JPS62201583A - バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 - Google Patents

バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法

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JPS62201583A JP61047273A JP4727386A JPS62201583A JP S62201583 A JPS62201583 A JP S62201583A JP 61047273 A JP61047273 A JP 61047273A JP 4727386 A JP4727386 A JP 4727386A JP S62201583 A JPS62201583 A JP S62201583A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ）を用いる遺伝子の発現方法に関する。
原核生物を用いて組換えＤＮＡ技術により遺伝子を発現
せしめようとする際、宿主の選択とその宿主に適したベ
クターの選択が重要であると思われる。バチルス・ブレ
ビスは菌体外に多量の蛋白質を生産しまたそのプロテア
ーゼ活性も極めて低いものであるが、組換えＤＮＡ技術
による遺伝子を発現させるための宿主とするための試み
はなされていなかった。
本発明者らは、上記のように又他に宿主として勝れた性
質を有するバチルス・ブレビスを宿主とすることに着目
し、バチルス・ブレビスを宿主とする際に適したベクタ
ーを開発すべく研究を行った。その結果、ＭＮＯＡＣＰ
よりなる塩基配列（ａ）。
塩基配列（ａ）の下流にＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配列
（ｂ）、塩基配列（ｂ）の下流にバチルス・ブレビスの
細胞内でリボソーム結合部位として機能する塩基配列（
ｃ）、塩基配列（ｃ）の下流にバチルス・ブレビスの細
胞内で翻訳開始コドンとして機能する塩基配列（ｄ）及
び塩基配列（ｄ）に直接接続されている発現させるべき
遺伝子を有しバチルス・ブレビスの細胞内で複製できる
プラスミドを、バチルス・ブレビスの細胞内に導入する
ことにより、バチルス・ブレビスを用いて、構造遺伝子
をよく発現せしめうろことを知った。
但しＭはＧ又はＴ、　ＮはＣ，Ｔ又はＡ、　ＯはＡ。
Ｃ又はＴ、ＰはＴ又はＧ、ＱはＴ又はＡ、　ＲはＴ又は
Ａ、　ＳはＴ、　Ｃ又はＡ、　ＷはＡ又はＧ、　ＸはＡ
又はＣ及びＹはＴ又はＧである。
塩基配列（ａ）及び塩基配列Ｔｂ）は転写プロモーター
としての機能を有する。
塩基配列ｔａ＋としては、より具体的には以下の例があ
る。
＋１１　Ｇ　ＣＡ　Ａ　ＣＴ　　（２１Ｔ　Ｔ　ＣＡ　
ＣＧ　　（３１Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　ＣＴ塩基配列（ｂ）と
してはより具体的には、以下の例がある。
（１）　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　　ｔ２）　Ｔ　Ａ　
ＣＡ　ＣＴ　　（３）　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＧ塩基配列
ｔｈ＋と塩基配列（ｂ）の間隔は、１７塩基対が上記具
体例の場合には好ましかったが、１５〜２０であっても
よい。
このようなプロモーターの支配下にこのプロモーターに
とって異種の構造遺伝子を発現させるには、プロモータ
ー配列と構造遺伝子との間にリボソーム結合部位（塩基
配列（ｃ））と翻訳開始コドン（塩基配列（ｄ））が配
置されるように接続する。リボソーム結合部位と翻訳開
始コドンがプロモーター配列と構造遺伝子との間に配置
するには、リボソーム結合部位及び翻訳開始コドンがも
ともと配置されているようなベクターを用いて、これに
構造遺伝子を挿入する。この際、リボソーム結合部位と
翻訳開始コドンを有する構造遺伝子をベクターに挿入し
てもよい。ベクターがリボソーム結合部位と翻訳開始コ
ドンのいずれをも又はいずれかを有しない場合には、リ
ボソーム結合部位又は翻訳開始コドンを有する構造遺伝
子をベクターに挿入するかリボソーム結合部位又は翻訳
開始コドンを別に挿入しなければならない。また、ベク
ターはシグナルペプチドに対応するＤＮＡ配列を有する
ものを用いてもよい。
構造遺伝子は、更に固有のプロモーター配列を存するも
のであっても支障はない。また、構造遺伝子として、シ
グナルペプチドに対応するＤＮＡ配列を有するものを用
いてもよい。
バチルス・ブレビスとしては、特に特定の株を用いる必
要はない。バチルス・ブレビスの内の好適な例として、
バチルス・ブレビス４７ＦＥＲＭ−Ｐ７２２４及び同４
８１ＦＥＲＭ−Ｐ７５３１がある。
本発明のプラスミドベクターに構造遺伝子を挿入してバ
チルス・ブレビスの細胞内に導入すれば、これら微生物
は、蛋白質等の有用物質を多量に生産するように形質転
換される。
ベクター内に構造遺伝子を挿入する方法及び得られた組
換えＤＮＡを用いてバチルス・ブレビスを形質転換する
方法は従来用いられている方法がそのまま適用できる。
ここで構造遺伝子の例としては真核生物由来のものおよ
び原核生物由来のもののいずれも使用することが可能で
ある。たとえばヒト遺伝子（たとえばインターフェロン
、インシュリンなど）、微生物の酵素蛋白遺伝子（たと
えばトリプトファナーゼ、アスパラギン酸アンモニアリ
アーゼなど）などがある。
次に、本発明を実施例により説明する。
実施例１ （１）　　バチルス・ブレビス４フ細胞表層蛋白質遺伝
子の５′側プロモーター領域のクローン化上記表層蛋白
質（分子量１５万の蛋白質、以下１５０に蛋白質と記す
）の遺伝子の断片（これは１５０ＫＷ白質遺伝子のプロ
モーター領域を含まないものとして塚越らによってクロ
ーニングされた；Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５８
．１０５４−１０６０（１９８４））をプローブとして
バチルス・ブレビス４７　（ＦＥＲＭ−Ｐ７２２４）の
染色体ＤＮＡについてサウザン・プロット法（Ｊ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏｌ。
エエ、５０３−５１７　　（１９７５））を用いて解析
した結果、本遺伝子及びその周辺の制限地図（第１図）
を得た。更にバチルス・ブレビス４７から抽出したＲＮ
Ａを用いてＳ１マツプ法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２
５６．１１９０５〜１１９１０（１９８１））を行い、
本遺伝子の転写方向およびその転写開始位置を第１図に
示すように決定した。
そこでバチルス・ブレビス４７のＤＮＡを制限酵素Ｂｃ
ｌ　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動により９Ｋｂ
断片（第１図に示すＤＮＡのほぼ全長）を分離し、その
ＤＮＡを更にＢｇｊ！Ｉｆで切断しアガロースゲル電気
泳動により、第１図中斜線で示した領域の３．ＩＫｂＤ
ＮＡ断片を濃縮分離した。次に、プラスミドｐ　Ｉ−Ｉ
　Ｗ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１５０．８０４〜８１４（１９８２））を制限酵素Ｈｉ
ｎｄｌｌｒで切断し、ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末
端化した後ＢａｍＨＩリンカ−を付加したものと、上記
の３．ＩＫｂＤＮＡ断片をＴ４リガーゼで連結し、その
ＤＮＡを枯草菌ＲＭ１４１（ｒｓ　ｆｆＬＨａｒＢ　　
１５　１ｅｕＢ８　　ｈｉｓＡｌ　　ｒｅｃＥ４）の形
質転換（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　　１６
８．　１１１〜１１５（１９７９））に用いた。エリス
ロマイシン（１０μｇ／ｍｌ＞を含む再生寒天培地上に
生育した形質転換株の中から、別途調製した１５０に蛋
白質に対する抗体とプロティンＡ・ホースラディツシュ
・パーオキシダーゼ・コンジュゲート（Ｅ−Ｙラボラト
リーズ）を用いるところのエンザイム・イムノ・アッセ
イ法（Ｇｅｎｅ　１６　。
１４９（１９８１））　　により上記抗体と反応するコ
ロニーを検出した。反応したコロニーからプラスミドｐ
ｃＷＰ１（第２図）を分離し前述の３．ＩＫｂ断片が挿
入されていること（第２図中太線で示す部分）を確認し
た。
（２）　　クローン化されたＤＮＡ断片の解析とプロモ
ーターの強さ クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列をマキサム・ギ
ルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５
　＋４４９〜５６０　（１９８０）’）　により決定す
るとともに、バチルス・ブレビス４７から抽出したＲＮ
Ａを用いたＳ１マツプ法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｆｌ
ｌ。
２５６、１１９０５〜１１９１０　（１９８１）により
転写開始位置を決定した。その結果Ｂｃｊ！！部位側か
ら約２Ｋｂ離れた部位から始まりＢｇｌｌＴ１部位へ向
うオープン・リディング・フレーム及びその上流に位置
する４個の転写開始部位（Ｐｌ。
Ｐ２．Ｐａ、Ｐ４）を見出した（第３図）。
これら４個の転写開始部位のそれぞれの上流に見出され
たーｌＯ領域および一３５領域の塩基配列を第１表に示
した。
Ｓｌマフブ法の解析の結果から、Ｐ２．ＰａおよびＰ４
における転写開始はコンセンサス配列と類似した配列を
有するＰｌあるいはバチルス・リケニホルミスのα−ア
ミラーゼのプロモーター（Ｐａｍ７りと比べてはるかに
強いことが明らかに＜＜＜＜ Ｅ−１−←Ｏ← ｙ＜＜ａａ＜ 諧＜＜＜ａ＜ 口←←Ｕ＜Ｏ −＜Ｅ−＜：＜＜Ｑ １←←←＜←寧 ＱＯＥ−＜　　Ｉ ＱＱａ＜　　＋ｈ ００１−　Ｑ　　／／１ ０ｏｃｐ＜　　ト （３）バチルス・ブレビス４７におけるプロモーター活
性測定ベクターの作製 バチルス・リケニホルミス５８４株（Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｊｏｐｈｙｓ、　　１５５．　２
９０〜２９８（１９７３））よりクローン化されたα−
アミラーゼ遺伝子をバチルス・ブレビス４７で安定に保
持されるプラスミドベクターｐ　ＨＹ　４８１　　（Ａ
ｐＰＩ−Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、工９，１０７
６〜１０７９（１９８５））に導入しｐＨＹ４８３　（
第４図）を得た。本アミラーゼ遺伝子の全塩基配列はバ
チルス・リケニホルミス５８４株のα−アミラーゼ遺伝
子の５“側領域の塩基配列Ｕ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１５８．３６９〜３７２　（１９８４））とほぼ一致し
、−１０及び−３５領域の配列、リボソーム結合部位の
配列（ＳＤ配列）また上流の遺伝子からの転写を終止さ
せていると思われるインバーテツド・リピート配列の存
在などの特徴は完全に一致することが確認された。本遺
伝子を用いて以下のようにプロモーター活性測定用のベ
クターを作製した。
まずｐＨＹ４８３をＢａｍＨＩで切断し、切断点からα
−アミラーゼ遺伝子のＳＤ配列直前までをヌクレアーゼ
Ｂａ＃３１を用いて取り除き、ＢａｍＨＩリンカ−を付
加した後環状化してｐＨＹ４８３△Ｐを得た。またｐＨ
Ｙ４８３をＰｓｔｌで切断し同様にして切断点からＢａ
ｍ８１部位下流２７０ｂ　（インバーテツド・リピート
配列の直前）までを取り除きＢｇｆｎリンカ−を付加し
た後環状化しｐＨＹ４８３△Ｎを得た。次にｐＨＹ４８
３△ＰＤＮＡをＢａａＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑末端としＢｇｌＵリンカ−を付加した後Ｓａｊ
！Ｉで切断し、アミラーゼ遺伝子５゛側領域を含むＢｇ
ｌ！Ｕ−３ａｊ！　１１．１ｋｂ断片をアガロースゲル
電気泳動により分離した。またｐＨＹ４８３△Ｎ　　Ｄ
ＮＡをＢｇｊ２１１，５ａｌｌＴで切断し、アミラーゼ
遺伝子の５゛側領域を含まない４．７ｋｂ断片を同様に
して分離した。両ＤＮＡをＴ４リガーゼで連結し、バチ
ルス・ブレビス４７を形質転換し得られた形質転換株か
らｐＨＹ４８３３を得た。ｐＨＹ４８３３はアミラーゼ
遺伝子上流のインバーテツド・リピート及びＳＤ配列を
保持し、−３５及び−１０領域を欠失している（第５図
）。
（４−１）　　バチルス・ブレビス４７を宿主とし、ｐ
ＨＹ４８３３を用いた細胞表層蛋白質遺伝子５′側領域
のプロモーター活性 細胞表層蛋白質遺伝子の５゛側領域から、Ａｌｕｒ−Ａ
ｌｕＩ６００ｂ断片（図３．ヌクレオチド１１６から７
１５まで、転写開始部位Ｐｌ。
Ｐ２．Ｐ３．Ｐ４及びそれぞれの−１０，−３５領域を
含む）、Ａｊ！ｕｌ−Ｒｓａ１１６５ｂ断片（第３図、
ヌクレオチド１１６から２８０まで、転写開始部位Ｐ１
とその−１０，−３５領域を含む）、Ｒｓａｌ−Ａｆｆ
ｉｕ１４３５ｂ断片（第３図。
ヌクレオチド２８１から７１５まで、転写開始部位Ｐ２
．Ｐ３．Ｐ４及びそれぞれの−１０，−３５領域を含む
）を分離し、それぞれＢａｌ１１）（ｉ　１ｉｎｋｅｒ
を付加後、ｐＨＹ４８３３のＢｇＪＩｒ部位に挿入し、
ｐＴＡｌ、３．２を得た（第６図）。
ｐＨＹ４８３３．ｐＴＡ３．ｐＴＡ２．ｐＴＡｌをそれ
ぞれ導入したバチルス・ブレビス４７をＴ３培地（可溶
性デンプン２％、ＭｇＣ６ｚ・６　Ｈ，ｏ　　ｏ、　１
％、イーストエキス０．４％、ポリペプトン２％、肉エ
キス０．５％、ウラシル０．０１％、ｐＨ７）に植え、
３７℃で振盪培養を行い１日後、３日後の菌体外アミラ
ーゼ生産量を可溶性デンプンを基質として、斉藤の方法
（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　１５５，２９０〜２９８　（１９
７３））を用いて測定した（第３表）。
第　　　３　　　表 ｐＨＹ４８３３０．２４　０．２４ ｐＴＡ３　０．１？　　　０．１６ ｐＴＡ２　９．２　　９．８ ｐＴＡｌ　　７．８　　１０．０ （４−２）　　バチルス・ブレビス４７を宿主とし、ｐ
ＨＹ４８３３を用いた細胞表層蛋白質遺伝子５゛側領域
のプロモーター活性の測定 細胞表層蛋白質遺伝子の５゛側領域から第７図に示した
各種の制限酵素断片あるいはＢａ１３１ヌクレアーゼ処
理によるＤＮＡ鎖の短縮後、合成リンカ−を付加した断
片を調製し、前節で作製したプロモーター活性測定ベク
ターｐＨＹ４８３３のＢｇ１ｍ部位へ挿入し、ｐＴＡｌ
−ｐＴＡ８を得た。これらのプラスミドを導入したバチ
ルス・ブレビス４７をＴ３培地（可溶性デンプン２％。
ＭｇＣｌ２・６　Ｈ２Ｏ０，１％、イーストエキス０．
４％、ポリペプトン２％、肉エキス０．５％、ウラシル
０．０１％、ｐＨ７）に植え、３７℃で振盪培養を行い
、菌体外アミラーゼ量を可溶性デンプンを基質とした斉
藤の方法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　１５５．２９０〜２９８　（１９
７３））により測定した（第４表）。
第４表 菌体外アミラーゼ（Ｘ１０’ｕ　／　ｍ　Ｉ！　）培　
　　　養　　　　日　　　　数 プラスミド　　　　　１日　　　　２日　　　　３日ｐ
ＨＹ４８３３　　　０．４　　　　０．４　　　　０．
４ｐＴＡ１　　　　　１２．７　　　１２．８　　　１
１．１ｐＴ　Ａ　２　　　　　　７．８　　　　７．８
　　　　９．８ｐ　Ｔ　Ａ　３　　　　　　０．２　　
　　０．２　　　　０．２ｐ　ＴＡ　４　　　　　　５
．７　　　　５．１　　　　６．０ｐＴＡ５　　　　　
　０，３　　　　１．０　　　　０．７ｐＴ　Ａ　６　
　　　　　８．０　　　　８．６　　　　８．０ｐＴＡ
？　　　　　　２５．７　　　２４．４　　　１９．１
ｐ　Ｔ　Ａ　８　　　　　　１．２　　　　１．５　　
　　１．５この結果からバチルス・ブレビス４７におい
ては、コンセンサス配列と類似した−１０．−３５配列
を持つ転写開始部位Ｐ１からの転写開始頻度は非常に低
く、コンセンサス配列に類似しない−１０，−３５配列
を持つ転写開始部位Ｐ２．Ｐ３、Ｐ４からの転写開始の
頻度の方がはるかに高いことが結論された。特に、Ｐ３
からの転写開始の頻度は高く、Ｐ３のみを持つ断片を挿
入したプラスミドｐＴＡ７を導入したバチルス・ブレビ
ス４７におけるα−アミラーゼ生産量は、断片を挿入し
ていないｐＨＹ４８３３あるいはＰｌのみを持つ断片を
挿入したプラスミドｐＴＡ３の場合と較べて５０倍以上
に達した。なお菌体内のアミラーゼ量は菌体外の１０％
以下である。
ｐＴＡ２を有するバチルス・ブレビス４７は工業技術院
微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　　Ｐ−８５０４とし
て寄託されている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、１５万蛋白質遺伝子及びその周辺の制限地図
である。Ｘは３．ＩＫｂ　　ＤＮＡ断片領域である。 第２図は、プラスミドｐＣＷＰ　１の制限地図である。 　　　　　　　は、３．ＩＫｂ　　ＤＮＡ断片領域であ
る。 第３図は、バチルス・ブレビス４フ細胞表層蛋白質遺伝
子の５゛側領域の塩基配列及び転写開始の位置（矢印で
示す）及び見出されたオーブンリーデングフレームに対
応するアミノ酸配列を示す。 がプロモーター領域であり、二二二二 は推定される翻訳開始コドンである。 第４図は、プラスミドｐＨＹ４８３の制限地図である。 第５図は、プロモーター検出用ベクターｐＨＹ４８３３
の造成経過の説明図である。＝＝＝コは欠失領域である
。 第６図は、プロモーター検出用ベクターｐＨＹ４８３３
に挿入された細胞表層蛋白質遺伝子の５“側領域断片を
示す。 第７図は、プロモーター検出用ベクターｐＨＹ４８３３
に挿入された細胞表層蛋白質遺伝子の５″側領域断片を
示す。なお、図中のヌクレオチド番号は第３図に対応す
る。 第６図 ＰＦ　　　Ｐ２Ｐ３Ｐ４

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. ＭＮＯＡＣＰよりなる塩基配列（ａ）、塩基配列（ａ）
    の下流にＱＲＳＷＸＹよりなる塩基配列（ｂ）、塩基配
    列（ｂ）の下流にバチルス・ブレビスの細胞内でリボソ
    ーム結合部位として機能する塩基配列（ｃ）、塩基配列
    （ｃ）の下流にバチルス・ブレビスの細胞内で翻訳開始
    コドンとして機能する塩基配列（ｄ）及び塩基配列（ｄ
    ）に直接接続されている発現させるべき遺伝子を有しバ
    チルス・ブレビスの細胞内で複製できるプラスミドを、
    バチルス・ブレビスの細胞内に導入することを特徴とす
    る、バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法。但
    しＭはＧ又はＴ、ＮはＣ、Ｔ又はＡ、ＯはＡ、Ｃ又はＴ
    、ＰはＴ又はＧ、ＱはＴ又はＡ、ＲはＴ又はＡ、ＳはＴ
    、Ｃ又はＡ、ＷはＡ又はＧ、ＸはＡ又はＣ及びＹはＴ又
    はＧである。
JP61047273A 1985-11-07 1986-03-06 バチルス・ブレビスを用いる遺伝子の発現方法 Expired - Lifetime JPH07108224B2 (ja)

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SE8604636A SE469560B (sv) 1985-11-07 1986-10-30 Foerfarande foer uttryckande av gener medelst bacillus brevis
CH4424/86A CH671032A5 (ja) 1985-11-07 1986-11-06
DK533386A DK533386A (da) 1985-11-07 1986-11-07 Fremgangsmaade til ekspression af gener ved hjaelp af bacillus brevis
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