SE462046C - Hybrid-DNA-vektor innehållande DNA-sekvens från Staphylococcus aureus, förfarande för dess framställning och bakterie innehållande densamma - Google Patents

Description

462 046 2 10 15 20 i* 25 30 35 stammar och underlättar givetvis isoleringen av protein A.

Framställning av protein A ur stammar av S. aureus har emellertid två huvudsakliga nackdelar. Den ena är bakteriens patogena natur, som kräver speciella säkerhetsåtgärder vid odlingsprocessen, och den andra är de relativt låga kvantiteter av protein A som produceras av de S. aureus-stammar som för närvarande används. Det skulle därför vara i hög grad önskvärt att kunna använda en mikroorganism med förmåga att producera protein A, eller något aktivt derivat därav, som å ena sidan är mindre eller företrädesvis icke-patogen och å andra sidan ger ökad produktion av protein A. En sådan mikroorganism tillhandahålles genom föreliggande uppfinning.

Föreliggande uppfinning, som avser s.k. genetisk ingenjörskonst, syftar till att åstadkomma en hybrid-DNA-molekyl, som innefattar en deoxiribonukleo- tidsekvens innehållande den genetiska informationen för protein A eller något aktivt derivat därav, dvs. som har förmåga att binda åtminstone en IgG-Fc-del till sig. En sådan hybrid-DNA-molekyl eller en s.k. hybrid- eller rekombinantvek- tor kan införas i någon lämplig värdbakterie, som man sedan kan odla för att producera det önskade protein A-materialet. Genom lämpligt val av såväl DNA- transfervektorn som värdbakterien kan man få en transformerad bakterie, som å ena sidan är icke-patogen och å andra sidan producerar väsentligt större mängder protein A än de hittills använda S. aureus-stammarna på grund av självreplikation av vektor-DNAn i värdcellerna, vilket ger upphov till en ökad mängd gener som kodar för protein A.

Den relativt nya hybrid-DNA-teknik eller genetiska ingenjörskonst som det hänvisats till ovan gör det möjligt att införa en speciell nukleotidsekvens, som kodar för ett önskat protein eller en önskad polypeptid, i en bakterie eller någon annan lämplig värdcell och därigenom överföra den önskade egenskapen till denna. DNA:t kan framställas genom kemisk syntes eller extraheras från någon annan bakteriestam eller annan organism. Konstruktionen av sådana transforme- rade mikroorganismer kan innefatta stegen att bilda en dubbelsträngad DNA- sekvens som kodar för det önskade proteinet eller polypeptiden, koppla in DNA:t på något lämpligt ställe i en lämplig' kloningsbärare eller vektor för att bilda hybrid-DNA-molekyler, av vilka vissa kommer att innehålla den önskade proteinkodande genen, transformera någon lämplig värdmikroorganism med hybrid-DNA-molekylerna, analysera de resulterande klonerna med avseende på närvaro av den protein- eller polypeptidkodande genen med lämpliga medel, och utvälja och föröka en eller flera positiva kloner. Eventuellt kan en eller flera om- eller subkloningar utföras, innefattande extraktion och klyvning av den protein- 10 15 20 25 30 35 3 462 046 kodande DNA-sekvensen, införande av de kluvna fragmenten i en annan klyvningsbärare eller vektor och analys med avseende på närvaro av den protein- eller polypeptidkodande genen.

Ett flertal såväl bakteriella som icke-bakteriella proteiner har erhållits med användning. av sådan hybrid-DNA-teknik, mestadels i fjcherichia coli, vanligtvis kallad lš_._gg_l_i_, och finns beskrivna i litteraturen. Inget av de tidigare kända hybrid-DNA-förfarandena har emellertid varit inriktat pâ syntes av protein A eller protein A-liknande material, såsom föreliggande uppfinning. Framställ- ning av protein A med användning av hybrid-DNA-teknik kräver vidare att man finner en DNA-sekvens med åtminstone delvis okänd struktur, dvs. den DNA- sekvens som kodar för protein A i någon lämplig värd, och separerar denna från en ytterst komplex blandning av DNA-sekvenser, såsom kommer att förklaras närmare nedan. När DNA-sekvensen väl identifierats erbjuder hybrid-DNA- tekniken möjlighet att framställa mikroorganismer med förmåga att producera inte enbart protein A utan även modifierade protein A-produkter med protein A- aktivitet, såsom fragment av protein A och oligomera former av protein A eller aktiva fragment därav, eller kombinationer, såsom kommer att beskrivas närmare nedan.

Således avser en aspekt av föreliggande uppfinning en hybrid-DNA-vektor enligt definitionen i patentkravet l och ett sätt för-dess framställning.

En annan aspektiav uppfinningen avser en ny bakterie framställd genom hybrid-DNA-teknik, som har förmåga att producera protein A eller något aktivt derivat därav såsom definieras nedan, liksom framställning av en sådan bakterie genom transformering av en värdbakterie med en hybrid-DNA-vektor enligt uppfinningen.

Ytterligare en aspekt av uppfinningen avser ett sätt att framställa protein A eller ett aktivt derivat därav genom odling av en transformerad mikroorganism enligt uppfinningen.

I föreliggande beskrivning och patentkrav avser uttrycket “protein A" varje proteinmakromolekyl som har analog eller likartad struktur och analoga eller likartade immunologiska och biologiska aktiviteter som den protein A- substans som produceras av de naturliga _S_. §i_1¿_e_Li_s-stammarna. Således kan struk- turella variationer mellan de olika substanserna uppträda. Uttrycket "aktivt derivat" (av protein A) är avsett att innefatta varje polypeptidfragment av protein A som har förmåga att binda åtminstone ett immunoglobulin vid sin Fc-del eller ett fritt Fc-fragment, liksom oligomera former av protein A eller aktiva polypeptidfragment 462 046 f* 10 15 20 25 30 35 därav. Sådana oligomera former kan innefatta tvâ eller flera hopkopplade protein A-molekyler, aktiva polypeptidfragment eller kombinationer därav och kan ha ökad IgG-bindande aktivitet jämfört med den normala protein A-molekylen.

Uttrycken "protein A" och “aktivt derivat" är vidare avsedda att innefatta protein A-molekyler resp. aktiva protein A-derivat enligt definitionen ovan, som kan ha en icke-protein A-peptidsekvens kopplad därtill, t.ex. på grund av införande av kemiskt syntetiserade oligonukleotider vid konstruktion av klonings- vektorn.

Ytterligare speciella termer som används i den följande beskrivningen (av vilka nâgra redan använts i den föregående delen) definieras nedan: Nukleotid - En monomer enhet av DNA eller RNA som består av en sockerdel (pentos), ett fosfat och en kvävehaltig heterocyklisk bas. Basen är bunden till sockerdelen via glykosidkolet (l'-kolet i pentosen) och denna kombination av bas och socker utgör en nukleosid. Basen kännetecknar nukleotiden. De fyra DNA-baserna är adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") och tymin ("T"). De fyra RNA-baserna är A, G, C och uracil ("U").

DNA-sekvens -- En linjär serie av nukleotider förbundna med varandra genom fosfodiesterbindningar mellan 3'- och 5'-kolatomerna i angränsande pentoser. l_<_o_<_l_o_n - En DNA-sekvens av tre nukleotider (en triplett) som via budbärar-RNA ("mRNA") kodar för en aminosyra, en translationsstartsignal eller en translationsavbrytningssignal. Exempelvis kodar nukleotidtripletterna TTA, TTG, CTT, CTC, CTA och CTG för aminosyran leucin ("Leu"), TAG, TAA och TGA är translationsstoppsignaler och ATG är en translationsstartsignal.

Plasmid - En icke-kromosomal dubbelsträngad DNA-sekvens som innefat- fa;- en intakt flfepficonflv, sg att plasmiden replikeras i en värdcell. När plasmiden placeras i en encellig värdorganism, ändras eller transformeras organismens egenskaper till följd av plasmidens DNA. Exempelvis transformerar en plasmid som uppbär genen för tetracyklinresistens (Tet) en värdcell, som tidigare varit känslig för tetracyklin, till en sådan som är resistent mot detsamma. En värdcell som transformerats av en plasmid kallas "transformant".

Egg eller Bakteriofag - Bakterievirus av vilka många kan innehålla DNA-sekvenser inkapslade i ett proteinhölje eller -överdrag.

Kloningsbärare - En plasmid, fag-DNA eller annan DNA-sekvens med förmåga att replikeras i en värdcell, kännetecknad av ett eller ett litet antal endonukleas-igenkänningsställen, eller restriktionsställen, vid vilka dess DNA- sekvens kan klyvas på ett förutbestämt sätt utan åtföljande förlust av någon väsentlig biologisk funktion hos DNA:t, t.ex. replikation, produktion av höljes- 10 15 20 25 30 35 5 462 046 proteiner eller förlust av promotor eller bindningsställen, och som innehåller en markör lämpad för användning vid en identifiering av transformerade celler, t.ex. tetracyklin-resistens eller ampicillin-resistens. En kloningsbärare är även känd som en vektor. l/šifl -- En organism som vid transformering med en kloningsbärare eller vektor gör det möjligt för kloningsbäraren att replikera och utföra sina andra biologiska funktioner, t.ex. produktion av polypeptider eller proteiner genom uttryckning av generna i en plasmid.

Kloning -- Sättet att erhålla en population av organismer eller DNA- sekvenser härrörande från en sådan organism eller sekvens genom asexuell reproduktion.

Expression eller uttryckning -- Den process en gen undergår för att producera en polypeptid eller ett protein. Det är en kombination av transkription och translation.

Trans-.ription -- Processen att producera mRNA från en gen.

Translation -- Processen att producera ett protein eller en polypeptid från mRNA.

Promotor -- Det område av DNA i en gen, till vilket RNA-polymeras binder och initierar transkription. En promotor är belägen före genens ribosom- bindande centrum.

Ribosombindande centrum - Det omrâde av DNA hos en gen som kodar för ett ställe på mRNA som hjälper mRNA att bindas till ribosomen, så att translation kan börja. Det ribosombindande centrat är beläget efter genens promotor och före genens translationsstartsignal. gg -- En DNA-sekvens vilken som mall för RNA kodar för en sekvens av aminosyror som är karakteristisk för en speciell polypeptid eller ett speciellt protein. En gen innefattar en promotor, ett ribosombindande centrum, en translationsstartsignal och en strukturell DNA-sekvens. I fallet med ett exporte- rat eller sekreterat protein eller polypeptid innefattar genen även en signal- DNA-sekvens.

Expressionskontrollsekvens -- En DNA-sekvens i en kloningsbärare eller vektor som kontrollerar och reglerar expressionen eller uttryckandet av gener i kloningsbäraren när den är funktionellt kopplad till dessa gener.

Signal-DNA-sekvens -- En DNA-sekvens inom en gen för en polypeptid eller ett protein vilken som mall för mRNA kodar för en sekvens av hydrofoba aminosyror vid den aminoterminala änden av polypeptiden eller proteinet, dvs. en "signalsekvens" eller "hydrofob ledarsekvens" hos polypeptiden eller proteinet. En signal-DNA-sekvens är placerad i en gen för en polypeptid eller ett protein 462 046 6 10 15 20 25 30 35 omedelbart före den strukturella DNA-sekvensen hos genen och efter genens translationsstartsignal (ATG). En signal-DNA-sekvens kodar för signalsekvens hos en polypeptid eller ett protein, vilken signalsekvens är karakteristisk för en prekursor till polypeptiden eller proteinet.

Prekursor - En polypeptid eller ett protein syntetiserat inuti en värdcell med en signalsekvens.

Nedströms och uppströms - På en kodande DNA-sekvens är nedströms transkriptionsriktningen, dvs. i riktningen från 5' till 3'. Uppströms är den motsatta riktningen.

Rekombinant DNA-molekyl eller hybrid-DNA - En molekyl bestående av segment av DNA från olika genomer som förenats ände-vid-ände utanför levande celler och som har förmåga att infektera en värdcell och kvarhållas i denna.

Strukturell DNA-sekvens - En DNA-sekvens inom en gen vilken som mall för mRNA kodar för en sekvens av aminosyror som är karakteristisk för någon speciell färdig polypeptid eller färdigt protein, dvs. den aktiva formen av polypeptiden eller proteinet.

En grundläggande aspekt av uppfinningen är således tillhandahållandet av en hybrid-DNA-vektor, som innefattar en deoxinukleotidsekvens som kodar för protein A eller ett polypeptidfragment därav enligt den ovan angivna defini- tionen. Ursprunget till deoxinukleotidsekvensen är inte kritiskt för uppfinningen så länge som den aktuella sekvensen kan anses härröra från en stam av S. aureus.

Varje sådan protein A-producerande bakteriestam kan användas för syftena med föreliggande uppfinning. För de aktiva polypeptidfragmenten av protein A, och eventuellt även för hela protein A-molekylen, kan man således även tänka sig syntetiskt producerade molekyler.

Vid framställning av en hybrid-DNA-molekyl i enlighet med föreliggande uppfinning kan någon lämplig kloningsbärare eller vektor klyvas med hjälp av ett restriktionsenzym och den DNA-sekvens eller -fragment som kodar för den önskade protein A-molekylen eller polypeptidfragmentet därav införas på klyvningsstället för att bilda en hybrid-DNA-molekyl. Detta allmänna förfarande är i och för sig känt och olika tekniker eller metoder för att hopkoppla DNA- sekvensen med den kluvna kloningsvektorn finns beskrivna i litteraturen.

Om man använder kromosomalt stafylokock-DNA som källa för den deoxi- nukleotidsekvens som skall införas i den utvalda vektorn, kan det erhållas genom behandling av Staphylococcus aureus-stammen med enzymet lysostafin för att 10 15 20 25 30 35 7 462 046 bilda protoplaster, s-:zn sedan lyseras och DNA extraheras och isoleras för att bilda en DNA-beredning. Genom partiell digerering eller klyvning med något lämpligt restriktionsenzym kan DNA-beredningen klyvas till fragment med lämplig storlek. Efter behandling av vektorn med samma eller något annat restriktionsenzym kan vektorklyvningsprodukterna och den ovannämnda fragmen- terade DNA-beredningen blandas och slumpvis kombineras under ligerande inverkan av ett ligasenzym. Selektering av de ligerade DNA-fragmentkombina- tionerna kan utföras genom att man gör dem biologiskt aktiva i någon lämplig bakterie. Sådan transformation är en annan aspekt av förelig- gande uppfinning och kommer att beskrivas närmare nedan. De trans- formerade celler som antingen innehåller en vektor eller en vektor/stafylokock- DNA-kombination kan väljas ut på basis av någon lämplig markör som ingår i vektorn, t.ex. antibiotisk resistens, såsom ampicillinresistens, som inte påverkas av införande av donatorkromosom-DNA. Bland de erhållna klonerna kan hybrider kännas igen på basis av en andra markör som ingår i vektorn, t.ex. tetracyklin- resistens, som påverkas av införandet av donator-DNA och sålunda indikerar en transformerad cell. På detta sätt kan en "genbank" av S. aureus-stammen erhållas bestående av ett stort antal, t.ex. flera hundra, kloner som innehåller stafylokock-DNA. Den klon eller de kloner som innehåller den protein A- producerande genen kan sedan återfinnas med någon lämplig analys med avseende på protein A, t.ex. genom ELISA-teknik (enzyme-linked immunosorbent assay).

Som ovan nämnts kan fragment av DNA från protein A-producerande kloner subklonas till samma eller någon annan värdmikroorganism.

De kloningsbärare eller vektorer som kan användas i enlighet med föreliggande uppfinning beror bl.a. på naturen hos den värdbakterie som skall transformeras. Användbara kloningsbärare kan t.ex. bestå av segment av kromosomala, icke-kromosomala och syntetiska DNA-sekvenser, såsom olika kända bakterie-plasmider, t.ex. plasmider från _E_._c_:o_li_ innefattande pBR 322 och derivat därav, fag-DNA, såsom derivat av fag-lambda, vektorer härledda från kombinationer av plasmider och fag-DNA, speciellt konstruerade sammansatta plasmider, etc. Det' speciella valet av kloningsvektor med avseende på en speciell värd kan göras av fackmannen på området. Även stället för införande av DNA:t i varje speciell kloningsvektor kan väljas av fackmannen, varvid klyvningsställena beror på det använda restriktionsenzymet. Givetvis är det inte nödvändigt att en kloningsvektor, som är användbar för denna uppfinning, skall ha ett restriktions- ställe för införande av det valda DNA-fragmentet, utan kloningsvektorn kan istället kopplas till fragmentet med alternativa metoder som är välkända på 462 046 s 10 15 20 25 30 35 området.

Användbara bakterievärdar för syftena med föreliggande uppfinning kan exempelvis innefatta stammar av Escherichia, Bacillus och Staphylococcus, t.ex.

E. coli och Bacillus subtilis. Bland bakterievärdarna är sådana av den gramposi- tiva typen att föredra för syftena med föreliggande uppfinning på grund av deras mindre komplicerade cellvägg, som endast innehåller ett membransystem och således medger sekretion av det producerade protein A-materialet genom detsamma, såsom kommer att förklaras närmare nedan. På grund av sin icke- patogena natur får jordbakterien Bacillus subtilis anses som särskilt användbar som slutvärd vid föreliggande uppfinning. Det ligger emellertid även inom ramen för uppfinningen att transformera redan protein A-producerande stammar av t.ex. S. aureus med den protein A-kodande rekombinantmolekylen enligt uppfinningen för att mångfaldiga antalet protein A-kodande gener i S. aureus- cellema.

I en föredragen utföringsform av hybrid-DNA-molekylen enligt förelig- gande uppfinning är DNA-sekvensen som kodar för den önskade protein A- produkten kopplad till en ledar- eller signalsekvens som kodar för en signalpeptid.

En sådan signalpeptid, som bildar en förlängning av den amino-terminala änden av den önskade -protein- eller polypeptidprodukten, krävs för att den trans- formerade mikroorganismen skall sekretera den syntetiserade produkten genom sitt membran. Den produkt som sålunda syntetiseras inuti cellen genom expression av den införda extrakromosomala genen blir då en prekursor till den önskade produkten. Under sekretionsprocessen genom cellväggen avklyvs signal- peptiden, och endast det färdiga protein A eller aktiva derivatet därav utsöndras till det omgivande mediet. En bakterie som transformerats med en gen innehållande en sådan signalsekvens kommer således inte endast att syntetisera protein A eller det aktiva derivatet därav utan även utsöndra det till odlingsmediet. Härigenom undanröjs nödvändigheten att bryta sönder cellerna för att utvinna protein A-produkten, och isoleringen därav underlättas och görs effektivare, vilket gör det möjligt att få en produkt med förbättrad renhet. Ett antal signalpeptider, liksom motsvarande DNA-sekvenser, för både grampositiva och gramnegativa bakterier är kända och kan användas vid uppfinningen.

Vid föreliggande uppfinning är det lämpligast att använda signal-DNA- sekvensen från den protein A-gen som erhålls från den S. aureus-stam som 10 15 20 25 30 35 9 - 462 046 används som donator-DNA-sekvens. I detta fall införs DNA-sekvensen som kodar för motsvarande protein A-produktprekursor, dvs. den önskade protein A- produkten fuserad till sin signalpeptid, i en kloningsvektor för framställning av hybrid-DNA-molekylen enligt uppfinningen. Om man emellertid önskar använda någon annan signalsekvens, som är mer funktionell i en speciell värd, kan en sådan signalsekvens införas i den kloningsvektor som används vid uppfinningen med i och för sig välkända metoder, som inte kommer att beskrivas här.

Företrädesvis används även promotorsekvensen från donator-stafylokock- stammen, och kan införas l kloningsvektorn tillsammans med signalsekvensen och den protein A-kodande sekvensen, vilket exempelvis blir fallet när hela den protein A-kodande genen, från promotor till stoppkodon, från stafylokock- stammen införs i kloningsvektorn. Andra promotorer kan givetvis också användas, såsom promotorn från någon naturligt förekommande vektor eller en vektor modifierad genom införandet av någon kraftig extern promotor.

DNA som kodar för ett aktivt polypeptidfragment av protein A enligt definitionen ovan kan erhållas genom att man inför en DNA-sekvens innefattande något lämpligt stoppkodon i den protein A-kodande genen med i och för sig välkända metoder. Stoppkodonet kan t.ex. införas så att endast den del av genen som kodar för den IgG-bindande aktiviteten translateras. Expression av genen producerar sedan en polypeptid motsvarande den IgG-aktiva delen av protein A- molekylen.

DNA som kodar för oligomera former av protein A eller IgG-aktiva polypeptidfragment av protein A-molekylen kan erhållas genom kombination av DNA-fragment som kodar för protein A eller IgG-bindande aktivitet till en kombinerad gen som kodar för en sådan dimer, trimer etc. Expression av den resulterande genen kommer således att producera en protein A-oligomer med ökad IgG-bindande aktivitet jämfört med den normala protein A-molekylen. Sätt att åstadkomma sådan kombination av DNA-fragment är i och för sig kända och kommer inte att beskrivas här.

Den protein A- eller polypeptidprodukt som produceras i enlighet med föreliggande uppfinning kan utvinnas med konventionella tekniker. När exempel- vis produkten sekreteras genom cellmembranet, vilket är den föredragna utföringsformen, kan produktisolering utföras med konventionella immuno- sorbentmoder. Om produkten uppfångas i periplasmautrymmet mellan de båda cellmembranen, såsom i gramnegativa bakterier, kan ett osmotisk chock- förfarande användas för att frigöra produkten till odlingsmediet, där den kan isoleras som ovan. När slutligen protein- eller polypeptidprodukten kvarhålls inuti 462 046 10 10 15 20 25 30 35 cellen, såsom är fallet när inte någon signalpeptid för produkten syntetiseras, måste cellerna brytas sönder innan t.ex. immunosorbentisolering kan utföras.

Sådan sönderbrytning av cellväggarna kan exempelvis åstadkommas genom pressning, ultrasonikering, homogenisering, skakning med glaspärlor, etc.

Uppfinningen kommer nu, endast som illustration, att beskrivas mer i detalj i de följande ej begränsande exemplen, som visar kloning i _E_._<_:9_li_ av protein A-genen från en stafylokockstam med cellväggsassocierat protein.

Hänvisning kommer att göras till de bifogade ritningarna.

I ritningarna är: Fig. l en schematisk illustration av en cirkulär restriktionskarta för ett plasmid-DNA (pSPAl) som kodar för protein A. Storleken på kartan ges i kilobaser med början vid Egg RI-restriktionsstället vid klockan 12, vilket är restriktionsstället i vektorn pBR322. Lägena för restriktionsställena för _E_c_o_ RI, gg RV, _l:l_in_d Ill, gst I och _B_a_rn H1 är angivna. Förbindelsepunkterna mellan vektorn och det införda DNA är angivna med pilar; Fig. 2A är en schematisk illustration av den protein A-kodande genen med angivande av dess olika områden. Tjock linje representerar DNA från vektorn pBR322. S är en signalsekvens, A-D är IgG-bindande regioner som tidigare identifierats, E är en region homolog med A-D, och X är den C- terminala delen av protein A som saknar IgG-bindande aktivitet; Fig. 2B är en detaljerad restriktionskarta för DNA-sekvensen motsvaran- de Fig. 2A. Storleken ges i kilobaser med början vid samma _l_.=._<_:_g RI-restriktions- ställe som anges i Fig. l. Förbindelsepunkten mellan vektorn pBR322 och det införda DNA-fragmentet är angiven med en pil. Restriktionsställena för Ia_qI (två) och lisa I (ett) inuti vektorsekvenserna har utelämnats; Fig. 3 visar bassekvensen för 5'-änden av protein A-genen. Två möjliga promotorer (-35 och -l0) och en möjlig Shine-Dalgarno-sekvens (angiven med "=") är angivna. Den aminosyrasekvens som härletts från DNA-sekvensen visas också (lUPAC-aminosyraförkortningarna används; J. Biol. Chem. 291, 527 och 2491 (1966)). De tre aminosyror (resterna 99, 101 och 120) som skiljer sig jämfört med den av Sjödahl ovan rapporterade aminosyrasekvensen anges liksom de åtta rester (av 50) i region E som skiljer sig från motsvarande aminosyra i region D, Startresterna i regionerna S, E, D och A är angivna med pilar. Det exakta läget för början av region D har emellertid inte bestämts; Fig. 4 är en autoradiograf av en nukleotidsekvensgel som visar förbindelsestället mellan regionerna D och Ei Fig. 3. Sekvensning (enligt Maxam et al, P.N.A.S. ZQ, 560-561! (1977)) utfördes på ett DNA-fragment märkt i §ç_l_ I- centrat i position 0,9 kb i Fig. 2. De partiellt kemiskt nedbrutna produkterna 10 15 20 25 30 35 11 462 046 uppseparerades i en 896 polyakrylamid-sekvensningsgel (Maizel et al, Methods in vir. g, 179-246 (197o)); Fig. 5 visar SDS-polyakrylamidgelelektrofores av IgG-SepharoséÉ-renade cellextrakt. pBR322 och pSPAl representerar extrakt av E. coli-celler som innehåller respektive plasmid. SPA är kommersiellt tillgängligt protein A från å: apr-sus (Pharmacia, Uppsala). Adeno 2 (AD 2) proteiner användes som storleks- markörer.

Fig. 6 är en schematisk kartillustration av plasmid pSPAl5, varvid AMP och CML betecknar gener som kodar för ampicillin- resp. kloramíenikolresistens, Ori är replikationsstartpunkten och SPA betecknar protein A-strukturgenen.

Fig. 7 är en schematisk illustration av konstruktioner av plasmider som innehåller hela eller delar av protein A-genen. Några restriktionsställen visas.

Rektanglarna representerar strukturgener, och pilarna anger orienteringsrikt- ningen (frän startkodon mot stoppkodon). Replikationsstartpunkten är angiven med Ori. AMP och TET är gener som kodar för ampicillin- resp. tetracyklinresistens.

PROT A är en gen som kodar för protein A och lac Z' är en gen som kodar för den N-terminala delen av B-galaktosidas. (Rüther et al, Nucl. Acids res. 2, 4087-4098 (1981)).

Fig. 8 är en schematisk illustration av konstruktionen av plasmid pSPAl6.

“ De använda förkortningarna är desamma som i Fig. 6. S, E, D och B är som i Fig. 2 och A' och C' betecknar delar av de respektive IgG-bindande regionerna A och C i den protein A-kodande genen.

Fig. 9 är en representation av nukleotidsekvensen, och motsvarande härledda aminosyrasekvens, kring 3'-änden av protein A-genen i plasmid pSPAl6. x x x betecknar det nya stoppkodonet.

Fig. 10A-C är en kombinerad illustration, liknande Fig. 2, av plasmiderna pSPAl5 (B) och pSPAl6 (C) tillsammans med en motsvarande restriktionskarta (A) inordnad parallellt därmed. Den kraftiga linjen representerar protein A- strukturgenen.

I Exemplen använda utgângsmaterial, buffertar, cellmedier och rutin- metodssteg var som följer.

UTGÅNGSMATERIAL Bakterievärdar. Tre stammar av E. coli K 12 användes i Exemplen: HBIOI, beskriven av Boyer et al, J. Moi. Biol. fi, 459-472 0969); 259, beskriven av Jacob, F. och Wollman, E.C., Ann. Inst. Pasteur gl, 486-510 0956); och GM l6l, beskriven av Marinus, M.G., Molec. gen. Genet. lä, 47-55 (l973); RRI del Ml5 (Langey et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Q, 1254-1257 (1975)) 462 046 12 (stammarna finns tillgängliga vid Institutionen för Mikrobiologi (N), Biomedi- cinska Centrum, Uppsala). Även följande fyra Staphylococcus-stammar användes: S. epidermidis 247, beskriven av Rosendorf gi, J. Bacteriol. _l__2_Q: 679-686 5 (1974); erhâllen från Institutionen för Medicinsk Mikrobiologi, Universitetet i Zürich, Schweiz; I S. xylosus KL1l7, beskriven av Schleifer e_.t_¿al, Int. J. Syst. Bacteriol. 25: 50-61 (1975) och Schleifer 131, Arch. Microbioi. 22: 93-101 (l979); erhâllen frân Institutionen för Mikrobiologi, Tekniska Universitetet i München, Västtyskland; 10 S. aureus SAl13, beskriven av lordanescu 3131 (J. Gen. Microbioi. _9__6_: 277-281 (1979): S. aureus 320, en protein A-negativ mutant av stammen S. aureus 113 isolerad vid Institutionen för Mikrobiologi, Biomedicinska Centrum, Uppsala.

Kloningsvektorer. De kloningsvektorer som användes i Exemplen var 15 pBR322 konstruerad och beskriven av Bolivar et al, Gene _2_, 95-113 (1977); pBR328 konstruerad och beskriven av Soberon, X., et al, Gene 2, 287-305 (1980); pTR262 konstruerad och beskriven av Roberts, T.M., et al, Gene _12, 123-127 (l980); pI-IV14 konstruerad och beskriven av Ehrlich, S.D., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA _7_Q, 3240-3244 (1978): pHV33 konstruerad och beskriven av Michel, B., et al, 20 Gene _12, 147-154 (l980); och pUR222 konstruerad och beskriven av Rüther et al, Nucl. Acids Res., 2, 4087-4098 (1981).

BUFFERTAR OCH MEDIER 1¿1=t=<>=r==-¿n=i=><== o,1% Triton x-ioø, 0,125 M som och 20 mM Tris (pl-l 8,0) 25 Tris-EDTA-buffert 3333:: 0,001 M EDTA och 0,01 M Tris (pH 7,8) gšëlàzàllgràg: Difco kaseinhydrolysat 196, Difco jästextrakt 196 och glukos 0,596; 4 ml l,5M glycerol- » fosfat sätts till 100 ml CY-buljong 30 gggggggiggggígggr: 1,59 g Na2co3, 2,93 g NaHco3 och 0,2 g (karbonat- NaNB, uppfyllt till 1 liter med destillerat vätekarbonat - pH 9,6): H20 8,0 g NaCl, 0,2 g KHZPOQ, 2,9 g Na HPO# x (fosfatbuffrad saltlösning 12 H20, 0,2 g KCl, 0,5 ml TWEE 0 och 35 plus 0,05% TWEE : 0,2 g NaN3, uppfyllt till I liter med destil- 1 lerat H20; pH 7,4 10 15 20 25 30 l, 462 046 Dietanolaminbuffert 10%: 97 ml dietanolamin, 800 ml destillerat H20, 0,2 g NaN3, och 100 mg MgClz x 61-120; pH justerat till 9,8 med 1 M HCl; uppfyllt till l liter med destillerat H O 2 1___.g§i=ag_-_b=u__lj__o_r1_g_ 10 g Difco trypton, 5 g Difco jästextrakt, " ("1.ß")= 0,5 g Naci, 2 m1 1M NaoH; justera: 1111 pH 7,0 med 1 M NaOH; 10 ml 2096 glukos tillsatt efter autoklavering LA-medium : 0.09 M Tris-borat, 0,09 M borsyra och 0,002 M EDTA RUTINMETODER Vissa förfaranden utfördes upprepade gånger i Exemplen. Såvida inte annat speciellt anges, utfördes de exakt som följer varje gång de utfördes.

Transformationer. Transformation av E. coli K12, med plasmid-DNA, utfördes exaktsåsom beskrivs av Morrison, D.A., Methods in Enzymology, Academic Press _§§, 326-331 (1979). De transformerade cellerna utvaldes på konventionellt sätt på plattor genom utstrykning för enskilda kolonier på LA-plattor innehållande lämpliga antibiotika, t.ex. 35 ug/ml ampicillin eller 25 ug/ml kloramfenikol.

Isolering av plasmider. Storskalig plasmidframställning utfördes exakt såsom beskrivs av Tanaka, T. och Weisblum, B., J. Bacteriol. _l_2_l_, 354-362 (1975). För testning av ett stort antal kloner med avseende på plasmider användes "minialkalimetoden" ("the mini alkali method") exakt sådan den besë-:rivs av ßirnbøim, H.c. och Doiy, J., Nuci. Acids Res. Z, 1513-1523 (1979).

Restriktionsenzymklyvning av DNA. DNA klövs med konventionella restriktionsenzymer köpta från New England Bio Labs, Waltham, MA, USA.

Restriktionsenzymerna sattes till DNA vid konventionella koncentrationer och temperaturer och med buffertar rekommenderade av New England Bio Labs.

Llgering av DNA-fragment. Alla DNA-fragment ligerades vid llloC över natten med TI; DNA-ligas köpt från New England Bio Labs, Waltham, MA., USA, i en buffert rekommenderad av leverantören.

Agarosgelelektrofores. ' 0,796 agarosgel-elektrofores för separation av kluvna plasmidfragment, "super com-plasmider, och DNA-fragment med 1000 till 10.000 Luria-buljong kompletterad med 196 Difco agar 462 046 11+ 10 15 20 25 30 35 nukleotiders längd utfördes exakt som beskrivs av I-lelling et al. J. Vir. _l_ll_, l235- 1244 (1974).

Polyakrylamidgelelektrofores. separation av 100 till 4.000 nukleotider långa DNA-fragment utfördes exakt som beskrivs av Maxam et al, P.N.A.S. _72, 560-564 (1977). 1396 polyakrylamidgel- 596 Polyakryiamidgel-elektrofores för elektrofores för separation av proteiner med molekylvikter från 5.000 till' 120.000 utfördes exakt som beskrivs av Maizel et al, Methods in Vir. 2 179-246 (1970).

Geleluering. DNA-fragment eluerades från antingen polyakrylamid- eller agarosgelstycken exakt såsom beskrivs av Maxam et al, P.N.A.S. _7_l¿, 560-564 (1977).

DNA-sekvensbestämning. DNA-fragment 5'-ändmärktes, och deras DNA- sekvenser bestämdes exakt som beskrivs av Maxam et al, ovan. 5'-änden av endonukleasgenererade DNA-fragment märktes med (Y-BZP) ATP (New England Nuclear, USA; 2700 Ci/mmol) med användning av Til polynukleotidkinas (Boehringer, Mannheim, Västtyskland).

Beredning av cellysat för detektering av protein A. §,_c_9_l¿-kloner odlades över manen vid 37°c i so m1 Luria-buijdng (LB) med ampiciliin tillsatt vid 35 ng/ml. Efter centrifugering omsuspenderades cellerna i 5 ml Tris-EDTA (0,05 M, pH 8,5) och centrifugerades. Cellerna omsuspenderades i 5 ml av samma buffert, och lysozym tillsattes till en slutkoncentration på 2 mg/ml. Efter l timme vid 37°C centrifugerades lysatet i en Sorvall 55-34 rotor vid 15.000 rpm i 15 minuter. Supernatanten uppsamiades och analyserades med avseende på protein A.

Detektering och kvantifiering av protein A från E. coli-kloner.

Ett ELISA-test (enzyme linked immunosorbent assay) användes för ' detektering och kvantifiering av producerat protein A. Testet utnyttjar en speciell mikrotiterplatta (Titertek, Amstelstad, Nederländerna) som inte har någon nettoladdning (neutral) och vars brunnar belagts med humant IgG (Kabi).

Testproven tillsätts sedan för att tillåta protein A att bindas till Fc-delen av IgG-molekylerna. Mängden kvarvarande fria Fc-centra titreras sedan genom tillsats av alkalisk fosfatas bunden till protein A. Efter tvättning av brunnarna tillsätts nitrofenylfosfat som substrat för alkalisk fosfatas. Åryig: Brunnarna i en mikrotiterplatta fylldes med 50 ul av en lösning av humant IgG (Kabi) vid 500 ug/ml i en beläggningsbuffert, och plattan inkuberades vid rumstemperatur i l timme. Brunnarna tvättades sedan tre gånger med PBS + 0,05% TWEE 20, som användes vid alla tvättningar vid analysen, och 50 ul av det lysat som skulle 'testas tillsattes. För kvantitativa bestämningar 10 15 20 25 30 35 15 462 046 gjordes tvåfaldiga serieutspädningar av lysaten i PBS + 0,05% TWEEb® 20. 10 ul PBS + 0,196 TWEE 20 tillsattes sedan och man lät inkubera i en timme vid rumstemperatur. Brunnarna tvättades åter tre gånger, och 50 ul protein A- alkalisk fosfatas-konjugat (framställt exakt som beskrivs i lmmunochemistry, Pergamon Press 1969, Vol. 6, sid. 43-55) tillsattes. Efter 1 timmes inkubation vid rumstemperatur tvättades brunnarna åter tre gånger, och 100 ul alkalisk fosfatas-substrat (Sigma 104 = p-nitrofenylfosfat vid 1 mg/ml) tillsattes. Enzym- reaktionen avbröts efter 30 minuter genom tillsats av 10 ul 3 M NaOH.

Resultatet bestämdes visuellt. Ett positivt resultat, dvs. närvaro av protein A, är en färglös reaktionsblandning, eftersom inga fria Ec-centra hos 1gG finns tillgängliga för att binda konjugatet. Ett negativt resultat, dvs. inget protein A, observeras som en gulfärgning på grund av aktiviteten av alkalisk fosfatas i det bundna konjugatet. Kvantitativa bestämningar av protein A gjordes genom körning av tvâfaldiga serieutspädningar av en protein A-standardlösning med känd koncentration parallellt med testproven.

EXEMPEL I Kloning av protein A i E. coli A. Framställning av kromosomalt stafylokockdonator-DNA. S. aureus stam 8325-4 (011) _n¿g<_:-49l6, stí-Wló, ¿1_o_y_-ll+2 [beskriven av Sjöström,,J.-E., et al, J.

Bacteriol. 122, 905-915 (1975) och tillgänglig från Institutionen för Mikrobiologi (N), Biomedicinska centrumet, Uppsala] odlades till OD 54o=0,2 i CY-buljong. En liter cellkultur skördades genom centrifugering vid 5.000 rpm i en Sorvall GSA- rotor, omsuspenderades i 100 ml 0,996 NaCl och 10 mM Tris, pH 7,2, och centrifugerades vid 5.000 rpm i en Sorvall (ESA-rotor. Cellpelleten omsuspende- ras slutligen i 10 ml 2596 sackaros, 50 mM Tris pH 7,2, och protoplaster framställdes genom lysostafinbehandling (15 ug/ml) vid 37°C i 30 minuter.

Protoplasterna lyserades genom tillsats av 10 ml Triton-mix och 5 ml H20.

Blandningen fick stå pâ is och skakades då och då försiktigt till fullständig lys.

DNA behandlades med proteinas K (0,1 mg/ml) och SDS (natriumdodecylsulfat) (0,5%) i en timme vid 37°C följt av fem fenolextraktioner med lika stora volymer fenol, och slutligen tvâ kloroformextraktioner. Natriumacetat, pH 7,0, tillsattes till 0,3 M, och DNA utfälldes med tvâ volymer kall etanol. Precipitatet tvättades stegvis i 70, 80, 90 och 9996-ig kall etanol. Precipitatet löstes i TE-buffert genom försiktig blandning vid 37°C. Slutligen dialyserades DNA:t mot TE- buffert.

B. Partiell digerering av kromosomalt DNA och isolering av donator- fragment. Renat stafylokock-DNA från steg A digererades med olika koncentra- tioner av restriktionsenzymet Mbo l. Varje reaktion gjordes i 50 ul volym med 462 l0 15 20 25 30 35 046 M 1 ng DNA, och reaktionen stoppades genom värmeinaktivering vid 65°C i 10 minuter. Omfattningen av digereringen bestämdes genom agarosgelelektrofores.

Den koncentration av _ll_l_b_g I som gav en stor partiell klyvningsprodukt på 5 till 20 kilobaser valdes för preparativ digerering av 100 ug stafylokock-DNA i 5 ml.

Denna klyvningsprodukt värmeinaktiverades, precipiterades med etanol, löstes i 100 nl TE och sedimenterades genom en lO-3096 sackarosgradient i TE-buffert.

En Beckman Sw40 rotor användes vid 5°C, 35 rpm, i 20 timmar. Gradienten fraktionerades i 0,5 ml fraktioner, som var och en analyserades genom agarosgelelektrofores. Fraktionerna med 8-10 kb fragment slogs samman, pre- cipiterades med 2 volymer etanol och löstes i TE-buffert.

C. Digerering och alkalisk fosfatas-behandling av Vektorn pBR322. Ett ng pBR322 digererades med §_a_m_ l-II i 2 timmar vid 37°C och enzymet inaktiverades vid 65° C i 10 minuter. DNA:t behandlades med alkalisk fosfatas för eliminering av 5'-fosfatet. Denna behandling eliminerade möjligheten till religering av vektorn. Reaktionen utfördes i 50 mM Tris, pI-l 7,9, 596 DMSO och 1 enhet alkalisk fosfatas från kalvtarm vid 37°C i 30 minuter i l ml. 0,596 SDS tillsattes, och DNA fenolextraherades två gånger. Spår av fenol avlägsnades med eter, och DNA precipiterades med två volymer etanol.

D. Införande av stafylokock-DNA i pBR322, transformering av E. coli och negativ selektion med avseende på rekombinanter. Vektorn pBR322, som valdes för den ursprungliga kloningen av stafylokock-DNA, kodar för tetracyklin (tet)- och ampicillin (amp)- resistens. När pBR322 öppnas genom klyvning med _§_a_rg HI, som i steg C ovan, och ett DNA-fragment införs, så inaktiveras genen för tetracyklinresistens. Genom att testa transformanter med avseende på känslighet för tetracyklin kan man finna rekombinanter - s.k. negativ selektion. 0,5 ug pBR322, som behandlats enligt steg C, och 2 ng stafylokock-DNA, som behandlats enligt steg B, blandades och ligerades i en total volym på 25 ul över natten vid l4°C. Blandningen användes för att transformera _§_._g_c¿i 259 med selektion med avseende på ampicillinresistens (35 ug/ml). Transformanter ut- plockades och utströks på plattor innehållande 10 ug/ml tetracyklin resp. plattor innehållande 35 lg/ml ampicillin. Transformanter som växte på ampicillin men inte på tetracyklin betraktades som rekombinanter.

E. Detektering av protein A-positiva E. coli-kloner. Femhundra tetracyklin- känsliga kloner från steg D odlades som separata kolonier på LA-plattor (fram- ställda av LA-medium) innehållande ampicillin (35 ug/ml). Grupper om 25 kolonier uppsamlades och inokulerades i 50 ml LB-buljong med 35 pg ampicillin och odlades över natten. Cellextrakt bereddes genom lysozym+EDTA-behandling (såsom beskrivs under Rutinmetoder) och testades med avseende på protein A 10 15 20 25 30 35 U 462 046 med det ELISA-test som beskrivs under Rutinmetoder. En av dessa grupper av kloner var positiv, och denna positiva grupp uppdelades ytterligare i undergrupper om 5 kloner vardera och odlades och behandlades som ovan. I en sista serie tester fann man slutligen en protein A-producerande klon, _l_3_._c_:9_li SPA ll, som innehöll plasmiden pSPAl. Kulturer av denna klon har deponerats i samlingen hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Göttingen, Västtyskland, den 12 juli 1982, där den tilldelades nr DSM 2434.

F. Restriktionskarta för pSPAl. För att få information för subkloning och sekvensbestämning av den gen som kodar för protein A gjordes en restriktions- karta för pSPAl erhållet i steg E. Detta gjordes med enkla, dubbla och/eller trefaldiga digereringar med de enzymer som är angivna i Fig. 1 och 2. Fig. 2 visar en mer detaljerad karta i detta område som kodar för protein A. Summering av storlekarna för de olika restriktionsfragmenten ger en totalstorlek på 12 kb för pSPAl, och det donerade stafylokockfragmentet uppgår sålunda till 7,6 kb.

G. Subkloning av den protein A-kodande genen från pSPAl till plasmiderna pBR328 och pHVlli. För att lokalisera läget av genen konstruerades flera subkloner och testades med avseende på protein A-aktivitet. 2 tg av plasmiden pSPAl från steg E och lug pBR328 klipptes upp med restriktionsenzymet ägg RV, blandades, behandlades med Tlß-ligas och användes för att transformera _l§_.__<_:gl_í HBl0l. Klyvning, ligering och transformering utfördes såsom beskrivits ovan under Rutinmetoder. Kolonier innehållande rekombinanter utvaldes som kloramfenikolreslstenta och tetracykllnkänsliga analogt med det i steg D beskrivna sättet. Åtta kolonier av 48 av dessa hybrider upptäcktes vara protein A-positiva med användning av den ELISA-metod som beskrivits under Rutin- metoder. Restriktionsanalys enligt steg F visade att alla åtta klonerna innehöll pBR328 med ett infört 2,15 kb šggRV-fragment härrörande från fragmentet motsvarande 0,2 kb till 2,35 kb i pSPAl-restriktionskartan i Fig. l. Alla kloner hade det införda fragmentet i samma orientering, vilket gav en funktionell _t_e_t- promotorläsning in i den införda genen.

En klon som innehöll denna plasmid, betecknad pSPAB, utvaldes för ytterligare studier. För att bestämma om protein A-genen kunde transkriberas från en egen promotor använde man plasmiden pSPA3 som källa för att omklona den i plasmiden pHVll4. Denna plasmid, som är härledd från pBR322, har en 2,8 kb insats i _i-_l_i_rg III-restriktionsstället, vilket således inaktiverar tet-pro- motorn. Varje infört fragment i ägg RV-restriktionsstället i denna plasmid måste därför ha en egen funktionell promotor för att kunna transkriberas av å: coli RNA-polymeras. lug pSPAB och lug pHVll+ klipptes upp med Egg RV, blandades, behandlades med Tli-ligas och användes för att transformera _l_š_.__<_§o_l_i 462 10 15 20 25 30 35 046 m HBIOI. Klyvning, ligering och transformering utfördes såsom beskrivits ovan.

Kolonier utvaldes som ampicillinresistenta och tetracyklinkänsliga såsom beskri- vits i steg D.

Plasmider från 52 av dessa kolonier isolerades genom den under Rutin- metoder ovan angivna "minialkalimetoden" och testades genom körning på 0,796 agarosgel-elektrofores. En av dessa kloner upptäcktes vara en rekombinant av pHVlli, som hade det ovannämnda 2,15 kb Eid RV-fragmentet från pSPAB. Den klon som innehöll denna plasmid, betecknad pSPAi, befanns vara protein A- positiv, när den testades med användning av ELISA-metoden. Man drog slutsatsen, att det införda fragmentet måste innehålla en stafylokockpromotor- läsning in i protein A-genen som också är funktionell i _§¿_<å>_l_i HBlOi.

Analys av DNA-sekvensen i 5'-änden av protein A-genen.

Resultaten av subkloníngen angav att DNA-sekvensbestämningen skulle börja vid Hind III-stället i kartposition 1,4 kb om man går moturs (Fig. l). DNA- källan för sekvensanalysen var renad pSPAB. Genom att jämföra den kända proteinsekvensen för protein A (sådan den rapporterats av Sjödahl ovan) med den erhållna DNA-sekvensen kunde läget för Hind III-stället i genen lokaliseras. Som visas i Fig. 2 och 3 ligger detta restriktionsställe inom region A i protein A- molekylen. Genom ytterligare analys, enligt steg F, fann man restriktíonsställen för enzymerna _1331, _I_l_s_a I och §c_ll i kartpositionerna 0,70, 0,87 resp. 0,98 kb (Fig. 2). Dessa tre ställen användes för sekvensbestämning i den ena eller båda riktningarna, vilket i de flesta fall gav nukleotidsekvenser för båda strängarna.

Eftersom §_c_ll inte klyver DNA som renats från _§._g_c_>_l_i HBIOI, transformerades pSPA3 till stammen _E_._c_:g_l_i GM l6l som saknar enzymet D-alaninmetylas. pSPAB som återrenats från denna stam klövs med _B_c_l_ I för sekvensbestämning.

Fig. 3 visar DNA-sekvensen för stafylokock-protein A-genen från Hind III-stället i kartposition 1,4 kb och uppströms. Den aminosyrasekvens som härletts från DNA-sekvensema anges också tillsammans med de avvikande aminosyrorna jämfört med den av Sjödahl ovan föreslagna sekvensen, som gjordes på en annan stam av S. aureus (Cowan I).

Den i Pig. 3 illustrerade DNA-sekvensen visar en N-terminal region kallad E, som liknar de repeterande regionerna D-A-B-C som rapporterats av Sjödahl ovan. Denna region med 50 aminosyror har #2 aminosyror som är identiska med region D.

Region E föregås av en ledarsekvens med kännetecken för en signalpeptid innehållande en basisk region med ll aminosyror följd av en hydrofob sekvens på 23 aminosyror. Det exakta klyvningsstället är inte känt, men möjliga ställen är vid alaninresterna 36, 37 eller 42, sannolikt vid 36. Om så skulle vara fallet, hör 10 15 20 25 30 35 19 462 046 aminosyrasekvensen 37-42 till region E i protein A-molekylen. Initieringskodonet för translation är TTG i likhet med några andra rapporterade initieringskodon från grampositiva bakterier. Sex nukleotider uppströms TTG finner man en Shine- Dalgarno-sekvens (definierad i Shine, J. och Dalgarno, L., Nature (London) _2211, 34-38 (1975)) som har många särdrag gemensamma med andra grampositiva ribosombindande ställen. Ytterligare uppströms finner man två möjliga promoto- rer vid _35 och -io (Pig. 3). ' Vid beräkning av antalet nödvändiga baser för att koda för hela proteinet förefaller det som om både pSPAl och pSPA3 innehåller den fullständiga protein A-strukturgenen.

Analys av genprodukten från E. coli innehållande pSPAl. E. coli-celler innehållande pSPAl odlades över natten i 400 ml LB med tillsatt ampiciliin, 35 ug/ml. Cellkulturen centrifugerades vid 6000 rpm med en Sorvall GSA-rotor i l0 minuter, och cellpelieten tvättades i 20 ml TE (0,05 M, pH 8,5, 0,05 M EDTA) och centrifugerades åter som ovan. Denna gång omsuspenderades cellpelieten i 15 ml av en proteasinhibitorbuffert ( 0,02 M kaliumfosfat, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,596 natriumdeoxicholat, 1% Triton X-100, 0,196 natriumdodecylsulfat (SDS), och l mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)). Cellerna sonikerades sedan i en MSE- sonikator i 4x40 sekunder på ett isbad och centrifugerades vid 15.000 rpm (Sorvall 55-34 rotor) i 10 minuter. Supernatanten uppsamlades och fick passera över en IgG-Sepharos liB-kolonn (Pharmacia, Uppsala) (Hjelm et al, FEBS Lett. _2§, 73-76 (1972)) som jämviktats med en natriumacetatbuffert (0,1 M natriumacetat, 296 NaCl, pH 5,5). Kolonnen tvättades sedan med samma buffert som ovan, och det adsorberade protein A eluerades med en glycinbuffert (0,1 M glycin, 296 NaCl, pl-i 3,0). Till de eluerade fraktionerna sattes l/9 volym 100 96-13 triklorättiksyra (TCA).

Proven precipiterades i 6 timmar vid +4°C och centrifugerades vid l2.000 rpm i en Eppendorf-centrifug i l5 minuter. Pelleterna tvättades en gång i l ml kall aceton och centrifugerades sedan som ovan. De kvarvarande pelleterna torkades, löstes i TE och slogs samman, vilket gav en total volym på 400 um.

Proteinkoncentrationen bestämdes, och 20 ng analyserades på en 1396 SDS-polyakrylamidgel vid 100 V i l2 timmar. Gelen fläckades med amidosvart (0,l96, #596 metanol, 1096 ättiksyra). Ett extrakt från celler innehållande pBR322 bereddes parallellt, och samma volym som ovan analyserades på gelen.

Resultaten av gelelektroforesen visas i Fig. 5, som visar att protein A producerat i Ägg uppbärande pSPAl migrerade tätt intill rent protein A från _S¿ aureus (från Pharmacia, Uppsala). Extraktet från celler innehållande pBR322- plasmiden hade inget motsvarande protein. 462 046 m 10 15 20 25 30 35 Analys av lokaliseringen av protein A i E. coli.

Enzymer, som i grampositiva bakterier är extracellulära, är i gram- negativa bakterier ofta belägna mellan inner- och yttermembranen i det s.k. periplasmat eller periplasmautrymmet. Eftersom protein A befinner sig i cellväggen och således utanför cellmembranet i S. aureus, bestämdes lokalise' - ringen av protein A i de transformerade E. coli-celler som innehöll pSPAl. För I detta ändamål använde man det osmotiska chockförfarande som beskrivs av Heppel, L. A., Science _l_§§, l45l-lll55 (1967). Detta förfarande frisätter proteiner från periplasmautrymmet men inte intracellulära enzymer. Alkalisk fosfatas användes som exempel på ett protein som återfinns i periplasma- utrymmet, och fenylalanin-tRNA-syntetas som exempel på ett intracellulärt protein. §.__c¿o§ innehållande pSPAl odlades i ett lågfosfatmedium (exakt som beskrivs av Neu, i-LG. och Heppel, I..A., J. Biol. Chem. 252, 3685-3692 (1965)) för att hämma syntesen av alkalísk fosfatas. En liter av en övernattskultur (ungefär 7,5 x 108 CFU/ml) uppdelades i två portioner. En portion tvättades tre gånger i kall 0,01 M tris-HCl-buffert, pl-I 8,1, och cellerna omsuspenderades i 20 ml 2096 sackaros-0,03 M Tris-HCl, pH 8,1, lmM EDTA. Efter 10 minuter på en rotationsskakare vid rumstemperatur centrífugerades blandningen i 10 minuter vid 13.000 x g i en Sorvall-Centrifug. Supernatanten avlägsnades, och den väl torkade pelleten blandades snabbt med 20 ml kall 5 x 1045,! MgClz-lösning.

Suspensionen blandades i isbad på en rotationsskakare i 10 minuter och centrifugerades. Supernatanten, som kallas "osmotisk chock-tvätt" uppsamlades för ytterligare testning. Som jämförelse centrifugerades, tvättades och omsus- penderades den andra portionen av celler i 5 ml polymix-buffert (I) [exakt som beskrivs av Jelenc, P.C., Anal. Biochem. lgj; 369-374 (1980) Cellerna desintegrerades i en X-press enligt tillverkarens rekommendationer (Biotec, Stockholm). Celldebris avlägsnades genom centrifugering vid 13.000 rpm i _15 minuter i en Sorvall SS-Blß-rotorcentrifug och supernatanten uppsamlades för ytterligare testning.

De båda erhållna extrakten, som innehöll periplasmiskt resp. helcell- protein, analyserades vardera med avseende på alkalisk fosfatas och fenylalanin- tRNA-syntetas med de nedan angivna enzymatiska analyserna, och med avseende på protein A såsom beskrivits ovan under Rutinmetoder.

Enzymatiska analyser Alkalisk fosfatas analyserades i en Tris-buffert, 0,05 M, pH 8,0, med användning av p-nitrofenylfosfat (4 x IO_4M) som substrat (Sigma 104). Hydro- lysen av p-nitrofenylfosfat uppmättes en spektrofotometer vid 410 mp. En 10 15 20 25 30 35 21 462 046 aktivitetsenhet representerade en förändring i absorbans vid 410 mp på 1,0 per minut (Heppel, L.A., Harkness, D.R. och Hilmoe, R.J., Biol. Chem. _2_3_7_, 841-846 (1962)).

Fenylalanin-tRNA-syntetas Analysen utfördes i en blandning, som i en total volym på 100 ul innehöll: 5 mM Mg(OAC)2, 0,5 mM CaClz, 95 mM KCl, 5mM Nl-lqCl, 8 mM putrescin, 1 mM spermidin, 5 mM K-fosfat, pH 7,5, 1 mM ditioerytritol, 1 mM ATP, 6 mM fosfoenolpyruvat, 1 pg pyruvatkinas (Sigma, St. Louis, USA), 1 enhet myokinas (Sigma), 100 uM (MQ-fenylalanin (ü cpm/-mol) (Radiochemical Centre, Amersham, England), 300 pg totalt _l§.__c_<_>_l_i-tRNA (Boehringer/Mannheim, Väst- tyskland). I Det X-pressade cellextraktet och den osmotiska chock-tvättlösningen testades genom tillsats av 10 ul av lämpliga utspädningar. Enzymanalyserna kördes i 15 minuter vid 37°C. Kall 10 96 TCA tillsattes för att avbryta reaktionen och för att precipitera fenylalanin-tRNA. Precipitatet uppsamlades på glasfiber- filter, (GFA, Whatman), tvättades med 1096 kall TCA och kall 7096 etanol och radioaktiviteten mättes. En aktivitetsenhet definieras som bildningen av 1 pmol Phe-tRNA per minut (Wagner, E.G.l-l., Jelenc, P.C., Ehrenberg, M. och Kurland, c.c., Eur. J. ßieehem., _1_2g, 193-197 (1932)).

Resultaten presenteras i den följande Tabell I. Alla figurer i tabellen är beräknade per soo m1 eemruirur (ee. 7,5 x 108 cFu/ml).

Tabell 1 Enzymaktiviteter och protein A-halti E. coli-celler innehållande pSPAl Periplasma från celler Hela celler Alkalisk fosfatas (enheter) 160 210 Fenylalanin-tRNA-syntetas (enheter) 0 1530 Prerem A (nya 24-48 24-4: a Eftersom bestämningen görs i tvâfaldiga serieutspädningar presenteras mängderna som liggande inom omrâdet för tvâ utspädningssteg.

Tabell 1 visar att protein A och alkalisk fosfatas frisattes, när cellerna utsattes för osmotisk chock, medan inte någon aktivitet för det intracellulära enzymet fenylalanin-tRNA-syntetas detekterades i osmotisk chock-tvättlös- ningen. Detta resultat indikerar att S. aureus-signalsekvensen, som enligt sekvensdata (Fig. 3) är närvarande i det klonade DNA, uttrycks i §_._c9_li_, och att 462 046 10 15 20 25 30 35 22 signalpeptiden igenkänns av membranet. I en grampositiv bakterie, som saknar det yttre membranet, som t.ex. Bacillus subtilis, skulle signalpeptiden med största sannolikhet ha åstadkommit sekretion av protein A till odlingsmediet.

De mängder av protein A som produceras av de _E'_.__c_g§- celler som innehåller plasmiden pSPAl är ca 1-2 mg/liter medium.

EXEMPEL H Kloning av protein A i olika stafylokockstammar I. Konstruktion av "shuttle"-vektorer som innehåller protein A-genen Två "shuttle"-vektorer som innehåller protein A-genen konstruerades för att möjliggöra replikering både i E. coli, S. aureus och koagulasnegativa stafylokocker. Plasmidvektorn pI-lV33 baserad på stafylokockplasmiden pCl94 användes, vilken uttrycker ampicillin- och tetracyklinresistens i E. coli och kloramfenikol-resistens i stafylokocker.

A. Konstruktion av "shuttle"-vektorplasmiden pSPAIS (Fig. 6) Den första "shuttle"-vektorn konstruerades genom kloning av det protein A-gen-innehållande 2,1 kb Egg RV-fragmentet frân Exempel I, steg G, ovan i Egg RV-klyvningsstället hos plasmiden pHV33. 2 pg av plasmid pSPAB, från steg G i Exempel I ovan, och l ug av pHV33 klövs med Egg RV, blandades, behandlades med Tll-ligas och användes för att transformera _E._ç_c¿li l-IBIOI. Klyvningen, ligeringen och transformeringen utfördes såsom beskrivits ovan under Rutin- metoder. Kolonier som innehöll rekombinanter utvaldes som ampicillin-resistenta och tetracyklin- och kloramfenikol-känsliga analogt med det sätt som beskrivits i steg D i Exempel I. Restriktionsanalys enligt steg F i Exempel I visade att av 8 testade kloner innehöll samtliga den plasmid som schematiskt visas i Fig. 6. Alla kloner hade det införda DNA-fragmentet i samma orientering som i plasmiden pSPAB (se steg G, Exempel I). En klon som innehöll denna plasmid, betecknad QSPAU, utvaldes för ytterligare studier. Denna plasmid befanns innehålla hela protein A-strukturgenen, som kodar för ett färdigt protein med 447 aminosyror och en beräknad molekylvikt på 119.604.

B. Konstruktion av "shuttle"-vektorplasmiden pSPAló (Fig. 8) Bl šabßlflzfzifzsflx .ßlšaflsn ai/.Pæsdfià-sefismfsfßßâlälidasmidællšáå fö: sfflëlsfids .wzlfisfnisleåñêš lFiad) lug av plasmid pSPAl (se Fig. i) från steg E i Exempel I och lug av plasmid pTR262 klövs med restriktionsenzymerna gig III och gg I, blandades, behandlades med Tlß-ligas och användes för att transformera E: g9_l_i l-lBlOl.

Klyvningen, ligeringen och transformeringen utfördes såsom beskrivits ovan under Rutinmetoder.

Plasmid pTR262 innehåller en lambdarepressorgen, som vid expression 10 15 20 25 30 35 462 046 23 inaktiverar genen för tetracyklinresistens. Lambdarepressorgenen har ett ll_i_r¿c_i III-ställe, och införande av en DNA-sekvens i den senare inaktiverar därför lambdarepressorgenen och aktiverar tetracyklinresistensgenen. Plasmid pTR262 medger sålunda positiv selektion med avseende på tetracyklinresistenta rekom- binanter.

Kolonier som innehåller rekombinanter selekterades sålunda som tetra- cyklinresistenta. En koloni av 20 av dessa rekombinanter upptäcktes vara protein A-positiv med användning av den under Rutinmetoder ovan beskrivna ELISA- metoden. Restriktionsanalys visade att den innehöll vektorplasmiden pTR262 med ett infört protein A-gensegment om 2,1 kb härrörande från fragmentet motsva- rande 0,0 till 2,1 kb i pSPAl-restriktionskartan i Fig. 1 och 2B. Denna plasmid betecknades ¿S_E_>1_*\_2_ och visas schematiskt i Fig. 7. Den har ett unikt 2st]- restriktionsställe i 3'-änden av det protein A-genfragment som kommer att användas i det följande steg B5. 52 fsamfifëllflifls stef.Efïfkëasmsfrfafmeflshêllsfæsfiëaê-swsn 100 ug av plasmid pSPA5 från steg G i Exempel I ovan klövs med restríktionsenzymet §_c_o RV i 1 timme vid 37°C. Detta gav upphov till två DNA- fragment, nämligen det införda DNA-fragmentet innehållande protein A-genen (2,1 kb) mellan positionerna 0,2 kb och 2,3 kb i Fig. 2B och vektorn pHVl-ï (7,2 kb). Denna klyvningsblandning värmeinaktiverades, utfälldes med etanol, löstes i 100 ul TE och sedimenterades genom en 10-3096 sukrosgradient i TE- buffert. Man använde en Beckman SWlm-rotor vid 5°C, 35.000 rpm, i 20 timmar.

Gradienten uppdelades i fraktioner om 0,5 ml, vilka var och en analyserades med agarosgelelektrofores. De fraktioner som innehöll 2,1 kb-fragmentet slogs sam- man, precipiterades med 2 volymer etanol och löstes i TE-buffert. Som framgår av Fig. 2A och B innehåller fragmentet, förutom hela protein A-genen, en E: _c_oli_-sekvens härrörande från plasmiden pBR322 och en stafylokockgenrest.

BB .Faamatêfllflifls eLsfLQNßfl-'Lasmeflt Ssmifmshšlls:sadslavææsflflfljt gfiflen 5 ng av det renade 2,1 kb-fragmentet från steg B klövs med restriktions- enzymet _S_ag 3A i l timme vid 37°C. En preparativ 896 polyakrylamidgel- elektrofores i 'FEB-buffert kördes på klyvningsblandningen. Gelen färgades med etidiumbromid (l tig/ml), och ett DNA-fragment på ungefär 600 baspar utskars.

Detta fragment motsvarar delen av genen mellan positionerna 1,15 och 1,8 kb i Fig. 2B. DNA:t eluerades över natten vid 37°C i 5 ml TE + 0,3 M NaCl. Eluatet fick passera över en kolonn innehållande ungefär 300 ul sedimenterat DE-52 (Whatman, England) jämviktat med 5 ml TE. Efter en 2 ml tvättning med TE + 0,3 M NaCl eluerades DNA med 2 volymer av vardera 0,5 ml TE + 0,6 M NaCl. 462 10 15 20. 25 30 35 046 .24 Eluatet som innehöll DNA-fragmentet späddes med l volym TE, precipiterades med etanol och löstes i TE-buffert. Det resulterande renade protein A-gen- fragmentet har kohesiva ändar motsvarande ett §_¿a_u BA-restriktionsställe och ett mellanliggande gig III-ställe. ß* .Faamfifšllflifls svßëfstvLa-afffliallßåë Plasmid pUR222 är en kommersiellt tillgänglig vektor som innehåller den gen som kodar för enzymet B-galaktosidas (lac Z). Genen innehåller en multilinker med flera restriktionsställen, såsom _l2s_t I, §§_r_n_ Hl och _E_g_c_> RI.

Eftersom B-galaktosidas lätt kan påvisas med enzymatiska analyser, kan rekombinanter med ett DNA-fragment infört på ett av restriktionsställena lätt fastställas med användning av lämpliga värdstammar. Ofta används Xgal-plattor (Xgal är ett kromogent substrat, S-brom-lß-klor-B-indolyl-B-D-galaktosid, som frisätter ett blått indolylderivat vid klyvning med B-galaktosidas), på vilka B- galaktosidas-negativa rekombinanter visar sig som vita kolonier till skillnad från den blågröna färgen för kolonier som innehåller plasmider utan något infört fragment.

För att klyva plasmiden pUR222 i den B-galaktosidas-kodande genen för att ge kohesiva ändar komplementära med de kohesiva ändarna hos protein A- fragmentet i steg BB för införande av detsamma i plasmiden, använde man ßín Hl-restriktionsstället. l ug av pUR222, levererad av Boehringer-Mannheim, Tyskland, behandlades med restriktionsenzymet ägg l-ll i l timme vid 37°C, varpå enzymet inaktiverades vid 65°C i 10 minuter. Denna klyvningsberedning användes sedan i det följande steget B5 för ligering med protein A-fragmentet. ßf fí<>_fl§ff_fl'_<ë°2_av_smmèflflpëlaflfá _P§P_^_1!¿ _=2f=1_ifl_f=sh_å1_1s_f.1>§Efï2_ BCILPIÄZÉZ. lflë; Zl 200 ng pUR222 digererat med §__a_rg H1, såsom beskrivs i steg Bli, och 200 ng eluerat protein A-fragment, såsom också beskrivs i steg B2, blandades och lígerades i en total volym om 20 ul över natten vid +l4°C. Enzymet inaktiverades vid 65°C i 10 minuter, precipiterades med etanol och löstes i TE-buffert. Hela DNA-blandningen innehållande bl.a. rekombinantplasmider med det i B-galak- tosidasgenen införda protein A-fragmentet klövs med restriktionsenzymerna find III och §_s_tI i l timme vid 37°C i den rekommenderade bufferten för find HI. Detta klyver rekombinantplasmiden i B-galaktosidasgenen _(_l_>¿t I) och i protein A-genen III) vilket ger två fragment, nämligen ett litet fragment bestående av en mindre B-galaktosidas-DNA-sekvens kopplad till den del av protein A-genfragmentet som sträcker sig från _S_ag BA-stället i position 1,15 kb till _l_-l_i¿1_c_l lll-stället i Fig. 2B, och ett större fragment bestående av återstoden av 10 15 20 25 30 35 462 D46 25 rekombinantplasmiden, som innefattar huvuddelen av B-galaktosidas-genen kopp- lad till det protein A-genfragmentet som sträcker sig från III-stället till §_a_u BA-stället i position 1,8 kb i Fig. 2B. Som framgår av Fig. 7 har 8- galaktosidas-fragmentet ett EQ RI-restriktionsställe nära fusionspunkten med protein A-fragmentet (Ägg l-ll-stället). 200 ng plasmid pSPAZ från steg Bl klövs med restriktionsenzymerna Llfld III och Eg I på samma sätt som ovan för att klyva plasmiden (se Fig. 7) i tre fragment, nämligen ett fragment som sträcker sig från gig III-stället beläget mellan Tet-genen och 5'-änden av protein A-genen till III-stället inuti protein A-genen, ett protein A-genfragment som sträcker sig från det senare Hind III-stället till 2st I-stället i 3'-änden av protein A-genen, och ett större fragment av pTR262-ursprung som innefattar resten av plasmiden.

De båda ovan framställda klyvningsberedningarna inaktiverades vid 65°C i 10 minuter, blandades och precipiterades med etanol. DNA:t löstes i lige-rings- buffert och behandlades med Tll-ligas. Den önskade rekombinantplasmiden innehåller det ovannämnda större fragment, som erhölls vid klyvning av pUR222- rekombinanten, infört i pSPAZ mellan _ij_ig_d lll-stället inuti protein A-genen och 2st I-stället och innefattande 5'-änden av protein A-genen, varvid en del därav således härrör från pSPAZ och den andra har sitt ursprung i pUR222- rekombinanten. Plasmiden är vidare ampicillin- och tetracyklinresistent och skall ge blå färg på Xgal-plattor såsom kommer att förklaras nedan.

Den ligerade DNA-blandningen användes därför för att transformera å _g>_l_i RRI del Ml5. Klyvning, ligering och transformering utfördes såsom beskrivits ovan. Rekombinanter utströks på Xgal-plattor innehållande ampicillin och tetracyklin. En av klonerna var ljusblå, och restriktionsanalys utfördes på dess plasmid. Detta avslöjade en plasmid, betecknad ESPAIO (Fig. 7), som består av delar av plasmid pUR222, plasmid pTR262 och protein A-genen som härrör från plasmid pSPAl och som har ett unikt Eco RI-ställe i genens nedströmsände. Även om plasmid pSPAIO inte innehåller hela lac Z-genen som kodar för B-galaktosidas utan endast den gen som kodar för dess a-fragment (lac Z'), är den aktiv vid klyvning av Xgal-substratet och ger därigenom blå färg vid de ovan använda betingelserna. Detta sker på grund av en komplettering mellan a- fragmentet som kodas av plasmiden och en kromosomal genprodukt som innehåller det karboxiterminala fragmentet av B-galaktosidas, vilket resulterar i ett aktivt enzym. Den ovan använda värdstammen _E_.___c_gQ RRI del Ml5 har sådant kromosomalt genmaterial och kompletterar därför det cin-fragment som produceras av pSPAl0-plasmiden till en aktiv B-galaktosidas-molekyl. 462 10 15 20 25 30 35 046 26 BG šabßmifzssx hfïaslsa afetsb ßßsflsindsæeflsaàplasfniá eåRåâåfëf ßeßafwhfßß anelëmisfßâäflå is; D l pg av det renade 2,1 kb protein A-fragmentet från steg B2 ovan behandlades med restriktionsenzymet jag I i l timme vid 60°C för att klyva det inom DNA-fragmentet av stafylokockursprung. Enzymet inaktiverades genom extraktion med en lika stor volym fenol följt av upprepad eterextraktíon, och. slutligen precipiterades DNA:t med etanol och löstes i TE-buffert. l ug plasmid pBR322 klövs med restriktionsenzymerna _C_la I och l_5_<_:g RV (som klyver på samma sätt och således ger komplementära kohesiva ändar) i 1 timme vid 37°C i E32 I-ll-buffert och värmeinaktiverades sedan i l0 minuter vid 65°C. DNA-proven blandades, ligerades och användes för att transformera E. coli HBlOl såsom beskrivits ovan under Rutinmetoder. Transformanter utströks på ampicillin (35 ug/ml). Kolonier utplockades till plattor som innehöll 10 ug/ml tetracyklin resp. 35 pg/ml ampicillin. Transformanter som växte på ampicillin men inte på tetracyklin betraktades som rekombinanter. Fyra kolonier av l2 av dessa rekombinanter upptäcktes vara protein A-positiva med användning av den under Rutinmetoder beskrivna ELISA-metoden. Restriktionsanalys, där renad plasmid klövs med en, två eller tre restriktionsenzymer, utfördes på en av dessa kloner.

Den resulterande restriktionskartan för denna plasmid, betecknad pilïAÄ, visas i Fig. 7. Den sålunda konstruerade plasmiden saknar varje som helst E. coli- promotor uppströms protein A-genen och protein A-genfragmentet föregås endast av sin egen stafylokockpromotor. ß? Eaflsfsßßtiws! elsfiiflidæšâfilá iFis-.Q En andra "shuttle"-vektor konstruerades som kodar för ett stympat protein A (dvs. som saknar X-regionen). Konstruktionen anges schematiskt i Fig. 8. 5 pg av plasmid pSPAIO från steg B5 ovan klövs med _E_<_:9_l_2_I_ och _l-_l_i_r_tdl_ll, och ett 0,4 kb fragment utskars från en 5 96-ig polyakrylamidgel efter elektrofores.

Fragmentet eluerades och renades såsom beskrivits ovan under Rutinmetoder. 5 ug av plasmid pSPAS från steg B6 ovan behandlades på samma sätt, och ett 0,7 kb fragment isolerades och renades. Slutligen klövs 2 ug av plasmid pHV33 med _E_c_o_lg, behandlades med alkalisk fosfatas och blandades med de båda renade DNA-fragmenten. Efter behandling med TlI--ligas användes DNA-fragmenten för att transformera _l§_.__cgli HBl0l. Klyvningen, behandlingen med alkalisk fosfatas, lígeringen och transformeringen utfördes såsom beskrivits ovan under Rutin- metoder. Restriktionsanalys av 12 ampicillinresistenta kloner påvisade en klon som innehöll plasmid pHV33 med ett l,l kb fragment infört på Eco Rl- klyvningsstället. Plasmiden, betecknad pSPAl , visas schematiskt i Pig. 8. Fig. 9 visar den nukleotidsekvens, och de därur härledda aminosyror, som föregår 10 15 20 25 30 35 462 046 27 stoppkodonet i denna stympade protein A-gen. Det sålunda producerade färdiga protein, som saknar region X, innehåller 274 aminosyror, vilket ger en beräknad molekylvikt på 30.938. Denna stympade protein A-molekyl, som visas schema- tiskt i Fig. 10, innehåller samtliga IgG-bindande delar av protein A intakta med undantag av den C-terminala delen av region C.

II. g Retransformation av shuttle-vektorerna pSPA15 och pSPA16 i E. coli De i avsnitt I ovan konstruerade shuttle-vektorerna pSPA15 och pSPA16 retransformerades i E. coli l-1Bl0l med selektion för ampicillin-resistens (50 ug/ml) som i sektion 1. Transformanter testades med avseende på protein A- produktion med det ovan under Rutinmetoder beskrivna ELISA-testet. Plasmid- DNA isolerades från protein A-positiva kloner som innehöll respektive plasmider såsom också beskrivits ovan under Rutinmetoder.

III. Transformation av stammar av S. aureus, S. xylosus och S. epidermidis ^- Efsæëëliima 90111f§f§å°Lff1a112fL=1fæsfælsëes!â-safsleâêëâ Olika arter och även stammar av stafylokocker innehåller olika restrik- tions- och modifieringssystem, och de flesta stammar uppbär flera av dem (jfr.

Stobberingh, E.E., och K. Winkler, J. Gen. Microbiol. 22: 359-367 (1977) och Sjöström, J.-E. _e_t__a_l, J. Bacteriol. _l__3_2: 1144-1149 (1978)).

Detta orsakar problem när plasmid-DNA isolerat från §._cg_l_i skall införas i stafylokocker genom transformation.

För att övervinna restriktionsproblemet använder man därför en restrik- tionsbristmutant av S. aureus 8325, kallad §_A_1_1_3_, som ursprungligen isolerats av Iordanescu _6111 (J. Gen. Microbiol. _96: 277-281 (1976)) för att utföra primära transformationer i S. aureus av plasmid-DNA som isolerats ur _l_';'_._<_:g1_i HB101.

Ursprungsstammen SA113 är lysogen för profagerna D11, D12 och D13 och lysogeniserades ytterligare med fag 83A. Stammen har följande standardfagtyp: 29/47/75/85. För att minska restriktionen ytterligare upphettades protoplasterna vid 56°C i 30 sekunder omedelbart före tillsatsen av DNA (cf. Asheshov _e_t_â1, J.

Gen. Microbiol. _31: 97-107 (1963), och Sjöström, J.-E. _e_t_a_l, Plasmid å: 529-535 (1979)).

De metoder och medier som användes för att framställa protoplasterna var huvudsakligen de som beskrivs för Bacillus subtilis av Wyrick och Rogers, J.

Bacteriol. _l_1_§: 456-465 (1973) med de modifieringar som anges av Chang och Cohen, Mol. Gen. Genet. _1_6§: 111-115 (1979). Emellertid infördes vissa modifieringar för stafylokocker beskrivna av Lindberg i J. Jeljaczewicz: Staphylococci and Staphylococcal Infections, Zbl. Bakt. Suppl. iQ: 535-541; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart-New York (1981) och Götz gííl, J. Bacteriol. gg: 74-81 (1981). 462 046 zs 10 15 20 25 30 35 Tio ml-prover av S. aureus SA113, som odlats i Trypticase Soy Broth (BBL, Cockeysville, Md., USA) till den stationära fasen (ungefär 2 x 109 koloni- bildande enheter per ml) skördades och suspenderades till samma volym i ett hypertoniskt buffrat medium (HBM) bestående av 0,7 M sackaros, 0,02 M Na- maleat och 0,02 M MgClz, pH 6,5 justerat med NaOH, plus 43 g Difco Penassay buljongpulver (Difco Lab., Detroit, Michigan, USA) per liter. Lysostafin (Schwarz/Mann Orangeburg, N.Y., USA) och lysozym (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) tillsattes vid slutkoncentrationer om 20 resp. 2.000 ug/ml, och cellsuspensionerna inkuberades vid 37°C med försiktig skakning. Lysozym är inte nödvändigt för eliminering av cellväggen, men det hjälper till att separera protoplasterna som i likhet med intakta stafylokockceller har en tendens att aggregera. Denna inkubering fortsattes tills absorbansen vid 540 nm blev konstant, vilket vanligtvis skedde inom 3 timmar. De återstående intakta bakterierna och celldebris pelleterades genom centrifugering vid 2.500 x g i 10 minuter. Supernatanterna uppsamlades och centrifugerades åter vid 16.000 x g i 10 minuter. De pelleterade protoplasterna omsuspenderades i HBM till 1/10 av startkulturens volym. 0,4 ml-suspensioner av de framställda SMB-protoplaster- na i HBM (ungefär 2 x 107 cellväggsgenererande protoplaster per ml) transforme- rades med _l§_._c_c>_l_i-plasmid-DNA från steg H ovan på följande sätt. 10-20 pg av protein A-positivt plasmid-DNA tillsattes i en maximal volym av 20 ml under försiktig blandning. 2 ml 4096 PEG 6000 (förrådslösning av polyetylenglykol (PEG) framställd genom upplösning av 40 g PEG med en molekylvikt av 6.000. (PEG 6000) i 100 ml hypertonisk buffert (l-lB): 0,7 M sackaros, 0,02 M Na-maleat, och 0,02 M MgClz, pH 6,5 justerat med NaOl-l) tillsattes omedelbart, och följdes 2 minuter senare av 8 ml HBM. Suspensionen centrifugerades vid 48.200 x g i 15 minuter. De pelleterade protoplasterna omsuspenderades sedan i lml HBM, och efter lämpliga utspädningar i HBM utströks prov på plattor för regenerering av cellväggen. Regenereringsmediet var DMB, ett Casamino Acids-jästextrakt-bovinserumalbumin-medium som innehöll 0,5 M natriumsuccinat och 8 g agar per liter enligt Chang och Cohen, Mol. Gen.

Genet. _l_6_§: lll-115 (1979). För selektion av kloramfenikol-resistenta transfor- manter användes CY-buljong (Novick, R.P., J. Gen. Microbiol. ä: 121-136 (1963)) med 0,5 M natriumsuccinat, 0,02 M MgClz, 0,08% bovinserumalbumin, och 4 g agar per liter som mjukagarbeläggning med kloramfenikol för att ge en slutkoncentration pâ 10 ug/ml i helagarmediet. Fenotypisk expression tilläts vid 37°C i 3 timmar före tillsatsen av mjukagar med kloramfenikol. Plattorna inkuberades vid 37°C i 3 dagar. Kloramfenikol-resistenta transformanter omströks på TSA-plattor (Trypticase Soy Agar) med kloramfenikol (10 pg/ml). 10 15 20 25 30 35 462 046 . 29 B- Dsfslfifzrba avæmfáaê Ett kvalitativt protein A-test utfördes genom att man utströk transfor- manter på hjärn-hjärt-infusionsagar-plattor ("BHl"-agarplattor) (Difco Lab., Detroit, Michigan, USA) med 196 hundserum. Protein A-produktion detekterades som en ring av utfällt IgG-protein A-komplex runt kolonierna (Kronvall, G. gt a_l., J. Immunol. _l_l_)_l¿: 140 (1970)). Recipientstammen S. aureus SAll3 gav mycket låga mängder protein A, nästan utan någon detekterbar ring kring kolonierna.

C- E@f_fl§ä11_ffl_flaav_|>la§ff_flë-P§ê Plasmid DNA framställdes ur de i steg A ovan erhållna protein A- producerande SAIIB-transformanterna med en snabbkokningsmetod såsom be- skrivs av Holmes gt_al (Anal. Biochem. _1_l_l¿: 193 (1981)) med undantag av att lysozym ersattes med lysostafin i en slutkoncentration på 50 tig/ml.

D- IEnsßzfnaseflavstflivßßæßa Följande stafylokockstammar transformerades med plasmiderna pSPAl5 och pSPAl6 såsom beskrivits ovan i steg A för S. aureus SAll3: Staphxlococcus aureus U320, en protein A-negativ mutant av stammen _S_¿ 5125593 SAll3 isolerad vid Institutionen för Mikrobiologi, Biomedicinska Centrum, Uppsala; Staphylococcus epidermidís 247, en koagulasnegativ stafylokock som inte producerar protein A; Staphxlococcus xXlosus KLl17, en koagulasnegativ stafylokock som inte produce- rar protein A.

IV. Framställning av protein A kodat av plasmiderna pSPAIS och pSPA16 Transformanter erhållna i steg lllA och D ovan odlades i Trypticase Soy Broth berikad med tiamin (l mg/liter), nikotinsyra (1,5 mg/liter), och Ca- pantotenat (1,5 mg/liter), och produktionen av såväl extracellulärt som cell- väggsbundet protein A bestämdes. Cellväggsbundet protein A är den mängd protein A som frigörs efter total lys av l ml tvättade celler i den stationära tillväxtfasen (ungefär 8 x 109 CFU/ml), och extracellulärt protein A är mängden protein A i odlingsmediet.

Cellväggsassocierat protein A mättes kvantitativt genom testning av bindningen av lzjl-märkt human-IgG till cellerna (Kronvall, G., J. of Immunol. _1213 273-278 (1970)) eller genom användning av det under Rutinmetoder ovan beskrivna ELISA-testet efter fullständig lys av cellerna med lysostafin.

Extracellulärt protein A mättes med användning av ELISA-testet.

S. aureus-stammarna Cowan I och A676 användes som referensstammar för framställning av cellväggsbundet resp. extracellulärt proteinA.

Stam Cowan I har varit typstammen för studier av cellväggsbundet 462 046 10 30 protein A [Nordström K., Acta Universitatis Upsaliensis, Abstracts of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 271 (1977)). Små mängder protein, dvs. extracellulärt protein A, återfanns i odlingsmediet, sannolikt på grund av autolys.

Stam A676 ger endast extracellulärt protein A [Lindmark g_t__z_1l, Eur. J.

Biochem. _72: 623-628 (1977)) och används av Pharmacia AB, Uppsala, för industriell framställning av protein A.

Resultaten redovisas i Tabellerna 2 och 3 nedan. Alla värden i Tabellerna är korrigerade för celldensiteter och sålunda direkt jämförbara.

TABELL 2 Framställning av cellväggsbundet protein A i olika stafylokockarter kodat av plasmid pSPAl5 Cellväggs- Extra- bundet cellulärt Bakterie- protein A protein A stam 96 96 Staphzlococcus aureus: Cowan I 100 12 l l3 l , 5 ll3 (pSPAl5) 3 0,3 U320 0 U320 (pSPA15) 50 6 Staphylococcus epidermidis: 247 0 0 247 (pSPA15) 3 0,3 Staphxlococcus xzlosus: KLll7 0 0 KLll7 (PSPAIS) 3 0,3 I Tabell 2 är mängden cellväggsbundet protein A i stam Cowan I satt som 10096 motsvarande utspädning 1/256 vid ELISA-testet och lika med 120 mg protein A/liter lysostafinbehandlad kultur. Alla andra siffror i Tabellen hänför sig till denna siffra. 10 15 462 046 31 i TABELL 3 Framställning av extracellulärt protein A i olika stafylokockarter kodat av plasmid pSPAl6 Extra- Cellväggs- cellulärt bundet Bakterie- protein A protein A stam 96 96 Staphxlococcus aureus: A676 100 0 1 13 0 1 , 5 113 (pSPAló) 3 1,5 U320 0 0 U320 (psPme) wo o Staphylococcus epidermidis: 247 0 0 247 (pSPAl6) 12 0 Staphzlococcus xzlosus: KLl 1 7 0 KL1 17 (pSPA1 6) 25 I Tabell 3 är mängden protein A i odlingsmediet (dvs. extracellulärt protein A) satt som 10096, motsvarande utspädning 1/256 vid ELISA-testet och lika med 90 mg protein A/liter medium. Alla andra siffror i Tabellen hänför sig till denna siffra.

Som framgår av Tabellerna 2 och 3 ovan är det protein A som kodas av plasmid pSPAl5 väsentligen cellväggsbundet, medan väsentligen allt det stympa- de protein A som kodas av plasmid pSPA16, som saknar region X, sekreteras till odlingsmediet.

Av Tabell 3 ovan framgår dessutom att S. aureus-signalsekvensen även fungerar i andra stafylokockarter än S. aureus, såsom S. epidermidis och §¿ 319312- Staphxlococcus xzlosus används som starterkultur för framställning av "Rohwurst" fLiepe, H.-U., Forum Mikrobiologie 2; 10-15 (1982), Fisher 3131, Fleischwirtschaft Q: 1046-1051 (1980) och kan sålunda anses vara en apatogen stafylokockart. Av detta skäl kan S. xzlosus innehållande den klonade protein A- genen utgöra ett alternativ till S. aureus för industriell framställning av protein A. 462 lO 15 20 046 32 En protein A-producerande klon av Staphylococcus xylosus KLII? innehållande plasmiden pSPAló har deponerats i samlingen hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM), Grisebachstrasse 8, 3400 Göttingen, Västtyskland, den 15 augusti 1983, där den fick nr DSM 2706.

Givetvis är de mängder protein A som framställts i de ovanstående exemplen inte maximala utbyten på något som helst sätt. Således ligger det inom kompetensen för varje fackman på området att öka utbytena, t.ex. genom lämpligt val av näringsmedium etc.

Medan utföringsformer av uppfinningen redovisats ovan, så är uppfin- ningen givetvis inte begränsad till dessa, utan många variationer och modifiering- ar av förfarandena och rekombinanterna enligt denna uppfinning är möjliga utan att man avviker från dess omfattning sådan den definieras av de efterföljande patentkraven.

Exempelvis är uppfinningen även avsedd att omfatta kloningsvektorer som innehåller mer än en separat deoxinukleotidsekvens som kodar för det önskade proteinet eller den önskade polypeptiden. Vidare är uppfinningen avsedd att även omfatta hybrid-DNA-molekyler, som innehåller deoxinukleotidsekvenser ehållna från vilken källa som helst, inklusive naturliga, syntetiska eller halvsyntetiska källor, som är relaterade till de deoxinukleotidsekvenser som kodar för protein A eller något aktivt fragmentdärav enligt definitionen ovan, genom mutation, innefattande enkla eller multipla bassubstitutioner, deletíoner, insertioner och inversioner.

Claims (7)

1. 0 15 20 25 30 33 462 046 1. Hybrid-DNA-vektor, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar minst en från en stam av Sgggnglgggggns gyrggfi härrörande DNA-sekvens som kodar för en aminosyrasekvens motsvarande protein A eller ett polypeptidfragment därav med förmåga att binda åtminstone ett immunoglobulin vid Fc-delen, varvid nämnda DNA/aminosyrasek- vens innefattar minst en sekvens GCTGATGCGCAA AlaAspAlaGln TATGAAATCTTG TyrGluIleLeu TTCATTCAAAGT PheIleGlnSer GGTGAAGCTAAA GlyGluAlaLys CAAAATAACTTC GlnAsnAsnPhe AACATGCCTAAC AsnMetProAsn CTTAAAGACGAC LeuLysAspAsp AAATTAAACGAA LysLeuAsnGlu GACAAAGATCAA AspLysAspGln TTAAACGAAGCG LeuAsnGluAla CCAAGCCAAAGC ProSerGlnSer TCTCAAGCACCG SerGlnAlaPro CAAAGCGCCTTC GlnSerAlaPhe CAACGTAACGGC GlnArsAsnGly ACTAACGTTTTA ThrAsnValLeu AAA Lys, eller analog därtill.

2. Hybrid-DNA-molekyl enligt patentkravet 1, k 8 n n e t e c k n a d av att nämnda DNA-sekvens omedelbart före den strukturella DNA-sekvensen för protein A eller polypeptidfragmentet därav innefattar en signal-DNA-sekvens som kodar för en cellmembranpáverkande signalpeptid, företrä- desvis signal-DNA-sekvensen i stafylokockdonatorns protein A- kodande gen.

3. Hybrid-DNA-molekyl enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a d av att nämnda DNA-sekvens innefattar promotorsekvensen i stafylokockdonatorns protein A-kodande gen.

4. Hybrid-DNA-molekyl enligt något av patentkraven 1 till 3/ k ä n n e t e c k n a d av att nämnda DNA-sekvens från E¿ ggli SPA 11, DSM nr. 2434. härrör

5. Sätt att framställa en hybrid-DNA-molekyl enligt något 462 046 34 10 15 20 25 30 35 av patentkraven 1 till 4, kännetecknat av att man på ioch för sig känt sätt inför en från en stam av figgphglggggggfi ggrggg erhållen DNA-sekvens, som kodar för en aminosyrasekvens motsvarande protein A eller ett polypeptidfragment därav med förmåga att binda åtminstone ett immunoglobulin vid Fc-delen, varvid nämnda DNA/aminosyrasekvens innefattar minst en sekvens eller analog därtill, i en kloningsvektor, varvid förfarandet GCTGATGCGCAA AlaAspAlaGln TATGAAATCTTG TyrGluIleLeu TTCATTCAAAGT PheIleGlnSer GGTGAAGCTAAA GlyGluAlaLys CAAAATAACTTC GlnAsnAsnPhe AACATGCCTAAC AsnMetProAsn CTTAAAGACGAC LeuLysAspAsp AAATTAAACGAA LysLeuAsnG1u GACAAAGATCAA AspLysAspGln TTAAACGAAGCG LeuAsnGluAla CCAAGCCAAAGC ProSerGlnSer TCTCAAGCACCG SerGlnAlaPro CAAAGCGCCTTC GlnSerAlaPhe CAACGTAACGGC GlnArsAsnGly ACTAACGTTTTA ThrAsnValLeu AÄÄ LYSI eventuellt innefattar ett eller flera subkloningssteg.

6. Bakterie, kännetecknad av att den på i-och för sig känt sätt transformerats med en därmed förenlig hybrid-DNA-molekyl innefattande minst en sekvens GCTGATGCGCAA AlaAspA1aGln TATGAAATCTTG TyrGluIleLeu TTCATTCAAAGT PheIleGlnSer GGTGAAGCTAAA GlyGluAlaLys CAAAATAACTTC GlnAsnAsnPhe AACATGCCTAAC AsnMetProAsn CTTAAAGACGAC LeuLysAspAsp AAATTAAACGAA LysLeuAsnGlu eller analog därtill.

7. k ä n n e t e c k n a d av att den är en grampositiv bak- GACAAAGATCAA AspLysAspGln TTAAACGAAGCG LeuAsnGluAla CCAAGCCAAAGC ProSerGlnSer TCTCAAGCACCG SerGlnAlaPro Bakterie enligt patentkravet 6, terie. k ä n n e t e c k n a d av att den är en Slâflhylnßnssnfi- Bakterie enligt patentkravet 7, CAAAGCGCCTTC GlnSerAlaPhe CAACGTAACGGC GlnArsAsnGly ACTAACGTTTTA ThrAsnValLeu AAA Lys, 10 15 20 25 30 35 462 046 stam. 9. Sätt att framställa en transformerad bakterie enligt patentkravet 7 eller 8, kännetecknat av att man på i och för sig känt sätt i en bakterie inför en hybrid-DNA-molekyl innefattande minst en sekvens GCTGATGCGCAA AlaAspAlaGln TATGAAATCTTG TyrGluIleLeu TTCATTCAAAGT PheIleGlnSer GGTGAAGCTAAA GlyGluAlaLys CAAAATAACTTC GlnAsnAsnPhe AACATGCCTAAC AsnMetProAsn CTTAAAGACGAC LeuLysAspAsp AAATTAAACGAA LysLeuAsnGlu GACAAAGATCAA AspLysAspGln TTAAACGAAGCG LeuAsnGluAla CCAAGCCAAAGC ProSerGlnSer TCTCAAGCACCG SerGlnAlaPro CAAAGCGCCTTC GlnSerAlaPhe CAACGTAACGGC GlnArsAsnGly ACTAACGTTTTA ThrAsnValLeu AAA LYS , eller analog därtill, varvid förfarandet eventuellt innefat- tar åtminstone ett subkloningssteg. 10. Sätt att framställa protein A eller ett derivat därav med förmåga att binda åtminstone ett immunoglobulin vid Fc- delen, kännetecknat av att man på i och för sig känt sätt odlar en bakterie transformerad med en hybrid-DNA-mole- kyl innefattande minst en sekvens eller analog därtill, i ett lämpligt näringsmedium och isole- GCTGATGCGCAA AlaAspAlaGln TATGAAATCTTG TyrGluIleLeu TTCATTCAAAGT PheIleGlnSer GGTGAAGCTAAA G1yGluAlaLys CAAAATAACTTC GlnAsnAsnPhe AACATGCCTAAC AsnMetProAsn CTTAAAGACGAC LeuLysAspAsp AAATTAAACGAA LysLeuAsnGlu GACAAAGATCAA AspLysAspGln TTAAACGAAGCG LeuAsnGluAla CCAAGCCAAAGC ProSerGlnSer TCTCAAGCACCG SerGlnAlaPro rar den bildade protein A-produkten. CAAAGCGCCTTC GlnSerAlaPhe CAACGTAACGGC GlnArsAsnGly ACTAACGTTTTA ThrAsnValLeu AAA I-YS ,