生合成に関する遺伝学的基礎は明らかになって
いない。すなわち、例えばこれらの抗生物質の生合成、
特にこれらの中に見られる異常アミノ酸の生成がリボゾ
ーム合成によるものか、多酵素複合体(complex)による
ものかは分かっていない。さらに、これらの抗生物質の
前駆体タンパク質が明確な構造遺伝子にコードされてい
るのか、または、より大きいタンパク質の分解産物なの
かが分かっていない。
【０００４】
【発明が解決するための手段】エピデルミンの構造遺伝
子を特定する研究の過程で、意外なことに上述の各抗生
物質、特にエピデルミンが明確な構造遺伝子によってコ
ードされており、かつ、プレ配列ポリペプチドのプロセ
シングがデヒドロアミノ酸残基、および／またはチオエ
ーテル結合の生成に関する酵素複合体によって起こるこ
とが明らかになった。さらに、この多酵素複合体は、プ
レポリペプチドのプロセシングと同時に該タンパク質を
細胞膜を通して培養上清に分泌する事にも関与してい
る。この点に関して、これらの活性は、例えば、以下に
説明するプレ・エピデルミンの−３０乃至−１の配列の
場合のようにプレ・ポリペプチドが有するプレ・配列に
関係している。概して言うと、本発明の一つの特徴は、
通常、宿主によって生産されないポリペプチドをコード
するプラスミドを含む細菌宿主であって、培養に際して
少なくとも１つのデヒドロアミノ酸、および／または、
少なくとも１つのランチオニン結合を含むポリペプチド
であって、該宿主にとって外来のポリペプチドを生産す
る多酵素複合体を提供する宿主を提供することにある。
適当な多酵素複合体とは、以下に示す機能、即ち、水脱
離およびスルフィド結合形成の少なくとも１つを果たし
うるものである。また、この多酵素複合体は、脱炭酸お
よび二重結合形成も行いうる。
子を特定する研究の過程で、意外なことに上述の各抗生
物質、特にエピデルミンが明確な構造遺伝子によってコ
ードされており、かつ、プレ配列ポリペプチドのプロセ
シングがデヒドロアミノ酸残基、および／またはチオエ
ーテル結合の生成に関する酵素複合体によって起こるこ
とが明らかになった。さらに、この多酵素複合体は、プ
レポリペプチドのプロセシングと同時に該タンパク質を
細胞膜を通して培養上清に分泌する事にも関与してい
る。この点に関して、これらの活性は、例えば、以下に
説明するプレ・エピデルミンの−３０乃至−１の配列の
場合のようにプレ・ポリペプチドが有するプレ・配列に
関係している。概して言うと、本発明の一つの特徴は、
通常、宿主によって生産されないポリペプチドをコード
するプラスミドを含む細菌宿主であって、培養に際して
少なくとも１つのデヒドロアミノ酸、および／または、
少なくとも１つのランチオニン結合を含むポリペプチド
であって、該宿主にとって外来のポリペプチドを生産す
る多酵素複合体を提供する宿主を提供することにある。
適当な多酵素複合体とは、以下に示す機能、即ち、水脱
離およびスルフィド結合形成の少なくとも１つを果たし
うるものである。また、この多酵素複合体は、脱炭酸お
よび二重結合形成も行いうる。
【０００５】本発明の方法を実施するのに適した宿主
は、その遺伝物質を修正すること無しにデヒドロアミノ
酸残基および／またはランチオニン結合および／または
メチルランチオニン結合を含むポリペプチドを生産しう
るものである。このような宿主の例には、ストレプトコ
ッカス ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、ストレプトミセス シナモニウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプ
トミセス ｓｐ．ストレプトベルチカラム グリセオベ
ルチシカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒ
ｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スセフィロコッカス エピデルミ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）、スタフィロコッカス エピデルミン ５株（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ ｓｔ
ｒａｉｎ５）、スタフィロコッカス ガリナラム（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およ
びこれらの変異株、例えばエピデルミンを生産しえない
Ｓ．エピデルミン（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３
０９５の変異株がある。特に興味深い株は、１９８８年
５月１８日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラ
ング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎ）に、寄託番号ＤＳＭ４６１６−Ｔｕ３９２
８として寄託されているスタフィロコッカス ガリナラ
ム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒ
ｕｍ）（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｕ３９２８、および１９８
４年１０月２６日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・
サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ）に本出願者により寄託されたスタフ
ィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５である。
は、その遺伝物質を修正すること無しにデヒドロアミノ
酸残基および／またはランチオニン結合および／または
メチルランチオニン結合を含むポリペプチドを生産しう
るものである。このような宿主の例には、ストレプトコ
ッカス ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）、ストレプトミセス シナモニウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプ
トミセス ｓｐ．ストレプトベルチカラム グリセオベ
ルチシカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒ
ｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スセフィロコッカス エピデルミ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）、スタフィロコッカス エピデルミン ５株（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ ｓｔ
ｒａｉｎ５）、スタフィロコッカス ガリナラム（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）およ
びこれらの変異株、例えばエピデルミンを生産しえない
Ｓ．エピデルミン（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３
０９５の変異株がある。特に興味深い株は、１９８８年
５月１８日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・サムラ
ング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔｓｃｈ
ｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎ）に、寄託番号ＤＳＭ４６１６−Ｔｕ３９２
８として寄託されているスタフィロコッカス ガリナラ
ム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒ
ｕｍ）（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｕ３９２８、および１９８
４年１０月２６日、ブダペスト協定に基づきドーシェ・
サムラング・ホン・マイクロオーガニズメン（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ）に本出願者により寄託されたスタフ
ィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５である。
【０００６】適当な宿主をトランスホームするために、
適当なプラスミドを従来の遺伝子工学技術を用いて修正
しうる。プレポリペプチドをコードする遺伝子の修正ま
たは置換により、少なくとも１つのデヒドロアミノ酸残
基および／または少なくとも１つのスルフィド結合を含
むポリペプチドを生産する宿主由来のプラスミドを処理
して該宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプ
ラスミドを提供し、この修正したプラスミドで該宿主を
トランスホームすることが望ましい。プレ・ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を置換または修正するには、様々
な方法が使用される。望ましい化合物のプレ・ポリペプ
チド配列をコードするＤＮＡは、化学合成で調製しう
る。適当な化学合成法は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１２１，３６５（１９８２）に報告されている。従来技
術で、例えば６０−１００塩基のポリヌクレオチドの合
成が可能である。適当な保護ヌクレオチドは、ホスホト
リエステル法（アガーワル（Ａｇａｒｗａｌ）等、Ａｇ
ｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．８４，４８９（１９７２））、ホス
ホトリエステル法（リーセム（Ｒｅｅｓｅｍ）．、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９，３，（１９８３））または
ホスファイトトリエステル法（レジンガー（Ｌｅｔｓｉ
ｎｇｅｒ）等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９８，３
６５５（１９７６））またはホスホアミダイト法で連結
しうる。固相法がポリヌクレオチド合成を簡便にしてい
る。二本鎖ＤＮＡは、化学合成した短いが重複したセグ
メントから酵素的に構築しうる。例えば、両ＤＮＡ鎖の
重複ポリヌクレオチド配列を塩基対合で正しい配置を取
らせ、ＤＮＡリガーゼにより化学的に結合させることが
出来る（コラーナ（Ｋｈｏｒａｎａ）等、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５（１９７６））。
適当なプラスミドを従来の遺伝子工学技術を用いて修正
しうる。プレポリペプチドをコードする遺伝子の修正ま
たは置換により、少なくとも１つのデヒドロアミノ酸残
基および／または少なくとも１つのスルフィド結合を含
むポリペプチドを生産する宿主由来のプラスミドを処理
して該宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプ
ラスミドを提供し、この修正したプラスミドで該宿主を
トランスホームすることが望ましい。プレ・ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を置換または修正するには、様々
な方法が使用される。望ましい化合物のプレ・ポリペプ
チド配列をコードするＤＮＡは、化学合成で調製しう
る。適当な化学合成法は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１２１，３６５（１９８２）に報告されている。従来技
術で、例えば６０−１００塩基のポリヌクレオチドの合
成が可能である。適当な保護ヌクレオチドは、ホスホト
リエステル法（アガーワル（Ａｇａｒｗａｌ）等、Ａｇ
ｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．８４，４８９（１９７２））、ホス
ホトリエステル法（リーセム（Ｒｅｅｓｅｍ）．、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９，３，（１９８３））または
ホスファイトトリエステル法（レジンガー（Ｌｅｔｓｉ
ｎｇｅｒ）等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９８，３
６５５（１９７６））またはホスホアミダイト法で連結
しうる。固相法がポリヌクレオチド合成を簡便にしてい
る。二本鎖ＤＮＡは、化学合成した短いが重複したセグ
メントから酵素的に構築しうる。例えば、両ＤＮＡ鎖の
重複ポリヌクレオチド配列を塩基対合で正しい配置を取
らせ、ＤＮＡリガーゼにより化学的に結合させることが
出来る（コラーナ（Ｋｈｏｒａｎａ）等、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５１，５６５（１９７６））。
【０００７】別の可能性として、短い重複セグメントを
有する２つのＤＮＡ鎖の各ポリヌクレオチド配列を必要
とされるデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリ
メラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼ、または逆転写酵素とインキュベーションす
る事が挙げられる。即ち、２つのポリヌクレオチド配列
が塩基対合で正しい配置を取り、酵素により必要とされ
るヌクレオチドが補填されることによって完全な二本鎖
ＤＮＡが提供される（ナラニー（Ｎａｒａｎｙ）等、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３６５（１９８
２））。ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る別の適
当な方法には、細胞を、例えばＳＤＳまたはプロテナー
ゼＫ、または望ましい場合は機械的に分解し、そのＤＮ
Ａを繰り返しフェノールで抽出することにより除タンパ
クを行うことにより、組織または細胞培養物または微生
物のゲノムＤＮＡからＤＮＡを単離する方法がある。Ｒ
ＮＡはＲＮＡａｓｅで消化しうる。得られた粗ＤＮＡ
は、適当な制限酵素、例えばＨａｅIII およびＡｌｕＩ
で消化し、フラグメントを単離し、適当なファージまた
はコスミド、例えばシャロン４ＡまたはＥＭＢＬ−３フ
ァージ中で増幅した後、例えば、放射能ラベルしたＤＮ
Ａプローブを用いて望ましい配列を検定する。また、望
ましいポリペプチドをコードするＤＮＡは、単離したｍ
ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより得ることが出
来る。この方法は、ＤＮＡの構造が分からない場合に有
効である。この方法では、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライ
ブラリー中のゲノムＤＮＡからＤＮＡを得る。ｃＤＮＡ
ライブラリーには、細胞から単離したｍＲＮＡに相補的
な遺伝情報が含まれている。ｃＤＮＡを得るために、ｍ
ＲＮＡを望ましい基本（出来るだけ未修正の）タンパク
質を発現する細胞から単離する。このｍＲＮＡを二本鎖
ｃＤＮＡに変換する。
有する２つのＤＮＡ鎖の各ポリヌクレオチド配列を必要
とされるデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、ＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリ
メラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼ、または逆転写酵素とインキュベーションす
る事が挙げられる。即ち、２つのポリヌクレオチド配列
が塩基対合で正しい配置を取り、酵素により必要とされ
るヌクレオチドが補填されることによって完全な二本鎖
ＤＮＡが提供される（ナラニー（Ｎａｒａｎｙ）等、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，３６５（１９８
２））。ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る別の適
当な方法には、細胞を、例えばＳＤＳまたはプロテナー
ゼＫ、または望ましい場合は機械的に分解し、そのＤＮ
Ａを繰り返しフェノールで抽出することにより除タンパ
クを行うことにより、組織または細胞培養物または微生
物のゲノムＤＮＡからＤＮＡを単離する方法がある。Ｒ
ＮＡはＲＮＡａｓｅで消化しうる。得られた粗ＤＮＡ
は、適当な制限酵素、例えばＨａｅIII およびＡｌｕＩ
で消化し、フラグメントを単離し、適当なファージまた
はコスミド、例えばシャロン４ＡまたはＥＭＢＬ−３フ
ァージ中で増幅した後、例えば、放射能ラベルしたＤＮ
Ａプローブを用いて望ましい配列を検定する。また、望
ましいポリペプチドをコードするＤＮＡは、単離したｍ
ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより得ることが出
来る。この方法は、ＤＮＡの構造が分からない場合に有
効である。この方法では、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライ
ブラリー中のゲノムＤＮＡからＤＮＡを得る。ｃＤＮＡ
ライブラリーには、細胞から単離したｍＲＮＡに相補的
な遺伝情報が含まれている。ｃＤＮＡを得るために、ｍ
ＲＮＡを望ましい基本（出来るだけ未修正の）タンパク
質を発現する細胞から単離する。このｍＲＮＡを二本鎖
ｃＤＮＡに変換する。
【０００８】ｍＲＮＡの調製には、従来法を使用する。
細胞膜を破壊し、放出される細胞内容物からｍＲＮＡを
単離する。細胞膜は、物理的方法で破壊するか、または
ＳＤＳ等の界面活性剤、クアニジンチオシアネート、限
定塩条件またはホモゲナイゼーション、望ましくはミキ
シングにより分解する事が望ましい。ｍＲＮＡは、フェ
ノール抽出、エタノール沈殿、遠心およびクロマトグラ
フィーを含む標準的方法、望ましくは幾つかの方法を組
み合わせて単離される。遠心は、勾配、例えばＣｓＣｌ
勾配をかけて行うことが望ましい。クロマトグラフィー
に関しては、カラム、特にオリゴ−ｄＴカラムを使用す
ることが望ましい。全ｍＲＮＡは、従来法に従い直接Ｄ
ｓ−ｃＤＮＡに変換しうる。さらに、望ましいポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡは、電気泳動、クロマトグラ
フィーおよび遠心、望ましくはスクロース勾配遠心等の
幾つかの技術を用いて濃縮することが望ましい。望まし
いポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むフラクショ
ンは、インビボまたはインビトロ・トランスレーション
と関連活性の検定、またはヌクレオチド配列が既知の場
合は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダゼー
ション等の種々の方法で検出しうる。インビボ・トラン
スレーション・システムは、原核性または真核性システ
ムで行いうる。望ましいインビボ・トランスレーション
・システムは、ゼノパス レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌ
ａｅｖｉｓ）卵細胞系（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリ
ングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハー
バー、ＮＹ（１９８２））がある。インビトロ・システ
ムには、例えば小麦胚芽およびウサギ網状赤血球溶解物
があり、いずれも市販されている。
細胞膜を破壊し、放出される細胞内容物からｍＲＮＡを
単離する。細胞膜は、物理的方法で破壊するか、または
ＳＤＳ等の界面活性剤、クアニジンチオシアネート、限
定塩条件またはホモゲナイゼーション、望ましくはミキ
シングにより分解する事が望ましい。ｍＲＮＡは、フェ
ノール抽出、エタノール沈殿、遠心およびクロマトグラ
フィーを含む標準的方法、望ましくは幾つかの方法を組
み合わせて単離される。遠心は、勾配、例えばＣｓＣｌ
勾配をかけて行うことが望ましい。クロマトグラフィー
に関しては、カラム、特にオリゴ−ｄＴカラムを使用す
ることが望ましい。全ｍＲＮＡは、従来法に従い直接Ｄ
ｓ−ｃＤＮＡに変換しうる。さらに、望ましいポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡは、電気泳動、クロマトグラ
フィーおよび遠心、望ましくはスクロース勾配遠心等の
幾つかの技術を用いて濃縮することが望ましい。望まし
いポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むフラクショ
ンは、インビボまたはインビトロ・トランスレーション
と関連活性の検定、またはヌクレオチド配列が既知の場
合は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダゼー
ション等の種々の方法で検出しうる。インビボ・トラン
スレーション・システムは、原核性または真核性システ
ムで行いうる。望ましいインビボ・トランスレーション
・システムは、ゼノパス レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌ
ａｅｖｉｓ）卵細胞系（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリ
ングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハー
バー、ＮＹ（１９８２））がある。インビトロ・システ
ムには、例えば小麦胚芽およびウサギ網状赤血球溶解物
があり、いずれも市販されている。
【０００９】未分画または分画したｍＲＮＡ由来のｍＲ
ＮＡプールから従来法にしたがってｄｓ−ｃＤＮＡを得
ることが出来る（望ましい一般的方法は、マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）、オカヤム（Ｏｋａｙ
ａｍ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，１６１−１
７０（１９８２）およびハイデッカー（Ｈｅｉｄｅｃｋ
ｅｒ），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１１，４８９１−４９０６（１９８３））。一般に、先
ず、ｍＲＮＡを逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ
（クレノーフラグメント）を用いてｓｓ−ＤＮＡに変換
する。ｄｓ−ＤＮＡの合成を開始させるには２つの方法
のいずれかが使用される。第１の方法は、ｓｓ−ＤＮＡ
のナチュラル・ループ形成である。第２の方法は、ポリ
−ｄＣまたはポリ−ｄＴ等のホモポリマー・テールをｓ
ｓ−ｃＤＮＡに付加する方法である。対応するポリペプ
チドが検出システムで高い活性を示すｍＲＮＡフラクシ
ョンを従来法に従い相補的ｃＤＮＡに転写する。ｍＲＮ
Ａおよびプライマーのオリゴ−ｄＴを混合し、開始物質
としてｄＮＴＰを添加すると逆転写酵素によりｃＤＮＡ
−ｍＲＮＡハイブリッド分子の合成が行われる。ＲＮＡ
分子はＮａＯＨの添加により分解する。ＤＮＡポリメラ
ーゼ、望ましくはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラ
グメントを混合し、その混合物を適当な温度、望ましく
は１２−１５℃でインキュベートする。この混合物をヌ
クレアーゼＳ１とインキュベーションすることにより、
目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応するｄ
ｓ−ｃＤＮＡが得られる。得られたｄｓ−ｃＤＮＡを増
幅するためには、これを適当なベクター、例えばプラス
ミドｐＵＣ−ＫＯにスプライスし、得られたハイブリッ
ドベクターを適当な宿主、例えば大腸菌ＨＢ１０１を用
いて増やすことが出来る。このハイブリッドベクターを
再び単離し、そこから単離したｃＤＮＡを回収すること
により、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡの構造
を決定することが出来る。
ＮＡプールから従来法にしたがってｄｓ−ｃＤＮＡを得
ることが出来る（望ましい一般的方法は、マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）、オカヤム（Ｏｋａｙ
ａｍ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，１６１−１
７０（１９８２）およびハイデッカー（Ｈｅｉｄｅｃｋ
ｅｒ），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１１，４８９１−４９０６（１９８３））。一般に、先
ず、ｍＲＮＡを逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ
（クレノーフラグメント）を用いてｓｓ−ＤＮＡに変換
する。ｄｓ−ＤＮＡの合成を開始させるには２つの方法
のいずれかが使用される。第１の方法は、ｓｓ−ＤＮＡ
のナチュラル・ループ形成である。第２の方法は、ポリ
−ｄＣまたはポリ−ｄＴ等のホモポリマー・テールをｓ
ｓ−ｃＤＮＡに付加する方法である。対応するポリペプ
チドが検出システムで高い活性を示すｍＲＮＡフラクシ
ョンを従来法に従い相補的ｃＤＮＡに転写する。ｍＲＮ
Ａおよびプライマーのオリゴ−ｄＴを混合し、開始物質
としてｄＮＴＰを添加すると逆転写酵素によりｃＤＮＡ
−ｍＲＮＡハイブリッド分子の合成が行われる。ＲＮＡ
分子はＮａＯＨの添加により分解する。ＤＮＡポリメラ
ーゼ、望ましくはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラ
グメントを混合し、その混合物を適当な温度、望ましく
は１２−１５℃でインキュベートする。この混合物をヌ
クレアーゼＳ１とインキュベーションすることにより、
目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応するｄ
ｓ−ｃＤＮＡが得られる。得られたｄｓ−ｃＤＮＡを増
幅するためには、これを適当なベクター、例えばプラス
ミドｐＵＣ−ＫＯにスプライスし、得られたハイブリッ
ドベクターを適当な宿主、例えば大腸菌ＨＢ１０１を用
いて増やすことが出来る。このハイブリッドベクターを
再び単離し、そこから単離したｃＤＮＡを回収すること
により、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡの構造
を決定することが出来る。
【００１０】ハイブリッドベクターの調製 本発明のハイブリッドベクターは、目的の配列を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクターにス
プライスする事により調製しうる。適当なベクターとは
組み込んだパッセンジャーＤＮＡのキャリヤーであっ
て、宿主微生物のトランスホームに使用しうるものであ
る。ベクターとして適当なものは、非トランスホーム状
態でデヒドロアミノ酸および／またはスルフィド結合を
含むポリペプチドを生産する微生物に由来するプラスミ
ドである。適当なベクターは、決まった位置に挿入ＤＮ
Ａを有している。一般に、これらのベクターは、宿主細
胞または使用される宿主細胞に適合する細胞種に由来す
るレプリコンおよびコントロール配列、即ちプロモータ
ーを含んでいる。通常、このベクターはレプリコン部位
を有し、かつトランスホーム細胞に発現型選択を可能に
する配列（マーカー遺伝子）を含んでいる。適当なマー
カー遺伝子は、抗生物質耐性または重金属耐性を提供す
るか、または宿主の遺伝的欠陥を補う。さらに、これら
のベクターに有用な配列には、エンハンサーおよびアク
チベーター配列がある。適当な開始ベクターには、スタ
フィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５株由来
の５４ kbpのプラスミドｐＥｐｉ３２があり、これはプ
ラスミドｐＴｕ３２と同じである。以下に特徴を示すこ
のプラスミドは、テトラサイクリック２１−ペプチド・
アミド抗生物質にプロセシングされる５２−プレペプチ
ドをコードするｅｐｉＡ遺伝子を含んでいる。パッセン
ジャーＤＮＡを含むベクターをハイブリッドベクターと
呼ぶ。
ポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なベクターにス
プライスする事により調製しうる。適当なベクターとは
組み込んだパッセンジャーＤＮＡのキャリヤーであっ
て、宿主微生物のトランスホームに使用しうるものであ
る。ベクターとして適当なものは、非トランスホーム状
態でデヒドロアミノ酸および／またはスルフィド結合を
含むポリペプチドを生産する微生物に由来するプラスミ
ドである。適当なベクターは、決まった位置に挿入ＤＮ
Ａを有している。一般に、これらのベクターは、宿主細
胞または使用される宿主細胞に適合する細胞種に由来す
るレプリコンおよびコントロール配列、即ちプロモータ
ーを含んでいる。通常、このベクターはレプリコン部位
を有し、かつトランスホーム細胞に発現型選択を可能に
する配列（マーカー遺伝子）を含んでいる。適当なマー
カー遺伝子は、抗生物質耐性または重金属耐性を提供す
るか、または宿主の遺伝的欠陥を補う。さらに、これら
のベクターに有用な配列には、エンハンサーおよびアク
チベーター配列がある。適当な開始ベクターには、スタ
フィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５株由来
の５４ kbpのプラスミドｐＥｐｉ３２があり、これはプ
ラスミドｐＴｕ３２と同じである。以下に特徴を示すこ
のプラスミドは、テトラサイクリック２１−ペプチド・
アミド抗生物質にプロセシングされる５２−プレペプチ
ドをコードするｅｐｉＡ遺伝子を含んでいる。パッセン
ジャーＤＮＡを含むベクターをハイブリッドベクターと
呼ぶ。
【００１１】目的のＤＮＡは、従来法に従い開始ベクタ
ーにスプライスする。例えば、先ず開始プラスミドを適
当な制限酵素、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２の場合は
ＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで線状化
し、ｄＧＴＰおよびターミナル・デオキシヌクレオチジ
ル・トランスフェラーゼの存在下でｄＧテール化する。
二本鎖ｃＤＮＡ挿入物は、ｄＣＴＰおよびターミナル・
デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下
でｄＣテール化する。ｃＤＮＡおよびベクターを合わせ
ることによりハイブリッドベクターが出来る。ゲノムラ
イブラリーを構築するには、ラムダ等のバクテリオファ
ージが望ましい。ラムダ・クローニング・システムにつ
いては、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）に
より報告されている。適当なベクターＤＮＡを適当な制
限酵素で完全に消化し、速度勾配遠心またはゲル電気泳
動により左右のアームと中央フラグメントを分離する。
別の方法では、左右のアームに認識部位を欠くスタッフ
ァーフラグメントの一部を制限酵素で消化する。単離し
たゲノムＤＮＡを長さ１３−２０ kbpのフラグメントに
部分分解する。その後、アームをアームの末端と適合す
る末端を有する外来ＤＮＡのフラグメントとライゲーシ
ョンする。最初のクローニングに使用したベクターから
適当なＤＮＡ挿入物を適当な発現ベクターに再クローニ
ングする。最後に、適当な制限酵素を、可能ならオキソ
ヌクレオンと組み合わせて使用して目的のＤＮＡフラグ
メントを生成する。ＤＮＡ挿入物は、従来の適当なプラ
スミドベクターの多くの部位、例えばｐＣ１９４、ｐＴ
１８１およびｐＵＢ１１０のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ
／ＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングしうる。
ーにスプライスする。例えば、先ず開始プラスミドを適
当な制限酵素、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２の場合は
ＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで線状化
し、ｄＧＴＰおよびターミナル・デオキシヌクレオチジ
ル・トランスフェラーゼの存在下でｄＧテール化する。
二本鎖ｃＤＮＡ挿入物は、ｄＣＴＰおよびターミナル・
デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼの存在下
でｄＣテール化する。ｃＤＮＡおよびベクターを合わせ
ることによりハイブリッドベクターが出来る。ゲノムラ
イブラリーを構築するには、ラムダ等のバクテリオファ
ージが望ましい。ラムダ・クローニング・システムにつ
いては、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（上述）に
より報告されている。適当なベクターＤＮＡを適当な制
限酵素で完全に消化し、速度勾配遠心またはゲル電気泳
動により左右のアームと中央フラグメントを分離する。
別の方法では、左右のアームに認識部位を欠くスタッフ
ァーフラグメントの一部を制限酵素で消化する。単離し
たゲノムＤＮＡを長さ１３−２０ kbpのフラグメントに
部分分解する。その後、アームをアームの末端と適合す
る末端を有する外来ＤＮＡのフラグメントとライゲーシ
ョンする。最初のクローニングに使用したベクターから
適当なＤＮＡ挿入物を適当な発現ベクターに再クローニ
ングする。最後に、適当な制限酵素を、可能ならオキソ
ヌクレオンと組み合わせて使用して目的のＤＮＡフラグ
メントを生成する。ＤＮＡ挿入物は、従来の適当なプラ
スミドベクターの多くの部位、例えばｐＣ１９４、ｐＴ
１８１およびｐＵＢ１１０のＨｉｎｄIII ／ＢａｍＨＩ
／ＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングしうる。
【００１２】このように、本発明の方法は、既知のペプ
チドおよびホルモンの誘導物であって、その未修正のペ
プチド内のシステイン残基をスルフィド結合アミノ酸に
置換し、かつセリンおよびチアミンを対応するデヒドロ
アミノ酸残基に置換した誘導体を調製するのに使用しう
る。これらのフラグメントは、直接粘着末端を用いる
か、または適当に化学合成されたオリゴヌクレオチド・
ブリッジを付加することにより適当な発現ベクターに組
み込まれる。末端の修正には、例えばＨｉｎｄIII およ
びＢｇｌIIを使用しうる。この方法は、制限酵素の種類
に制限されることはない。適当な制限酵素と化学合成し
たオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することによ
り、発現ベクターとＤＮＡ挿入物とを結合することがで
きる。また、部位特異的突然変異を有するポリペプチド
をコードする適当なＤＮＡ挿入物も得ることが出来る。
目的の変異体を得るために基本となるＤＮＡに突然変異
を誘導するには、種々の方法を使用しうる。１つの方法
では、先ず、変異させる領域をコードする配列を含む天
然の、または基本遺伝子のフラグメントをファージの複
製型、例えばＭ１３ｍｐ８ＰＡを調製する場合のＭ１３
ｍｐ８に挿入する。挿入する配列に相補的出るが、置換
するアミノ酸をコードする１つ以上のヌクレオチドトリ
プレットを含む合成オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ８
Ａの一本鎖にアニールし、二本鎖領域を作る。この領域
は、残りの相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成のプライ
マーの役割を果たす。複製および同定後、この変異配列
をさらに修正するか、もしくは変異ポリペプチドを発現
する適当なベクターの構築に用いる。
チドおよびホルモンの誘導物であって、その未修正のペ
プチド内のシステイン残基をスルフィド結合アミノ酸に
置換し、かつセリンおよびチアミンを対応するデヒドロ
アミノ酸残基に置換した誘導体を調製するのに使用しう
る。これらのフラグメントは、直接粘着末端を用いる
か、または適当に化学合成されたオリゴヌクレオチド・
ブリッジを付加することにより適当な発現ベクターに組
み込まれる。末端の修正には、例えばＨｉｎｄIII およ
びＢｇｌIIを使用しうる。この方法は、制限酵素の種類
に制限されることはない。適当な制限酵素と化学合成し
たオリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することによ
り、発現ベクターとＤＮＡ挿入物とを結合することがで
きる。また、部位特異的突然変異を有するポリペプチド
をコードする適当なＤＮＡ挿入物も得ることが出来る。
目的の変異体を得るために基本となるＤＮＡに突然変異
を誘導するには、種々の方法を使用しうる。１つの方法
では、先ず、変異させる領域をコードする配列を含む天
然の、または基本遺伝子のフラグメントをファージの複
製型、例えばＭ１３ｍｐ８ＰＡを調製する場合のＭ１３
ｍｐ８に挿入する。挿入する配列に相補的出るが、置換
するアミノ酸をコードする１つ以上のヌクレオチドトリ
プレットを含む合成オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ８
Ａの一本鎖にアニールし、二本鎖領域を作る。この領域
は、残りの相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成のプライ
マーの役割を果たす。複製および同定後、この変異配列
をさらに修正するか、もしくは変異ポリペプチドを発現
する適当なベクターの構築に用いる。
【００１３】エピデルミンに関して行った研究では、エ
ピデルミンに関して提唱されているプレ・配列の適当な
ペンタペプチドＬｙｓＰｈｅＣｙｓＴｈｒから誘導され
るワブルＤＮＡプローブ５’−ＧＴＧ（Ａ）ＣＡＴ（Ｇ
／Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＡＡＴ（Ｃ）ＴＴ−３’を合成し
た。このＤＮＡプローブをＳ．エピデルミン（ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３０９５由来のプラスミドＤＮＡに
ハイブリダイズした。単離したプラスミドの制限分析に
より、ＥｃｏＲＩで７個のフラグメント（１６，１１，
１０，６．５，５．５，３．５および２．５ kbp）、Ｈ
ｉｎｄIII で９個のＤＮＡフラグメント（１７，１４，
１０，５．３，２．８，１．８，０．８，０．６および
０．５ kbp）およびＢａｍＨＩで５個のＤＮＡフラグメ
ント（２０，１９，１０，３および１ kbp）が確認され
た。５．４ kbpのＨｉｎｄIII フラグメントをサブクロ
ーン化し、リハイブリダゼーションする事により、構造
遺伝子ｅｐｉＡは２．２ kbpＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラ
グメントに存在することが分かった。ハイブリダゼーシ
ョンプローブとして２４種の１４マーの混合物を使用し
た。ノビク（Ｎｏｖｉｋ）等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．１８２，２７９−２９４（１９７１）、サ
ザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ
ｌ．９８，５０３−５１７（１９７５）およびハインリ
ッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌ．ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９，５６３−５６９（１９８７）
に示されている技術に従い、シーケンシングプライマー
として３０倍過剰量のプローブを使用した。エピデルミ
ンのペプチド配列で、オープン・リーディング・フレー
ムを同定しえた。シャイン・ダルガルノ配列から適当な
距離に単一のメチオニンコドンが存在している。プレ・
エピデルミンの構造遺伝子はＴＡＡ停止コドンで終わっ
ており、その結果、プレ・エピデルミンは５２個のアミ
ノ酸を含み（第１図）、Ａｒｇ-1およびＩｌｅ+1の間で
プロセシングされてエピデルミンとなる。以上のことか
ら明らかなように、プレ・エピデルミンはより大きいタ
ンパク質の分解産物ではなく、明確な構造遺伝子により
コードされている。従って、意外にも抗生物質の前駆体
タンパク質は、明確な構造遺伝子によってコードされて
いることが明らかになった。
ピデルミンに関して提唱されているプレ・配列の適当な
ペンタペプチドＬｙｓＰｈｅＣｙｓＴｈｒから誘導され
るワブルＤＮＡプローブ５’−ＧＴＧ（Ａ）ＣＡＴ（Ｇ
／Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＡＡＴ（Ｃ）ＴＴ−３’を合成し
た。このＤＮＡプローブをＳ．エピデルミン（ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｎ）ＤＳＭ３０９５由来のプラスミドＤＮＡに
ハイブリダイズした。単離したプラスミドの制限分析に
より、ＥｃｏＲＩで７個のフラグメント（１６，１１，
１０，６．５，５．５，３．５および２．５ kbp）、Ｈ
ｉｎｄIII で９個のＤＮＡフラグメント（１７，１４，
１０，５．３，２．８，１．８，０．８，０．６および
０．５ kbp）およびＢａｍＨＩで５個のＤＮＡフラグメ
ント（２０，１９，１０，３および１ kbp）が確認され
た。５．４ kbpのＨｉｎｄIII フラグメントをサブクロ
ーン化し、リハイブリダゼーションする事により、構造
遺伝子ｅｐｉＡは２．２ kbpＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラ
グメントに存在することが分かった。ハイブリダゼーシ
ョンプローブとして２４種の１４マーの混合物を使用し
た。ノビク（Ｎｏｖｉｋ）等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．１８２，２７９−２９４（１９７１）、サ
ザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ
ｌ．９８，５０３−５１７（１９７５）およびハインリ
ッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）等、Ｍｏｌｅｃｕｌ．ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９，５６３−５６９（１９８７）
に示されている技術に従い、シーケンシングプライマー
として３０倍過剰量のプローブを使用した。エピデルミ
ンのペプチド配列で、オープン・リーディング・フレー
ムを同定しえた。シャイン・ダルガルノ配列から適当な
距離に単一のメチオニンコドンが存在している。プレ・
エピデルミンの構造遺伝子はＴＡＡ停止コドンで終わっ
ており、その結果、プレ・エピデルミンは５２個のアミ
ノ酸を含み（第１図）、Ａｒｇ-1およびＩｌｅ+1の間で
プロセシングされてエピデルミンとなる。以上のことか
ら明らかなように、プレ・エピデルミンはより大きいタ
ンパク質の分解産物ではなく、明確な構造遺伝子により
コードされている。従って、意外にも抗生物質の前駆体
タンパク質は、明確な構造遺伝子によってコードされて
いることが明らかになった。
【００１４】二次構造（α、β）、フレキシビリティ
ー、ハイドロパシー、親水性（第２図）およびヘリック
ス・ホイール・プロットに関する予測をハイコン（Ｈｙ
ｃｏｎ）プログラムを用いて行った（第３図）。プレ・
エピデルミン−３０乃至−８に関して高いα−ヘリック
ス含量の可能性が予測され、一方、プロ・エピデルミン
に対応するＣ末端部分には高いターン含量の可能性が示
された。さらに、予測プロットは、Ｎ末端−３０乃至−
１が高い親水性、一方、Ｃ末端部分がより親油性である
ことを明確に示している。Ｎ末端部分−３０乃至−８
は、部分的に折り畳んでおり、両親媒的α−ヘリックス
となっているようである。プレ・エピデルミンのＮ末端
セグメントはシステイン残基を含んでおらず、一方、Ｃ
末端セグメント１−２２はスルフィド結合形成に関する
４個のシステイン残基を含んでいる。配列−３０乃至−
１はエンドプロテアーゼに対する多くの切断部位を含ん
でいるが、一方、プレ・エピデルミン状態でさえ、配列
１−２２は蛋白分解に対して非常に耐性を有している。
成熟型抗生物質は部位１３のＬｙｓでのみトリプシンの
攻撃を受ける。プロセシング部位Ａｒｇ-1−Ｉｌｅ
+1は、ターン形成するＰｒｏ-2のために親水性で接近可
能となっている。
ー、ハイドロパシー、親水性（第２図）およびヘリック
ス・ホイール・プロットに関する予測をハイコン（Ｈｙ
ｃｏｎ）プログラムを用いて行った（第３図）。プレ・
エピデルミン−３０乃至−８に関して高いα−ヘリック
ス含量の可能性が予測され、一方、プロ・エピデルミン
に対応するＣ末端部分には高いターン含量の可能性が示
された。さらに、予測プロットは、Ｎ末端−３０乃至−
１が高い親水性、一方、Ｃ末端部分がより親油性である
ことを明確に示している。Ｎ末端部分−３０乃至−８
は、部分的に折り畳んでおり、両親媒的α−ヘリックス
となっているようである。プレ・エピデルミンのＮ末端
セグメントはシステイン残基を含んでおらず、一方、Ｃ
末端セグメント１−２２はスルフィド結合形成に関する
４個のシステイン残基を含んでいる。配列−３０乃至−
１はエンドプロテアーゼに対する多くの切断部位を含ん
でいるが、一方、プレ・エピデルミン状態でさえ、配列
１−２２は蛋白分解に対して非常に耐性を有している。
成熟型抗生物質は部位１３のＬｙｓでのみトリプシンの
攻撃を受ける。プロセシング部位Ａｒｇ-1−Ｉｌｅ
+1は、ターン形成するＰｒｏ-2のために親水性で接近可
能となっている。
【００１５】エピデルミンなどの抗生物質の生産におい
て発生する種々の酵素反応には、プロ・ポリペプチド部
分１−２２の修飾、Ｎ末端プレペプチドフラグメント−
３０乃至−１の切断および成熟型抗生物質の分泌が含ま
れる（第４図および第５図）。酵素的修飾は、プレペプ
チドフラグメントの切断前に起こる。酵素的修飾には、
デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン残基を生成す
る各々部位５、１６、１９および８、１４のＳｅｒおよ
びＴｈｒ残基からの水の脱離が含まれる。また、部位
２、１１、２１および２２のＣｙｓ残基のチオール基の
Ｃ＝Ｃ二重結合への付加も起こり、メソ−ランチオニン
または（２Ｓ ３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオニ
ン結合が生ずる。さらに、残基２２の脱炭酸および二重
結合形成でＣ末端Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−シス
テインが生ずる。Ｃ末端に存在するシステインのチオー
ル基とＮ末端に存在するデヒドロアミノ酸との反応は、
エピデルミン、ニシンおよびズブチリンにおいては完全
な立体特異性を以て起こる。従って、修飾の際のこれら
の脱離・付加反応は、プレ・エピデルミンの残基Ｌ−Ｓ
ｅｒおよびＬ−ＴｈｒのＣα炭素原子の配置を逆転させ
Ｄ型Ｃα原子とする事を意味している。また、４個のス
ルフィド環が、結果的に同じ触媒部位に生成するが、こ
の事はＮ末端の両親媒体性α−ヘリックスとの相互作用
で支持される。Ｔｈｒ+14 のみが、システインとは無関
係に脱水する。この部位（Ｌｙｓ+13 −Ｄｈｂ+14 ）は
酵素切断部位を形成しており、ここでトリプシンがエピ
デルミンを失活させる。スルフィド環生成によりＣ末端
のリジディティーおよび疎水性が増加して、脂質二重層
とプロ・エピデルミンとの相互作用を促進され、かつ、
トランスロケーションが誘導される。最後に、親水性の
α−ヘリックスＮ末端−３０乃至−１は、上述の特徴的
切断部位で特異的プロテアーゼにより切断を受ける。
て発生する種々の酵素反応には、プロ・ポリペプチド部
分１−２２の修飾、Ｎ末端プレペプチドフラグメント−
３０乃至−１の切断および成熟型抗生物質の分泌が含ま
れる（第４図および第５図）。酵素的修飾は、プレペプ
チドフラグメントの切断前に起こる。酵素的修飾には、
デヒドロアラニンおよびデヒドロブチリン残基を生成す
る各々部位５、１６、１９および８、１４のＳｅｒおよ
びＴｈｒ残基からの水の脱離が含まれる。また、部位
２、１１、２１および２２のＣｙｓ残基のチオール基の
Ｃ＝Ｃ二重結合への付加も起こり、メソ−ランチオニン
または（２Ｓ ３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオニ
ン結合が生ずる。さらに、残基２２の脱炭酸および二重
結合形成でＣ末端Ｓ−（２−アミノビニル）−Ｄ−シス
テインが生ずる。Ｃ末端に存在するシステインのチオー
ル基とＮ末端に存在するデヒドロアミノ酸との反応は、
エピデルミン、ニシンおよびズブチリンにおいては完全
な立体特異性を以て起こる。従って、修飾の際のこれら
の脱離・付加反応は、プレ・エピデルミンの残基Ｌ−Ｓ
ｅｒおよびＬ−ＴｈｒのＣα炭素原子の配置を逆転させ
Ｄ型Ｃα原子とする事を意味している。また、４個のス
ルフィド環が、結果的に同じ触媒部位に生成するが、こ
の事はＮ末端の両親媒体性α−ヘリックスとの相互作用
で支持される。Ｔｈｒ+14 のみが、システインとは無関
係に脱水する。この部位（Ｌｙｓ+13 −Ｄｈｂ+14 ）は
酵素切断部位を形成しており、ここでトリプシンがエピ
デルミンを失活させる。スルフィド環生成によりＣ末端
のリジディティーおよび疎水性が増加して、脂質二重層
とプロ・エピデルミンとの相互作用を促進され、かつ、
トランスロケーションが誘導される。最後に、親水性の
α−ヘリックスＮ末端−３０乃至−１は、上述の特徴的
切断部位で特異的プロテアーゼにより切断を受ける。
【００１６】上述の技術を用い、ランチビオティクスを
コードするプラスミドを各ポリペプチドをコードする遺
伝子の突然変異または異なるポリペプチドをコードする
遺伝子でそのような遺伝子を置換することにより修正
し、本来の宿主、もしくは、天然の状態でそれらの宿主
がランチビオティクス発現しうる場合には、別の宿主を
トランスホームするのに使用しうる。一般に、例えばエ
ピデルミンの場合について上述したように、本来の機能
的遺伝子がプレ・配列をコードしている場合、そのよう
なプレ・配列をコードしているＤＮＡ配列は、修正した
プラスミドに保持しうる。この場合、新規の、または変
異したプロ・ポリペプチドに関するＤＮＡ配列は、本来
のプロ・ポリペプチド配列と同様にプレ・配列の直ぐ上
流に位置することになる。本発明の細菌宿主の培養は、
例えば、１９８８年５月１８日の英国特許出願第８８１
１７６０．１号およびヨーロッパ特許出願第０ １８１
５７８号に示されているような従来の培養条件で行い
うる。また、目的のタンパク質の精製および単離もエピ
デルミンおよびガリデルミンに関して先の特許出願に示
されている、吸着剤、イオン交換樹脂および望ましい場
合はＨＰＬＣを使用する方法または適当な修正法を用い
て行いうる。
コードするプラスミドを各ポリペプチドをコードする遺
伝子の突然変異または異なるポリペプチドをコードする
遺伝子でそのような遺伝子を置換することにより修正
し、本来の宿主、もしくは、天然の状態でそれらの宿主
がランチビオティクス発現しうる場合には、別の宿主を
トランスホームするのに使用しうる。一般に、例えばエ
ピデルミンの場合について上述したように、本来の機能
的遺伝子がプレ・配列をコードしている場合、そのよう
なプレ・配列をコードしているＤＮＡ配列は、修正した
プラスミドに保持しうる。この場合、新規の、または変
異したプロ・ポリペプチドに関するＤＮＡ配列は、本来
のプロ・ポリペプチド配列と同様にプレ・配列の直ぐ上
流に位置することになる。本発明の細菌宿主の培養は、
例えば、１９８８年５月１８日の英国特許出願第８８１
１７６０．１号およびヨーロッパ特許出願第０ １８１
５７８号に示されているような従来の培養条件で行い
うる。また、目的のタンパク質の精製および単離もエピ
デルミンおよびガリデルミンに関して先の特許出願に示
されている、吸着剤、イオン交換樹脂および望ましい場
合はＨＰＬＣを使用する方法または適当な修正法を用い
て行いうる。
【００１７】本発明の方法は、実験用の新規化合物の生
成、または新規宿主中の既知化合物または既知化合物の
誘導体の生成に応用しうる。例えば、エピデルミンをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドをストレプトコッカス
ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）にトランスホームして該宿主からエピデルミンを生
産しうるし、また、ガリデルミンをコードする遺伝子
（先に示した英国特許出願参照）を、例えばプラスミド
ｐＥｐｉ３２におけるようにエピデルミンのプロ・ポリ
ペプチドをコードする遺伝子と置換し、これを用いてス
タフィロコッカスエピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５をトラ
ンスホームして該宿主からガリデルミンを生産しうる。
同様に、ヒトのインシュリンなどのホルモン、オキシト
シン、バソプレシン、ペプチド抗生物質、エラスターゼ
インヒビター等のホルモンインヒビターおよびヒトの組
織プラスミノーゲン活性化因子などの繊維素溶解剤等、
デヒドロアミノ酸残基および／またはランチオニン結合
および／またはメチルランチオニン結合を含む他の生物
学的に活性なペプチド誘導体も生産しうる。親化合物の
生物学的活性を保持すると同時に、これらの化合物の安
定性を増し、寿命を延ばすことが出来る。理想的には、
目的のプロ・ポリペプチドをコードするＤＮＡは、チオ
エーテル結合を形成するためのシステインおよびセリ
ン、および／またはシステインおよびスレオニンに対す
るコドンが含まれるべきである。比較的短いポリペプチ
ド鎖の場合には、通常、これらの各々のコドンはわずか
８個、望ましくはわずか６個のコドンで分離してている
が、もっとも最終的ポリペプチド分子の立体配置に応じ
てより以上の間隔も可能であることが想像される。デヒ
ドロアミノ酸の生成の関しては、通常、これらはセリン
およびスレオニンから誘導されることから、目的のプロ
・ポリペプチドをコードするＤＮＡにはこのようなアミ
ノ酸に対するコドンが含まれる。
成、または新規宿主中の既知化合物または既知化合物の
誘導体の生成に応用しうる。例えば、エピデルミンをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドをストレプトコッカス
ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）にトランスホームして該宿主からエピデルミンを生
産しうるし、また、ガリデルミンをコードする遺伝子
（先に示した英国特許出願参照）を、例えばプラスミド
ｐＥｐｉ３２におけるようにエピデルミンのプロ・ポリ
ペプチドをコードする遺伝子と置換し、これを用いてス
タフィロコッカスエピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５をトラ
ンスホームして該宿主からガリデルミンを生産しうる。
同様に、ヒトのインシュリンなどのホルモン、オキシト
シン、バソプレシン、ペプチド抗生物質、エラスターゼ
インヒビター等のホルモンインヒビターおよびヒトの組
織プラスミノーゲン活性化因子などの繊維素溶解剤等、
デヒドロアミノ酸残基および／またはランチオニン結合
および／またはメチルランチオニン結合を含む他の生物
学的に活性なペプチド誘導体も生産しうる。親化合物の
生物学的活性を保持すると同時に、これらの化合物の安
定性を増し、寿命を延ばすことが出来る。理想的には、
目的のプロ・ポリペプチドをコードするＤＮＡは、チオ
エーテル結合を形成するためのシステインおよびセリ
ン、および／またはシステインおよびスレオニンに対す
るコドンが含まれるべきである。比較的短いポリペプチ
ド鎖の場合には、通常、これらの各々のコドンはわずか
８個、望ましくはわずか６個のコドンで分離してている
が、もっとも最終的ポリペプチド分子の立体配置に応じ
てより以上の間隔も可能であることが想像される。デヒ
ドロアミノ酸の生成の関しては、通常、これらはセリン
およびスレオニンから誘導されることから、目的のプロ
・ポリペプチドをコードするＤＮＡにはこのようなアミ
ノ酸に対するコドンが含まれる。
【００１８】本発明の方法にしたがって生産したポリペ
プチド中に存在する異常アミノ酸には、デヒドロアラニ
ン、２，３−デヒドロ−２−アミノ酪酸、メソ−ランチ
オニン、（２Ｓ，３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオ
ニン、Ｓ−（２−（Ｚ）−アミノビニル）−Ｄ−システ
イン、リシノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギ
ン酸がある。これらの残基の構造を第６図に示す。意外
にも、プレ・エピデルミンの翻訳後の修飾に関する多酵
素複合体が、スタフィロコッカス エピデルミン（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ
３２９８／ＤＳＭ３０９５の５４ kbpのプラスミドｐＴ
ｕ３２に存在することが分かった。本明細書ではエピデ
ルミンの生産を担っている６個の遺伝子（ＯＲＦ）をｅ
ｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰと命名するが、これら
は８ｋｂ内に集まっており、また、これらがコードする
タンパク質をそれぞれＥｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｑおよび
Ｐと命名した。ｅｐｉＡは、５２アミノ酸残基長のプレ
・エピデルミンである。以下に述べるように、ｅｐｉ
Ｂ、ＣおよびＤは、４個の酵素的修飾反応(i）セリン／
スレオニン デヒドラターゼによる水脱離、(ii)ランチ
オニン シンテースによる硫黄付加、(iii) システイン
脱炭酸酵素によるＣ末端脱炭酸および(iv)二重結合形成
に関連する。ＥｐｉＰタンパク質は、セリンプロテアー
ゼの本質的ドメインとの著しい類似性に基づくＮ末端リ
ーダーペプチドからの成熟型エピデルミンの切断を担う
と考えられているが（コイデ（Ｋｏｉｄｅ）等、Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：１１０−１１６（１９８
６）；メロン（Ｍｅｌｏｕｎ）等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．１８３：１９５−２００（１９８５）；およびスト
ール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５
８：４１１−４１８（１９８４））、一方、ＥｐｉＱ
は、大腸菌のｐｈｏＢ遺伝子への明確な類似性（マキノ
（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：
３７−４４（１９８６））、両タンパク質が２０５（Ｅ
ｐｉＱ）および２２９（ｐｈｏＢ）アミノ酸残基長と同
じサイズであるという事実、１５３個のＣ末端アミノ酸
残基に渡る２４．２％の類似性および両タンパク質の親
水性プロットに基づき、エピデルミンの整合性を調節す
る調節タンパク質であると考えられる。
プチド中に存在する異常アミノ酸には、デヒドロアラニ
ン、２，３−デヒドロ−２−アミノ酪酸、メソ−ランチ
オニン、（２Ｓ，３Ｓ，６Ｒ）−３−メチル−ランチオ
ニン、Ｓ−（２−（Ｚ）−アミノビニル）−Ｄ−システ
イン、リシノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギ
ン酸がある。これらの残基の構造を第６図に示す。意外
にも、プレ・エピデルミンの翻訳後の修飾に関する多酵
素複合体が、スタフィロコッカス エピデルミン（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ
３２９８／ＤＳＭ３０９５の５４ kbpのプラスミドｐＴ
ｕ３２に存在することが分かった。本明細書ではエピデ
ルミンの生産を担っている６個の遺伝子（ＯＲＦ）をｅ
ｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰと命名するが、これら
は８ｋｂ内に集まっており、また、これらがコードする
タンパク質をそれぞれＥｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｑおよび
Ｐと命名した。ｅｐｉＡは、５２アミノ酸残基長のプレ
・エピデルミンである。以下に述べるように、ｅｐｉ
Ｂ、ＣおよびＤは、４個の酵素的修飾反応(i）セリン／
スレオニン デヒドラターゼによる水脱離、(ii)ランチ
オニン シンテースによる硫黄付加、(iii) システイン
脱炭酸酵素によるＣ末端脱炭酸および(iv)二重結合形成
に関連する。ＥｐｉＰタンパク質は、セリンプロテアー
ゼの本質的ドメインとの著しい類似性に基づくＮ末端リ
ーダーペプチドからの成熟型エピデルミンの切断を担う
と考えられているが（コイデ（Ｋｏｉｄｅ）等、Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：１１０−１１６（１９８
６）；メロン（Ｍｅｌｏｕｎ）等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．１８３：１９５−２００（１９８５）；およびスト
ール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５
８：４１１−４１８（１９８４））、一方、ＥｐｉＱ
は、大腸菌のｐｈｏＢ遺伝子への明確な類似性（マキノ
（Ｍａｋｉｎｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：
３７−４４（１９８６））、両タンパク質が２０５（Ｅ
ｐｉＱ）および２２９（ｐｈｏＢ）アミノ酸残基長と同
じサイズであるという事実、１５３個のＣ末端アミノ酸
残基に渡る２４．２％の類似性および両タンパク質の親
水性プロットに基づき、エピデルミンの整合性を調節す
る調節タンパク質であると考えられる。
【００１９】エピデルミン生合成に関する全遺伝的情報
の予想外の知見およびタンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、Ｑ
およびＰに対する遺伝子の解釈の結果から、これらのタ
ンパク質をコードするＤＮＡを単離し、かつ、これらの
遺伝子を１つ異常含むプラスミドを構築する事が出来、
その結果、このようなプラスミドを含む宿主を培養する
ことによりこれらのタンパク質のうちの１つ、または所
定のタンパク質の組み合わせ物を発現し、単離すること
が可能となった。従って、本発明には、タンパク質Ｅｐ
ｉＢまたはＥｐｉＣ、またはＥｐｉＤ、またはＥｐｉＰ
またはＥｐｉＱをそれぞれコードするＤＮＡ配列が含ま
れる。これらの配列は、従来法によるｐＴｕ３２からの
切断および単離、または化学合成または他の従来法で得
ることが出来る。また、このＤＮＡはプラスミド、望ま
しくは発現プラスミドに組み込むことができ、これらの
構築物で適当な宿主にトランスホームした後、その宿主
を培養すると、プロモーターのコントロール下の該構築
物はプラスミドにライゲーションしたＤＮＡにしたがっ
てタンパク質ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、ＥｐｉＰ
またはＥｐｉＱ、またはこれらのタンパク質の組み合わ
せ物を発現するであろう。別に、プラスミドｐＴｕ３２
を適当な制限酵素で処理してＤＮＡ配列の１つまたは他
の部分を切り捨て、目的のプラスミドの遊離末端に必要
とする修正を施した後に再ライゲーションすることで、
ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱの内の所定の１つをコー
ドするＤＮＡ配列を含むプラスミドを作ることが出来
る。さらに、変異体には、ｐＴｕ３２中のエピデルミン
をコードする遺伝子の所定のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列による置換が含まれ、この修正プラスミドを
有する宿主の培養でエピデルミンとは異なるタンパク質
が発現される。従って、ｐＴｕ３２中のエピデルミンを
コードする遺伝子をガリデルミン、またはエピデルミン
変異体、または他のランチビオチック、または他のタン
パク質をコードするＤＮＡ配列で置換することが出来、
それにより生成したプラスミドを通常ランチビオチック
またはタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいず
れも生産しえない適当な宿主にトランスホームし、置換
したＤＮＡ配列および遺伝子ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、Ｐおよ
びＱが発現する条件下で宿主を培養する事により、ガリ
デルミン、エピデルミン変異体またはランチビオチック
の構造的特徴を少なくとも１つ含む他のタンパク質を得
ることが出来る。
の予想外の知見およびタンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、Ｑ
およびＰに対する遺伝子の解釈の結果から、これらのタ
ンパク質をコードするＤＮＡを単離し、かつ、これらの
遺伝子を１つ異常含むプラスミドを構築する事が出来、
その結果、このようなプラスミドを含む宿主を培養する
ことによりこれらのタンパク質のうちの１つ、または所
定のタンパク質の組み合わせ物を発現し、単離すること
が可能となった。従って、本発明には、タンパク質Ｅｐ
ｉＢまたはＥｐｉＣ、またはＥｐｉＤ、またはＥｐｉＰ
またはＥｐｉＱをそれぞれコードするＤＮＡ配列が含ま
れる。これらの配列は、従来法によるｐＴｕ３２からの
切断および単離、または化学合成または他の従来法で得
ることが出来る。また、このＤＮＡはプラスミド、望ま
しくは発現プラスミドに組み込むことができ、これらの
構築物で適当な宿主にトランスホームした後、その宿主
を培養すると、プロモーターのコントロール下の該構築
物はプラスミドにライゲーションしたＤＮＡにしたがっ
てタンパク質ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、ＥｐｉＰ
またはＥｐｉＱ、またはこれらのタンパク質の組み合わ
せ物を発現するであろう。別に、プラスミドｐＴｕ３２
を適当な制限酵素で処理してＤＮＡ配列の１つまたは他
の部分を切り捨て、目的のプラスミドの遊離末端に必要
とする修正を施した後に再ライゲーションすることで、
ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱの内の所定の１つをコー
ドするＤＮＡ配列を含むプラスミドを作ることが出来
る。さらに、変異体には、ｐＴｕ３２中のエピデルミン
をコードする遺伝子の所定のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ配列による置換が含まれ、この修正プラスミドを
有する宿主の培養でエピデルミンとは異なるタンパク質
が発現される。従って、ｐＴｕ３２中のエピデルミンを
コードする遺伝子をガリデルミン、またはエピデルミン
変異体、または他のランチビオチック、または他のタン
パク質をコードするＤＮＡ配列で置換することが出来、
それにより生成したプラスミドを通常ランチビオチック
またはタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいず
れも生産しえない適当な宿主にトランスホームし、置換
したＤＮＡ配列および遺伝子ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、Ｐおよ
びＱが発現する条件下で宿主を培養する事により、ガリ
デルミン、エピデルミン変異体またはランチビオチック
の構造的特徴を少なくとも１つ含む他のタンパク質を得
ることが出来る。
【００２０】一方、タンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、Ｐま
たはＱをコードする遺伝子を所定のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子と共に適当なベクターに挿入し、Ｅｐｉタ
ンパク質および所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子
を適当なプロモーターと機能的に結合させ、生成したプ
ラスミドで通常ランチビオチックまたはタンパク質Ｅｐ
ｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいずれも生産しえない適当
な宿主をトランスホームして、この宿主を培養すること
で、挿入した遺伝子に所定のアミノ酸配列に由来する
が、ガリデルミン、エピデルミン、エピデルミン変異
体、またはその他のタンパク質に見られるランチビオチ
ックの構造的特徴を含むタンパク質を発現することが出
来る。また、本発明は、望ましくはストリンジェント条
件下、本明細書で示しているタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、
Ｄ、ＰまたはＱの活性を実質的に有しているタンパク質
をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ
配列を含む。ストリンジェント・ハイブリダゼーション
条件では、８５％以上、望ましくは約９０％以上のホモ
ロジーを有するＤＮＡ配列を選択する。ｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングは、ヨーロッパ特許出願第８８
１１９ ６０２．９号およびカシマ（Ｋａｓｈｉｍ
ａ）等、（Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４０２−４０４（１
９８５））の方法に従って高ストリンジェント条件で行
った。ストリンジェント条件下で本出願で公開したＤＮ
Ａ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ配列は、例えば、
公開したＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、公開したＤＮ
Ａ配列に関連するが特定の微生物中に天然に存在するも
の、または他の生物種に由来するものがある。核酸のハ
イブリダゼーションに関する一般的技術は、参考として
本出願に含まれるマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、
Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリ
ングハーバー、ＮＹ（１９８２）およびハイムス（Ｈａ
ｙｍｅｓ），Ｂ．Ｄ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬプレス、ワシントン、ＤＣ
（１９８５）に示されている。タンパク質ＥｐｉＢ、
Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱは、デヒドロアラニン、デヒドロブ
チニン、メソ−ランチオニン、３−メチル−ランチオン
およびＳ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン等の
構造的特徴を含む新規なタンパク質またはその他の物質
の製造に有用な高価値で、かつ興味深い新しい試薬であ
る。このように、これらは、単離型のタンパク質とし
て、またはこれらの酵素による細胞外プロセシングを研
究するための化学的合成操作における化学的触媒試薬と
して使用しうる。
たはＱをコードする遺伝子を所定のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子と共に適当なベクターに挿入し、Ｅｐｉタ
ンパク質および所定のアミノ酸配列をコードする遺伝子
を適当なプロモーターと機能的に結合させ、生成したプ
ラスミドで通常ランチビオチックまたはタンパク質Ｅｐ
ｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱのいずれも生産しえない適当
な宿主をトランスホームして、この宿主を培養すること
で、挿入した遺伝子に所定のアミノ酸配列に由来する
が、ガリデルミン、エピデルミン、エピデルミン変異
体、またはその他のタンパク質に見られるランチビオチ
ックの構造的特徴を含むタンパク質を発現することが出
来る。また、本発明は、望ましくはストリンジェント条
件下、本明細書で示しているタンパク質ＥｐｉＢ、Ｃ、
Ｄ、ＰまたはＱの活性を実質的に有しているタンパク質
をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ
配列を含む。ストリンジェント・ハイブリダゼーション
条件では、８５％以上、望ましくは約９０％以上のホモ
ロジーを有するＤＮＡ配列を選択する。ｃＤＮＡライブ
ラリーのスクリーニングは、ヨーロッパ特許出願第８８
１１９ ６０２．９号およびカシマ（Ｋａｓｈｉｍ
ａ）等、（Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４０２−４０４（１
９８５））の方法に従って高ストリンジェント条件で行
った。ストリンジェント条件下で本出願で公開したＤＮ
Ａ配列とハイブリダイズしうるＤＮＡ配列は、例えば、
公開したＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体、公開したＤＮ
Ａ配列に関連するが特定の微生物中に天然に存在するも
の、または他の生物種に由来するものがある。核酸のハ
イブリダゼーションに関する一般的技術は、参考として
本出願に含まれるマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、
Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，コールドスプリ
ングハーバー、ＮＹ（１９８２）およびハイムス（Ｈａ
ｙｍｅｓ），Ｂ．Ｄ．等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬプレス、ワシントン、ＤＣ
（１９８５）に示されている。タンパク質ＥｐｉＢ、
Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱは、デヒドロアラニン、デヒドロブ
チニン、メソ−ランチオニン、３−メチル−ランチオン
およびＳ−（２−アミノビニル）−Ｄ−システイン等の
構造的特徴を含む新規なタンパク質またはその他の物質
の製造に有用な高価値で、かつ興味深い新しい試薬であ
る。このように、これらは、単離型のタンパク質とし
て、またはこれらの酵素による細胞外プロセシングを研
究するための化学的合成操作における化学的触媒試薬と
して使用しうる。
【００２１】また、本発明は、実質的に純粋なタンパク
質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱに関する。“実質的に
純粋”とは、そのタンパク質が天然で会合している不純
物を含まないことを意味している。実質的純粋性は、電
気泳動による単一バンドで確認しうる。本発明のポリペ
プチドは、抽出、沈殿化、クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、電気泳動等の従来法によ
り上述の組み換え分子から単離・精製しうる。このタン
パク質は、さらに補助タンパク質を含む融合タンパク質
の一部として生産されることが望ましい。これらの補助
タンパク質には、例えば、典型的分泌シグナル、大腸菌
由来のマルトース結合タンパク質、またはプロテインＡ
等が含まれる。プロテインＡを含む融合タンパク質の調
製、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによる
その精製、および目的タンパク質を放出するその切断に
関する方法は、例えば、ＰＣＴ出願第Ｗ／Ｏ８４／０３
２０３号（１９８４）に示されている。融合タンパク質
の切断を可能にする必要条件は、それが適当な切断手段
で認識および切断される単一の切断部位を含むことであ
る。このような切断部位は、化学的または酵素的手段で
認識可能で、かつ、目的タンパク質と補助タンパク質の
間にある単一のアミノ酸配列である。このような特異的
アミノ酸配列が目的タンパク質または補助タンパク質の
中にあってはならない。酵素的試薬の例には、アミノ酸
配列ＮＨ2−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基、例えばロイシン）を
認識しうるコラゲナーゼ等のプロテアーゼ；Ｍｅｔ−Ｐ
ｈｅ結合を切断するキモシン（レニン）；Ｘ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−ＹのＡｒｇのカルボキシル側を切断するカリク
レインＢ；配列Ｘ−（Ａｓｐ）n−Ｌｙｓ−Ｙ（式中、
ｎ＝２−４）を認識し、Ｌｙｓのカルボキシル側で切断
するエンテロキナーゼ；特異的アルギニル結合を切断す
るトロンビン等がある。融合タンパク質を切断するのに
使用しうる化学試薬の例には、Ａｓｎ−Ｚ結合（式中、
ＺはＧｌｙ、ＬｅｕまたはＡｌａである）を切断するヒ
ドロキシルアミン；高濃度で（約７０％）特異的にＡｓ
ｐ−Ｐｒｏを切断する蟻酸等がある。
質ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱに関する。“実質的に
純粋”とは、そのタンパク質が天然で会合している不純
物を含まないことを意味している。実質的純粋性は、電
気泳動による単一バンドで確認しうる。本発明のポリペ
プチドは、抽出、沈殿化、クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、電気泳動等の従来法によ
り上述の組み換え分子から単離・精製しうる。このタン
パク質は、さらに補助タンパク質を含む融合タンパク質
の一部として生産されることが望ましい。これらの補助
タンパク質には、例えば、典型的分泌シグナル、大腸菌
由来のマルトース結合タンパク質、またはプロテインＡ
等が含まれる。プロテインＡを含む融合タンパク質の調
製、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによる
その精製、および目的タンパク質を放出するその切断に
関する方法は、例えば、ＰＣＴ出願第Ｗ／Ｏ８４／０３
２０３号（１９８４）に示されている。融合タンパク質
の切断を可能にする必要条件は、それが適当な切断手段
で認識および切断される単一の切断部位を含むことであ
る。このような切断部位は、化学的または酵素的手段で
認識可能で、かつ、目的タンパク質と補助タンパク質の
間にある単一のアミノ酸配列である。このような特異的
アミノ酸配列が目的タンパク質または補助タンパク質の
中にあってはならない。酵素的試薬の例には、アミノ酸
配列ＮＨ2−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基、例えばロイシン）を
認識しうるコラゲナーゼ等のプロテアーゼ；Ｍｅｔ−Ｐ
ｈｅ結合を切断するキモシン（レニン）；Ｘ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−ＹのＡｒｇのカルボキシル側を切断するカリク
レインＢ；配列Ｘ−（Ａｓｐ）n−Ｌｙｓ−Ｙ（式中、
ｎ＝２−４）を認識し、Ｌｙｓのカルボキシル側で切断
するエンテロキナーゼ；特異的アルギニル結合を切断す
るトロンビン等がある。融合タンパク質を切断するのに
使用しうる化学試薬の例には、Ａｓｎ−Ｚ結合（式中、
ＺはＧｌｙ、ＬｅｕまたはＡｌａである）を切断するヒ
ドロキシルアミン；高濃度で（約７０％）特異的にＡｓ
ｐ−Ｐｒｏを切断する蟻酸等がある。
【００２２】以上の説明を用いて、当業者が本発明を十
分なまでに利用しうることは明白である。従って、以下
に示す望ましい特定の態様は単なる例として解釈される
べきものであり、本出願を制限するものではない。
分なまでに利用しうることは明白である。従って、以下
に示す望ましい特定の態様は単なる例として解釈される
べきものであり、本出願を制限するものではない。
【００２３】
実施例１ １．ガリデルミンの過剰生産 ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＴ１８１ま
たはｐＭＫ１４８ガリデルミン等のメディアム・コピー
・プラスミドを用いて、ガリデルミンのオープン・リー
ディング・フレームを含むＤＮＡフラグメントをエピデ
ルミン生産株であるスタフィロコッカス エピデルミス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）ＤＳＭ３０９５にクローニングしうる。通常、この
遺伝子の増加は生産物の増加と相関する。但し、この相
関は必ずしも線型ではない。ｐＣ１９４またはｐＴ１８
１の高コピー数プラスミド誘導体もクローニングベヒク
ルとして使用しうる。
たはｐＭＫ１４８ガリデルミン等のメディアム・コピー
・プラスミドを用いて、ガリデルミンのオープン・リー
ディング・フレームを含むＤＮＡフラグメントをエピデ
ルミン生産株であるスタフィロコッカス エピデルミス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）ＤＳＭ３０９５にクローニングしうる。通常、この
遺伝子の増加は生産物の増加と相関する。但し、この相
関は必ずしも線型ではない。ｐＣ１９４またはｐＴ１８
１の高コピー数プラスミド誘導体もクローニングベヒク
ルとして使用しうる。
【００２４】２．リーダー配列の交換 アミノ酸−１乃至−３０に相当するエピデルミンのリー
ダー配列は、エピデルミンの分泌に関する。この配列を
用いて、ガリデルミン等、Ｓ．エピデルミジス（ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓ）中の他のタンパク質を分泌しうる。
このリーダー配列ＤＮＡは、その配列の前後に各リンカ
ーを挿入することにより移動可能とすることが出来る。
従って、このリーダー配列ＤＮＡは、プラスミドから大
量に単離することが出来、かつ、他のペフチドおよびタ
ンパク質の各位置に挿入することが出来る。また、この
リーダー配列ＤＮＡは化学合成でも生成する事が出来
る。
ダー配列は、エピデルミンの分泌に関する。この配列を
用いて、ガリデルミン等、Ｓ．エピデルミジス（ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓ）中の他のタンパク質を分泌しうる。
このリーダー配列ＤＮＡは、その配列の前後に各リンカ
ーを挿入することにより移動可能とすることが出来る。
従って、このリーダー配列ＤＮＡは、プラスミドから大
量に単離することが出来、かつ、他のペフチドおよびタ
ンパク質の各位置に挿入することが出来る。また、この
リーダー配列ＤＮＡは化学合成でも生成する事が出来
る。
【００２５】実施例２ 宿主としてＳ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）を
用いたガリデルミンの生産 １．プラスミドの調製（第７図参照） a)プラスミドｐＣＵＩは、ラルフ ローゼンシュタイン
博士（Ｄｒ．ＲａｌｆＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）の“Ｍｏ
ｌｅｋｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓ
ｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｒ ｐｌａｓｍｉｄｋｏｄｉｅ
ｒｔｅｎ Ａｒｓｅｎｉｔ ｕｎｄ Ａｒｓｅｎａｔｒ
ｅｓｔｉｓｔｅｎｔ ｂｅｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｅｎ”（ドイツ、ミュンヘン、技術大学から市販され
ている）の方法に従い、クレノーフラグメントを用いて
ＰｓｔＩ消化したｐＣＬＰ１００およびＮｄｅ１消化し
たｐＵＣ１８をライゲーションする事により調製した。
ついで、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。 b)Ｓ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＭＳ４
６１６）から染色体ＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩ
で消化した。ＨｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩ認識部位の
間にある２．４kb長のガリデルミン構造遺伝子を含む
４．７kbのフラグメントを、以下の配列： ５’ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ３’ を有するプライマーを用いて単離した。 c)ステップa)の消化したｐＣＵＩプラスミドのＥｃｏＲ
Ｉ部位に４．７kbフラグメントをライゲーションして、
プラスミドｐＣＵｇｄｍ１を得た。
用いたガリデルミンの生産 １．プラスミドの調製（第７図参照） a)プラスミドｐＣＵＩは、ラルフ ローゼンシュタイン
博士（Ｄｒ．ＲａｌｆＲｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）の“Ｍｏ
ｌｅｋｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓ
ｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕｒ ｐｌａｓｍｉｄｋｏｄｉｅ
ｒｔｅｎ Ａｒｓｅｎｉｔ ｕｎｄ Ａｒｓｅｎａｔｒ
ｅｓｔｉｓｔｅｎｔ ｂｅｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｅｎ”（ドイツ、ミュンヘン、技術大学から市販され
ている）の方法に従い、クレノーフラグメントを用いて
ＰｓｔＩ消化したｐＣＬＰ１００およびＮｄｅ１消化し
たｐＵＣ１８をライゲーションする事により調製した。
ついで、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。 b)Ｓ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＤＭＳ４
６１６）から染色体ＤＮＡを単離し、これをＥｃｏＲＩ
で消化した。ＨｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩ認識部位の
間にある２．４kb長のガリデルミン構造遺伝子を含む
４．７kbのフラグメントを、以下の配列： ５’ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ３’ を有するプライマーを用いて単離した。 c)ステップa)の消化したｐＣＵＩプラスミドのＥｃｏＲ
Ｉ部位に４．７kbフラグメントをライゲーションして、
プラスミドｐＣＵｇｄｍ１を得た。
【００２６】２．宿主Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｓ）の調製 本実施例においては、エピデルミンを生産しえないＳ．
エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５の
変異体を単離した。突然変異誘発は、染色体にコードさ
れているリファンピシン耐性（μg/ml）によって特徴付
けられる株について行った。寒天プレートで増殖した
Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９
５を３０mlの基礎栄養培地に接種し、これを一晩培養し
た。この一晩培養物０．５mlを生産培地５０mlに接種
し、これを３７℃で３時間振盪培養した。培養培地から
細胞を取り出し、保温した４．５mlＴＭバッファ（３０
mMトリス−マレイン酸 ｐＨ７．４（生成した溶液を溶
液Ａとする））。溶液Ａの突然変異体および細胞数
（１．２５×１０10細胞／ml）をチェックした。４mlの
溶液Ａを１mlのエチルメチルスルホネート（最終濃度４
７μg/ml）と完全に混合し、３７℃で１時間振盪した。
それから細胞を培養培地から抽出し、ＴＭバッファで２
度洗浄した後、５mlのＴＭバッファに懸濁した（この変
異細胞を含む溶液を溶液Ｂと命名した）。溶液Ｂは２×
１０8 細胞／mlの濃度であり、これは１．６％の生存率
に当たる。５０mlの溶液Ｂを５mlの生産培地に添加し、
３７℃で一晩培養した（発現型の発現）。この溶液を溶
液Ｃとする。細胞数は７．３×１０8 細胞／mlを示し
た。この溶液をＢＭ寒天プレートにプレーティングし、
各コロニーを釣り上げた。これらをテストプレート（表
面にマイクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）を撒いたＢＭ寒天を含む）に接種
した。Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）への阻害効果を示
さないコロニーをエピデルミンの非生産株として選択し
た。 ＢＭ寒天（１リットル当たり） １０ｇm ペプトンＮｏ．１４０ ５ｇm イースト イクストラクト １mg グルコース ５mg ＮａＣｌ １mg Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ７．５ 約３％の変異率が測定された。見つかった４５個の非生
産株を２０回サブクローニングし、１６個の安定な非生
産株を得た。全ての安定な非生産株は、野生型のプラス
ミドｐＥｐｉ３２を含んでいることが分かった。制限パ
ターンから、これが野生型株中のプラスミドと同じもの
であることが同定された。
ｍｉｓ）の調製 本実施例においては、エピデルミンを生産しえないＳ．
エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５の
変異体を単離した。突然変異誘発は、染色体にコードさ
れているリファンピシン耐性（μg/ml）によって特徴付
けられる株について行った。寒天プレートで増殖した
Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９
５を３０mlの基礎栄養培地に接種し、これを一晩培養し
た。この一晩培養物０．５mlを生産培地５０mlに接種
し、これを３７℃で３時間振盪培養した。培養培地から
細胞を取り出し、保温した４．５mlＴＭバッファ（３０
mMトリス−マレイン酸 ｐＨ７．４（生成した溶液を溶
液Ａとする））。溶液Ａの突然変異体および細胞数
（１．２５×１０10細胞／ml）をチェックした。４mlの
溶液Ａを１mlのエチルメチルスルホネート（最終濃度４
７μg/ml）と完全に混合し、３７℃で１時間振盪した。
それから細胞を培養培地から抽出し、ＴＭバッファで２
度洗浄した後、５mlのＴＭバッファに懸濁した（この変
異細胞を含む溶液を溶液Ｂと命名した）。溶液Ｂは２×
１０8 細胞／mlの濃度であり、これは１．６％の生存率
に当たる。５０mlの溶液Ｂを５mlの生産培地に添加し、
３７℃で一晩培養した（発現型の発現）。この溶液を溶
液Ｃとする。細胞数は７．３×１０8 細胞／mlを示し
た。この溶液をＢＭ寒天プレートにプレーティングし、
各コロニーを釣り上げた。これらをテストプレート（表
面にマイクロコッカス ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）を撒いたＢＭ寒天を含む）に接種
した。Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）への阻害効果を示
さないコロニーをエピデルミンの非生産株として選択し
た。 ＢＭ寒天（１リットル当たり） １０ｇm ペプトンＮｏ．１４０ ５ｇm イースト イクストラクト １mg グルコース ５mg ＮａＣｌ １mg Ｋ2ＨＰＯ4 ｐＨ７．５ 約３％の変異率が測定された。見つかった４５個の非生
産株を２０回サブクローニングし、１６個の安定な非生
産株を得た。全ての安定な非生産株は、野生型のプラス
ミドｐＥｐｉ３２を含んでいることが分かった。制限パ
ターンから、これが野生型株中のプラスミドと同じもの
であることが同定された。
【００２７】非生産型Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｓ）のトランスホーメーション 安定な非生産型株の一晩培養から得た５mlの培地を７５
０mlのＢＭ培地に接種し、この培地を２リットルフラス
コ中、振盪速度１２０rpm、３７℃で振盪培養した。接
種したＢＭ培地の当初の光学密度は、０．０３−０．０
４であった。光学密度が０．４５−０．５５に達したと
き、細胞をＧＳ−３ローターを用いた８５００rpm、４
℃、１５分の遠心で回収した。単離した細胞を順次、７
５０、３５０、４０および１０mlの１０％グリセリンで
洗浄し、ついで２−３mlの１０％グリセリンに懸濁した
後、ＥＲＧ中１１０ml分を−７０℃で凍結した。細胞数
は、１−５×１０10／mlであった。凍結した細胞を室
温、５分間で融解し、その細胞懸濁液５０μlをＥＲＧ
中プラスミドｐＣＵｇｄｍ１のＴＥバッファ溶液２μl
と共に室温で３０分間インキュベートした。この混合物
を電極間隙０．２cmのエレクトロポレーション・キュベ
ットに導入し、直ちにエレクトロポレーションした。そ
の後、この細胞を迅速に９５０μlのＳＭＭＰ５０培地
に懸濁し、２．５mlのＥＲＧに移して、３７℃で９０分
間振盪した。ＥＲＧは、培地によく空気が溶けるように
４５°に傾けた。ＳＭＭＰ５０培地には、ｐｒｏ １０
０ml、２ＳＭＭ ５５ml、４ＰＡＢ ４０mlおよび５％
ＢＳＡ ５mlが含まれる。２ＳＭＭには、１mol サッ
カロース、０．０４mol マレイン酸、０．０４mol Ｍ
ｇＣｌ2およびｐＨ６．５とするためのＮａＯＨが含ま
れている。４ＰＡＢは、７g/１００mlのギブコ抗生物質
培地３溶液である。ガリデルミンを生産する増殖株のテ
ストは、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）テストプレート
からのコロニーの選択、および各選択されたコロニーの
培養およびＨＰＬＣによるガリデルミンの検定によって
行った。ガリデルミンを生産しうる３個のｐＣＵｇｄｍ
１トランスホーム変異体が確認された。
ｍｉｓ）のトランスホーメーション 安定な非生産型株の一晩培養から得た５mlの培地を７５
０mlのＢＭ培地に接種し、この培地を２リットルフラス
コ中、振盪速度１２０rpm、３７℃で振盪培養した。接
種したＢＭ培地の当初の光学密度は、０．０３−０．０
４であった。光学密度が０．４５−０．５５に達したと
き、細胞をＧＳ−３ローターを用いた８５００rpm、４
℃、１５分の遠心で回収した。単離した細胞を順次、７
５０、３５０、４０および１０mlの１０％グリセリンで
洗浄し、ついで２−３mlの１０％グリセリンに懸濁した
後、ＥＲＧ中１１０ml分を−７０℃で凍結した。細胞数
は、１−５×１０10／mlであった。凍結した細胞を室
温、５分間で融解し、その細胞懸濁液５０μlをＥＲＧ
中プラスミドｐＣＵｇｄｍ１のＴＥバッファ溶液２μl
と共に室温で３０分間インキュベートした。この混合物
を電極間隙０．２cmのエレクトロポレーション・キュベ
ットに導入し、直ちにエレクトロポレーションした。そ
の後、この細胞を迅速に９５０μlのＳＭＭＰ５０培地
に懸濁し、２．５mlのＥＲＧに移して、３７℃で９０分
間振盪した。ＥＲＧは、培地によく空気が溶けるように
４５°に傾けた。ＳＭＭＰ５０培地には、ｐｒｏ １０
０ml、２ＳＭＭ ５５ml、４ＰＡＢ ４０mlおよび５％
ＢＳＡ ５mlが含まれる。２ＳＭＭには、１mol サッ
カロース、０．０４mol マレイン酸、０．０４mol Ｍ
ｇＣｌ2およびｐＨ６．５とするためのＮａＯＨが含ま
れている。４ＰＡＢは、７g/１００mlのギブコ抗生物質
培地３溶液である。ガリデルミンを生産する増殖株のテ
ストは、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）テストプレート
からのコロニーの選択、および各選択されたコロニーの
培養およびＨＰＬＣによるガリデルミンの検定によって
行った。ガリデルミンを生産しうる３個のｐＣＵｇｄｍ
１トランスホーム変異体が確認された。
【００２８】ｐＣＵｇｄｍ１でトランスホームしたＳ．
エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）により生産される
ガリデルミンの検定 a)バイオアッセイ ＦＰ寒天をＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３
４１で接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。
生成した培養物の半分をループで取り出し１００mlのＦ
Ｐ培地に懸濁し、３６℃で８時間培養した。その光学密
度が１．０に到達したときに培養を終えた。この懸濁液
の０．５％をＦＰ寒天に接種し、各１０mlをシャーレに
注いで４℃で３週間保存した。ゾナー（Ｚａｈｎｅｒ）
およびマス（Ｍａａｓ）“抗生物質の生化学”スプリン
ガー・バーラグ、ベルリン １９７２に示されている方
法でプレート拡散テストを行った。トランスホームした
Ｓ．エビデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）の培養由来の
培養濾液１０μlを濾紙にしみ込ませ、乾燥した。この
濾紙をテストプレートの上に置き、３７℃で２４時間イ
ンキュベートした。
エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）により生産される
ガリデルミンの検定 a)バイオアッセイ ＦＰ寒天をＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）ＡＴＣＣ９３
４１で接種し、３７℃で１８時間インキュベートした。
生成した培養物の半分をループで取り出し１００mlのＦ
Ｐ培地に懸濁し、３６℃で８時間培養した。その光学密
度が１．０に到達したときに培養を終えた。この懸濁液
の０．５％をＦＰ寒天に接種し、各１０mlをシャーレに
注いで４℃で３週間保存した。ゾナー（Ｚａｈｎｅｒ）
およびマス（Ｍａａｓ）“抗生物質の生化学”スプリン
ガー・バーラグ、ベルリン １９７２に示されている方
法でプレート拡散テストを行った。トランスホームした
Ｓ．エビデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）の培養由来の
培養濾液１０μlを濾紙にしみ込ませ、乾燥した。この
濾紙をテストプレートの上に置き、３７℃で２４時間イ
ンキュベートした。
【００２９】b)ＨＰＬＣ 選択したトランスホーム株を生産培地中で２６時間培養
した。培養培地を１３，０００rpmで１０分間遠心し
た。単離した培養液を、移動相としてA)７０％過塩素酸
を０．５％含むＨ2ＯおよびB)アセトニトリルを用いた
ＳＰ８．７００液体クロマトグラフィー（スペクトラ・
フィジックス、ダルムスタット、ドイツ）によるＨＰＬ
Ｃで分析した。カラム系には、粒子径７μm およびカラ
ムサイズ１２５mm×４．６mmＩ．Ｄ．のヌクレオシル−
１００ Ｃ−１８と２０mm×４．６mmＩ．Ｄ．のプレカ
ラムを使用した。勾配を以下に示す。 クロマトグラフィーの結果を第８図に示す。７．５４分
でガリデルミンの溶出を示す標準的曲線を第９図に示
す。
した。培養培地を１３，０００rpmで１０分間遠心し
た。単離した培養液を、移動相としてA)７０％過塩素酸
を０．５％含むＨ2ＯおよびB)アセトニトリルを用いた
ＳＰ８．７００液体クロマトグラフィー（スペクトラ・
フィジックス、ダルムスタット、ドイツ）によるＨＰＬ
Ｃで分析した。カラム系には、粒子径７μm およびカラ
ムサイズ１２５mm×４．６mmＩ．Ｄ．のヌクレオシル−
１００ Ｃ−１８と２０mm×４．６mmＩ．Ｄ．のプレカ
ラムを使用した。勾配を以下に示す。 クロマトグラフィーの結果を第８図に示す。７．５４分
でガリデルミンの溶出を示す標準的曲線を第９図に示
す。
【００３０】培養培地には以下に示すものを使用した。 １．ＦＰ寒天 肉抽出物 ４g ペプトン １０g ＮａＣｌ ３g Ｎａ2ＨＰＯ4 ５g グルコース １０g 複合寒天 １５g 水 １リットル ｐＨ ７．２ ２．ＦＰ培地 肉抽出物 ４g ペプトン １０g ＮａＣｌ ３g Ｎａ2ＨＰＯ4 ５g グルコース １０g 水 １リットル ｐＨ ７．２ ３．生産培地 肉抽出物 ３３g モルト抽出物 ３０g ＮａＣｌ ４０g 水酸化カルシウム ３．８g 水 １リットル ｐＨ ６．５
【００３１】実施例３ プラスミドの単離 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｔｕ３２９８
のプラスミドＤＮＡをノリック（Ｎｏｒｉｃｋ）等、Ａ
ｎｎ．ＮＹ−Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１８２：２７９−２９
４（１９７１）の修正法に従って単離した。Ｓ．エピデ
ルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）をＢＭ培地（１％ペプト
ン１４０、ギブコ、ニュウ・アイゼンバーグ、Ｆ．Ｒ．
Ｇ．、０．５％酵母抽出物、ディフコ、デトロイト、Ｕ
ＳＡ、０．１％グルコース、０．５％ＮａＣｌおよび
０．１％Ｋ2ＨＰＯ4×２Ｈ2Ｏ）で静止期まで培養し
た。細胞を遠心し、０．５M ＥＤＴＡで２回洗浄した。
このペレットを８０ml ＮａＣｌバッファ（５０mM ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０mM ＥＤＴＡ、２．
５M ＮａＣｌ）に再懸濁し、１．５mlのリゾスタフィ
ン溶液（０．５mg/ml、シグマ、ハイデルベルグ、Ｆ．
Ｒ．Ｇ．）を添加して、３７℃で２０分間インキュベー
トした。細胞は、８０mlの溶解バッファ（５０mM トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mM ＥＤＴＡ、５０
０mM ブリッジ、４０mM デオキシコレート酸ナトリウ
ム）を添加し、氷水中で１時間放置することで溶解し
た。この溶解物を遠心し（３０分間、１３，０００rp
m、４℃）、その上清を４分の１倍容の５０％ＰＥＧ６
０００溶液と混合した。プラスミドＤＮＡを４℃、一晩
で沈殿させた。このＤＮＡ懸濁液を遠心後（２０分、１
３，０００rpm、４℃）、８mlのＴＥバッファに溶解
し、さらに、５０μlのプテアーゼ溶液（２０mg/ml）を
添加した。３７℃、１５分間のインキュベーション後、
ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、さらにＣｓＣｌ遠心
（１g ＣｓＣｌ／ml、４０，０００rpm、４０h 、２０
℃）で精製した。
のプラスミドＤＮＡをノリック（Ｎｏｒｉｃｋ）等、Ａ
ｎｎ．ＮＹ−Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１８２：２７９−２９
４（１９７１）の修正法に従って単離した。Ｓ．エピデ
ルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）をＢＭ培地（１％ペプト
ン１４０、ギブコ、ニュウ・アイゼンバーグ、Ｆ．Ｒ．
Ｇ．、０．５％酵母抽出物、ディフコ、デトロイト、Ｕ
ＳＡ、０．１％グルコース、０．５％ＮａＣｌおよび
０．１％Ｋ2ＨＰＯ4×２Ｈ2Ｏ）で静止期まで培養し
た。細胞を遠心し、０．５M ＥＤＴＡで２回洗浄した。
このペレットを８０ml ＮａＣｌバッファ（５０mM ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０mM ＥＤＴＡ、２．
５M ＮａＣｌ）に再懸濁し、１．５mlのリゾスタフィ
ン溶液（０．５mg/ml、シグマ、ハイデルベルグ、Ｆ．
Ｒ．Ｇ．）を添加して、３７℃で２０分間インキュベー
トした。細胞は、８０mlの溶解バッファ（５０mM トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mM ＥＤＴＡ、５０
０mM ブリッジ、４０mM デオキシコレート酸ナトリウ
ム）を添加し、氷水中で１時間放置することで溶解し
た。この溶解物を遠心し（３０分間、１３，０００rp
m、４℃）、その上清を４分の１倍容の５０％ＰＥＧ６
０００溶液と混合した。プラスミドＤＮＡを４℃、一晩
で沈殿させた。このＤＮＡ懸濁液を遠心後（２０分、１
３，０００rpm、４℃）、８mlのＴＥバッファに溶解
し、さらに、５０μlのプテアーゼ溶液（２０mg/ml）を
添加した。３７℃、１５分間のインキュベーション後、
ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、さらにＣｓＣｌ遠心
（１g ＣｓＣｌ／ml、４０，０００rpm、４０h 、２０
℃）で精製した。
【００３２】ＲＮＡの単離と電気泳動 Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）をＳＭＳ最小
培地（タザジ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．２９：８０７−８１３（１９７５））
で増殖し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）ＲＮＡに関して示された方法（ウルマネン（Ｕｌｍ
ａｎｅｎ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７
６−１８２（１９８５））と同様の修正法を用い、そこ
からＲＮＡを単離した。プロトプラスティング・バッフ
ァ中のリゾスタフィンと３７℃でインキュベーションす
る事で細胞を溶解した。全ＲＮＡをグリオキシル化し
（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：４８３５−
４８３９（１９７７））、電気泳動バッファとして１０
mM Ｎａ2ＰＯ4 （ｐＨ７）を用いた１．２％アガロー
スゲルで分離した。ＲＮＡをエチジウム・ブロマイドを
用いて染色し、２０×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、
０．０１５M クエン酸三ナトリウム、ｐＨ９）を用い
たキャピラリー・トランスファーによりニトロセルロー
スメンブレン（シーダー・アンド・シュエル、ダセル、
Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にブロッティングした。２３ＳｒＲＮＡ
および１６ＳｒＲＮＡをサイズマーカーとして用いた。
培地（タザジ（Ｔｅｒｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．２９：８０７−８１３（１９７５））
で増殖し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）ＲＮＡに関して示された方法（ウルマネン（Ｕｌｍ
ａｎｅｎ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：１７
６−１８２（１９８５））と同様の修正法を用い、そこ
からＲＮＡを単離した。プロトプラスティング・バッフ
ァ中のリゾスタフィンと３７℃でインキュベーションす
る事で細胞を溶解した。全ＲＮＡをグリオキシル化し
（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：４８３５−
４８３９（１９７７））、電気泳動バッファとして１０
mM Ｎａ2ＰＯ4 （ｐＨ７）を用いた１．２％アガロー
スゲルで分離した。ＲＮＡをエチジウム・ブロマイドを
用いて染色し、２０×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、
０．０１５M クエン酸三ナトリウム、ｐＨ９）を用い
たキャピラリー・トランスファーによりニトロセルロー
スメンブレン（シーダー・アンド・シュエル、ダセル、
Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にブロッティングした。２３ＳｒＲＮＡ
および１６ＳｒＲＮＡをサイズマーカーとして用いた。
【００３３】インビトロ・トランスレーション ｐＳＰＴ１８／１９ベクターシステム（ベーリンガー・
マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）に各フラグメントをクロー
ニングする事により、一本鎖のＲＮＡプローブを得た。
このプラスミドをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIII で線状
にし、線状ＤＮＡテンプレートを得た。転写のためのメ
ルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．１２：７０３５−７０５６（１９８４）の方法は、
業者の説明書に従って修正した。α32Ｐ−ＣＴＰ（８０
０Ci/mMol）の存在下でＴ７−ＲＮＡポリメラーゼまた
はＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼを使用した。取り込まれ
なかったリボヌクレオチドは、セファデックスＧ５０ク
ロマトグラフィーでラベル化したＲＮＡと分離した。
マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）に各フラグメントをクロー
ニングする事により、一本鎖のＲＮＡプローブを得た。
このプラスミドをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIII で線状
にし、線状ＤＮＡテンプレートを得た。転写のためのメ
ルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．１２：７０３５−７０５６（１９８４）の方法は、
業者の説明書に従って修正した。α32Ｐ−ＣＴＰ（８０
０Ci/mMol）の存在下でＴ７−ＲＮＡポリメラーゼまた
はＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼを使用した。取り込まれ
なかったリボヌクレオチドは、セファデックスＧ５０ク
ロマトグラフィーでラベル化したＲＮＡと分離した。
【００３４】ノーザン・ハイブリダゼーション 電気泳動後、ＲＮＡをトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｐ．
Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７７：５２０１−５２０５（１９８０）の方法に従っ
てフィルターにトランスファーした。８０℃、２時間の
インキュベーションの後、そのフィルターを２０ トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、１００℃で手短にインキュベ
ーションして、グリコシル化を外した。その後、このフ
ィルターを、そのフィルターを５０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン
酸三ナトリウム、ｐＨ９）、５０ ＮａＰＯ4 、ｐＨ
６．５、０．１％フィコール４００（ファルマシア、フ
レイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）、０．１％ポリビニルピロ
リドン、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２５mg
/ml 変性サケ精子ＤＮＡ溶液中、４２℃で２時間かけ
てプレハイブリダイズした。このフィルターを１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ溶液中、４２℃で１５分間かけて洗
浄した後、これを用いて−７０℃で４時間かけてコダッ
ク−Ｘ オマットフィルムを感光させた。さらに、この
フィルターを０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用
い、７０℃で１５分間かけて２回洗浄した後、−７０℃
で１６時間かけてオートラジオグラムを作製した。翌
日、７０℃、３０−６０分間の０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ溶液による洗浄を続け、その後再び、−７０
℃、３日間のコダック−Ｘ オマットフィルムへの感光
を行った。
Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７７：５２０１−５２０５（１９８０）の方法に従っ
てフィルターにトランスファーした。８０℃、２時間の
インキュベーションの後、そのフィルターを２０ トリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中、１００℃で手短にインキュベ
ーションして、グリコシル化を外した。その後、このフ
ィルターを、そのフィルターを５０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ（０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン
酸三ナトリウム、ｐＨ９）、５０ ＮａＰＯ4 、ｐＨ
６．５、０．１％フィコール４００（ファルマシア、フ
レイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）、０．１％ポリビニルピロ
リドン、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．２５mg
/ml 変性サケ精子ＤＮＡ溶液中、４２℃で２時間かけ
てプレハイブリダイズした。このフィルターを１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ溶液中、４２℃で１５分間かけて洗
浄した後、これを用いて−７０℃で４時間かけてコダッ
ク−Ｘ オマットフィルムを感光させた。さらに、この
フィルターを０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用
い、７０℃で１５分間かけて２回洗浄した後、−７０℃
で１６時間かけてオートラジオグラムを作製した。翌
日、７０℃、３０−６０分間の０．１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ溶液による洗浄を続け、その後再び、−７０
℃、３日間のコダック−Ｘ オマットフィルムへの感光
を行った。
【００３５】サザン・ハイブリダゼーション サザン・ハイブリダイゼーション（サザン（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ）、Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５
０３−５１７（１９７５））には、プローブとしての
５’ラベル化オリゴヌクレオチドを２３℃で使用した。
オリゴヌクレオチドは、ガンマ32Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マ
ンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いてラベルした。オリゴ
ヌクレオチドおよびプライマーは３９１ＤＮＡ合成機を
用いて合成し、さらに精製すること無く使用した。
ｅｒｎ）、Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５
０３−５１７（１９７５））には、プローブとしての
５’ラベル化オリゴヌクレオチドを２３℃で使用した。
オリゴヌクレオチドは、ガンマ32Ｐ−ＡＴＰとＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム、マ
ンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いてラベルした。オリゴ
ヌクレオチドおよびプライマーは３９１ＤＮＡ合成機を
用いて合成し、さらに精製すること無く使用した。
【００３６】ＤＮＡシーケンシング ＤＮＡは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア、フ
レイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いたチェーン・ターミ
ネーション法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３
−５４６７（１９７７））により、放射能的および非放
射能的にシーケンシングした。放射能プラスミドシーケ
ンシングは、適当なプライマーを用い、ハットリ（Ｈａ
ｔｔｏｒｉ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：
２３２−２３８（１９８４）の方法で行った。３．６kb
のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、アプライド３
７３Ａ ＤＮＡシークエネーター（アプライド・バイオ
システムズ、ウェイタートタット、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用
い、非放射能的にシーケンシングした。各フラグメント
は、ファージミドｐＢＳＤ-/+にクローニングした。こ
の構築物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、線状に
したＤＮＡをエクソヌクレアーゼIII （ベーリンガー・
マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いて５’
末端から両方向に消化していき、一組のネステド欠失物
とした後、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）で処理し
て平滑末端とした。電気泳動後（１％アガローズゲ
ル）、適当なサイズのフラグメントをゲルから単離し、
再ライゲーションしてから大腸菌ＸＬ−１ブルー株にト
ランスホーメーションした。ヘルパーファージＣＳＭ１
３を用いて一本鎖ＤＮＡを単離し、Ｔａｑポリメラーゼ
（プロメガ、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用い、市
販業者の説明書にしたがってシーケンシングした。
レイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いたチェーン・ターミ
ネーション法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３
−５４６７（１９７７））により、放射能的および非放
射能的にシーケンシングした。放射能プラスミドシーケ
ンシングは、適当なプライマーを用い、ハットリ（Ｈａ
ｔｔｏｒｉ）等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：
２３２−２３８（１９８４）の方法で行った。３．６kb
のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、アプライド３
７３Ａ ＤＮＡシークエネーター（アプライド・バイオ
システムズ、ウェイタートタット、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用
い、非放射能的にシーケンシングした。各フラグメント
は、ファージミドｐＢＳＤ-/+にクローニングした。こ
の構築物をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、線状に
したＤＮＡをエクソヌクレアーゼIII （ベーリンガー・
マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用いて５’
末端から両方向に消化していき、一組のネステド欠失物
とした後、ムング・ビーン・ヌクレアーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム、マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）で処理し
て平滑末端とした。電気泳動後（１％アガローズゲ
ル）、適当なサイズのフラグメントをゲルから単離し、
再ライゲーションしてから大腸菌ＸＬ−１ブルー株にト
ランスホーメーションした。ヘルパーファージＣＳＭ１
３を用いて一本鎖ＤＮＡを単離し、Ｔａｑポリメラーゼ
（プロメガ、フレイバーグ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）を用い、市
販業者の説明書にしたがってシーケンシングした。
【００３７】プラスミドの構築 スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
のテトラサイクリン耐性プラスミドｐＴ１８１のシーケ
ンシングで（カーン（Ｋａｈｎ）等、Ｐｌａｓｍｉｄ
１０：２５１−２５９（１９８３）、プラスミドの複製
に必要ではないプレ・遺伝子内に単一のＮｄｅＩ部位が
あることが分かった（ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）等、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２６０１−２６１０
（１９８７））。大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシ
ュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅ
ｎｅ ３３：１０３−１１９（１９８５））の多重クロ
ーニング部位（ｍｃｓ）をこのＮｄｅＩ部位に挿入し、
ｐＴ１８１ｍｃｓを構築した（第２４図）。スタフィロ
コッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌シ
ャトルベクター、ｐＣＵＩ（第２０図）をスタフィロコ
ッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のクロラムフ
ェニコール耐性プラスミドｐＣ１９４の誘導体であるｐ
ＣＬＰ１００および大腸菌ベクターｐＵＣ１９から構築
した。ｐＣＵＩは、両宿主内で約６kbまでの挿入物を安
定に維持する。ｐＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵＩは、ス
タフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に
適合しており、これらをｐＴｕ３２由来のＤＮＡフラグ
メントをサブクローニングするのに使用した。ｐＴｕ３
２のＨｉｎｄIII フラグメントをｐＵＣ１９にクローニ
ングし、これをサザン・ハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして使用して、さらにＨｉｎｄIII フラグメント
付近の制限部位を同定した（第１０図Ｃ）。Ｓ．Ｓ．エ
ピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）由来の５４ kbpエピ
ソーマル要素ｐＴｕ32の１３．５ kbpＢｇｌIIフラグメ
ントをｐＴ１８１ｍｃｓにサブクローニングしてｐＴｅ
ｐｉ１４を構築した（第１０図Ａ）。ＤＮＡシーケンス
用に大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシュ・ペラン
（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ ３
３：１０３−１１９（１９８５））およびｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔIIR （ストラタジーン、ハイデルベルグ、
Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にサブクローンを作製した。ベクターｐ
ＳＰＴ１８／１９（ベーリンガー・マンハイム、マンハ
イム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングしたＤＮＡから一
本鎖ＲＮＡプローブを得た。
のテトラサイクリン耐性プラスミドｐＴ１８１のシーケ
ンシングで（カーン（Ｋａｈｎ）等、Ｐｌａｓｍｉｄ
１０：２５１−２５９（１９８３）、プラスミドの複製
に必要ではないプレ・遺伝子内に単一のＮｄｅＩ部位が
あることが分かった（ゲナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）等、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２６０１−２６１０
（１９８７））。大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシ
ュ・ペラン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅ
ｎｅ ３３：１０３−１１９（１９８５））の多重クロ
ーニング部位（ｍｃｓ）をこのＮｄｅＩ部位に挿入し、
ｐＴ１８１ｍｃｓを構築した（第２４図）。スタフィロ
コッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌シ
ャトルベクター、ｐＣＵＩ（第２０図）をスタフィロコ
ッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のクロラムフ
ェニコール耐性プラスミドｐＣ１９４の誘導体であるｐ
ＣＬＰ１００および大腸菌ベクターｐＵＣ１９から構築
した。ｐＣＵＩは、両宿主内で約６kbまでの挿入物を安
定に維持する。ｐＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵＩは、ス
タフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に
適合しており、これらをｐＴｕ３２由来のＤＮＡフラグ
メントをサブクローニングするのに使用した。ｐＴｕ３
２のＨｉｎｄIII フラグメントをｐＵＣ１９にクローニ
ングし、これをサザン・ハイブリダイゼーションのプロ
ーブとして使用して、さらにＨｉｎｄIII フラグメント
付近の制限部位を同定した（第１０図Ｃ）。Ｓ．Ｓ．エ
ピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）由来の５４ kbpエピ
ソーマル要素ｐＴｕ32の１３．５ kbpＢｇｌIIフラグメ
ントをｐＴ１８１ｍｃｓにサブクローニングしてｐＴｅ
ｐｉ１４を構築した（第１０図Ａ）。ＤＮＡシーケンス
用に大腸菌ベクターｐＵＣ１９（ヤニッシュ・ペラン
（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ ３
３：１０３−１１９（１９８５））およびｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔIIR （ストラタジーン、ハイデルベルグ、
Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にサブクローンを作製した。ベクターｐ
ＳＰＴ１８／１９（ベーリンガー・マンハイム、マンハ
イム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングしたＤＮＡから一
本鎖ＲＮＡプローブを得た。
【００３８】遺伝子解析 エピデルミン構造遺伝子、ｅｐｉＡに隣接するＤＮＡ領
域をシーケンシングする事で、ｐＴｕ３２の１３．５ k
bpＢｇｌIIフラグメントの内部にさらに５個の完全なオ
ープン・リーディング・フレーム、ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、
ＰおよびＱが存在することが明らかになった。第１１図
乃至第１９図から分かるように、ｅｐｉＡオーカーコド
ンから僅か５０ヌクレオチド離れた、ＥｐｉＡをコード
する配列の直ぐ隣に、Ｓ／Ｄ配列に続く２，９７０bpの
大きなオープン・リーディング・フレームが存在する。
また、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ）の翻訳開始コドンとして働きうるロイシンのＴＴ
ＧコドンもＳ／Ｄ配列から適当な距離に存在する。この
オープン・リーディング・フレームをｅｐｉＢと呼ぶ
が、これは、本明細書で示すようにエピデルミンの生合
成変異体の相補性やエピデルミン生合成における基本的
役割において利用することが出来る。ＴＴＧ（Ｌｅｕ）
から開始する、ｅｐｉＢによってコードされるタンパク
質は、分子量約１１５DaおよびｐＨ７における正味の電
荷−３を有し、またカイト（Ｋｙｔｅ）等、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）に
従う親水性プロットからも予想されるように、中程度の
疎水性（４１％疎水性残基）である。ｅｐｉＢの３’末
端には、転写停止に特徴的なパリンドローム構造は見ら
れない。しかし、第１１図乃至第１９図からも分かるよ
うに、１塩基シフトして別のリーディング・フレームｅ
ｐｉＣと１２２bpの重複がある。本出願者は、２つの独
立したプラスミドの単離物由来の各４７ kbpのＨｉｎｄ
III フラグメントを独立に２回、クローニングおよびシ
ーケンシングする事により、この事がアーテファクトで
はないことを確認した。また、このことは、本明細書で
示すｅｐｉＣ含有フラグメントを用いた変異体の相補性
によっても確認された。ｅｐｉＢおよびｅｐｉＣのリー
ディング・フレームの重複領域の内側で、ＡＧＧＡ要素
の３’側僅か３６bpの所にある最初のＴＴＧコドン（Ｌ
ｅｕ）が翻訳開始コドンの役割を果たしており、このこ
とは、両リーディング・フレームが約４０コドン重複し
ていることを示している。ＥｐｉＣタンパク質の実際の
アミノ末端は、Ｎ末端シーケンシングで決定した。リー
ディング・フレームｅｐｉＣは、開始コドンＴＴＧ（Ｌ
ｅｕ）で始まる４４５アミノ酸残基のタンパク質をコー
ドしている。リーディング・フレームｅｐｉＤは、ｅｐ
ｉＣの３’側に直接続き、Ｓ／Ｄ配列ＡＧＧＡＧＧの
３’側８６bpの所に開始コドンＡＴＧを有している。ｅ
ｐｉＤの３’側には、古典的なロー因子依存の転写ター
ミネーター構造がある。ｅｐｉＤは、開始コドンＡＴＧ
（Ｍｅｔ）を含む１８１アミノ酸残基のタンパク質であ
る。タンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱのいずれ
も、スイス・プロットおよびジーン・バンクのタンパク
質データベースに登録されているタンパク質配列との類
似性を示さず、したがって、これらは未知のタイプの酵
素または調節タンパク質である。
域をシーケンシングする事で、ｐＴｕ３２の１３．５ k
bpＢｇｌIIフラグメントの内部にさらに５個の完全なオ
ープン・リーディング・フレーム、ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、
ＰおよびＱが存在することが明らかになった。第１１図
乃至第１９図から分かるように、ｅｐｉＡオーカーコド
ンから僅か５０ヌクレオチド離れた、ＥｐｉＡをコード
する配列の直ぐ隣に、Ｓ／Ｄ配列に続く２，９７０bpの
大きなオープン・リーディング・フレームが存在する。
また、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ）の翻訳開始コドンとして働きうるロイシンのＴＴ
ＧコドンもＳ／Ｄ配列から適当な距離に存在する。この
オープン・リーディング・フレームをｅｐｉＢと呼ぶ
が、これは、本明細書で示すようにエピデルミンの生合
成変異体の相補性やエピデルミン生合成における基本的
役割において利用することが出来る。ＴＴＧ（Ｌｅｕ）
から開始する、ｅｐｉＢによってコードされるタンパク
質は、分子量約１１５DaおよびｐＨ７における正味の電
荷−３を有し、またカイト（Ｋｙｔｅ）等、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）に
従う親水性プロットからも予想されるように、中程度の
疎水性（４１％疎水性残基）である。ｅｐｉＢの３’末
端には、転写停止に特徴的なパリンドローム構造は見ら
れない。しかし、第１１図乃至第１９図からも分かるよ
うに、１塩基シフトして別のリーディング・フレームｅ
ｐｉＣと１２２bpの重複がある。本出願者は、２つの独
立したプラスミドの単離物由来の各４７ kbpのＨｉｎｄ
III フラグメントを独立に２回、クローニングおよびシ
ーケンシングする事により、この事がアーテファクトで
はないことを確認した。また、このことは、本明細書で
示すｅｐｉＣ含有フラグメントを用いた変異体の相補性
によっても確認された。ｅｐｉＢおよびｅｐｉＣのリー
ディング・フレームの重複領域の内側で、ＡＧＧＡ要素
の３’側僅か３６bpの所にある最初のＴＴＧコドン（Ｌ
ｅｕ）が翻訳開始コドンの役割を果たしており、このこ
とは、両リーディング・フレームが約４０コドン重複し
ていることを示している。ＥｐｉＣタンパク質の実際の
アミノ末端は、Ｎ末端シーケンシングで決定した。リー
ディング・フレームｅｐｉＣは、開始コドンＴＴＧ（Ｌ
ｅｕ）で始まる４４５アミノ酸残基のタンパク質をコー
ドしている。リーディング・フレームｅｐｉＤは、ｅｐ
ｉＣの３’側に直接続き、Ｓ／Ｄ配列ＡＧＧＡＧＧの
３’側８６bpの所に開始コドンＡＴＧを有している。ｅ
ｐｉＤの３’側には、古典的なロー因子依存の転写ター
ミネーター構造がある。ｅｐｉＤは、開始コドンＡＴＧ
（Ｍｅｔ）を含む１８１アミノ酸残基のタンパク質であ
る。タンパク質ｅｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱのいずれ
も、スイス・プロットおよびジーン・バンクのタンパク
質データベースに登録されているタンパク質配列との類
似性を示さず、したがって、これらは未知のタイプの酵
素または調節タンパク質である。
【００３９】生合成遺伝子の転写 先に示したように、目的のフラグメントをｐＳＰＴ１８
／１９ベクターシステム（ベーリンガー・マンハイム、
マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングすることに
より一本鎖ＲＮＡプローブを得た。第２０図に示すよう
に、サイズのかなり異なる２つの転写物が得られた。ｅ
ｐｉＡに特異的なハイブリダイゼーション・プローブ
が、約３００bpの小さな転写物を同定した。また、同様
のサイズの転写物が、ランチビオチックであるニシン
（バックマン（Ｂｕｃｈｍａｎｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３：１６２６０−１６２６６（１９８
８））およびズブチリン（バネリー（Ｂａｎｅｒｊｅ
ｅ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９５０８−
９５１４（１９８８））についても発見された。さら
に、約５kbの大きい転写物もｅｐｉＢに特異的なハイブ
リダゼーション・プローブを用いて同定された。ｅｐｉ
Ｂの前に大腸菌様のプロモーター配列が無く、一方、ｅ
ｐｉＡの５’側に適当な配列が存在することから、ｅｐ
ｉＡプロモーターはポリシストロンｍＲＮＡのプロモー
ターとして働くと見ることが出来る。
／１９ベクターシステム（ベーリンガー・マンハイム、
マンハイム、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）にクローニングすることに
より一本鎖ＲＮＡプローブを得た。第２０図に示すよう
に、サイズのかなり異なる２つの転写物が得られた。ｅ
ｐｉＡに特異的なハイブリダイゼーション・プローブ
が、約３００bpの小さな転写物を同定した。また、同様
のサイズの転写物が、ランチビオチックであるニシン
（バックマン（Ｂｕｃｈｍａｎｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６３：１６２６０−１６２６６（１９８
８））およびズブチリン（バネリー（Ｂａｎｅｒｊｅ
ｅ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９５０８−
９５１４（１９８８））についても発見された。さら
に、約５kbの大きい転写物もｅｐｉＢに特異的なハイブ
リダゼーション・プローブを用いて同定された。ｅｐｉ
Ｂの前に大腸菌様のプロモーター配列が無く、一方、ｅ
ｐｉＡの５’側に適当な配列が存在することから、ｅｐ
ｉＡプロモーターはポリシストロンｍＲＮＡのプロモー
ターとして働くと見ることが出来る。
【００４０】下流のオープン・リーディング・フレーム オープン・リーディング・フレームｅｐｉＰおよびｅｐ
ｉＱは、ｅｐｉＢ、ＣおよびＤとは反対のＤＮＡに存在
し、ｅｐｉＱは、６bpのループを含む完全なヘアピンで
あるターミネーション構造をｅｐｉＤと共有している。
このループ構造の中で、ｅｐｉＤおよびｅｐｉＱ両リー
ディング・フレームのＴＡＡ終止コドンは、３個のヌク
レオチドの内の２個を共有している。ｅｐｉＰのリーデ
ィング・フレームは、Ｓ／Ｄ配列と適当な距離（６bp）
にあるＡＴＧコドンで開始している。このＡＴＧコドン
をｅｐｉＰの翻訳開始コドンとすると、このタンパク質
は４６１アミノ酸残基からなる分子量５１．８kDのタン
パク質である。ｅｐｉＰは、セリン・プロテアーゼに保
存されているアミノ酸モチーフ（図２１）に類似する特
徴を有しており、このことは、ｅｐｉＰが修正されたプ
レペプチドからの成熟型リンチビオチックの切断に関係
していることを示している。また、ｅｐｉＱのリーディ
ング・フレームも、ＡＴＧコドンから開始しており、こ
れは２０５アミノ酸残基をコードしている（第１１図乃
至第１９図）。Ｓ／Ｄ配列は、ＡＴＧ翻訳開始コドンか
ら６bp離れて存在し、また、その分子量２４３kDはＤＮ
Ａ配列から誘導した。ｅｐｉＱタンパク質は、大腸菌の
リン酸調節に関するポジティブ調節因子であるＰｈｏＢ
に類似する特徴を有し（第２２図参照）、その結果、ｅ
ｐｉＱはランチビオチック合成における調節因子と考え
られる。ｅｐｉＰに先行して、Ｓ／Ｄ配列の１２bp手前
に大腸菌様の−１０領域（５’−ＴＡＴＡＡＡ）があ
り、これはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ）においてプロモーターの役割を果たしてい
る。第１１図乃至第１９図に示すように、ｅｐｉＰの終
止コドンとｅｐｉＱのＡＴＧ翻訳開始コドンの距離は、
僅か１０ヌクレオチドであり、また、ｅｐｉＱのＳ／Ｄ
配列はｅｐｉＰの終止コドンと重複している。ｅｐｉ
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの５’側に逆方向のリーディング・フレ
ームがあり、これは潜在的に最高１４８アミノ酸残基を
コードしている。特徴的なＳ／Ｄ配列は存在するが、先
に示したスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ）の開始コドン（ＡＴＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ）はい
ずれも存在しない。−１のフレームシフトを持つリーデ
ィング・フレームが続くが、これは第１１図乃至第１９
図に示したＢｇｌII単離フラグメントを越えている。こ
れら２個のリーディング・フレームは、ガリデルミンの
構造遺伝子に隣接すると同定された単一のオープン・リ
ーディング・フレームｇｄｍＹと相同的である（シュネ
ル（Ｓｃｈｎｅｌｌ），Ｎ．，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ
ｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ Ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｎ ｕｎｄ Ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ；
博士論文、チュービンゲン大学、Ｆ．Ｒ．Ｇ．（１９８
９））。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）
プラスミド上の相同的リーディング・フレームをｅｐｉ
Ｙ’およびｅｐｉＹ”と命名した。
ｉＱは、ｅｐｉＢ、ＣおよびＤとは反対のＤＮＡに存在
し、ｅｐｉＱは、６bpのループを含む完全なヘアピンで
あるターミネーション構造をｅｐｉＤと共有している。
このループ構造の中で、ｅｐｉＤおよびｅｐｉＱ両リー
ディング・フレームのＴＡＡ終止コドンは、３個のヌク
レオチドの内の２個を共有している。ｅｐｉＰのリーデ
ィング・フレームは、Ｓ／Ｄ配列と適当な距離（６bp）
にあるＡＴＧコドンで開始している。このＡＴＧコドン
をｅｐｉＰの翻訳開始コドンとすると、このタンパク質
は４６１アミノ酸残基からなる分子量５１．８kDのタン
パク質である。ｅｐｉＰは、セリン・プロテアーゼに保
存されているアミノ酸モチーフ（図２１）に類似する特
徴を有しており、このことは、ｅｐｉＰが修正されたプ
レペプチドからの成熟型リンチビオチックの切断に関係
していることを示している。また、ｅｐｉＱのリーディ
ング・フレームも、ＡＴＧコドンから開始しており、こ
れは２０５アミノ酸残基をコードしている（第１１図乃
至第１９図）。Ｓ／Ｄ配列は、ＡＴＧ翻訳開始コドンか
ら６bp離れて存在し、また、その分子量２４３kDはＤＮ
Ａ配列から誘導した。ｅｐｉＱタンパク質は、大腸菌の
リン酸調節に関するポジティブ調節因子であるＰｈｏＢ
に類似する特徴を有し（第２２図参照）、その結果、ｅ
ｐｉＱはランチビオチック合成における調節因子と考え
られる。ｅｐｉＰに先行して、Ｓ／Ｄ配列の１２bp手前
に大腸菌様の−１０領域（５’−ＴＡＴＡＡＡ）があ
り、これはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ）においてプロモーターの役割を果たしてい
る。第１１図乃至第１９図に示すように、ｅｐｉＰの終
止コドンとｅｐｉＱのＡＴＧ翻訳開始コドンの距離は、
僅か１０ヌクレオチドであり、また、ｅｐｉＱのＳ／Ｄ
配列はｅｐｉＰの終止コドンと重複している。ｅｐｉ
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの５’側に逆方向のリーディング・フレ
ームがあり、これは潜在的に最高１４８アミノ酸残基を
コードしている。特徴的なＳ／Ｄ配列は存在するが、先
に示したスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ）の開始コドン（ＡＴＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ）はい
ずれも存在しない。−１のフレームシフトを持つリーデ
ィング・フレームが続くが、これは第１１図乃至第１９
図に示したＢｇｌII単離フラグメントを越えている。こ
れら２個のリーディング・フレームは、ガリデルミンの
構造遺伝子に隣接すると同定された単一のオープン・リ
ーディング・フレームｇｄｍＹと相同的である（シュネ
ル（Ｓｃｈｎｅｌｌ），Ｎ．，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅ
ｄｅｒ Ｐｅｐｔｉｄ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ Ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｎ ｕｎｄ Ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ；
博士論文、チュービンゲン大学、Ｆ．Ｒ．Ｇ．（１９８
９））。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）
プラスミド上の相同的リーディング・フレームをｅｐｉ
Ｙ’およびｅｐｉＹ”と命名した。
【００４１】実施例４ 先に示したように調製したプラスミドｐＴｅｐｉ１４を
標準的技術を用いてＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕ
ｓ）にトランスホームした。ついで、このトランスホー
ム株をＢＭ培地で増殖した（上述）。生成したトランス
ホーマントは、エピデルミン感受性テスト株マイクロコ
ッカス リテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅ
ｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１を阻害することが分かった。こ
の検定では、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の一晩培養
物１ml（ＯＤ578 を１．０に調整）を５００mlの融解Ｂ
Ｍ寒天培地に添加した。通常、この寒天培地１０mlをシ
ャーレに入れた。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｓ）の培養希釈物をこの寒天培地の表面に拡げた。
エピデルミン・ポジティブ・コロニーは、コロニーの回
りのＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の増殖阻害帯で検出
した。細胞を３％肉抽出物、３．８％モルト抽出物、
０．６％ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏおよび４．６％ＮａＣｌ
（ｐＨ６．５）溶液で培養した。使用したトランスホー
マントに応じて、テトラサイクリンまたはクロラムフェ
ニコールを添加した。１つのイクステンションを有する
５００mlの三角フラスコ中、１００mlの培地で２４時間
インキュベートした後、両培養物をサーバル遠心機を用
いて１０，０００rpmで１０分間遠心した。トランスホ
ーマントの液体培養物の上清を吸着クロマトグラフィー
で精製し（ＸＡＤ１１８０、不純物は、水／メタノール
（１：１）で溶出し、エピデルミンは、メタノール／
０．１Ｎ ＨＣｌ（９：１）で溶出した。エバポレーシ
ョン後、溶出液を３Ｎ ＮａＯＨでｐＨ３．５に調整
し、水を加えて１０mlとした。）、ＨＰＬＣクロマトグ
ラフィーで検出した。この阻害活性は、成熟型エピデル
ミンと共に溶出した（６．７５／６．７６分、第２３図
Ａ及びＢ参照）。トランスホームしていないＳ．カルノ
サス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）の培養培地を同様に処理した
が、この溶出領域にはピークを示さなかった（第２３図
Ｃ）。これらの結果は、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓ
ｕｓ）における異種エピデルミンの生合成を明確に示す
ものであり、かつ、ｐＴｅｐｉ１４がエピデルミンの生
合成に必要な全ての情報を含んでいることを示してい
る。ｐＴｅｐｉ１４は１３．５ kbpのＢｇｌIIフラグメ
ントを含んでおり、かつ、ｅｐｉＹ’が翻訳開始コドン
を欠き、また、ｅｐｉＹ”がこのフラグメント上で不完
全なことから、ｅｐｉＹ’およびｅｐｉＹ”のリーディ
ング・フレームがこの系におけるエピデルミンの生産に
必ずしも必要ではないことを示している。
標準的技術を用いてＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕ
ｓ）にトランスホームした。ついで、このトランスホー
ム株をＢＭ培地で増殖した（上述）。生成したトランス
ホーマントは、エピデルミン感受性テスト株マイクロコ
ッカス リテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅ
ｕｓ）ＡＴＣＣ９３４１を阻害することが分かった。こ
の検定では、Ｍ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の一晩培養
物１ml（ＯＤ578 を１．０に調整）を５００mlの融解Ｂ
Ｍ寒天培地に添加した。通常、この寒天培地１０mlをシ
ャーレに入れた。Ｓ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｓ）の培養希釈物をこの寒天培地の表面に拡げた。
エピデルミン・ポジティブ・コロニーは、コロニーの回
りのＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）の増殖阻害帯で検出
した。細胞を３％肉抽出物、３．８％モルト抽出物、
０．６％ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏおよび４．６％ＮａＣｌ
（ｐＨ６．５）溶液で培養した。使用したトランスホー
マントに応じて、テトラサイクリンまたはクロラムフェ
ニコールを添加した。１つのイクステンションを有する
５００mlの三角フラスコ中、１００mlの培地で２４時間
インキュベートした後、両培養物をサーバル遠心機を用
いて１０，０００rpmで１０分間遠心した。トランスホ
ーマントの液体培養物の上清を吸着クロマトグラフィー
で精製し（ＸＡＤ１１８０、不純物は、水／メタノール
（１：１）で溶出し、エピデルミンは、メタノール／
０．１Ｎ ＨＣｌ（９：１）で溶出した。エバポレーシ
ョン後、溶出液を３Ｎ ＮａＯＨでｐＨ３．５に調整
し、水を加えて１０mlとした。）、ＨＰＬＣクロマトグ
ラフィーで検出した。この阻害活性は、成熟型エピデル
ミンと共に溶出した（６．７５／６．７６分、第２３図
Ａ及びＢ参照）。トランスホームしていないＳ．カルノ
サス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）の培養培地を同様に処理した
が、この溶出領域にはピークを示さなかった（第２３図
Ｃ）。これらの結果は、Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓ
ｕｓ）における異種エピデルミンの生合成を明確に示す
ものであり、かつ、ｐＴｅｐｉ１４がエピデルミンの生
合成に必要な全ての情報を含んでいることを示してい
る。ｐＴｅｐｉ１４は１３．５ kbpのＢｇｌIIフラグメ
ントを含んでおり、かつ、ｅｐｉＹ’が翻訳開始コドン
を欠き、また、ｅｐｉＹ”がこのフラグメント上で不完
全なことから、ｅｐｉＹ’およびｅｐｉＹ”のリーディ
ング・フレームがこの系におけるエピデルミンの生産に
必ずしも必要ではないことを示している。
【００４２】実施例５ Ｓ．エピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）Ｔｕ３２９８
の多くのｅｐｉ変異体をエチルメタンスルホネート（Ｅ
ＭＳ）突然変異誘発法で調製した。この操作は、ミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｊ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，コー
ルド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９７２）の
方法にしたがって行った。変異体は、エピデルミンの生
産、または上述のＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）を用い
たエピデルミン生産の欠如でスクリーニングした。ｅｐ
ｉ変異体を数回移し替えて安定性をテストした。単離し
た４０個のｅｐｉ変異体の内、安定なのは僅か１０個で
あった。不安定な変異体は、数回の移し替えの後、再び
エピデルミンを生産した。全ての安定なｅｐｉ変異体
は、プラスミドｐＴｕ３２を含んでおり、このプラスミ
ドは、制限エンドヌクケアーゼ分析で明らかなように欠
失、または再配列を起こしていなかった。この１０個の
ｅｐｉ変異体を相補性の実験に使用した。プラスミドｐ
Ｔｕ３２の種々の制限フラグメントをＳ．カルノサス
（ｃａｒｎｏｓｕｓ）にクローン化し、異種のエピデル
ミンの生産を検定した。先に述べたこのフラグメントを
プラスミドベクターＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵ１、お
よび第２６図Ｂに示したように、サブクローニングした
種々のＯＲＦＣに挿入した。先ず、Ｓ．カルノサス（ｃ
ａｒｎｏｓｕｓ）（プロトプラスト・トランスホーメー
ション（ゴズ（Ｇｏｔｚ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．４０：２８５−２８８（１９８７）
による）または大腸菌（ＣａＣｌ2を使用、コーエン
（Ｃｏｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０−２１１４（１９７２））
を用いてクローニングを行い、ついで、その組み換えプ
ラスミドを単離し、エレクトロポレーションを用いて種
々のＳ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に移
した（オーグスチン（Ａｕｇｕｓｔｉｎ）等、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３−２０
８（１９９０））。分子クローニングに使用した酵素
は、ベーリンガー・マンハイム（マンハイム、Ｆ．Ｒ．
Ｇ．）、ＢＲＬ（エゲンスタイン、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）また
はファルマシア（スウェーデン）から入手した。Ｓ．エ
ピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）株のトランスホーメ
ーションは、環状（ｃｃｃ）プラスミドでのみ旨く行
き、即ち、ライゲーション産物を用いた場合、時々しか
トランスホーマントが得られないことから、この間接的
トランスホーメーション法が必要となった。相補性実験
の結果を表１に示した。
の多くのｅｐｉ変異体をエチルメタンスルホネート（Ｅ
ＭＳ）突然変異誘発法で調製した。この操作は、ミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｊ．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，コー
ルド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９７２）の
方法にしたがって行った。変異体は、エピデルミンの生
産、または上述のＭ．ルテウス（ｌｕｔｅｕｓ）を用い
たエピデルミン生産の欠如でスクリーニングした。ｅｐ
ｉ変異体を数回移し替えて安定性をテストした。単離し
た４０個のｅｐｉ変異体の内、安定なのは僅か１０個で
あった。不安定な変異体は、数回の移し替えの後、再び
エピデルミンを生産した。全ての安定なｅｐｉ変異体
は、プラスミドｐＴｕ３２を含んでおり、このプラスミ
ドは、制限エンドヌクケアーゼ分析で明らかなように欠
失、または再配列を起こしていなかった。この１０個の
ｅｐｉ変異体を相補性の実験に使用した。プラスミドｐ
Ｔｕ３２の種々の制限フラグメントをＳ．カルノサス
（ｃａｒｎｏｓｕｓ）にクローン化し、異種のエピデル
ミンの生産を検定した。先に述べたこのフラグメントを
プラスミドベクターＴ１８１ｍｃｓおよびｐＣＵ１、お
よび第２６図Ｂに示したように、サブクローニングした
種々のＯＲＦＣに挿入した。先ず、Ｓ．カルノサス（ｃ
ａｒｎｏｓｕｓ）（プロトプラスト・トランスホーメー
ション（ゴズ（Ｇｏｔｚ）等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．４０：２８５−２８８（１９８７）
による）または大腸菌（ＣａＣｌ2を使用、コーエン
（Ｃｏｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０−２１１４（１９７２））
を用いてクローニングを行い、ついで、その組み換えプ
ラスミドを単離し、エレクトロポレーションを用いて種
々のＳ．Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に移
した（オーグスチン（Ａｕｇｕｓｔｉｎ）等、ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３−２０
８（１９９０））。分子クローニングに使用した酵素
は、ベーリンガー・マンハイム（マンハイム、Ｆ．Ｒ．
Ｇ．）、ＢＲＬ（エゲンスタイン、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）また
はファルマシア（スウェーデン）から入手した。Ｓ．エ
ピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）株のトランスホーメ
ーションは、環状（ｃｃｃ）プラスミドでのみ旨く行
き、即ち、ライゲーション産物を用いた場合、時々しか
トランスホーマントが得られないことから、この間接的
トランスホーメーション法が必要となった。相補性実験
の結果を表１に示した。
【表１】 表１ 種々の pTepi 14 DNA フラグメントによるトランスホーメーション後の 非生産型S.エピデルミス（epidermis)変異体によるエピデルミンの生産 変異体 相補性 変異部位 pTepi 14 pTepi pCUepi pTepi AB pCUepi ABCDQ ABC A1 EMS 5 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ epiA EMS 6 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ epiA EMS 11 ＋ ＋ − − − epiD EMS 12 ＋ ＋ ＋ − − epiC EMS 13 ＋ ＋ ＋ − − epiC EMS 18 ＋ ＋ ＋ ＋ − epiB EMS 19 ＋ ＋ ＋ − − epiC EMS 33 ＋ ＋ ＋ ＋ − epiB EMS 39 ＋ ＋ ＋ − − epiC EMS 45 ＋ ＋ ＋ ＋ − epiB ───────────────────────────────────
【表２】 表１（続き） 変異体 相補性 変異部位 pCUepi pCUepi pCUepi pCUepi Q pCUepi B A2 CDQ DQ EMS 5 − − − − − epiA EMS 6 − − − − − epiA EMS 11 − ＋ ＋ − − epiD EMS 12 − ＋ − − − epiC EMS 13 − ＋ − − − epiC EMS 18 − − − − − epiB EMS 19 − ＋ − − − epiC EMS 33 − − − − − epiB EMS 39 − ＋ − − − epiC EMS 45 − − − − − epiB ─────────────────────────────────── pCU:pCU1にクローニングしたフラグメント PT：PT181mcs にクローニングしたフラグメント ＋ 相補性あり（エピデルミン生産あり） − 相補性なし
【００４３】種々のｅｐｉ遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｐ
およびＱ）を含む一連のプラスミドを構築した（第２６
図Ｂ）。２つのプラスミドｐＴｅｐｉ１４およびｐＴｅ
ｐｉＡＢＣＤＱは、全てのｅｐｉ変異体を相補しえた。
構築した他のプラスミドｐＣＵｅｐｉＡＢＣ、ｐＴｅｐ
ｉＡＢ、ｐＣＵｅｐｉＣＤＱ、ｐＣＵｅｐｉＢ、ｐＣＵ
ｅｐｉＡ1 、ｐＣＵｅｐｉＡ2 、ｐＣＵｅｐｉＤＱおよ
びｐＣＵｅｐｉＱは、指示された遺伝子を含んでいた。
種々のプラスミドは、以下のように分類される特定のク
ラスの変異体のみを相補しえた。 ＥＭＳ ５および６−ｅｐｉＡ変異体 ＥＭＳ １８、３３および４５−ｅｐｉＢ変異体 ＥＭＳ １２、１３、１９および３９−ｅｐｉＣ変異体 ＥＭＳ １１−ｅｐｉＤ変異体 以下に示す結果は、少なくともエピデルミンの生合成に
は４個のＯＲＦ、ｅｐｉＡ、Ｂ、ＣおよびＤが必要であ
ることを示している。
およびＱ）を含む一連のプラスミドを構築した（第２６
図Ｂ）。２つのプラスミドｐＴｅｐｉ１４およびｐＴｅ
ｐｉＡＢＣＤＱは、全てのｅｐｉ変異体を相補しえた。
構築した他のプラスミドｐＣＵｅｐｉＡＢＣ、ｐＴｅｐ
ｉＡＢ、ｐＣＵｅｐｉＣＤＱ、ｐＣＵｅｐｉＢ、ｐＣＵ
ｅｐｉＡ1 、ｐＣＵｅｐｉＡ2 、ｐＣＵｅｐｉＤＱおよ
びｐＣＵｅｐｉＱは、指示された遺伝子を含んでいた。
種々のプラスミドは、以下のように分類される特定のク
ラスの変異体のみを相補しえた。 ＥＭＳ ５および６−ｅｐｉＡ変異体 ＥＭＳ １８、３３および４５−ｅｐｉＢ変異体 ＥＭＳ １２、１３、１９および３９−ｅｐｉＣ変異体 ＥＭＳ １１−ｅｐｉＤ変異体 以下に示す結果は、少なくともエピデルミンの生合成に
は４個のＯＲＦ、ｅｐｉＡ、Ｂ、ＣおよびＤが必要であ
ることを示している。
【００４４】プラスミドｐＣＵｅｐｉＡは、唯一の完全
なＯＲＦとして構造遺伝子ｅｐｉＡ、および、さらにそ
の上流に１４００bpおよび下流に６０２bpを有してお
り、この後者の配列はｅｐｉＢＮ末端の１９０個のアミ
ノ酸をコードしている。ｐＣＵｅｐｉＡ1 を用いたトラ
ンスホーメーションでエピデルミン変異体ＥＭＳ５およ
び６の相補性が示され、この事でこれらがｅｐｉＡの変
異体であることが同定された。ｐＣＵｅｐｉＡ2 におい
て両方向にクローニングされたより小さいｅｐｉＡ含有
Ｓｃａ１フラグメントは、ｅｐｉ変異体によりｅｐｉＡ
プロモーターが切断されたためにｅｐｉ変異体を相補す
る事が出来なかった。ｐＣＵｅｐｉＢは、完全なｅｐｉ
ＢおよびｅｐｉＡの３’末端の７５bpを含む１００bpの
上流領域を含むＢｓｔＮ１フラグメントを含んでいる。
ｅｐｉＡプロモーターは含んでいない。ｐＣＵｅｐｉＢ
でのトランスホーメーションでは、いずれのＳ．エピデ
ルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体のエピデルミン生
産も相補しえず、この事は、ｅｐｉＢが自分自身のプロ
モーターを欠いており、ｅｐｉＡのプロモーターから一
緒に転写されているらしいことを示している。この事
は、ｅｐｉＡプロモーターと完全なｅｐｉＡおよびＢ遺
伝子を含み、かつその使用がｅｐｉＡおよびｅｐｉＢ変
異体の両方を相補するｐＴｅｐｉＡＢ（第２６図Ｂ、表
１）で得られた結果と一致する。プラスミドｐＣＵｅｐ
ｉＣＤＱはｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方を相補できる
が、プラスミドｐＣＵｅｐｉＤＱはｅｐｉＤ変異体のみ
を相補しうる（表１）。この相補性は、クローン化した
ＤＮＡフラグメントの方向には依存しない。これらの結
果は、ｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方が自分のプロモー
ターを有していることを示している。
なＯＲＦとして構造遺伝子ｅｐｉＡ、および、さらにそ
の上流に１４００bpおよび下流に６０２bpを有してお
り、この後者の配列はｅｐｉＢＮ末端の１９０個のアミ
ノ酸をコードしている。ｐＣＵｅｐｉＡ1 を用いたトラ
ンスホーメーションでエピデルミン変異体ＥＭＳ５およ
び６の相補性が示され、この事でこれらがｅｐｉＡの変
異体であることが同定された。ｐＣＵｅｐｉＡ2 におい
て両方向にクローニングされたより小さいｅｐｉＡ含有
Ｓｃａ１フラグメントは、ｅｐｉ変異体によりｅｐｉＡ
プロモーターが切断されたためにｅｐｉ変異体を相補す
る事が出来なかった。ｐＣＵｅｐｉＢは、完全なｅｐｉ
ＢおよびｅｐｉＡの３’末端の７５bpを含む１００bpの
上流領域を含むＢｓｔＮ１フラグメントを含んでいる。
ｅｐｉＡプロモーターは含んでいない。ｐＣＵｅｐｉＢ
でのトランスホーメーションでは、いずれのＳ．エピデ
ルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体のエピデルミン生
産も相補しえず、この事は、ｅｐｉＢが自分自身のプロ
モーターを欠いており、ｅｐｉＡのプロモーターから一
緒に転写されているらしいことを示している。この事
は、ｅｐｉＡプロモーターと完全なｅｐｉＡおよびＢ遺
伝子を含み、かつその使用がｅｐｉＡおよびｅｐｉＢ変
異体の両方を相補するｐＴｅｐｉＡＢ（第２６図Ｂ、表
１）で得られた結果と一致する。プラスミドｐＣＵｅｐ
ｉＣＤＱはｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方を相補できる
が、プラスミドｐＣＵｅｐｉＤＱはｅｐｉＤ変異体のみ
を相補しうる（表１）。この相補性は、クローン化した
ＤＮＡフラグメントの方向には依存しない。これらの結
果は、ｅｐｉＣおよびｅｐｉＤの両方が自分のプロモー
ターを有していることを示している。
【００４５】実施例６ ｅｐｉＡ変異ｐＴｕ３２誘導体をＥＭＳ５および６から
単離し、各々のｅｐｉＡのＯＲＦをシーケンシングし
た。両プラスミドは、ｅｐｉＡ内に点突然変異を含んで
いた。すなわち、プラスミドＥＭＳ５では、コドンＡＧ
Ｔ（Ｓｅｒ3 ）がＡＡＴ（Ａｓｎ3 ）に変化しており、
プラスミドＥＭＳ６では、コドンＧＧＡ（Ｇｌｙ10）が
ＧＡＡ（Ｇｌｎ10）に変化していた。これらの変異は、
未修正のエピデルミンにおいて重要な部位に位置してい
た。
単離し、各々のｅｐｉＡのＯＲＦをシーケンシングし
た。両プラスミドは、ｅｐｉＡ内に点突然変異を含んで
いた。すなわち、プラスミドＥＭＳ５では、コドンＡＧ
Ｔ（Ｓｅｒ3 ）がＡＡＴ（Ａｓｎ3 ）に変化しており、
プラスミドＥＭＳ６では、コドンＧＧＡ（Ｇｌｙ10）が
ＧＡＡ（Ｇｌｎ10）に変化していた。これらの変異は、
未修正のエピデルミンにおいて重要な部位に位置してい
た。
【００４６】実施例７ ｅｐｉＢ（ＢｓｔＮ１フラグメント中）をプラスミドｐ
ＰＳ４上のプロモーターのコントロール下に置いた（第
２７図）。生成したプラスミドｐＰＳ４ｅｐｉＢは、ｅ
ｐｉＢ変異体ＥＭＳ１８、３３および４５を相補しえ
た。逆方向にｅｐｉＢを含むプラスミドは、これらの変
異体を相補しえなかった。この事も、ｐＣＵｅｐｉＢが
ｅｐｉＡプロモーターを欠いている為にどのＥＭＳ変異
体も相補しえないことを示している。
ＰＳ４上のプロモーターのコントロール下に置いた（第
２７図）。生成したプラスミドｐＰＳ４ｅｐｉＢは、ｅ
ｐｉＢ変異体ＥＭＳ１８、３３および４５を相補しえ
た。逆方向にｅｐｉＢを含むプラスミドは、これらの変
異体を相補しえなかった。この事も、ｐＣＵｅｐｉＢが
ｅｐｉＡプロモーターを欠いている為にどのＥＭＳ変異
体も相補しえないことを示している。
【００４７】実施例８ 先に示したように、ｐＴｅｐｉ４（第２６図Ａ）の存在
によりＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）中でエピデ
ルミンの生合成が起こる。しかし、ｐＴｅｐｉＡＢＣＤ
Ｑで起こらない。Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）
中での異種エピデルミンの発現を誘導するのに必要な最
小限のＤＮＡサイズが、末端に存在するＤＮＡによる相
補によるＳ．カルノサス（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）の相
補により決定された（第２８図）。プラスミドｐＣＡ４
４−９０、ｐＣＡ４４−９１およびｐＣＡ４４−９２に
よるＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉ
ＡＢＣＤＱ）のトランスホーメーションは、エピデルミ
ンの生産を誘導するが、完全なｅｐｉＱおよびｅｐｉＰ
ＯＲＦを含むｐＣＡ４４−９２は、エピデルミンの生
産を相補しうる最小のＤＮＡフラグメントを含んでい
る。これらの結果は、エピデルミン生合成遺伝子は、６
個のＯＲＦ；ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰを含む
８kbのＤＮＡフラグメント内に集まっており、かつ、そ
の他の遺伝子はエピデルミンの生合成に関与していない
ことを示している。これらの実施例で使用したスタフィ
ロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプラス
ミドＤＮＡは、切断溶解法（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）
等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９
８６））により調製した。細胞をリゾスタフィン（８μ
g/ml）の添加によって溶解し、そのＤＮＡをＣｓＣｌ遠
心により単離した。大腸菌のプラスミドのスーパーコイ
ルＤＮＡは、修正アルカリ溶解法（バーンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄ．Ｒｅｓ．７：
１５１３−１５１８（１９７９））で調製した。ＰＣＲ
増幅したｅｐｉＡ含有フラグメントおよびＳ．エピデル
ミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体ＥＭＳ５および６の
２つの変異したｅｐｉＡ領域のＤＮＡ配列は、ダイデオ
キシ法、ファルマシアの“配列”リストおよびアマーシ
ャムの（α−35Ｓ）−ｄＡＴＰを用いた二本鎖ＤＮＡシ
ーケンシング（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
４：４８３５−４８３９（１９７７））で決定した。Ｄ
ＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅に用いたプライマ
ーは、アプライド・バイオシステムズのＤＮＡ合成機を
用いて合成した。ｅｐｉＡのＰＣＲ増幅に用いた２つの
プライマーの配列を以下に示す：
によりＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）中でエピデ
ルミンの生合成が起こる。しかし、ｐＴｅｐｉＡＢＣＤ
Ｑで起こらない。Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）
中での異種エピデルミンの発現を誘導するのに必要な最
小限のＤＮＡサイズが、末端に存在するＤＮＡによる相
補によるＳ．カルノサス（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤＱ）の相
補により決定された（第２８図）。プラスミドｐＣＡ４
４−９０、ｐＣＡ４４−９１およびｐＣＡ４４−９２に
よるＳ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉ
ＡＢＣＤＱ）のトランスホーメーションは、エピデルミ
ンの生産を誘導するが、完全なｅｐｉＱおよびｅｐｉＰ
ＯＲＦを含むｐＣＡ４４−９２は、エピデルミンの生
産を相補しうる最小のＤＮＡフラグメントを含んでい
る。これらの結果は、エピデルミン生合成遺伝子は、６
個のＯＲＦ；ｅｐｉＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＱおよびＰを含む
８kbのＤＮＡフラグメント内に集まっており、かつ、そ
の他の遺伝子はエピデルミンの生合成に関与していない
ことを示している。これらの実施例で使用したスタフィ
ロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプラス
ミドＤＮＡは、切断溶解法（マキノ（Ｍａｋｉｎｏ）
等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４（１９
８６））により調製した。細胞をリゾスタフィン（８μ
g/ml）の添加によって溶解し、そのＤＮＡをＣｓＣｌ遠
心により単離した。大腸菌のプラスミドのスーパーコイ
ルＤＮＡは、修正アルカリ溶解法（バーンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｅｄ．Ｒｅｓ．７：
１５１３−１５１８（１９７９））で調製した。ＰＣＲ
増幅したｅｐｉＡ含有フラグメントおよびＳ．エピデル
ミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）変異体ＥＭＳ５および６の
２つの変異したｅｐｉＡ領域のＤＮＡ配列は、ダイデオ
キシ法、ファルマシアの“配列”リストおよびアマーシ
ャムの（α−35Ｓ）−ｄＡＴＰを用いた二本鎖ＤＮＡシ
ーケンシング（マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）等、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
４：４８３５−４８３９（１９７７））で決定した。Ｄ
ＮＡシーケンシングおよびＰＣＲ増幅に用いたプライマ
ーは、アプライド・バイオシステムズのＤＮＡ合成機を
用いて合成した。ｅｐｉＡのＰＣＲ増幅に用いた２つの
プライマーの配列を以下に示す：
【表３】 a) 5'-GGGTTTTAGG(TA)ATCCTTTTTAATAAATTTTTAGGAG-3' b) 5'-CCTCAAAATTAAGACG(A)GAT(G)CCTCTATTGAAGCCC-3'
【００４８】プライマーa)は、ｅｐｉＡのＲＢＳの前に
結合し、プライマーb)は、ｅｐｉＡの停止コドンの後に
結合する。太字で示した塩基は（括弧内に示されてい
る）、ｅｐｉＡの前後にＢａｍＨＩ部位を作るのに使用
されることを示している。増幅したＤＮＡフラグメント
内にはｅｐｉＡプロモーターは無い。変異体ＥＭＳ５お
よび６内の変異ｅｐｉＡのＤＮＡ配列を決定するため
に、プラスミドｐＴｕ３２を単離し、そのＤＮＡ領域
を、推定されるｅｐｉＡプロモーター領域の上流（5'-G
GTTTGGTTATTTTCC-3') および停止コドンの下流(5'-CCTC
AAAATTAAGACAGAGCCTC-3') に結合する別のＤＮＡプライ
マー対を使用したＰＣＲで増幅した。ｅｐｉＡのＤＮＡ
配列は、シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）等、Ｎａｔｕｒｅ
（ロンドン）３３３：２７６−２７８（１９８８）にも
示されている。
結合し、プライマーb)は、ｅｐｉＡの停止コドンの後に
結合する。太字で示した塩基は（括弧内に示されてい
る）、ｅｐｉＡの前後にＢａｍＨＩ部位を作るのに使用
されることを示している。増幅したＤＮＡフラグメント
内にはｅｐｉＡプロモーターは無い。変異体ＥＭＳ５お
よび６内の変異ｅｐｉＡのＤＮＡ配列を決定するため
に、プラスミドｐＴｕ３２を単離し、そのＤＮＡ領域
を、推定されるｅｐｉＡプロモーター領域の上流（5'-G
GTTTGGTTATTTTCC-3') および停止コドンの下流(5'-CCTC
AAAATTAAGACAGAGCCTC-3') に結合する別のＤＮＡプライ
マー対を使用したＰＣＲで増幅した。ｅｐｉＡのＤＮＡ
配列は、シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）等、Ｎａｔｕｒｅ
（ロンドン）３３３：２７６−２７８（１９８８）にも
示されている。
【００４９】実施例９ プラスミドｐＴｅｐｉ１４からｅｐｉＤを単離し、これ
をＰＣＲで増幅して、“平滑末端”ライゲーションによ
りベクターｐＩＨ９０２（ニュー・イングランド・バイ
オラブ）のＳｔｕＩ制限部位にクローニングした。その
結果、ｅｐｉＤがベクターｐＩＨ９０２の因子Ｘａ切断
部位の隣に、介在塩基対無しに融合され、これを用いて
大腸菌をトランスホーメーションした。この大腸菌の培
養により、大腸菌のマルトース結合タンパク質に融合し
たｅｐｉＤ酵素が発現された。この融合タンパク質をア
ミロース・カラム充填剤によるアフィニティー・クロマ
トグラフィーで精製した。このｅｐｉＤ酵素は、因子Ｘ
ａにより融合タンパク質から低収率で切断しうることが
分かった。切断領域のアミノ酸配列の修正で切断速度を
向上しうるであろう。この融合タンパク質の融合部位か
らｅｐｉＤの３’末端までをＤＮＡレベルでシーケンシ
ングした。このｅｐｉＤ配列は、Ｓ．エピデルミス（ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｓ）の野生型配列に対応していた。プラ
スミドｐＣＡ４４は、スタフィロコッカス カルノサス
（Staphylococcus carnosus)ＴＭ３００に入れて、the
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell
kulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3000 Braunsch
weig, ドイツに、寄託されている。寄託日は１９９１年
１２月２３日、寄託番号は６８６３である。またプラス
ミドｐＰＳ４もスタフィロコッカス カルノサスＴＭ３
００に入れて同所に寄託されている。寄託日は１９９１
年１２月２３日、寄託番号は６８６４である。
をＰＣＲで増幅して、“平滑末端”ライゲーションによ
りベクターｐＩＨ９０２（ニュー・イングランド・バイ
オラブ）のＳｔｕＩ制限部位にクローニングした。その
結果、ｅｐｉＤがベクターｐＩＨ９０２の因子Ｘａ切断
部位の隣に、介在塩基対無しに融合され、これを用いて
大腸菌をトランスホーメーションした。この大腸菌の培
養により、大腸菌のマルトース結合タンパク質に融合し
たｅｐｉＤ酵素が発現された。この融合タンパク質をア
ミロース・カラム充填剤によるアフィニティー・クロマ
トグラフィーで精製した。このｅｐｉＤ酵素は、因子Ｘ
ａにより融合タンパク質から低収率で切断しうることが
分かった。切断領域のアミノ酸配列の修正で切断速度を
向上しうるであろう。この融合タンパク質の融合部位か
らｅｐｉＤの３’末端までをＤＮＡレベルでシーケンシ
ングした。このｅｐｉＤ配列は、Ｓ．エピデルミス（ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｓ）の野生型配列に対応していた。プラ
スミドｐＣＡ４４は、スタフィロコッカス カルノサス
（Staphylococcus carnosus)ＴＭ３００に入れて、the
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell
kulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-3000 Braunsch
weig, ドイツに、寄託されている。寄託日は１９９１年
１２月２３日、寄託番号は６８６３である。またプラス
ミドｐＰＳ４もスタフィロコッカス カルノサスＴＭ３
００に入れて同所に寄託されている。寄託日は１９９１
年１２月２３日、寄託番号は６８６４である。
【００５０】以上の説明から、当業者は、容易に本発明
の基本的特徴を理解し、かつ、本発明の精神および範囲
を逸脱すること無しに、本発明を種々に変化および修正
して種々の用途および条件に適用しえるであろう。
の基本的特徴を理解し、かつ、本発明の精神および範囲
を逸脱すること無しに、本発明を種々に変化および修正
して種々の用途および条件に適用しえるであろう。
【図１】 エピデルミンの構造遺伝子（ｅｐｉＡ）のヌ
クレオチド配列および誘導されるプレ・エピデルミンの
アミノ酸配列を示している。サャイン・ダルガルノ配列
はボックスで囲み、プロペプチドがプロセシングされる
切断部位は矢印で示してある。インバーティド・リピー
トには下線を付し、潜在的停止コドンにはａｍ（アンバ
ー）およびｏｃ（オーカー）と記した。
クレオチド配列および誘導されるプレ・エピデルミンの
アミノ酸配列を示している。サャイン・ダルガルノ配列
はボックスで囲み、プロペプチドがプロセシングされる
切断部位は矢印で示してある。インバーティド・リピー
トには下線を付し、潜在的停止コドンにはａｍ（アンバ
ー）およびｏｃ（オーカー）と記した。
【図２】 ハイロン・プログラムを用いたプレ・エピデ
ルミンに関する予測プロットを棒グラフで表したもので
ある：(a) フレキシビリティー、(b) ハイドロパシー、
(c) 親水性、(d) ターンの性質、(e) β−シートおよび
(f) α−ヘリックス構造。
ルミンに関する予測プロットを棒グラフで表したもので
ある：(a) フレキシビリティー、(b) ハイドロパシー、
(c) 親水性、(d) ターンの性質、(e) β−シートおよび
(f) α−ヘリックス構造。
【図３】 プレ・エピデルミンのヘリックス・ホィール
・プロットを表しており、そのＮ末端が適当な環境下で
部分的に両親媒性のα−ヘリックス構造をとっているこ
とを示している。
・プロットを表しており、そのＮ末端が適当な環境下で
部分的に両親媒性のα−ヘリックス構造をとっているこ
とを示している。
【図４】 エピデルミンに関して提唱されている成熟過
程を示している。翻訳されたポリペプチド（プレ・エピ
デルミン）は、５２アミノ酸残基からなっている。構造
予測は、Ｎ末端の部分的α−ヘリックスを示しており、
そこから残基−３０乃至−１０が両親媒体性α−ヘリッ
クス構造を形成している。指示されているＳｅｒおよび
Ｔｈｒ残基から水の脱離が起こる(a) 。Ｔｈｒ+14 は例
外として、水脱離に続いてスルフィド環の生成(b) およ
びＣ末端における脱炭酸(c) および二重結合形成(d) が
起こり、プロ・エピデルミンが生産される。その後、こ
のプロ・エピデルミンがタンパク質分解的切断によりプ
ロセシングされ、エピデルミンが生成する。
程を示している。翻訳されたポリペプチド（プレ・エピ
デルミン）は、５２アミノ酸残基からなっている。構造
予測は、Ｎ末端の部分的α−ヘリックスを示しており、
そこから残基−３０乃至−１０が両親媒体性α−ヘリッ
クス構造を形成している。指示されているＳｅｒおよび
Ｔｈｒ残基から水の脱離が起こる(a) 。Ｔｈｒ+14 は例
外として、水脱離に続いてスルフィド環の生成(b) およ
びＣ末端における脱炭酸(c) および二重結合形成(d) が
起こり、プロ・エピデルミンが生産される。その後、こ
のプロ・エピデルミンがタンパク質分解的切断によりプ
ロセシングされ、エピデルミンが生成する。
【図５】 エピデルミンの構造を示している。環構造
は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと命名した。アミノ酸、メ
ソランチオニンおよびトレオ・メチルランチオニンの構
造も示した。
は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと命名した。アミノ酸、メ
ソランチオニンおよびトレオ・メチルランチオニンの構
造も示した。
【図６】 ランチオン抗生物質中に存在し、かつ本発明
の方法を用いたペプチド生産物中に生成しうる異常アミ
ノ酸の例を示している。
の方法を用いたペプチド生産物中に生成しうる異常アミ
ノ酸の例を示している。
【図７】 プラスミドｐＣＬＰ１００およびｐＵＣ１８
からプラスミドｐＣＵＩを調製するための方法を図式で
示したものである。
からプラスミドｐＣＵＩを調製するための方法を図式で
示したものである。
【図８】 実施例２で調製した培養培地単離物の溶出パ
ターンを示している。
ターンを示している。
【図９】 ガリデルミンを含む標準物質の溶出パターン
を示している。ガリデルミンは７．５４分に溶出する。
を示している。ガリデルミンは７．５４分に溶出する。
【図１０】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）
のプラスミドｐＴｕ３２のエピソームｐＴｕ３２の遺伝
子解析を示しており、以下のものが含まれる： Ａ：エピソームｐＴｕ３２の制限地図。 Ｂ：ｐＴｕ３２の１３．５kbのＢｇｌIIフラグメントの
制限地図。黒矢印はｅｐｉＡの構造遺伝子に対応してい
る。白矢印はシーディング・フレームｅｐｉＢ、Ｃ、
Ｄ、ＰおよびＱを示している。 Ｃ：ｅｐｉＡに特異的な１５マー・オリゴヌクレオチド
(5'cacatccaggagtac3') を用いた、種々の制限酵素（Ｅ
ｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌII、ＳｐｈＩ）で消化し
たｐＴｕ３２のサザン・ハイブダイゼーション。
のプラスミドｐＴｕ３２のエピソームｐＴｕ３２の遺伝
子解析を示しており、以下のものが含まれる： Ａ：エピソームｐＴｕ３２の制限地図。 Ｂ：ｐＴｕ３２の１３．５kbのＢｇｌIIフラグメントの
制限地図。黒矢印はｅｐｉＡの構造遺伝子に対応してい
る。白矢印はシーディング・フレームｅｐｉＢ、Ｃ、
Ｄ、ＰおよびＱを示している。 Ｃ：ｅｐｉＡに特異的な１５マー・オリゴヌクレオチド
(5'cacatccaggagtac3') を用いた、種々の制限酵素（Ｅ
ｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｇｌII、ＳｐｈＩ）で消化し
たｐＴｕ３２のサザン・ハイブダイゼーション。
【図１１】 リーディング・フレーム、ｅｐｉＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄ、Ｐ、Ｑ、Ｙ’およびＹ”を含むｐＴｕ３２のＢ
ｇｌII／ＨｐａIIフラグメントのヌクレオチド配列およ
び誘導される各タンパク質のアミノ酸配列である。Ｓ／
Ｄ配列およびターミネーション構造には上線を付した。
ＩＲは、インバーティド・リピートを示している。ｅｐ
ｉＹ、ｅｐｉＡ、ｅｐｉＢ、ｅｐｉＣ、ｅｐｉＤ、ｅｐ
ｉＱ、およびｅｐｉＰのオープン・リーディング・フレ
ームの開始は、太字で示してある。Ｎ末端アミノ酸残基
（翻訳開始部位）は、ボックスで囲んである。図１１
は、１〜８７００のヌクレオチド配列の１〜９００まで
を示す。
Ｃ、Ｄ、Ｐ、Ｑ、Ｙ’およびＹ”を含むｐＴｕ３２のＢ
ｇｌII／ＨｐａIIフラグメントのヌクレオチド配列およ
び誘導される各タンパク質のアミノ酸配列である。Ｓ／
Ｄ配列およびターミネーション構造には上線を付した。
ＩＲは、インバーティド・リピートを示している。ｅｐ
ｉＹ、ｅｐｉＡ、ｅｐｉＢ、ｅｐｉＣ、ｅｐｉＤ、ｅｐ
ｉＱ、およびｅｐｉＰのオープン・リーディング・フレ
ームの開始は、太字で示してある。Ｎ末端アミノ酸残基
（翻訳開始部位）は、ボックスで囲んである。図１１
は、１〜８７００のヌクレオチド配列の１〜９００まで
を示す。
【図１２】 図１１に続くヌクレオチド配列９０１〜１
９００を示す。
９００を示す。
【図１３】 図１２に続くヌクレオチド配列１９０１〜
２８００を示す。
２８００を示す。
【図１４】 図１３に続くヌクレオチド配列２８０１〜
３８００を示す。
３８００を示す。
【図１５】 図１４に続くヌクレオチド配列３８０１〜
４７００を示す。
４７００を示す。
【図１６】 図１５に続くヌクレオチド配列４７０１〜
５７００を示す。
５７００を示す。
【図１７】 図１６に続くヌクレオチド配列５７０１〜
６６００を示す。
６６００を示す。
【図１８】 図１７に続くヌクレオチド配列６６０１〜
７６００を示す。
７６００を示す。
【図１９】 図１８に続くヌクレオチド配列７６０１〜
８７００を示す。
８７００を示す。
【図２０】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）
におけるｅｐｉＡ（１０Ａ）およびｅｐｉＢ（１０Ｂ）
の発現のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
の結果を示しており、これは、１．２％アガロースゲル
による全ＲＮＡ（４０μg、レーン１、３および５、ま
たは２０μg、２、４および６）の分離およびアンチセ
ンスＲＮＡプローブによるハイブリダゼーション（ＳＰ
６転写物、ストリンジェンシーを上げながらフィルター
を洗浄した。レーン１、２：１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ、露光時間４時間；レーン３、４：０．５×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ、露光時間１６時間；レーン５、６：
０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間３日）を行
ったものである。サイズ標準物質として２３Ｓおよび１
６Ｓ ＲＮＡを使用している。
におけるｅｐｉＡ（１０Ａ）およびｅｐｉＢ（１０Ｂ）
の発現のノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーション
の結果を示しており、これは、１．２％アガロースゲル
による全ＲＮＡ（４０μg、レーン１、３および５、ま
たは２０μg、２、４および６）の分離およびアンチセ
ンスＲＮＡプローブによるハイブリダゼーション（ＳＰ
６転写物、ストリンジェンシーを上げながらフィルター
を洗浄した。レーン１、２：１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ、露光時間４時間；レーン３、４：０．５×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳ、露光時間１６時間；レーン５、６：
０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、露光時間３日）を行
ったものである。サイズ標準物質として２３Ｓおよび１
６Ｓ ＲＮＡを使用している。
【図２１】 ＥｐｉＰと種々のセリンプロテアーゼ（Ｓ
ＵＢＳＩ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）のズブチリシンＩ１６８前駆体（テルザジ（Ｔｅｒ
ｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
９：８０７−８１３（１９７５）；枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の主要細胞内セリンプロテ
アーゼ（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｎｕａｌ，第２編、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリーズ（１９８０）；ＳＵＭＹＴＶ、サーモ
アクチモミセス バルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のサーミテース（ス
トール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
５８：４１１−４１８（１９８４））の活性部位に関す
る配列のホモロジーを示している。保存性の高いスパラ
ギン（ａｓｐ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）およびセリン
（ｓｅｒ）残基にはアステリスクを付した。同様のアミ
ノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロン
で示した。
ＵＢＳＩ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）のズブチリシンＩ１６８前駆体（テルザジ（Ｔｅｒ
ｚａｇｈｉ）等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
９：８０７−８１３（１９７５）；枯草菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の主要細胞内セリンプロテ
アーゼ（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｎｕａｌ，第２編、コールドスプリングハーバ
ーラボラトリーズ（１９８０）；ＳＵＭＹＴＶ、サーモ
アクチモミセス バルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のサーミテース（ス
トール（Ｓｔａｈｌ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
５８：４１１−４１８（１９８４））の活性部位に関す
る配列のホモロジーを示している。保存性の高いスパラ
ギン（ａｓｐ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）およびセリン
（ｓｅｒ）残基にはアステリスクを付した。同様のアミ
ノ酸残基は点で示し、また同一のアミノ酸残基はコロン
で示した。
【図２２】 ＥｐｉＱとＰｈｏＢ（マキノ（Ｍａｋｉｎ
ｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４
（１９８６））。同様のアミノ酸残基は点で示し、また
同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
ｏ）等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：３７−４４
（１９８６））。同様のアミノ酸残基は点で示し、また
同一のアミノ酸残基はコロンで示した。
【図２３】 Ｓ．カルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）で生
産されたエピデルミンのＨＰＬＣの溶出プロフィールを
示している。 Ａ：エピデルミン標準物質の溶出プロフィール（６．７
５分、矢印で示した）。 Ｂ：Ｓ．エルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００
ｐＴｅｐｉ１４の培養濾液から単離したエピデルミン標
準物質の溶出プロフィール（６．７５分、矢印で示し
た）。培養液をＸＡＤ１１８０に吸着し、メタノールで
溶出後、最後にエバポレーションで濃縮した。 Ｃ：１９Ｂと同様に処理した非トランスホームＳ．エル
ノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００の培養濾液溶出
プロフィール。太線は、エピデルミンの溶出領域を示し
ている。
産されたエピデルミンのＨＰＬＣの溶出プロフィールを
示している。 Ａ：エピデルミン標準物質の溶出プロフィール（６．７
５分、矢印で示した）。 Ｂ：Ｓ．エルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００
ｐＴｅｐｉ１４の培養濾液から単離したエピデルミン標
準物質の溶出プロフィール（６．７５分、矢印で示し
た）。培養液をＸＡＤ１１８０に吸着し、メタノールで
溶出後、最後にエバポレーションで濃縮した。 Ｃ：１９Ｂと同様に処理した非トランスホームＳ．エル
ノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＴＭ３００の培養濾液溶出
プロフィール。太線は、エピデルミンの溶出領域を示し
ている。
【図２４】 ｐＴ１８１ｍｃｓの構築を示している。ｐ
Ｔ１８１のプレ内にある単一のＮｄｅＩ部位に、平滑末
端ライゲーションによりｐＵＣ１９のＰｖｕII309 −Ｐ
ｖｕII631 フラグメント、ｌａｃＺの一部およびマルチ
クローニング部位（ｍｃｓ）を挿入した（ゲナロ（Ｇｅ
ｎｎａｒｏ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２
６０１−２６１０（１９８７）；カーン（Ｋａｈｎ）
等、Ｐａｓｍｉｄ １０：２５１−２５９（１９８
３））。ｌａｃＺは、プレに対して逆を向いている。黒
棒はプレの切断を示しており、白棒はｐＵＣ１９フラグ
メントの挿入を示している。
Ｔ１８１のプレ内にある単一のＮｄｅＩ部位に、平滑末
端ライゲーションによりｐＵＣ１９のＰｖｕII309 −Ｐ
ｖｕII631 フラグメント、ｌａｃＺの一部およびマルチ
クローニング部位（ｍｃｓ）を挿入した（ゲナロ（Ｇｅ
ｎｎａｒｏ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２
６０１−２６１０（１９８７）；カーン（Ｋａｈｎ）
等、Ｐａｓｍｉｄ １０：２５１−２５９（１９８
３））。ｌａｃＺは、プレに対して逆を向いている。黒
棒はプレの切断を示しており、白棒はｐＵＣ１９フラグ
メントの挿入を示している。
【図２５】 ｐＣＵ１の構築を示している。ＰＣＬＰ１
００は、単一のＰｓｔＩ部位を含むｐＣ１９４（ホリノ
ウチ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１５０：８１５−８２５（１９８２））の誘導体
であって、ＨｉｎｄIII 部位におけるｐＣ１９４の開
環、Ｂａｌ３１による末端の削除（約９５０bp）および
平滑末端ライゲーションによるＰｓｔＩリンカーの挿入
により生成する。ｐＵＣ１は、各々単一のＰｓｔＩとＮ
ｄｅＩ部位によるｐＣＰＬ１００とｐＵＣ１９との平滑
末端ライゲーションで生成する（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒ
ａ）等、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８
２））。ｌａｃＺの前にあるマルチクローニング部位
（ｍｃｓ）は、種々のｅｐｉ遺伝子含有フラグメントの
クローニングに使用した。このシャトルベクターは、ス
タフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）お
よび大腸菌の両方で複製する。
００は、単一のＰｓｔＩ部位を含むｐＣ１９４（ホリノ
ウチ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１５０：８１５−８２５（１９８２））の誘導体
であって、ＨｉｎｄIII 部位におけるｐＣ１９４の開
環、Ｂａｌ３１による末端の削除（約９５０bp）および
平滑末端ライゲーションによるＰｓｔＩリンカーの挿入
により生成する。ｐＵＣ１は、各々単一のＰｓｔＩとＮ
ｄｅＩ部位によるｐＣＰＬ１００とｐＵＣ１９との平滑
末端ライゲーションで生成する（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒ
ａ）等、Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８（１９８
２））。ｌａｃＺの前にあるマルチクローニング部位
（ｍｃｓ）は、種々のｅｐｉ遺伝子含有フラグメントの
クローニングに使用した。このシャトルベクターは、ス
タフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）お
よび大腸菌の両方で複製する。
【図２６】 下記の事項を示している。 A)ｐＴ１８１ｍｃｓにおけるｐＴｕ３２の１４kbのＢｇ
ｌIIフラグメントのクローニングによるｐＴｅｐｉ１４
の生成。このフラグメントには、Ｓ．カルノサス（ｃａ
ｒｎｏｓｕｓ）におけるエピデルミンの生産に必要な全
遺伝子情報を含まれている。指示されているＯＲＦおよ
びその転写方向（矢印で示されている）は、このＤＮＡ
配列に基づくものである。構造遺伝子ｅｐｉＡは、黒矢
印で表されている。 B)ｐＴ１８１ｍｃｓ（ｐＴ．．．）またはｐＣＵ１（ｐ
ＣＵ．．．）にサブクローニングされた種々のｐＴｅｐ
ｉ１４フラグメント。各プラスミドは、Ｓ．エピデルミ
ス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｅｐｉ変異体の相補に使用し
た。プラスミド中に存在する完全なＯＲＦが示されてい
る。
ｌIIフラグメントのクローニングによるｐＴｅｐｉ１４
の生成。このフラグメントには、Ｓ．カルノサス（ｃａ
ｒｎｏｓｕｓ）におけるエピデルミンの生産に必要な全
遺伝子情報を含まれている。指示されているＯＲＦおよ
びその転写方向（矢印で示されている）は、このＤＮＡ
配列に基づくものである。構造遺伝子ｅｐｉＡは、黒矢
印で表されている。 B)ｐＴ１８１ｍｃｓ（ｐＴ．．．）またはｐＣＵ１（ｐ
ＣＵ．．．）にサブクローニングされた種々のｐＴｅｐ
ｉ１４フラグメント。各プラスミドは、Ｓ．エピデルミ
ス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）Ｅｐｉ変異体の相補に使用し
た。プラスミド中に存在する完全なＯＲＦが示されてい
る。
【図２７】 ｐＰＳｅｐｉＡおｐＰＳ４ｅｐｉＢの構築
を示している。ｐＰＳ４は、ｐＬｉｐＰＳ１の誘導体で
ある（リーブル（Ｌｉｅｂｌ）等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．２０４：１６６−１７３（１９８６））。強
力なスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）プロモーターの後ろに単一のＢａｍＨＩ部位が挿入
された。通常、ＯＲＦ２プロモーターのコントロール下
のＢａｍＨＩ部位に遺伝子をクローニングすると、スタ
フィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）での
発現が高くなる。ｅｐｉＡをＰＣＲ増幅してみると、Ｂ
ａｍＨＩ部位に隣接して含まれていた。ｅｐｉＢを含む
３．２kbのＢｓｔＮＩフラグメントを平滑末端ライゲー
ションによりＢａｍＨＩ部位に挿入した。各ＥＭＳ変異
体は、ｅｐｉＡおよびｅｐｉＢがＯＲＦ２プロモーター
のコントロール下にあるときのみ相補された。ｌｉｐ，
リパーゼ遺伝子；ｃａｔ、クロラムフェニコール・アセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子；ＯＲＦ２、Ｓ．カルノ
サス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）特異的短縮型ＯＲＦ。
を示している。ｐＰＳ４は、ｐＬｉｐＰＳ１の誘導体で
ある（リーブル（Ｌｉｅｂｌ）等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．２０４：１６６−１７３（１９８６））。強
力なスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）プロモーターの後ろに単一のＢａｍＨＩ部位が挿入
された。通常、ＯＲＦ２プロモーターのコントロール下
のＢａｍＨＩ部位に遺伝子をクローニングすると、スタ
フィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）での
発現が高くなる。ｅｐｉＡをＰＣＲ増幅してみると、Ｂ
ａｍＨＩ部位に隣接して含まれていた。ｅｐｉＢを含む
３．２kbのＢｓｔＮＩフラグメントを平滑末端ライゲー
ションによりＢａｍＨＩ部位に挿入した。各ＥＭＳ変異
体は、ｅｐｉＡおよびｅｐｉＢがＯＲＦ２プロモーター
のコントロール下にあるときのみ相補された。ｌｉｐ，
リパーゼ遺伝子；ｃａｔ、クロラムフェニコール・アセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子；ＯＲＦ２、Ｓ．カルノ
サス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）特異的短縮型ＯＲＦ。
【図２８】 隣接するＤＮＡフラグメントによるＳ．カ
ルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤ
Ｑ）におけるエピデルミン生産の相補性を示している。
フラグメントは、適合するプラスミドｐＣＡ４４にサブ
クローニングした。
ルノサス（ｃａｒｎｏｓｕｓ）（ｐＴｅｐｉＡＢＣＤ
Ｑ）におけるエピデルミン生産の相補性を示している。
フラグメントは、適合するプラスミドｐＣＡ４４にサブ
クローニングした。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:625） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:625） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:44） (72)発明者 フリードリッヒ ゲーツ ドイツ連邦共和国 デー7400 テュービン ゲンバイム ヘルプシュテンホフ 31 (72)発明者 ノルベルト シュネル ドイツ連邦共和国 デー8630 コーブルク ザイトマンスドルフェル シュトラーセ 148 (72)発明者 ヨハネス アウグスティン ドイツ連邦共和国 デー7400 テュービン ゲンヴィクトル レンネル シュトラーセ 59 (72)発明者 ゲルマー エンゲルケ ドイツ連邦共和国 デー6000 フランクフ ルトアム マイン グリューネブルクヴェ ーク 82 (72)発明者 ラルフ ローゼンシュイタイン ドイツ連邦共和国 デー7410 ロイトリン ゲン22 コリントシュトラーセ ６ (72)発明者 コルティナ カレッタ ドイツ連邦共和国 デー8000 ミュンヘン 70 ゼーハウゼル シュトラーセ 14 (72)発明者 コーラ クライン ドイツ連邦共和国 デー6050 オッフェン バッハ ベルナルトシュトラーセ 26 (72)発明者 ベルント ヴィーラント ドイツ連邦共和国 デー7407 ロッテンブ ルクブルクハルトシュトラーセ 34 (72)発明者 トーマス クプケ ドイツ連邦共和国 デー7400 テュービン ゲンルートヴィッヒシュトラーセ 12 (72)発明者 ギュンター ユンク ドイツ連邦共和国 デー7400 テュービン ゲンオーベー デル グラッフェンハルデ ５ (72)発明者 ローラント ケルナー ドイツ連邦共和国 デー6148 ヘッペンハ イムトゥーフブライヒ シュトラーセ 12
Claims (62)
- 【請求項１】 外来のポリペプチド前駆体をコードする
ヌクレオチド配列を含むプラスミドでトランスホームし
た細菌宿主細胞であって、該宿主が該ポリペプチド前駆
体を発現し得、かつ、該ポリペプチド前駆体と反応して
該宿主にとって外来のポリペプチドであって、少なくと
も１つのデヒドロアミノ酸、少なくとも１つのランチオ
ン結合、または少なくとも１つのデヒドロアミノ酸およ
び少なくとも１つのランチオン結合を含むポリペプチド
を生産しうる多酵素複合体を含む宿主。 - 【請求項２】 前記多酵素複合体が水脱離をすることに
より、該ポリペプチド前駆体にエーテル含有環およびス
ルフィド結合を形成しうる請求項１記載の細菌宿主細
胞。 - 【請求項３】 前記多酵素複合体が、さらに脱炭酸およ
び二重結合形成により該ポリペプチド前駆体から二酸化
炭素を除去しうる請求項２記載の細菌宿主細胞。 - 【請求項４】 前記細菌宿主が、ストレプトコッカス
ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉ
ｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトミセス シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｒ）、ストレプ
トミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） ｓｐ．、スト
レプトベルチカラム グリセオベルチシラム（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒｉｓｅｏｖｅｒｔ
ｉｃｉｌｕｍ）、スタフィロコッカスエピデルミス（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、
スタフィロコッカス エピデルミン（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）５株またはスタフ
ィロコッカス ガリナリウム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）である請求項１記載
の細菌宿主細胞。 - 【請求項５】 前記ポリペプチドが抗生物質、ホルモン
または繊維素溶解剤である請求項１記載の細菌宿主細
胞。 - 【請求項６】 前記ポリペプチドが抗生物質、ホルモン
または繊維素溶解剤である請求項４記載の細菌宿主細
胞。 - 【請求項７】 前記細菌宿主が、スタフィロコッカス
エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９５であり、かつ、前記ポリ
ペプチドがガリデルミンである請求項５記載の細菌宿主
細胞。 - 【請求項８】 前記細菌宿主がエピデルミンを生産しえ
ないスタフィロコッカス エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）ＤＳＭ３０９
５の変異株である請求項７記載の細菌宿主細胞。 - 【請求項９】 下記のステップを含むポリペプチドの生
産方法。 (a) 請求項１記載の細菌宿主細胞の培養、および(b) 該
ポリペプチドの精製。 - 【請求項１０】 下記のステップを含むポリペプチドの
生産方法。 (a) 請求項４記載の細菌宿主細胞の培養、および(b) 該
ポリペプチドの単離。 - 【請求項１１】 下記のステップを含むガリデルミンの
生産方法。 (a) 請求項７記載の細菌宿主細胞の培養、および(b) 該
ガリデルミンの単離。 - 【請求項１２】 下記のステップを含むガリデルミンの
生産方法。 (a) 請求項８記載の細菌宿主細胞の培養、および(b) 該
ガリデルミンの単離。 - 【請求項１３】 請求項１１記載の方法に従って生産し
たガリデルミン。 - 【請求項１４】 請求項１２記載の方法に従って生産し
たガリデルミン。 - 【請求項１５】 細菌宿主をトランスホームしうるプラ
スミドであって、プレ・エピデルミンのプレペプチド配
列−３０乃至−１およびエピデルミンとは異なるポリペ
プチドのプロペプチド配列をコードするヌクレオチド配
列を含むプラスミド。 - 【請求項１６】 前記ポリペプチドがガリデルミンであ
る請求項１５記載のプラスミド。 - 【請求項１７】 エピデルミンをコードするヌクレオチ
ド配列を欠き、かつ、その代わりにホルモン、繊維素溶
解剤、またはエピデルミン以外の抗生物質をコードする
ヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＥｐｉ３２修正
物。 - 【請求項１８】 前記ヌクレオチド配列がガリデルミン
をコードする請求項１７記載のプラスミド。 - 【請求項１９】 第１１図乃至第１９図に示したアミノ
酸配列を有するタンパク質ＥｐｉＢをコードする組み換
えＤＮＡ分子。 - 【請求項２０】 第１１図乃至第１９図に示したアミノ
酸配列を有するタンパク質ＥｐｉＣをコードする組み換
えＤＮＡ分子。 - 【請求項２１】 第１１図乃至第１９図に示したアミノ
酸配列を有するタンパク質ＥｐｉＤをコードする組み換
えＤＮＡ分子。 - 【請求項２２】 第１１図乃至第１９図に示したアミノ
酸配列を有するタンパク質ＥｐｉＰをコードする組み換
えＤＮＡ分子。 - 【請求項２３】 第１１図乃至第１９図に示したアミノ
酸配列を有するタンパク質ＥｐｉＱをコードする組み換
えＤＮＡ分子。 - 【請求項２４】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエレメン
トのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズしうるＤＮ
Ａ分子であって、エピデルミンの合成においてＥｐｉＢ
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２５】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエレメン
トのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズしうるＤＮ
Ａ分子であって、エピデルミンの合成においてＥｐｉＣ
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２６】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエレメン
トのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズしうるＤＮ
Ａ分子であって、エピデルミンの合成においてＥｐｉＤ
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２７】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエレメン
トのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズしうるＤＮ
Ａ分子であって、エピデルミンの合成においてＥｐｉＰ
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２８】 Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエレメン
トのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズしうるＤＮ
Ａ分子であってエピデルミンの合成においてＥｐｉＱ酵
素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２９】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項１９または請求項２４記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、Ｅｐｉ
Ｐ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列を
１つ以上含まないプラスミド。 - 【請求項３０】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項１９または請求項２４記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、Ｅｐｉ
Ｐ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列全
てを含まないプラスミド。 - 【請求項３１】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項１９または請求項２４記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、
ＥｐｉＰ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を１つ以上含まないプ
ラスミド。 - 【請求項３２】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項１９または請求項２４記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、
ＥｐｉＰ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列全てを含まないプラス
ミド。 - 【請求項３３】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２０または請求項２５記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＤ、Ｅｐｉ
Ｐ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列を
１つ以上含まないプラスミド。 - 【請求項３４】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２０または請求項２５記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＤ、Ｅｐｉ
Ｐ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列全
てを含まないプラスミド。 - 【請求項３５】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２０または請求項２５記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＤ、
ＥｐｉＰ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を１つ以上含まないプ
ラスミド。 - 【請求項３６】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２０または請求項２５記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＤ、
ＥｐｉＰ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列全てを含まないプラス
ミド。 - 【請求項３７】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２１または請求項２６記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、Ｅｐｉ
Ｐ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列を
１つ以上含まないプラスミド。 - 【請求項３８】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２１または請求項２６記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、Ｅｐｉ
Ｐ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列全
てを含まないプラスミド。 - 【請求項３９】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２１または請求項２６記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、
ＥｐｉＰ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を１つ以上含まないプ
ラスミド。 - 【請求項４０】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２１または請求項２６記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、
ＥｐｉＰ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列全てを含まないプラス
ミド。 - 【請求項４１】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２２または請求項２７記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、Ｅｐｉ
Ｄ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列を
１つ以上含まないプラスミド。 - 【請求項４２】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２２または請求項２７記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、Ｅｐｉ
Ｄ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列全
てを含まないプラスミド。 - 【請求項４３】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２２または請求項２７記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、
ＥｐｉＤ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を１つ以上含まないプ
ラスミド。 - 【請求項４４】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２２または請求項２７記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、
ＥｐｉＤ、ＥｐｉＱまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列全てを含まないプラス
ミド。 - 【請求項４５】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２３または請求項２８記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、Ｅｐｉ
Ｄ、ＥｐｉＰまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列を
１つ以上含まないプラスミド。 - 【請求項４６】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２３または請求項２８記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、Ｅｐｉ
Ｄ、ＥｐｉＰまたはＥｐｉＡをコードするＤＮＡ配列全
てを含まないプラスミド。 - 【請求項４７】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２３または請求項２８記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、
ＥｐｉＤ、ＥｐｉＰまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を１つ以上含まないプ
ラスミド。 - 【請求項４８】 プロモーター調節配列のコントロール
下の請求項２３または請求項２８記載のＤＮＡ分子を含
むプラスミドであって、Ｓ．エピデルミス（ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｓ）由来のｐＴｕ３２の５４ kbpエピソーマルエ
レメントのＢｇｌIIフラグメントにハイブリダイズし、
かつエピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、
ＥｐｉＤ、ＥｐｉＰまたはＥｐｉＡ酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列全てを含まないプラス
ミド。 - 【請求項４９】 請求項２４記載のタンパク質、または
通常、会合している不純物を含まないＥｐｉＢ。 - 【請求項５０】 請求項２５記載のタンパク質、または
通常、会合している不純物を含まないＥｐｉＣ。 - 【請求項５１】 請求項２６記載のタンパク質、または
通常、会合している不純物を含まないＥｐｉＤ。 - 【請求項５２】 請求項２７記載のタンパク質、または
通常、会合している不純物を含まないＥｐｉＰ。 - 【請求項５３】 請求項２８記載のタンパク質、または
通常、会合している不純物を含まないＥｐｉＱ。 - 【請求項５４】 ＥｐｉＢ、ＥｐｉＣ、ＥｐｉＤ、Ｅｐ
ｉＰまたはＥｐｉＱの製造方法であって、プロモーター
調節配列のコントロール下となるような請求項１９乃至
２８記載のＤＮＡ配列のプラスミドベクターへの挿入、
該プラスミドベクターの適当な宿主への挿入、該タンパ
ク質を発現させる該宿主の培養、および該タンパク質の
単離を含む方法。 - 【請求項５５】 ランチビオチックの構造的特徴の少な
くとも１つを有するタンパク質の生産方法であって、プ
ロモーター調節配列のコントロール下となるように所定
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をベクタープラ
スミドであって、ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰおよびＱ、また
は、エピデルミンの合成においてＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、Ｐ
およびＱ酵素活性を有するこれらの変異体をコードする
機能性遺伝子を含むベクタープラスミドに挿入するこ
と、該ベクタープラスミドを適当な宿主にトランスホー
ムすること、該宿主を培養して該ＤＮＡ配列および遺伝
子を発現させること、およびランチビオチックの構造的
特徴の少なくとも１つを有するタンパク質を単離するこ
とを含む方法。 - 【請求項５６】 前記ＤＮＡ配列がプレ・エビデルミン
のプレ・ペプチド配列−３０乃至−１をコードするＤＮ
Ａ配列を含むか、または該配列の直ぐ下流に挿入されて
いる請求項５５記載の方法。 - 【請求項５７】 ＥｐｉＢ、Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱの内の
１つ、および補助タンパク質を含む融合タンパク質。 - 【請求項５８】 Ｅｐｉタンパク質と補助タンパク質の
間の結合を１つの酵素で切断しうるように、ＥｐｉＢ、
Ｃ、Ｄ、ＰまたはＱの内の１つを補助タンパク質と融合
した融合タンパク質。 - 【請求項５９】 前記補助タンパク質が選択した宿主か
ら融合タンパク質を分泌しうる請求項５７記載の融合タ
ンパク質。 - 【請求項６０】 前記補助タンパク質がアフィニティー
クロマトグラフィーで精製可能な請求項５７記載の融合
タンパク質。 - 【請求項６１】 前記補助タンパク質が大腸菌由来のマ
ルトース結合タンパク質である請求項５７記載の融合タ
ンパク質。 - 【請求項６２】 請求項５７記載の融合タンパク質をコ
ードするＤＮＡ配列。
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