JPS60188073A - バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド - Google Patents
バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミドInfo
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- JPS60188073A JPS60188073A JP59044072A JP4407284A JPS60188073A JP S60188073 A JPS60188073 A JP S60188073A JP 59044072 A JP59044072 A JP 59044072A JP 4407284 A JP4407284 A JP 4407284A JP S60188073 A JPS60188073 A JP S60188073A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、バチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ欺
■旦）を宿主とするプラスミドに関する。
■旦）を宿主とするプラスミドに関する。
鵜高によって土壌中から分離されたバチルス・プレビス
４７は最適培養条件下で１２ｇ／ｊＩもの蛋白質を培地
中へ分泌する（ Ｓ、Ｕｄａｋａ、 Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ
。
４７は最適培養条件下で１２ｇ／ｊＩもの蛋白質を培地
中へ分泌する（ Ｓ、Ｕｄａｋａ、 Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ
。
Ｃｈｅｍ、 ４０ ； ５２３ ５２８ （１９７６）
、 Ｓ、Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ。
、 Ｓ、Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ。
１１、Ｅｎｅｉ、 Ｋ、Ｔａｋａｎａｍｉ＋ Ｙ、Ｈｉ
ｒｏｓｅ、 Ｔ、Ｔｓｕｃｈｉｄａ ａｎｄＳ、Ｕｄａ
ｋａ、八ｇｒ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、４４ ；２２９７
−２３０３ （１９８０））。
ｒｏｓｅ、 Ｔ、Ｔｓｕｃｈｉｄａ ａｎｄＳ、Ｕｄａ
ｋａ、八ｇｒ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、４４ ；２２９７
−２３０３ （１９８０））。
バチルス・プレビス４７のこのような蛋白質分泌能力を
利用して、組み換えＤＮＡ技法によりバチルス・プレビ
ス４７に導入した異種有用遺伝子の生産物を大量に培地
中に蓄積することができれば、その応用的価値は大きい
。
利用して、組み換えＤＮＡ技法によりバチルス・プレビ
ス４７に導入した異種有用遺伝子の生産物を大量に培地
中に蓄積することができれば、その応用的価値は大きい
。
本発明は、バチルス・プレビス４７において安定に保持
されるコピー数の少ないプラスミドに関するものである
。一般にコピー数の少ないプラスミドはコピー数の大幅
な増加が宿主にとって致死的となるような遺伝子のクロ
ーニングを行う場合に有利であるが、その保持のために
は選択的薬剤の培地への添加が必要であることが多い。
されるコピー数の少ないプラスミドに関するものである
。一般にコピー数の少ないプラスミドはコピー数の大幅
な増加が宿主にとって致死的となるような遺伝子のクロ
ーニングを行う場合に有利であるが、その保持のために
は選択的薬剤の培地への添加が必要であることが多い。
本発明のプラスミドはコピー数が少ないにも関わらすバ
チルス・プレビス４７において非常に安定に保持される
という点が特徴である。
チルス・プレビス４７において非常に安定に保持される
という点が特徴である。
このプラスミドの発見、精製およびその性質の解明は以
下のようにして行われた。
下のようにして行われた。
１）プラスミドｐＷＴ ４８１の分離
バチルス・プレビス４７（ＰＩ！ＲＭ Ｐ−７２２４）
の類縁菌１２株をＴ２培地（１％ペプトン、０．５％肉
エキス、０．２％酵母エキス、１％グルコース、ｐＨ７
）を用いて３７℃で振盪し停止期まで生育させた後、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍと Ｄｏｌｙの急速アルカリ変性抽出法
（１１゜Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｊ、Ｄｏｌｙ
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋７ ；
１５１３− １５２３ （１９７９））によってプラス
ミドの有無を試験した。その結果、バチルス・プレビス
４８１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５３１） （Ｓ、 １ｌｄａ
ｋａ、 Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
の類縁菌１２株をＴ２培地（１％ペプトン、０．５％肉
エキス、０．２％酵母エキス、１％グルコース、ｐＨ７
）を用いて３７℃で振盪し停止期まで生育させた後、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍと Ｄｏｌｙの急速アルカリ変性抽出法
（１１゜Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｊ、Ｄｏｌｙ
、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋７ ；
１５１３− １５２３ （１９７９））によってプラス
ミドの有無を試験した。その結果、バチルス・プレビス
４８１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５３１） （Ｓ、 １ｌｄａ
ｋａ、 Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
４０ ； ５２１５２８ （１９７６））においてプラ
スミドを発見し、これをｐｗｒ ４８１と命名した。
スミドを発見し、これをｐｗｒ ４８１と命名した。
２）プラスミドｐＷＴ４８１ ＤＮＡの精製Ｔ２培地２
ｐを用いて３７℃で振盪し、静止期末−で生育させたバ
チルス・プレビス４８１から国中らの方法（Ｔ、Ｔａｎ
ａｋａ、 Ｎ、Ｋｕｒｏｄａ ａｎｄ Ｋ、Ｓａｋａｇ
ｕｃｈｉ＋Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １２９ ； １
４８７−１４９４ （１９７７））によって純粋なｐＷ
Ｔ４８１ ＤＮＡ 約１００ ｐｇを得た。
ｐを用いて３７℃で振盪し、静止期末−で生育させたバ
チルス・プレビス４８１から国中らの方法（Ｔ、Ｔａｎ
ａｋａ、 Ｎ、Ｋｕｒｏｄａ ａｎｄ Ｋ、Ｓａｋａｇ
ｕｃｈｉ＋Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １２９ ； １
４８７−１４９４ （１９７７））によって純粋なｐＷ
Ｔ４８１ ＤＮＡ 約１００ ｐｇを得た。
制限酵素を用いた解析の結果、第１図に示すとおり、ｐ
Ｈ７４８１は分子量１．６ Ｘ １０’ダルトンの比較
的小さなプラスミドであり、３個所の旧ｎｄ ｍ。
Ｈ７４８１は分子量１．６ Ｘ １０’ダルトンの比較
的小さなプラスミドであり、３個所の旧ｎｄ ｍ。
２個所のＥＣ９ＲＩおよび１個所のＢｇｌ ＩＩ制限部
位を持っていることが判明した。
位を持っていることが判明した。
３ ） ｐｗｒ ４８１のバチルス・プレビス４７への
導入と安定性試験 ｐＨ７４８１には選択マーカーがないため、以下のよう
な間接的な方法でｐＨ７４８１をバチルス・プレビス４
７に導入した。ｐ葬Ｔ ４８１ ＤＮＡ （ｌμｇ）と
エリスロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨＷ
１ （Ｓ、ｔｌｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ＆ Ｂ、Ｗｅｉｓ
ｂｌｕｍ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
導入と安定性試験 ｐＨ７４８１には選択マーカーがないため、以下のよう
な間接的な方法でｐＨ７４８１をバチルス・プレビス４
７に導入した。ｐ葬Ｔ ４８１ ＤＮＡ （ｌμｇ）と
エリスロマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨＷ
１ （Ｓ、ｔｌｏｒｉｎｏｕｃｈｉ ＆ Ｂ、Ｗｅｉｓ
ｂｌｕｍ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１５０ 、８０４−８１４ （１９Ｂ２ ））のＤ Ｎ
Ａ （０，００２μｇ）とを混合し、トリス・ＰＥＧ
法（１，７ａｋａｈａｓｈｉ。
Ａ （０，００２μｇ）とを混合し、トリス・ＰＥＧ
法（１，７ａｋａｈａｓｈｉ。
Ｈ，Ｙａｍａｇａｔａ＋ Ｋ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、
Ｎ、Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ ａｎｄＳ、Ｕｄａｋａ、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５６ 、１１３０−１１
３４ （１９８３））によるバチルス・プレビス４７の
形質転換に使用した。
Ｎ、Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ ａｎｄＳ、Ｕｄａｋａ、
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５６ 、１１３０−１１
３４ （１９８３））によるバチルス・プレビス４７の
形質転換に使用した。
エリスロマイシン（１０μｓ ／ ｍ １２ ） ヲ含
ｔ； Ｔ ｚ寒天培地（］゛２培地に１．５％の寒天を
加えた固型培地）上に３７℃で生育した形質転換株牽エ
リスロマイシン（１０μｇ／ｍｊりを含むＴ２培地中で
３７℃で振盪し、停止期まで生育させＢｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙ の方法（前述）によりプラスミドの検定を
行った。調べた形質転換株の約１０分のｌがｐＨＷ １
と同時にｐＨ７４８１を保持していることが判明した。
ｔ； Ｔ ｚ寒天培地（］゛２培地に１．５％の寒天を
加えた固型培地）上に３７℃で生育した形質転換株牽エ
リスロマイシン（１０μｇ／ｍｊりを含むＴ２培地中で
３７℃で振盪し、停止期まで生育させＢｉｒｎｂｏｉｍ
とＤｏｌｙ の方法（前述）によりプラスミドの検定を
行った。調べた形質転換株の約１０分のｌがｐＨＷ １
と同時にｐＨ７４８１を保持していることが判明した。
次にこれらの形質転換株をＴ２培地およびエリスロマイ
シン（１０μｇ／ｎｕ）を含むＴ２培地で３７℃におい
て、それぞれ５０世世代化培養した後、Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ＆Ｄｏｌｙの方法によりプラスミドを抽出し解析した
。プラスミドのアガロースゲル電気泳動（Ｐ、Ａ、Ｓｌ
＋ａｒｐ、 Ｂ、Ｓｕｇｄｅｎ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ。
シン（１０μｇ／ｎｕ）を含むＴ２培地で３７℃におい
て、それぞれ５０世世代化培養した後、Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ＆Ｄｏｌｙの方法によりプラスミドを抽出し解析した
。プラスミドのアガロースゲル電気泳動（Ｐ、Ａ、Ｓｌ
＋ａｒｐ、 Ｂ、Ｓｕｇｄｅｎ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １２； ３０５５ ３０
６３ （１９７３））による解析の結果、エリスロマイ
シンを添加した培地中では両プラスミドともに安定に保
持されたが、エリスロマイシンを添加しないＴ２培地中
ではｐｔｔｗｌは速やかに失われ、ｐＨ７４８１のみが
安定に保持された。
６３ （１９７３））による解析の結果、エリスロマイ
シンを添加した培地中では両プラスミドともに安定に保
持されたが、エリスロマイシンを添加しないＴ２培地中
ではｐｔｔｗｌは速やかに失われ、ｐＨ７４８１のみが
安定に保持された。
以上のように、バチルス・プレビス４８１において発見
されたプラスミドｐＷ７４８１はバチルス・プレビス４
７において複製を行い、選択的薬剤のない培養条件下で
も安定に保持されるコピー数の少ないプラスミドである
ことが判明した。このプラスミド上に既知の薬剤耐性遺
伝子、例えばｐＨＷ １（前述）のエリスロマイシン耐
性遺伝子あるいはｐｕｔ＋ １１０上のネオマイシン耐
性遺伝子（Ｔ、Ｊ。
されたプラスミドｐＷ７４８１はバチルス・プレビス４
７において複製を行い、選択的薬剤のない培養条件下で
も安定に保持されるコピー数の少ないプラスミドである
ことが判明した。このプラスミド上に既知の薬剤耐性遺
伝子、例えばｐＨＷ １（前述）のエリスロマイシン耐
性遺伝子あるいはｐｕｔ＋ １１０上のネオマイシン耐
性遺伝子（Ｔ、Ｊ。
Ｇｌｙｃｚａｎ、 Ｓ、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ａｎｄ Ｄ
、Ｄｕｂｎａｕ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
、Ｄｕｂｎａｕ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
旦４ ； ３１Ｂ −３２９（１９７８））などを導入
し、直接形質転換体を選択できるプラスミドを作製する
ことが可能である。実施例１に詳しく示したようにｐＷ
Ｔ ４８１にｐＨＷ ｌ上のエリスロマイシン耐性遺伝
子を導入して作製されたプラスミドｐＨＹ ４８１ （
第２図）はエリスロマイシンによって形質転換体の選択
が可能である。
し、直接形質転換体を選択できるプラスミドを作製する
ことが可能である。実施例１に詳しく示したようにｐＷ
Ｔ ４８１にｐＨＷ ｌ上のエリスロマイシン耐性遺伝
子を導入して作製されたプラスミドｐＨＹ ４８１ （
第２図）はエリスロマイシンによって形質転換体の選択
が可能である。
第３図に示したように、バチルス・プレビス４７に導入
されたｐＨＹ ４８１はｐＷＴ ４８１と同様エリスロ
マイシンを添加しないＴ２培地における５０世代以上の
培養を通じて安定に保持され、かつコピー数も少ないこ
とが判明した。ｐＷＴ ４８１およびｐ）ＩＹ ４８１
上にクローン化された異種遺伝子はこれらのプラスミド
の性質から他のプラスミド上にクローン化された異種遺
伝子よりもバチルス・プレビス４７において安定に保持
されることが予想されるが、このような実施例としてバ
チルス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子をｐＨＹ
４８１上にクローン化しく第４図）バチルス・プレビ
ス４７における安定性を試験した。
されたｐＨＹ ４８１はｐＷＴ ４８１と同様エリスロ
マイシンを添加しないＴ２培地における５０世代以上の
培養を通じて安定に保持され、かつコピー数も少ないこ
とが判明した。ｐＷＴ ４８１およびｐ）ＩＹ ４８１
上にクローン化された異種遺伝子はこれらのプラスミド
の性質から他のプラスミド上にクローン化された異種遺
伝子よりもバチルス・プレビス４７において安定に保持
されることが予想されるが、このような実施例としてバ
チルス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子をｐＨＹ
４８１上にクローン化しく第４図）バチルス・プレビ
ス４７における安定性を試験した。
第４図に示したように、バチルス・メガテリウムのα−
アミラーゼ遺伝子をρＩＩＹ ４８１に導入して作製さ
れたプラスミドｐＨＹ ４８２は、同じ遺伝子をｐＨＷ
ｌ上に導入して作製されたプラスミドｐＫＮ １１（
第４図）よりもバチルス・プレビス４７においてはるか
に安定に保持された。
アミラーゼ遺伝子をρＩＩＹ ４８１に導入して作製さ
れたプラスミドｐＨＹ ４８２は、同じ遺伝子をｐＨＷ
ｌ上に導入して作製されたプラスミドｐＫＮ １１（
第４図）よりもバチルス・プレビス４７においてはるか
に安定に保持された。
以上の結果は、この発明のプラスミドｐｌｊ７４８１の
バチルス・プレビス４７におけるクローニングヘクター
としての有用性を示すものである。
バチルス・プレビス４７におけるクローニングヘクター
としての有用性を示すものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
ｐＷＴ ４８１へのエリスロマイシン耐性遺伝子の導入
ｐＨＷＩＤＮＡを１（ｐａ ｎおよびＴａｑ Ｉで切断
し、生ずるＤＮＡ断片の中からエリスロマイシン耐性遺
伝子を含む１，２Ｋｂの断片を分離した。この断片の両
末端をＴ、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、旧
ｎｄ ｍリンカ−を付着し、旧ｎｄ ｍで部分的に切断
したｐＷＴ ４８１ ＤＮＡとＴ４リガーゼにより連結
した（第２図）。このＤＮＡを用いてバチルス・プレビ
ス４７を形質転換し、エリスロマイシン耐性形質転換株
を得た。
ｐＨＷＩＤＮＡを１（ｐａ ｎおよびＴａｑ Ｉで切断
し、生ずるＤＮＡ断片の中からエリスロマイシン耐性遺
伝子を含む１，２Ｋｂの断片を分離した。この断片の両
末端をＴ、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端とし、旧
ｎｄ ｍリンカ−を付着し、旧ｎｄ ｍで部分的に切断
したｐＷＴ ４８１ ＤＮＡとＴ４リガーゼにより連結
した（第２図）。このＤＮＡを用いてバチルス・プレビ
ス４７を形質転換し、エリスロマイシン耐性形質転換株
を得た。
これらの形質転換株の約２５％がエリスロマイシンを含
まぬＴ２培地中でも安定にプラスミドを保持した。この
ような形質転換株の１つから日中らの方法（前述）によ
りプラスミドを精製し、ｐＨＹ４８１と命名した。第２
図にｐＨＹ ４８１の制限地図を示した。次にｐＨＹ
４８１を持つバチルス・プレビス４７株をエリスロマイ
シンを含まないＴ２培地において３７℃で継代培養し、
各時間にその一部をとり適当に希釈し、Ｔ２寒天培地に
散布した。生じたコロニーをエリスロマイシン（１０μ
ｓ／ｍＲ）を含むＴ２寒天培地へレプリカし、プラスミ
ドの保持率を測定した（第３図）。ｐＨＹ ４８１はこ
の条件におりる５０世代以上の継代培養を通じて安定に
保持されることが判明した（プラスミド保持率９５％以
上）。一方、対照として用いたｐＨｌｌ１ｌを持つバチ
ルス・プレビス４７はこの条件における５０世代の培養
によって、９９％以上の細胞がプラスミドを失った（第
３図）。
まぬＴ２培地中でも安定にプラスミドを保持した。この
ような形質転換株の１つから日中らの方法（前述）によ
りプラスミドを精製し、ｐＨＹ４８１と命名した。第２
図にｐＨＹ ４８１の制限地図を示した。次にｐＨＹ
４８１を持つバチルス・プレビス４７株をエリスロマイ
シンを含まないＴ２培地において３７℃で継代培養し、
各時間にその一部をとり適当に希釈し、Ｔ２寒天培地に
散布した。生じたコロニーをエリスロマイシン（１０μ
ｓ／ｍＲ）を含むＴ２寒天培地へレプリカし、プラスミ
ドの保持率を測定した（第３図）。ｐＨＹ ４８１はこ
の条件におりる５０世代以上の継代培養を通じて安定に
保持されることが判明した（プラスミド保持率９５％以
上）。一方、対照として用いたｐＨｌｌ１ｌを持つバチ
ルス・プレビス４７はこの条件における５０世代の培養
によって、９９％以上の細胞がプラスミドを失った（第
３図）。
実施例２
バチルス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子のｐＨ
Ｙ ４８１上へのクローニングとバチルス・プレビス４
７における安定性 １）バチルス・メガテリウムα−アミラーゼ遺伝子の大
腸菌へのクローニング 斉藤、三浦の方法（Ｈ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉ
ｕｒａ。
Ｙ ４８１上へのクローニングとバチルス・プレビス４
７における安定性 １）バチルス・メガテリウムα−アミラーゼ遺伝子の大
腸菌へのクローニング 斉藤、三浦の方法（Ｈ，５ａｉｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉ
ｕｒａ。
Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃ ｔ ａ ＋
工２ ； ６１９−６２９ ＜ １９６３ ））によっ
て調製したバチルス・メガテリウムのＤＮＡを旧ｎｄ
ｍで切断し、旧ｎｄ ｍで切断したｐＢＲ３２２ＤＮＡ
と１：１の割合で混合し、Ｔ、リガーゼにより連結して
大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。
工２ ； ６１９−６２９ ＜ １９６３ ））によっ
て調製したバチルス・メガテリウムのＤＮＡを旧ｎｄ
ｍで切断し、旧ｎｄ ｍで切断したｐＢＲ３２２ＤＮＡ
と１：１の割合で混合し、Ｔ、リガーゼにより連結して
大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。
可溶性澱粉（０，３％）およびアンピシリン（５０μｓ
／ ｍβ）を添加したＭ９合成寒天培地（０，６％Ｎ
ａ ｚＨＰ ０４．０．３％Ｋ Ｈｚ Ｐ ’０４＋
０．０２％Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ ・７ Ｈｚｏ、 ０．０
５％ＮａＣＣ０，１％Ｎｕ（、Ｃλ、０．２％グルコー
ス、 ０．０１％プロリン、 ０．０１％ロイシン、１
．５％寒天）上に生育した形質転換株の中からヨード澱
粉反応でコロニーの周辺を透明とする株１株を得た。
／ ｍβ）を添加したＭ９合成寒天培地（０，６％Ｎ
ａ ｚＨＰ ０４．０．３％Ｋ Ｈｚ Ｐ ’０４＋
０．０２％Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ ・７ Ｈｚｏ、 ０．０
５％ＮａＣＣ０，１％Ｎｕ（、Ｃλ、０．２％グルコー
ス、 ０．０１％プロリン、 ０．０１％ロイシン、１
．５％寒天）上に生育した形質転換株の中からヨード澱
粉反応でコロニーの周辺を透明とする株１株を得た。
この株よりプラスミドを日中らの方法（前述）により精
製し、ｐＫＮ １ と命名した。制限酵素を用いた解析
の結果、ｐＫＮ ｌ上の２．３ Ｋｂの１ｌｉｎｄ ｍ
断片の上にアミラーゼ遺伝子が存在するこたが示された
（第４図）。
製し、ｐＫＮ １ と命名した。制限酵素を用いた解析
の結果、ｐＫＮ ｌ上の２．３ Ｋｂの１ｌｉｎｄ ｍ
断片の上にアミラーゼ遺伝子が存在するこたが示された
（第４図）。
２）バチルス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子の
ｐＨＹ ４８１への導入 ｐＫＮ １を旧ｎｄ ＩＩＩで切断し、旧ｎｄ ｍで部
分的に切断したｐＨＹ ４８１ ＤＮＡと混合し、Ｔ４
リガーゼにより連結してバチルス・プレビス４７の形質
転換に用いた（第４図）。エリスロマイシン（１０μｇ
／ｍβ）および可溶性澱粉（０，３％）を添加したＴ２
寒天培地上に生育した形質転換株の中からヨード澱粉反
応によりコロニーの周辺を透明とする株を得た。この株
より日中らの方法（前述）によりプラスミドを精製し、
ｐＩＩＹ ４８２と命名した。
ｐＨＹ ４８１への導入 ｐＫＮ １を旧ｎｄ ＩＩＩで切断し、旧ｎｄ ｍで部
分的に切断したｐＨＹ ４８１ ＤＮＡと混合し、Ｔ４
リガーゼにより連結してバチルス・プレビス４７の形質
転換に用いた（第４図）。エリスロマイシン（１０μｇ
／ｍβ）および可溶性澱粉（０，３％）を添加したＴ２
寒天培地上に生育した形質転換株の中からヨード澱粉反
応によりコロニーの周辺を透明とする株を得た。この株
より日中らの方法（前述）によりプラスミドを精製し、
ｐＩＩＹ ４８２と命名した。
対照として用いるため、ｐＨＷＩＤＮＡ上に同様の操作
によりバチルス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子
を含む旧ｎｄ ｍ断片を導入し、ｐＫＮ １１を得たく
第４図）。
によりバチルス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子
を含む旧ｎｄ ｍ断片を導入し、ｐＫＮ １１を得たく
第４図）。
３ ） ｐＩＩＹ ４８１上にクローン化されたバチル
ス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子のバチルス・
プレビス４７における安定性 ｐＩＩＹ ４８２およびｐＫＮ １１を有するバチルス
・プレビス４７をそれぞれエリスロマイシンを含まない
１゛２培地において３７℃で継代培養した。各時間にそ
の一部をとり、希釈し可溶性澱粉（０，３％）を含むＴ
ｔ寒天培地へ散布した。生じたコロニーをエリスロマイ
シン（１０μｇ／ｍりを含むＴ２寒天培地へレプリカす
ることにより、またヨード澱粉反応によりプラスミドの
保持率を測定した。
ス・メガテリウムのα−アミラーゼ遺伝子のバチルス・
プレビス４７における安定性 ｐＩＩＹ ４８２およびｐＫＮ １１を有するバチルス
・プレビス４７をそれぞれエリスロマイシンを含まない
１゛２培地において３７℃で継代培養した。各時間にそ
の一部をとり、希釈し可溶性澱粉（０，３％）を含むＴ
ｔ寒天培地へ散布した。生じたコロニーをエリスロマイ
シン（１０μｇ／ｍりを含むＴ２寒天培地へレプリカす
ることにより、またヨード澱粉反応によりプラスミドの
保持率を測定した。
第５図に示すように、ｐＫＮ １１はこの条件における
３０世代の培養で９９％以上の細胞から失われる（保持
率１％以下）のに対してｐＩＩＹ ４８２は５０世代の
培養においても約５０％の細胞において保持されていた
。ｐＩＩＹ ｄ８２は、バチルス・プレビス４７ ／
ｐＨＹ４８２ （ＦＥＲ月ｐ−７５３５）として寄託さ
れている。
３０世代の培養で９９％以上の細胞から失われる（保持
率１％以下）のに対してｐＩＩＹ ４８２は５０世代の
培養においても約５０％の細胞において保持されていた
。ｐＩＩＹ ｄ８２は、バチルス・プレビス４７ ／
ｐＨＹ４８２ （ＦＥＲ月ｐ−７５３５）として寄託さ
れている。
第１図はプラスミドｐＷ７４８１の制限酵素切断地図で
ある。 第２図はプラスミドｐＨＹ ４８１の造成経過説明図で
ある。 第３図は形質転換株のプラスミド保持率を示すグラフで
ある。実線はｐ）ＩＹ ｄ８１８１形質転換点線はｐＩ
ＩＹ １形質転換株を示す。 第４図はプラスミドｐＨＹ ４Ｂ２およびｐＫＮ １１
の造成経過説明図である。 第５図は形質転換株のプラスミド保持率を示すグラフで
ある。実線はｐＩＩＹ ４８２形質転換株、点線はｐＫ
Ｎ １１形質転換株を示す。
ある。 第２図はプラスミドｐＨＹ ４８１の造成経過説明図で
ある。 第３図は形質転換株のプラスミド保持率を示すグラフで
ある。実線はｐ）ＩＹ ｄ８１８１形質転換点線はｐＩ
ＩＹ １形質転換株を示す。 第４図はプラスミドｐＨＹ ４Ｂ２およびｐＫＮ １１
の造成経過説明図である。 第５図は形質転換株のプラスミド保持率を示すグラフで
ある。実線はｐＩＩＹ ４８２形質転換株、点線はｐＫ
Ｎ １１形質転換株を示す。
Claims (3)
- （１）第１図に示す制限部位を有するバチルス・プレビ
スを宿主とするプラスミド。 - （２）第１図に示す制限部位を有するバチルス・プレビ
スを宿主とするプラスミドの全部または少なくとも当該
プラスミドの複製開始点を含むＤＮＡ領域および上記宿
主に抗生物質耐性を付与することができるＤＮＡよりな
るバチルス・プレビスを宿主とするプラスミド。 - （３）第１図に示す制限部位を有するバチルス・プレビ
スを宿主とするプラスミドの全部または少なくとも当該
プラスミドの複製開始点を含むＤＮＡ領域および上記宿
主に所望の蛋白質の生産能を付与することができるＤＮ
Ａよりなるバチルス・プレビスを宿主とするプラスミド
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044072A JPS60188073A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044072A JPS60188073A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188073A true JPS60188073A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH0533986B2 JPH0533986B2 (ja) | 1993-05-20 |
Family
ID=12681423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044072A Granted JPS60188073A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188073A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2589880A1 (fr) * | 1985-11-07 | 1987-05-15 | Shigezo Udaka | Procede pour l'expression de genes par bacillus brevis |
-
1984
- 1984-03-09 JP JP59044072A patent/JPS60188073A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2589880A1 (fr) * | 1985-11-07 | 1987-05-15 | Shigezo Udaka | Procede pour l'expression de genes par bacillus brevis |
| US4994380A (en) * | 1985-11-07 | 1991-02-19 | Shigezo Udaka | Process for expressing genes by Bacillus brevis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0533986B2 (ja) | 1993-05-20 |
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