DE3390105T1 - Rekombinantes DNA-Molekul, transformierter Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von Protein A - Google Patents

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PHARMACIA AB
Uppsala, Schweden

Rekombinantes DNA-Molekül, transformierter Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von Protein A

Die Erfindung betrifft rekombinante Deoxyribonucleinsäure bzw. Rekombinationsdeoxyribonucleinsäure, welche für Protein A oder ein aktives Derivat davon kodiert, wie auch ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Erfindung betrifft ebenfalls einen transformanten Mikroorganismus, welcher derartige rekombinante Deoxyribonucleinsäure einschließt, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung für die Herstellung von Protein A oder eines seiner aktiven Derivate.

Protein A ist eine Zellwandkomponente des Bakteriums Staphylococcus aureus, welches im folgenden als S. aureus bezeichnet wird, und zeichnet sich durch eine spezifische serologische Reaktion mit Säugetierimmunoglobulinen aus.

Im Gegensatz zu den normalen Antigen-Antikörper-Reaktionen bindet jedoch Protein A den Fc-Teil aller Subklassen humanen Immunoglobulins Typ G oder IgG, ausgenommen IgG₃, wobei der Fab-Teil davon für Antigen- und Haptenkupplung / freigelassen wird. Diese Eigenschaft hat bewirkt, daß Pro-

tein A eine weitverbreitete Verwendung sowohl bei quantitativen als auch bei qualitativen immunochemischen Techniken besitzt. An einen Träger kovalent gebunden, ist Protein A somit ein ausgezeichnetes Immunosorbens für die Isolierung von IgG. Weiterhin hat die Komplexierung von Protein A am IgG gezeigt, daß das Komplementsystem aktiviert wird, und kürzlich wurde Protein A bei der Behandlung von Krebs und Immunokomplexstörungen untersucht, indem man die IgG-Komple xe aus dem Blutplasma damit entfernte.

Protein A, dessen genaue Struktur in Abhängigkeit von seinem Ursprung variieren kann, besitzt, wie in der Literatur berichtet wurde, ein Molekulargewicht von etwa 42 000 und eine stark ausgedehnte Form. Die Sequenzanalyse hat zwei

.15 funktionelle und strukturell unterschiedliche Regionen des Moleküls angezeigt. Der N-terminale Teil mit einem Molekulargewicht von 27 000 besteht aus vier oder fünf aufeinanderfolgenden und stark homologen IgG-Bindungseinheiten, wovon jede ein Molekulargewicht von etwa 7 00 0 aufweist.

Der C-terminale Teil des Proteins, der ein Molekulargewicht von etwa 15 000 besitzt, ist eine Region, die kovalent an den Peptidoglykanmolekülteil der Zellwand gebunden ist und gar keine Fc-Bindungsfähigkeit hat. Eine vorgeschlagene primäre Struktur für den Fc-Bindungsteil von S.-aureus-Protein A ist in Sjödahl, J., Eur. J. Biochem. 7_3_, 343-351 (1977) und T8_' 471-490 (1977) angegeben.

Die Biosynthese von Protein A findet während der exponentiellen Wachstumsphase statt. Die Hauptmenge des Proteins ist an die Zellwand gebunden, jedoch gibt es in der stationären Wachstumsphase immer eine gewisse Freigabe, bedingt durch Autolyse. Das Protein A kann von solchen S.-aureus-Stämmen durch Digestion mit dem Enzym Lysostaphin und anschließende Affinitätschromatographie an Agarose mit daran gebundenem IgG freigesetzt werden. Es gibt weiterhin Stämme von S. aureus, die Protein A nicht in die Zellwand ein-

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arbeiten können, wobei alles gebildete Protein A in das Wachstumsmedium abgeschieden wird. Eine solche extrazellulare Produktion von Protein A bei methicillinresistenten Stämmen ist üblich und erleichtert natürlich die Isolierung des Proteins A.

Die Erzeugung von Protein A aus Stämmen von S. aureus besitzt jedoch zwei Hauptnachteile. Der eine ist die pathogene Natur der Bakterien, die besondere Sicherheitsvorkehrungen beim Züchtungsverfahren erfordert, und der zweite sind die relativ geringe Mengen an Protein A, die von den derzeit verwendeten S.-aureus-Stämmen gebildet werden. Es besteht daher ein großer Bedarf an einem Mikroorganismus, der Protein A oder ein aktives Derivat davon erzeugen kann, wobei dieser Mikroorganismus einerseits weniger oder bevorzugt nicht pathogen sein soll und andererseits eine erhöhte Produktion von Protein A ergibt. Ein derartiger Mikroorganismus wird durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt.

Die vorliegende Erfindung, die auf dem sogenannten Gebiet der Gentechnologie liegt, betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, welches eine Deoxyribonucleotidsequenz, die die genetische Information für Protein A oder ein aktives Derivat davon enthält, umfaßt, d.h. es ist fähig, mindestens einen IgG-Fc-Teil daran oder Vorstufen daran zu binden. Ein solches rekombinantes DNA-Molekül oder ein sogenannter Hybridvektor kann in irgendeinen geeigneten Wirtmikroorganismus eingeführt werden, der dann unter Bildung des gewünschten Protein-A-Materials gezüchtet werden kann. Durch geeignete Auswahl des DNA-Transfervektors wie auch des Wirtmikro organismus kann ein transformierter Mikroorganismus erhalten werden, der einerseits nichtpathogen ist und andererseits wesentlich größere Mengen an Protein A ergibt als die bis heute verwendeten S.-aureus-Stämme, bedingt durch eine Selbstreplikation der Vektor-DNA in den Wirtzellen, wobei

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eine vielfache Menge an Genen, die für Protein A kodieren, erzeugt wird.

Die relativ neue rekombinante DNA-Technologie oder Gentechnologie, auf die oben Bezug genommen wurde, erlaubt die Einführung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die für ein gewünschtes Protein oder Polypeptid kodiert, in eine Bakterien- oder andere geeignete Wirtzelle und verleiht dieser dabei die gewünschte Eigenschaft. Die DNA kann durch chemisehe Synthese hergestellt werden oder aus einem anderen Bakterienstamm oder einem anderen Organismus extrahiert werden. Die Konstruktion solcher transformanten Mikroorganismen kann die folgenden Stufen umfassen: Erzeugung einer doppelstrangigen DNA-Sequenzkodierung für das gewünschte Protein oder Polypeptid; Bindung der DNA an eine geeignete Stelle in einem geeigneten Klonierungsvehikel oder Vektor unter Bildung der rekombinanten DNA-Moleküle, von denen einige das gewünschte Proteinkodierungsgen enthalten; Transformierung des geeigneten Wirtmikroorganismus mit den rekombinanten DNA-Molekülen; Screening der entstehenden Klone auf die Anwesenheit des Protein- oder Polypeptidkodierungsgens durch geeignete Maßnahmen; und Auswahl und Vervielfältigung von einem oder mehreren positiven Klonen. Gegebenenfalls können eine oder mehrere Subklonierungen durchgeführt werden, welche die Extraktion und Spaltung der Proteinkodierungs-DNA, den Einsatz der gespaltenen Fragmente in ein zweites Klonierungsvehikel oder einen Vektor und das Screening auf die Anwesenheit des Protein- oder Polypeptidkodierungsgens umfassen.

Es wurden verschiedene Bakterien sowie auch nichtbakterielle Proteine erhalten, unter Anwendung derartiger rekombinanter DNA-Technologie, hauptsächlich in Escherichia coli, gewöhnlich als E. coli bezeichnet, und in der Literatur bereits beschrieben. Keines der derzeit bekannten rekombinanten DNA-Verfahren betrifft jedoch die Synthese von Protein

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A oder protein-A-artigen Materialien wie die vorliegende Erfindung. Die Erzeugung von Protein A unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie erfordert zusätzlich, daß eine DNA-Sequenz von mindestens teilweise unbekannter Struktur, d.h. die DNA-Sequenz, die für Protein A in einem geeigneten Wirt kodiert, in einem sehr komplexen Gemisch aus DNA-Sequenzen gefunden und daraus abgetrennt wird, wie es im folgenden näher erläutert wird. Wenn die DNA-Sequenz einmal identifiziert worden ist, erlaubt die rekombinante DNA-Technologie die Möglichkeit zur Erzeugung von Mikroorganismen, die nicht nur Protein A sondern ebenfalls modifizierte Protein-A-Produkte mit Protein-A-Aktivität, wie Fragmente von Protein A und oligomere Formen von Protein A oder ihre aktiven Fragmente oder Kombinationen, ergeben, wie es im folgenden näher erläutert werden wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit einen neuen Mikroorganismus, der durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt worden ist, dieser Mikroorganismus kann Protein A oder ein aktives Derivat davon, wie es im folgenden erläutert wird, bilden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung eines solchen Mikroorganismus durch Transformation eines Wirtorganismus mit einem rekombinanten DNA-Molekül.

Die Erfindung betrifft außerdem ein rekombinantes DNA-Molekül, welches mindestens eine DNA-Sequenz, die für Protein A oder ein aktives Fragment davon kodiert, enthält, und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Protein A oder eines aktiven Derivats davon durch Züchtung des erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismus.

5 In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bedeutet der Ausdruck "Protein A" irgendein Proteinmakromolekül

mit einer analogen oder ähnlichen Struktur und immunologischen und biologischen Aktivitäten der Protein-A-Substanz, die durch Staphylococci, wie die natürlichen Stämme von S. aureus, erzeugt wird, einschließlich irgendwelcher Mutanten davon. Daher können strukturelle Variationen zwischen den verschiedenen Verbindungen auftreten. Der Ausdruck "aktives Derivat" (von Protein A) bedeutet irgendein Polypeptidfragment von Protein A, welches mindestens ein Immunoglobulin an seinem Fc-Teil binden kann, oder ein freies Fc-Fraament

TO sowie auch oligomere Formen von Protein A oder aktiven Polypeptidf ragmenten davon. Solche oligomeren Formen können zwei oder mehrere,gebundene Protein-A-Moleküle, aktive Polypeptidf ragmente oder Kombinationen davon enthalten, und sie können eine gesteigerte IgG-Bindungsaktivität, verglichen mit dem normalen Protein-A-Molekül, aufweisen. Die Aus drücke "Protein A" und "aktives Derivat" sollen weiterhin Protein-A-Moleküle und aktive Protein-A-Derivate, wie oben definiert, umfassen, die eine Nicht-Protein-A-Peptidsequenz daran gebunden aufweisen, beispielsweise bedingt durch Einsatz von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden beim Bau bzw. bei der Konstruktion des Klonierungsvehikels.

Weitere spezifische Ausdrücke, die in der folgenden Beschreibung verwendet werden (wovon einige bereits oben verwendet wurden), werden im folgenden näher erläutert.

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Nucleotid — Eine monomere Einheit von DNA oder RNA, die einen Zuckermolekülteil (Pentose), ein Phosphat und eine stickstoffhaltige heterocyclische Base aufweist. Die Base ist an den Zuckermolekülteil über ein glycosidisches Kohlenstoffatom (1'-Kohlenstoff der Pentose) gebunden, und diese Kombination von Base und Zucker ist ein Nucleosid. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U"). 10

DNA-Sequenz — Eine lineare Reihe von Nucleotiden, die aneinander über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3¹- und 5'-Kohlenstoffatomen benachbarter Pentosen gebunden sind.

Codon -- Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplet), welche über Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssignal verschlüsselt. Beispielsweise verschlüsseln die Nucleotidtriplette TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstopsignale, und ATG ist ein Translationsstartsignal.

Plasmid — Eine nichtchromosomale doppelstrangige DNA-Sequenz, welche ein intaktes "Replikon" aufweist, so daß das Plasmid in der Wirtzelle vervielfältigt wird. Wenn das Plasmid in einen unizellularen Wirtorganismus gegebenen wird, ändern sich die Eigenschaften des Organismus oder werden transformiert als Ergebnis der DNA des Plasmids. Beispielsweise transformiert ein Plasmid, welches ein Gen für die Tetracyclinresistenz (Tet) trägt, eine Wirtzelle, die zuvor gegenüber Tetracyclin empfindlich war, in eine, die dagegen resistent ist. Eine Wirtzelle, die durch ein Plasmid transformiert worden ist, wird als "Transformant" bezeichnet.

Phage oder Bacteriophage — Bakterieller Virus, wovon viele DNA-Sequenzen aufweisen, die in eine Proteinumhüllung oder -schutzüberzug eingekapselt sind.

Klonierungsvehikel bzw. Klonvehikel — Ein Plasmid, Phage-DNA oder andere DNA-Sequenz, welche sich in einer Wirtzelle vervielfältigen kann und durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonucleaserekognitionsstellen oder Restriktionsstellen ausgezeichnet ist, wo seine DNA-Sequenz auf bestimmbare Art gespalten bzw. geschnitten werden kann, ohne nennenswerten Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA, beispielsweise der Replikation, die Produktion von Umhüllungs- bzw. Einkapselungsproteinen oder Verlust des Promotors oder der Bindungsstellen, und welche einen Marker aufweist, der für die Verwendung der Identifizierung der transformierten Zellen, beispielsweise der Tetracyclinresistenz oder der Ampicillinresistenz, geeignet ist. Ein KIonierungsvehikel ist ebenfalls als Vektor bekannt.

Wirt bzw. Host — Ein Organismus, der bei der Transformation durch ein Klonierungsvehikel das Klonierungsvehikel befähigt, sich zu vervielfältigen und seine anderen biologischen Funktionen auszuüben, beispielsweise die Produktion von Polypeptiden oder Proteinen durch Expression der Gene eines Plasmids.

Klonierung — Das Verfahren, bei dem man eine Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die sich von solchen Organismen oder Sequenz ableiten, durch asexuelle Reproduktion erhält.

Expression — Das Verfahren, das ein Gen unter Bildung eines Polypeptids oder Proteins durchmacht. Es ist eine Kombination der Transkription und Translation.

Transkription — Das Verfahren zur Erzeugung von mRNA aus einem Gen.

Translation — Das Verfahren zur Erzeugung eines Proteins oder Polypeptids aus mRNA.

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Promotor — Der Bereich von DNA eines Gens, wo sich RNA-Polymerase bindet und die Transkription initiiert. Ein Promotor ist vor der Ribosomenbindungsstelle des Gens lokalisiert.

Ribosomenbindungsstelle — Der Bereich der DNA eines Gens, der für eine Stelle auf mRNA kodiert, die hilft, das mRNA an das Ribosom zu binden, so daß die Translation beginnen kann. Die Ribosomenbindungsstelle liegt nach dem Promotor und vor dem Translationsstartsignal des Gens.

Gen — Eine DNA-Sequenz, welche als Templat für mRNA eine Sequenz der Aminosäuren, die für ein spezifisches Polypeptid oder Protein charakteristisch ist, verschlüsselt. Ein Gen enthält einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsstartsignal und eine strukturelle DNA-Sequenz. Im Falle eines exportierten oder abgeschiedenen Proteins oder Polypeptids enthält das Gen ebenfalls eine Signal-DNA-Sequenz.

Expressionskontrollsequenz -- Eine DNA-Sequenz in einem Klonierungsvehikel, welche die Expression der Gene des KIonierungsvehikels kontrolliert und reguliert, wenn sie arbeitsfähig bzw. betriebsfähig an solche Gene gebunden ist.

Signal-DNA-Sequenz — Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens für ein Polypeptid oder Protein, welche als Templat für mRNA eine Sequenz von hydrophoben Aminosäuren am Aminoterminus des Polypeptids oder Proteins verschlüsselt, d.h. eine "Signalsequenz" oder "hydrophobe Führungssequenz" des PoIypeptids oder Proteins. Eine Signal-DNA-Sequenz ist in einem Gen für ein Polypeptid oder Protein unmittelbar vor der strukturellen DNA-Sequenz des Gens und nach dem Translationsstartsignal (ATG) des Gens lokalisiert. Eine Signal-DNA-Sequenz kodiert für die Signalsequenz des Polypeptids oder Proteins, welche (Signalsequenz) charakteristisch für die Vorstufe des Polypeptids oder Proteins ist.

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Vorstufe — Ein Polypeptid oder Protein, wie es innerhalb einer Wirtzelle mit einer Signalsequenz synthetisiert wird.

Stromabwärts und stromaufwärts — Bei einer Kodierungs-DNA-Sequenz ist stromabwärts die Richtung der Transkription, d.h, in der Richtung von 5' zu 3'. Stromaufwärts ist die entgegengesetzte Richtung.

Rekombinations- bzw. Rekombinanten-DNA-Molekül oder Hybrid-DNA — Ein Molekül, welches Segmente von DNA von unterschiedlichen Genomen enthält, die Ende an Ende außerhalb lebender Zellen zusammengefügt bzw. aneinandergebunden wurden und die Fähigkeit haben, einige Wirtzellen zu infizieren, und die darin gehalten werden können. 15

Strukturelle DNA-Sequenz bzw. Struktur-DNA-Sequenz — Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens, welche als Templat für mRNA eine Sequenz von Aminosäuren verschlüsselt, die für ein spezifisches vollentwickeltes Polypeptid oder Protein charakteristisch ist, d.h. die aktive Form des Polypeptids oder Proteins.

Die Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, welches eine Deoxynucleotidsequenzkodierung für Protein A, _ein aktives Derivat von Protein A oder seine Vorstufen umfaßt. Der Ursprung der Deoxynucleotidsequenz ist bei der vorliegenden Erfindung nicht kritisch. Es kann irgendeine Quelle verwendet werden, einschließlich natürlicher, synthetischer oder semisynthetischer DNA-Quellen. In der Praxis wird jedoch die Quelle für die DNA-Kodierung für Protein A ein Bakteriendonor, beispielsweise eine Protein A produzierende Staphylococcusspezies, wie ein Stamm von S. aureus, sein. Irgendwelche derartige Protein A erzeugenden staphylococcen Donoren können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für die aktiven Polypeptidfragmente von Protein A, und möglicherweise ebenfalls für das

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gesamte Protein-r-A-Molekül, können jedoch auch synthetisch erzeugte Moleküle verwendet werden bzw. in Betracht gezogen werden.

Bei der Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein geeignetes Klonierungsvehikel oder Vektor mittels eines Restriktionsenzyms gespalten werden und die DNA-Sequenz- oder -Fragmentkodierung für das gewünschte Protein A oder das aktive Protein-A-Deri vat oder ihre Vorstufen in die Spaltungsstelle eingesetzt werden, wobei ein rekombinantes DNA-Molekül erzeugt wird. Dieses allgemeine Verfahren ist per se bekannt, und verschiedene Techniken oder Verfahren zur Bindung der DNA-Sequenz an das gespaltene Klonierungsvehikel werden in der Literatur beschrieben.

Wenn staphylococce chromosomale DNA als Quelle für die in den ausgewählten Vektor einzusetzende Deoxynucleotidsequenz verwendet wird, kann sie durch Behandlung eines Staphylo coccus-Stammes mit dem Enzym Lysostaphin unter Bildung von Protoplasten, welche dann lysiert werden, und wobei dann die DNA unter Bildung einer DNA-Präparation extrahiert und isoliert wird, erhalten werden. Durch teilweise Digestion mit einem geeigneten Restriktionsenzym kann die DNA-Präpara 5 tion in Fragmente geeigneter Größe gespalten werden. Nach Behandlung des Vektors mit dem gleichen oder einem anderen Restriktionsenzym werden die Vektorspaltungsprodukte und die oben fragmentierte DNA-Fraktion vermischt und randomartig unter der Ligationswirkung eines Ligaseenzyms kombiniert. Das Screening der der Ligation unterworfenen DNA-Fragmentkombinationen kann durchgeführt werden, indem, man sie in einer geeigneten Mikroorganismenzelle, beispielsweise einem Bakterium, biologisch aktiv macht. Eine derartige Transformation ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung und wird im folgenden näher erläutert. Die transformierten Zellen, die entweder einen Vektor oder eine Kombination aus

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Vektor und staphylococcer DNA enthalten, können auf der Grundlage eines geeigneten Markers, der in dem Vektor vorhanden ist, ausgewählt werden, beispielsweise auf der Grundlage der antibiotischen Resistenz, wie Ampicillinresistenz, welche durch den Einsatz der donorchromosomalen DNA nicht geändert wird. Unter den erhaltenen Klonen können Rekombinanten auf der Grundlage eines zweiten Markers erkannt werden , der in dem Vektor vorhanden ist, beispielsweise Tetracyclinresistenz, welche durch den Einsatz der Donor-DNA beeinflußt wird und so als Anzeichen für eine transformierte Zelle dient. Auf diese Weise kann eine "Genbank" des S.-aureus-Stammes erhalten werden, welche aus einer großen Zahl, beispielsweise mehreren Hundert, von Klonen besteht, welche staphylococce DNA enthalten. Der Klon oder die Klone, die das Protein A erzeugende Gen enthalten, können durch irgendeinen geeigneten Assay für Protein A, beispielsweise nach einem ELISA-Verfahren (enzymgebundenes Immunosorbens-Assay), nachgewiesen werden. Wie oben erwähnt, können Fragmente der DNA von Protein A produzierenden Klonen in den gleichen oder einen anderen Wirtmikroorganismus subkloniert werden.

Die Klonierungsvehikel oder Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, hängen unter anderem von der Natur der zu transformierenden Wirtzelle ab, d.h. davon, ob sie ein Bakterium, Hefe oder ein anderer Fungi etc. ist. Geeignete Klonierungsvehikel können beispielsweise aus Segmenten von chromosomalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen, wie verschiedenen bekannten Bakterienplasmiden, beispielsweise Plasmiden von E. coli einschließlich pBR322 und ihrer Derivate, Phage-DNA, wie Derivaten von Phage lambda, Vektoren, die sich von Kombinationen von Plasmiden und Phage-DNAn ableiten, Hefeplasmiden, speziell konstruierten zusammengesetzten Plasmiden etc., bestehen. Die besondere Auswahl des Klonierungsvehikels hinsichtlich des besonderen Wirtes kann durch den Fachmann erfolgen. Ebenfalls kann die Stelle für den Einsatz der DNA

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innerhalb des spezifischen Klonierungsvehikels durch den Fachmann ausgewählt werden, wobei die Spaltungsstellen von dem verwendeten Restriktionsenzym abhängen. Selbstverständlich ist es bei einem Klonierungsvehikel, welches bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist, nicht erforderlich, daß es eine Restriktionsstelle für den Einsatz des gewählten DNA-Fragments aufweist, aber das Klonierungsvehikel kann stattdessen durch alternative Mittel an ein Fragment gebunden werden, welche auf diesem Gebiet gut bekannt sind.

Nützliche Wirte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können Bakterienwirte, wie Stämme von Escherichia, Bacillus und Staphylococcus, zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis und S. xylosus, Hefen und andere Fungi, Pflanzenzellen in Kultur und anderen Wirten sein. Unter den Bakterienwirten sind solche des grampositiven Typs für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, bedingt durch ihre weniger komplexe Zellwand, welche nur ein Membransystem enthält und somit die Sekretion des gebildeten Protein-A-Materials dadurch erlaubt, wie es im folgenden näher erläutert wird, bevorzugt. Wegen ihrer nichtpathogenen Natur sind beispielsweise das Bodenbakterium Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus besonders nützlich als Endwirt bei der vorliegenden Erfindung. Bei der vorliegenden Erfindung können jedoch auch bereits Protein A erzeugende Stämme, beispielsweise S. aureus, mit dem Protein-A-Kodierungsrekombinationsmolekül gemäß der Erfindung transformiert werden, um die Zahl der Protein-A-Kodierungsgene in den S.-aureus-Zellen zu vervielfältigen. Hefe (deren Genetik recht gut bekannt ist) ist ebenfalls ein bevorzugter Endwirt, der in einen Protein A erzeugenden Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rekombinanten-DNA-Moleküls wird die DNA-Sequenzkodierung für das gewünschte Protein-A-Produkt an einen Leader oder

eine Signalsequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, gebunden. Ein solches Signalpeptid, welches als Extension für das aminoterminale Ende des gewünschten Proteins oder PoIypeptids wirkt, ist für die transformierte Mikroorganismuszelle erforderlich, um das synthetisierte Produkt durch ihre Membran abzuscheiden. Das so innerhalb der Zelle durch Expression des eingesetzten extrachromosomalen Gens synthetisierte Produkt wird dann die Vorstufe für das gewünschte Produkt sein. Während des Sekretionsverfahrens durch die Zellwand wird das Signalpeptid abgespalten, und nur das vollentwickelte Protein A oder sein aktives Derivat wird in das Umgebungsmedium abgeschieden. Ein Mikroorganismus, der mit einer solchen Signalsequenz, die das Gen enthält, transformiert ist, wird somit nicht nur das Protein A oder dessen aktives Derivat synthetisieren, sondern es ebenfalls in das Kulturmedium abscheiden. Dadurch wird die Notwendigkeit, die Zellen zur Gewinnung des Protein-A-Produkts zu zerstören, vermieden und ihre Isolierung erleichtert, und es ist möglich, ein Produkt mit verbesserter Reinheit leichter zu erhalten. Eine Zahl von Signalpeptiden wie auch die entsprechenden DNA-Sequenzen sowohl für grampositive als auch gramnegative Bakterien wie auch für Hefen sind bekannt und können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bei der vorliegenden Erfindung ist es besonders zweckdienlich, mindestens was die Bakterienwirte betrifft, eine Signal-DNA-Sequenz des Protein-A-Gens zu verwenden, die von einem stapylococcen Stamm, wie S. aureus, erhalten wurde, welcher als Donor-DNA-Sequenz verwendet wird. In diesem Fall wird die DNA-Sequenzkodierung für die entsprechende Protein-A-Produkt-Vorstufe, d.h. das gewünschte Protein-AProdukt, an das Signalpeptid fusioniert bzw. angeschmolzen und in ein Klonierungsvehikel unter Herstellung des erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküls eingesetzt. Wenn es jedoch bevorzugt ist, eine andere Signalsequenz, welche in

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einem besonderen Wirt funktioneller ist, zu verwenden, kann eine derartige Signalsequenz in das Klonierungsvehikel, welches gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nach an sich gut bekannten Verfahren, welche im folgenden näher erläutert werden, eingesetzt werden.

Bevorzugt wird ebenfalls die Promotorsequenz des donorstaphylococcen Stammes verwendet und in das Klonierungsvehikel zusammen mit der Signalsequenz und der Protein-A-Kodierungssequenz eingesetzt, was beispielsweise der Fall sein wird, wenn das gesamte Protein-A-Kodierungsgen von dem Promotor bis zu dem Stopcodon des staphylococcen Stammes in das Klonierungsvehikel eingesetzt wird. Andere Promotoren können natürlich ebenfalls verwendet werden, wie der Promotor des natürlich vorkommenden Vektors oder eines Vektors, der durch Einsatz eines starken externen Promotors modifiziert worden ist.

DNA, welche für ein aktives Polypeptidfragment von Protein A kodiert, wie sie oben definiert wurde, kann erhalten werden, indem man eine DNA-Sequenz, die ein geeignetes Stopcodon enthält, in das Protein-A-Kodierungsgen nach per se gut bekannten Verfahren einführt. Das Stopcodon kann beispielsweise so eingesetzt werden, daß nur der Teil des Gens, der für die IgG-Bindungsaktivität kodiert, translatiert wird. Die Expression des Gens wird dann ein Polypeptid ergeben, welches dem IgG-aktiven Teil des Protein-A-Moleküls entspricht .

Die DNA-Kodierung für oligomere Formen von Protein A oder IgG-aktive Polypeptidfragmente des Protein-A-Moleküls kann erhalten werden, indem man die DNA-Fragmente, die für Protein A oder die IgG-Bindungsaktivität kodieren, in ein kombiniertes Gen, das für ein Dimeres, Trimeres etc. kodiert, kombiniert. Die Expression des entstehenden Gens wird so ein Protein-A-Oligomeres mit erhöhter IgG-Bindungs-

aktivität, verglichen mit dem normalen Protein-A-Molekül, ergeben. Verfahren zur Durchführung derartiger Kombinationen aus DNA-Fragmenten sind per se bekannt und werden hier nicht näher beschrieben.
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Das Protein A oder das Polypeptidprodukt, das erfindungsgemäß hergestellt worden ist, kann nach an sich bekannten Verfahren isoliert werden. Wenn zum Beispiel das Produkt durch die Zellmembran abgeschieden wird, was einer bevorzugten Ausführungsform entspricht, kann die Produktisolierung nach an sich bekannten Immunosorbensverfahren erfolgen. Wenn das Produkt in dem periplasmischen Raum zwischen zwei Zellmembranen eingeschlossen wird, wie bei gramnegativen Bakterien, kann ein osmotisches Schockverfahren angewendet werden, um das Produkt in das Wachstumsmedium freizusetzen, woraus es wie oben beschrieben isoliert werden kann. Wenn schließlich das Protein- oder Polypeptidprodukt innerhalb der Zelle zurückgehalten wird, wie es der Fall ist, wenn ein Signalpeptid für das Produkt synthetisiert wird, muß die Zelle zerstört werden, bevor beispielsweise die Immunosorbensisolierung durchgeführt werden kann. Eine derartige Zerstörung der Zellwände kann beispielsweise durch Pressen bzw. Anwendung von Druck, Ultrabeschallung, Homogenisierung, Schütteln mit Glasperlen etc. erfolgen.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nichtbeschränkenden Beispiele erläutert, in denen die Klonierung in E,-coli- und unterschiedlichen Staphylococcus-Stämmen des Protein-A-Gens von einem staphylococcen Stamm mit zellwandassoziiertem Protein erläutert. Auf die beigefügten Zeichnungen wird Bezug genommen.

In den beigefügten Zeichnungen:

Figur 1 ist eine schexnatische Erläuterung einer zirkulären Restriktionskarte einer Plasmid-DNA (pSPAl)-Kodierung
für Protein A. Die Größe der Karte wird in Kilobasen,
ausgehend von der Eco-RI-Restriktionsstelle bei 12 Uhr angegeben, welche eine Restriktionsstelle innerhalb des Vektors pBR322 ist. Die Stellungen der Eco-RI- Eco-RV-Hind-III-, Pst-I- und Barn HI-Restriktionsstellen sind angegeben. Die Verbindungen bzw. Junktionen zwischen dem Vektor und der eingesetzten DNA sind mit Pfeilen angegeben.

Figur 2Ά ist eine schematische Darstellung des Protein-A-Kodierungsgens und zeigt dessen verschiedene Regionen. Die dunklere Linie stellt die DNA des Vektors pBR322 dar. S ist eine Signalsequenz, A-D sind IgG-Bindungsregionen, die zuvor identifiziert wurden, E ist eine Region homolog zu A-D, und X ist der C-terminale Teil des Proteins A, der keine IgG-Bindungsaktivität hat.

Figur 2B ist eine detaillierte Restriktionskarte der DNA-Sequenz entsprechend Figur 2A und zeigt die Restriktionsstellen für Taq I, Hind III, Eco RV, Pst I, Bei I und Sau 3A. Die Größe ist in Kilobasen angegeben, ausgehend von der gleichen Eco-RI-Restriktionsstelle wie in Figur 1 angegeben. Die Verbindungsstelle zwischen dem Vektor pBR322 und dem eingesetzten DNA-Fragment ist mit einem Pfeil angegeben. Die Restriktionsstellen für Tag I (zwei) und Rsa I (eine) innerhalb der VektorSequenzen wurden weggelassen.

In den Figuren 3A bis D ist die Basensequenz für das strukturelle Protein-A-Gen angegeben. Zwei mögliche Promotoren (-35 und -10) und eine mögliche Shin-Dalgarno-Sequenz (angezeigt durch "=") sind angegeben. Die Aminosäuresequenz, wie sie sich von der DNA-Sequenz ableitet, ist ebenfalls aufgeführt (die IUPAC-Aminosäureabkürzungen werden verwendet; J. Biol. Chem. 241, 527 und 2491 (1966)). Die fünf Aminosäuren (Reste 99, 101, 120, 199 und 273), die sich, verglichen mit der Aminosäuresequenz, die von Sjödahl oben angegeben wurde, unterscheiden, sind angegeben wie auch die acht Reste (von 50) im Bereich E, die sich von der entsprechenden Aminosäure des Bereichs D unterscheiden. Die Startreste der Bereiche S, E, D, A, B, C und X sind durch Pfeile angegeben.

Figur 4 ist ein Autoradiograph (eine autoradiographische Darstellung) eines Nucleotidsequenzgels, wo die Verbin-

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dungssteile zwischen den Bereichen D und E der Figur 3 dargestellt sind. Die Sequenzierung (entsprechend Maxam u.a., P.N.A.S. 21' ^{560 b}is ⁵64 (1977)) erfolgte auf einem DNA-Fragment, welches an der Bcl-I-Stelle in der Position 0,9 kb in Figur 2 markiert war. Die teilweise ' chemisch abgebauten Produkte wurden in einem 8%igen Po-

lyacrylamidsequenzgel (Maizel u.a., Methqds in Vir. 5_, \ 179 bis 246 (1970)) aufgelöst bzw. aufgespalten.

Figur 5 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

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von IgG-Sepharose -gereinigten Zellextrakten. pBR322 und pSPA1 stellen Extrakte von E.-coli-Zellen dar, die das entsprechende Plasmid tragen. SPA ist ein im Handel erhältliches Protein A von S_. aureus (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Adeno-2 (AD 2)-Proteine werden als Größenmarker verwendet.

Figur 6 ist eine schematische Kartendarstellung von Plasmid pSPA15, AMP und CML und erläutert Gene, die für Ampicillin- und Chloramphenicolresistenz kodieren, wobei Ori Replikationsursprünge sind und SPA das strukturelle Protein-A-Gen bezeichnet.

Figur 7 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide, welche das gesamte Protein-A-Gen oder Teile davon enthalten. Einige Restriktionsstellen werden dargestellt. Kästen bzw. Rechtecke bedeuten Strukturgene, und die Pfeile zeigen die Orientierung (vom Startcodon in Richtung zum Stopcodon). Der Replikationsursprung wird ebenfalls durch Ori angegeben. AMP und TET sind die Gene, die für die Ampicillin- bzw. Tetracyclinresistenz kodieren. PROT A ist das Gen, das für Protein A kodiert und lac Z¹ ist das Gen, das für den N-terminalen Teil von ß-Galactosidase kodiert. (Rüther u.a., Nucl. Acids Res. 9, 4087 bis 4098 (1981)).

Figur 8 ist eine schematische Erläuterung der Konstruktion des Plasmids pSPA16. Die verwendeten Abkürzungen sind die gleichen wie in Figur 6. S, E, D und B besitzen die gleiche Bedeutung wie in Figur 2, und A¹ und C sind Tei-Ie der entsprechenden IgG-Bindungsregionen A und C des Protein-A-Kodierungsgens.

Figur 9 ist eine Präsentation der Nucleotidsequenz und der entsprechenden deduzierten Aminosäuresequenz um das 3'-Ende des Protein-Α-Gens im Plasmid pSPAi6. xxx bedeutet das neue Stopcodon.

Figuren 10A bis C sind eine kombinierte Darstellung, ähnlich wie Figur 2, der Plasmide pSPA15 (B) und pSPA16 (C) zusammen mit der entsprechenden Restriktionskarte (A), die daran angefügt ist. Die dunkle Linie bedeutet das Protein-A-Strukturgen.

Figur 11 ist eine schematische Darstellung der Sequenz-Strategie (C), die für die Sequenzierung des 1,8 kb Taq-I-Eco-RV-DNA-Fragments (B) verwendet wurde, die das Protein-A-Kodierungsgen (A) enthält, wobei man die in Figur 3 dargestellte Sequenz erhält.

In den Beispielen wurden die folgenden Ausgangsmaterialien, Puffer, Zellmedien und Routineverfahren verwendet.

Ausgangsmaterial·ien

Bakterienwirte: Vier Stämme von E. coli K12 wurden in den Beispielen verwendet: HB101, beschrieben von Boyer u.a., J. Mol. Biol. _41_, 459-472 (1969); 259, beschrieben von Jacob, F. und Wollman, E.C. Ann. Inst. Pasteur 9λ_, 486-510 (1956); GM 161, beschrieben von Marinus, M.G., Molec. gen. Genet. 127, 47-55 (1973); RRI del M15 (Langey u.a., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 72, 1254-1257 (1975)).

- ar -

(Die Stämme sind beim Department of Microbiology (N), Biomedial Centre, Uppsala, Schweden erhältlich.)

Weiterhin wurden die folgenden vier Staphylococcus-Stämme verwendet: S. epidermidis 24 7, beschrieben von Rosendorf u. a., J. Bacteriol. 120: 679-686 (1974); erhalten von Inst, of Medical Microbiology, Universität von Zürich, Schweiz; S. xylosus KL117, beschrieben von Schleifer u.a., Int. J. Syst. Bacteriol. 25: 50-61 (1975) und Schleifer u.a., Arch. Microbiol. 122: 93-101 (1979); erhalten von Inst.f.Mikrobiologie, Technische Universität München, Bundesrepublik Deutschland; S. aureus SA113, beschrieben von Iordanescu u. a. (J. Gen. Microbiol. 2£^: 277-281 (1976)); S. aureus 320, eine Protein-A-negative Mutante des Stammes

S. aureus 113, isoliert beim Department of Micorbiology, Biomedical Centre, Uppsala, Schweden und beschrieben von Jonsson u.a., Curr. Microbiol. 8^: (1983).

Klonierungsvehikel: Die in den Beispielen verwendeten KIonierungsvehikel waren pBR322, wie von Bolivar u.a., Gene 2^, 95-113 (1977) konstruiert und beschrieben; pBR328, wie von Soberon, X. u.a., Gene 9_, 287-305 (1980) konstruiert und beschrieben; pTR262, wie von Roberts, T.M. u.a., Gene 12, 123-127 (1980) konstruiert und beschrieben; pHV14, wie von Ehrlich, S.D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7JD, 3240-3244 (1978) konstruiert und beschrieben, und pHV33, wie von Primrose, S.B. und Ehrlich, S.D., Plasmid 6_, 193-201 (198,1) konstruiert und beschrieben; pUR222, wie von Rüther u.a., Nucl. Acids Res., 9^, 4087-4098 (1981) konstruiert und beschrieben.

Puffer und Medien

Triton-Gemisch: 0,1% Triton X-100, 0,125 M EDTA und 20

mM Tris (pH 8,0) Tris-EDTA-Puffer

("TE") : 0,001 M EDTA und 0,01 M Tris (pH 7,8)

CY-Brühe (Nährmedium): Difco-Casein-Hydrolysat 1%, Difco-

Hefeextrakt 1% und Glucose 0,5%; 4 ml 1,5 M Glycerinphosphat wird bis 100 ml CY-Nährmedium zugegeben

Beschichtungs- bzw.

Coating-Puffer 1,5 9 Na₃CO₃, 2.9 3 g NaHCO₃ und 0,2 g

(Carbonat - Bicarbonat - pH 9,6):

NaN.

3'
aufgefüllt

mit destilliertem

auf 1 Liter

PBS-TWEEN

8,0 g NaCl, 0,2 g KH₃PO₄, 2,9 g Na₃HPO₄

(phosphatgepuffer- χ 12 H₃O, 0,2 g KCl, 0,5 ml TWEEN 20 und te Salzlösung 0,2 g NaN₃, mit destilliertem Wasser auf plus 0,05% TWEEN^R): 1 Liter aufgefüllt; pH 7,4

Diethanolaminpuffer 1096:

Luria-Kultürmedium ("LB"):

97 ml Diethanolamin, 800 ml destilliertes H₃O, 0,2 g NaN₃ und 100 mg MgCl₃ χ 6 H₃O; pH mit 1 M HCl auf 9,8 eingestellt; mit destilliertem H₃O auf 1 Liter aufgefüllt

10g Difco-Trypton, 5 g Difco-Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 2 ml 1 M NaOH; mit 1 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt; 10 ml 20%ige Glucose nach Behandlung im Autoklaven zugegeben

LA-Medium

TEB-Puffer:

Luria-Kulturmedium mit 1% Difco-Agar supplementiert

0,09 M Trisborat, 0,09 M Borsäure und 0,002 M EDTA

Routineverfahren

Bestimmte Verfahren wurden in den Beispielenwiederholt 35 durchgeführt· Sofern nicht anders angegeben, wurden sie jedesmal genau wie folgt durchgeführt.

- ae -

Transformationen: Transformation von E. coli K12 mit Plasmid-DNA erfolgte genau, wie durch Morrison, D.Α., Methods in Enzymology, Academic Press £8, 326-331 (1979) beschrieben. Die transformierten Zellen wurden in an sich bekannter Weise auf Platten selektiert, indem man die einzelnen Kolonien auf LA-Platten, die geeignete Antibiotika, beispielsweise 35 μg/ml Ampicillin oder 25 ng/ml Chloramphenicol, enthalten, aufbrachte.

Isolierung der Plasmide; Die Präparation der Plasmide in großem Maßstab erfolgte genau, wie von Tanaka, T. und Weisblum, B. in J. Bacteriol. 121, 354-362 (1975) beschrieben. Zum Nachweis einer großen Zahl von Klonen für Plasmide wurde das "Mini-Alkaliverfahren" genau, wie von Birnboim, H.C. und DoIy, J. in Nucl. Acids Res. Ί_, 1513-1523 (1979) beschrieben, angewendet.

Restriktionsenzymdigestion von DNA: DNA wurde mit bekannten Restriktionsenzymen, die von New England Bio Labs, Waltham MA, USA gekauft wurden, gespalten. Die Restriktionsenzyme wurden zu DNA bei üblichen Konzentrationen und Temperaturen und mit Puffern, wie von New England Bio Labs empfohlen, zugegeben.

Abbindung bzw. Ligation der DNA-Fragmente: Alle DNA-Fragmente wurden bei 14⁰C über Nacht mit T4-DNA-Ligase, erhalten von New England Bio Labs, Waltham, MA, USA, in einem vom Hersteller empfohlenen Puffer abgetrennt bzw. abgebunden.

Agarosegelelektrophorese: 0,7%-Agarosegelelektrophorese für die Abtrennung der geschnittenen Plasmidfragmente, der supercoiled Plasmide und der DNA-Fragmente mit einer Länge von 1000 bis 10 000 Nucleotiden erfolgte genau, wie von Helling u.a., J. Vir. Jj4, 1235-1244 (1974) beschrieben.

- a* -25

Polyacrylamidgelelektrophorese: 5%-Polyacrylamidgelelektrophorese für die Abtrennung der DNA-Fragmente mit einer Länge von 100 bis 4000 Nucleotiden erfolgte genau, wie von Maxam u.a. in P.N.A.S. _7_i, 560-564 (1977) beschrieben. Die 13%-Polyacrylamidgelelektrophorese für die Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten von 5 000 bis 120 000 erfolgte genau, wie von Maizel u.a. in Methods in Vir. j5, 179 -246 (1970) beschrieben.

Geleluierung: Die DNA-Fragmente wurden entweder von Polyacrylamid- oder Agarosegelstücken genau, wie von Maxam u.a. in P.N.A.S. 21 560-564 (1970) beschrieben, eluiert.

DNA-Sequenzierung: DNA-Fragmente wurden am 5'-Ende markiert, und ihre DNA-Sequenzen wurden genau, wie von Maxam u.a., oben, beschrieben, bestimmt. Das 5'-Ende von aus Endonuclea-

32

se erzeugten DNA-Fragmenten wurde mit (γ- P)-ATP (New England Nuclear, USA, 2700 Ci/mmol) unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Boehringer, Mannheim, Westdeutschland) markiert.

Herstellung von Zellysat für den Nachweis von Protein A: E.-coli-Klone wurden über Nacht bei 37⁰C in 50 ml Luria-Nährmedium (LB) mit bei 35 μg/ml zugegebenem Ampicillin gezüchtet. Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen in 5 ml Tris-EDTA (0,05 M, pH 8,5, 0,05 M) erneut suspendiert und zentrifugiert. Die Zellen wurden in 5 ml des gleichen Puffers erneut suspendiert, und Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde das Lysat in einem Sorvall-SS-34-Rotor bei 15 000 Upm während 15 Minuten zentrifugiert. Der überstand wurde gesammelt und das Protein A analysiert.

Nachweis und quantitative Bestimmung des Proteins A aus E,-coli-Klonen: Ein ELISA-Test (Enzym Linked Immunosorbent Assay) (enzymgebundener Immunsorbenz-Assay) wurde für den

Nachweis und die quantitative Bestimmung von hergestelltem Protein A angewendet. Bei dem Test wird eine spezielle Mikrotiterplatte (Titertek, Amstelstad, Niederlande) ohne Nettoladung (neutral) verwendet, deren Vertiefungen mit humanein IgG (Kabi, Schweden) beschichtet sind. Testproben werden dann zugegeben, damit das Protein A an die Fc-Teile der IgG-Moleküle gebunden werden kann. Die Menge an verbleibenden freien Fc-Stellen wird dann durch Zugabe von alkalischer Phosphatase, die an Protein A gebunden ist, titriert. Nach dem Waschen der Vertiefungen wird p-Nitr ophenylphosphat als Substrat für die alkalische Phosphatase zugegeben.

Assay: Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 50 μΐ einer Lösung von humanem IgG (Kabi, Schweden) bei 500 μg/ml in einem Beschichtungspuffer gefüllt, und die Platte wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS + 0,05% TWEEN 20 gewaschen, was in allen Waschvorgängen in dem Assay verwendet wurde, und 50 μΐ des zu untersuchenden Lysats wurden zugegeben. Die quantitativen Bestimmungen der zweifachen Reihenverdünnungen der Lysate in PBS + 0,05% TWEEN 20 wurden durchgeführt. 10 μΐ PBS + 0,1% TWEEN 20 wurden dann zugegeben, und die Inkubation konnte während 1 Stunde bei Raumtemperatur ablaufen. Die Vertiefungen wurden erneut dreimal gewaschen, und 50 μΐ Konjugat von Protein A und alkalischer Phosphatase (hergestellt genau, wie in Immunochemistry, Pergamon Press 1969, Band 6, Seiten 43-52 beschrieben) wurden zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen erneut dreimal gewaschen, und 100 μΐ Substrat aus alkalischer Phosphatase (Sigma 104 = p-Nitrophenylphosphat mit 1 mg/ml) wurden zugegeben. Die Enzymreaktion wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von 10 μΐ 3 M NaOH unterbrochen. Das Ergebnis wurde visuell bestimmt. Ein positives Ergebnis, d.h. die Anwesenheit von Protein A, ist ein farbloses Reaktionsgemisch, da keine freien Fc-Stellen von IgG verfügbar sind, um das Konjugat zu binden.

Ein negatives Ergebnis, d.h. kein Protein A, wird durch eine gelbe Farbe festgestellt, die auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase des gebundenen Konjugats zurückzuführen ist. Quantitative Bestimmungen von Protein A erfolgten durch Durchführung von reihenweisen Zweifachverdünnungen einer Protein-A-Standardlösung bekannter Konzentration parallel zu den Testproben.

Beispiell Klonierung von Protein A in E. coli A. Herstellung staphylococcer chromosomaler Donor-DNA

S. aureus Stamm 8325-4 (0 1 1) mec-4916, str-4916, nov-142 (beschrieben von Sjöström, J.-E. u.a. in J. Bacteriol. 123, 905-915 (1975) und erhältlich vom Department of Microbiologie (N), Biomedical Centre, Uppsala, Schweden) wurde bis OD₅₄₀ = 0,2 in Cy-Nährmedium gezüchtet. Ein Liter der ZeIl-

kultur wurde durch Zentrifugieren bei 5 000 Upm in einem Sorvall-GSA-Rotor aufgearbeitet, erneut in 100 ml 0,9%iger NaCl und 10 mM Tris, pH 7,2, suspendiert und bei 5 000 Upm in einem Sorvall-GSA-Rotor zentrifugiert. Das Zellpellet wurde schließlich in 10 ml 25%iger Saccharose, 50 mM Tris, pH 7,2 resuspendiert, und Protoplasten wurden hergestellt durch Lysostaphinbehandlung (15 μg/ml) bei 37⁰C während 20 min. Die Protoplasten wurden durch Zugabe von 10 ml Triton-Gemisch und 5 ml H-O lysiert. Das Gemisch wurde auf Eis stehen gelassen und gelegentlich leicht geschüttelt, bis die Lyse vervollständigt war. Die DNA wurde mit Proteinase K (0,1 mg/ml) und SDS (Natriumdodecylsulfat) (0,5%) während 1 h bei 37°C behandelt, und danach erfolgten fünf Phenolextraktionen mit gleichen Volumina von Phenol und schließlich zwei Chloroformextraktionen. Natriumacetat, pH 7,0, wurde bis zu 0,3 M zugegeben, und die DNA wurde mit zwei Volumen kaltem Ethanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde stufen-

- fif -

weise mit 70, 80, 90 und 99% kaltem Ethanol gewaschen. Das Präzipitat wurde in TE-Puffer durch sanftes Mischen bei 37t gelöst. Schließlich wurde die DNA gegen TE-Puffer dialysiert,

B. Partielle Digestion von chromosomaler DNA und Isolierung von Donorfragmenten

Gereinigte staphylococcale DNA aus Stufe A wurde mit verschiedenen Konzentrationen des Restriktionsenzyms Mbο I digeriert. Jede Reaktion erfolgte in 50 μ.1 Volumen mit 1 ug DNA, und die Reaktion wurde durch Wärmeinaktivierung bei 65°C während 10 min beendet. Das Ausmaß der Digerierung wurde durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Konzentration von Mbo I, die ein großes partielles Spaltungsprodukt von 5 bis 20 Kilobasen ergibt, wurde für eine präparative Digerierung von 100 ng von staphylococcaler DNA in 5 ml gewählt. Dieses digerierte Material wurde durch Hitze inaktiviert, mit Ethanol präzipitiert, in 100 μΐ TE gelöst und durch einen 10 bis 30%igen Saccharosegradienten in TE-Puffer sedimentiert. Ein Beckman-Sw4 0-Rotor wurde bei 5°C, 35 Upm während 20 h verwendet. Der Gradient wurde in 0,5-ml-Fraktionen fraktioniert, wovon jede mittels Agarosegelelektrophorese analysiert wurde. Die Fraktionen mit 8 bis 10 kb Fragmenten wurden gesammelt, mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst.

C. Digestion und Behandlung mit alkalischer Phosphatase des Vektors pBR322

1 ug pBR322 wurde mit Bam HI während 2 h bei 37°C digeriert, und das Enzym wurde bei 65⁰C während 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wurde mit alkalischer Phosphatase zur Entfernung des 5'-Phosphats behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Möglichkeit der Religation des Vektors ausgeschlossen.

Die Reaktion erfolgte in 50 mM Tris, pH 7,9, 5% DMSO und 1 Einheit intestinaler alkalischer Kalbsphosphatase bei 37°C

während 30 Minuten in 1 ml. 0,5% SDS wurde zugegeben, und die DNA wurde zweimal mit Phenol extrahiert. Spuren von Phenol wurden mit Ether entfernt, und die DNA wurde mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert.
5

D. Insertion bzw. Einsatz von staphylococcaler DNA in pBR322, Transformation von E. coli und negative Se-

lektion für die Rekombinanten

Der Vektor pBR322, der für die ursprüngliche Klonierung von staphylococcer DNA verwendet wurde, kodiert für Tetracyclin-(tet) und Ampicillin (amp) -Resistenz. Wenn pBR322 durch Digestion mit Bam HI wie in Stufe C oben geöffnet wird und ein DNA-Fragment eingesetzt wird, wird das Gen für die Tetracyclinresistenz inaktiviert. Durch Prüfung der Transformanten für die Sensitivität gegenüber Tetracyclin können die Rekombinanten festgestellt werden - sogenannte negative Selektion. 0,5 μg von pBR3 22, behandelt entsprechend Stufe C, und 2 ug staphylococce DNA, behandelt entsprechend Stufe B, wurden vermischt und in einem Gesamtvolumen von 25 μΐ über Nacht bei 14⁰C der Ligation unterworfen. Das Gemisch wurde verwendet, um E. coli 259 mit Selektion für Ampicillinresistenz (35 ug/ml) zu transformieren. Die Transformanten wurden herausgenommen und auf Platten, welche 10 ng/ml Tetraeye1in bzw. 35 ug/ml Ampicillin enthielten, aufgestrichen.

Transformanten, welche auf Ampicillin, aber nicht auf Tetracyclin wuchsen, wurden als Rekombinanten angesehen.

E. Nachweis von Protein-A-positiven E.-coli-Klonen 30

Fünfhundert tetracyclinempfindliche Klbne aus Stufe D wurden als getrennte Kolonien auf LA-Platten (hergestellt von LA-Medium), welche Ampicillin (35 μg/ml) enthielten, gezüchtet. Gruppen von 25 Kolonien wurden gesammelt und in 50 ml LB-Brühe mit 35 ag Ampicillin inokuliert und über Nacht gezüchtet. Die Zellextrakte wurden durch Lysozym+EDTA-

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Behandlung (wie bei Routineverfahren beschrieben) hergestellt und nach dem ELISA-Test, der bei den Routineverfahren beschrieben wurde, auf Protein A untersucht. Eine dxeser Gruppen von Klonen war positiv, und diese positive Gruppe wurde weiter in 5 Gruppen von je 5 Klonen unterteilt und wie oben gezüchtet und behandelt. Schließlich wurde in einer letzten Versuchsreihe ein Protein A produzierender Klon, E. coli SPA 11, enthaltend das Plasmid pSPA1, festgestellt. Kulturen dieses Klons wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, am 12. Juli 1982 unter der Hinterlegungsnummer DSM 2434 hinterlegt.

F. Restriktionskarte bzw. -mappe von pSPAI 15

Um Informationen für die Subklonierung und Sequenzierung der Genkodierung für Protein A zu erhalten, wurde eine Restriktionskarte von pSPAI, erhalten in Stufe E, gemacht. Dies erfolgte mit einfachen, doppelten und/oder dreifachen Digerierungen mit den in den Figuren 1 und 2 angegebenen Enzymen. In Figur 2 ist eine genauere Karte in der Fläche, die für Protein A kodiert, dargestellt. Addiert man die Größen der verschiedenen Restriktionsfragmente, so erhält man die Gesamtgröße von 12 kb für pSPAI, und somit beträgt das staphylococce Donorfragment ungefähr 7,6 kb.

G. Subklonierung des Protein-A-Kodierungsgens von pSPAI in Plasmide pBR328 und pHV14 ■

Zur Lokalisierung der Position des Gens wurden verschiedene Subklone konstruiert und auf Protein-A-Aktivität untersucht. 2 ng Plasmid pSPAI von Stufe E und 1 μg pBR32 8 wurden mit dem Restriktionsenzym Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben bei den Routineverfahren beschrie-

ben, durchgeführt. Kolonien, welche Rekorabinanten enthielten, wurden als chloramphenicolresistent und tetracyclinempfindlich auf analoge Weise, wie in Stufe D beschrieben, ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß 8 Kolonien von 48 dieser Rekombinanten Protein-A-positiv unter Verwendung des ELISA-Verfahrens, das bei den Routineverfahren beschrieben wurde, sind. Die Restriktionsanalyse, entsprechend Stufe F, zeigte, daß alle 8 Klone pBR328 mit einem 2,15-kb-Eco- j RV-Einsatz, der sich von dem Fragment, entsprechend 0 ,2 kb ί bis 2,35 kb der pSPA1-Restriktionskarte von Figur 1, ableitet, enthielten. Alle Klone enthielten den Einsatz bzw. das Insert in der gleichen Orientierung und ergaben einen funktionellen tet-Promotor, ablesend in dem eingesetzten Gen·

Ein Klon, der dieses Plasmid, bezeichnet als pSPA3, enthielt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Um zu bestimmen, ob das Protein-A-Gen aus einem eigenen Promotor transkribiert werden konnte, wurde das Plasmid pSPA3 als Quelle verwendet, um es in das Plasmid pHV14 zu reklonieren. Dieses Plasmid, welches sich von pBR322 ableitet, besitzt einen 2,8-kb-Einsatz in der Hind-III-Restriktionsstelle, wodurch der tet-Promotor inaktiviert wird. Irgendein Einsatz in der Eco-RV-Restriktionsstelle dieses Plasmids muß daher einen eigenen funktioneilen Promotor besitzen, damit es durch E. coli-RNA-Polymerase transkribiert werden kann. 1 μg pSPA3 und 1 μg pHV14 werden mit Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation erfolgten, wie oben beschrieben. Kolonien wurden gesammelt, die ampicillinresistent und tetracyclinempfindlich waren, wie in Stufe D beschrieben .

Plasmide von 52 dieser Kolonien wurden nach dem "Mini-Alkali-Verfahren", welches unter Routineverfahren erläutert wurde, isoliert und geprüft, indem man eine 0,7%-Agarose-

gelelektrophorese durchführte. Eine dieser Kolonien war eine Rekombinante von pHVi4 mit dem oben erwähnten 2,15-kb-Eco-RV-Einsatz von pSPA3. Der Klon, der dieses Plasmid, bezeichnet als pSPA5, enthielt, war Protein-A-empfindlich, als er unter Anwendung des ELISA-Verfahrens geprüft wurde. Man schloß daraus, daß der Einsatz eines staphylococcen Promotors, ablesbar in das Protein-A-Gen, welches ebenfalls in E. coli HB101 funktionell ist, enthalten muß.

Analyse der DNA-Sequenz des Protein-A-Gens

Die Ergebnisse der Subklonierung zeigten an, daß die DNA-Sequenzbildung an der Hind-III-Stelle bei der Kartenposition 1,4 kb beginnen sollte und im Gegenuhrzeigersinn abläuft (Figur 1). Die DNA-Quelle für die Sequenzierungsanalyse war gereinigtes pSPA3. Durch Vergleich der teilweise bekannten Aminosäuresequenz von Protein A (wie oben von Sjödahl beschrieben) mit der erhaltenen DNA-Sequenz konnte die Position der HIND-III-Stelle in dem Gen lokalisiert werden. Wie aus den Figuren 2 und 3 folgt, liegt die Restriktionsstelle innerhalb der Region A des Proteins A. Durch weitere Analyse entsprechend Stufe F wurden die Restriktionsstellen für die Enzyme Tag1, Rsa I, Bei I, Sau 3A und Pst I bestimmt (Figur 2). Diese Stellen wurden für die Sequenzierung in einer oder beiden Richtungen verwendet, die in den meisten Fällen Nucleotidsequenzen von beiden Strängen bzw. strands ergaben. Die für die Sequenzbildung angewandte Strategie ist in Figur 11 erläutert. Da Bei I DNA, gereinigt von E. coli HB101, nicht spaltet, wurde pSPA3 in den Stamm E. coli GM 161 transformiert, dem das Enzym D-Alaninmethylase fehlt. pSPA3, welches aus diesem Stamm wieder gereinigt wurde, wurde mit Bei I für die Sequenzbildung gespalten.

In Figur 3 ist die DNA-Sequenz des gesamten staphylococcen Protein-A-Gens dargestellt. Die Aminosäuresequenz, die sich

-3A-

von den DNA-Sequenzen ableitet, ist ebenfalls angegeben, zusammen mit den unterschiedlichen Aminosäuren, verglichen mit der Sequenz, die von Sjödahl, oben vorgeschlagen wurde, welche auf einem anderen Stamm von S. aureus (Cowan I) bestimmt wurde.

Die DNA-Sequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, zeigt einen N-terminalen Bereich, der mit E bezeichnet wird, ähnlich den sich wiederholenden Regionen D-A-B-C, über die Sjödahl, oben berichtet. Diese Region von 50 Aminosäuren besitzt 4 2 Aminosäuren, die mit der Region D identisch sind.

Vor der Region E ist eine Führungssequenz mit den Charakteristiken eines Signalpeptids angebracht, welches eine basisehe Region von 11 Aminosäuren, gefolgt von einem hydrophoben Stretch (dehnbare Kette) von 2 3 Aminosäuren, enthält. Die genaue Spaltungsstelle ist nicht bekannt, aber mögliche Stellen sind bei den Alaninresten 36, 37 oder 42, vermutlich bei 36. Wenn dies so ist, gehört die Aminosäuresequenz 37-42 zu der Region E des Protein-A-Moleküls. Der Initiierungscodon für die Translation ist TTG, ähnlich einigen anderen beschriebenen Initiierungscodons von grampositiven Bakterien. Sechs Nucleotide stromaufwärts von TTG, wird eine Shine-Dalgarno-Sequenz festgestellt (definiert in Shine,

J. und Dalgarno, L., Nature (London) 254, 34-38 (1975)), die viele Merkmale mit anderen grampositiven Ribosomenbindungsstellen gemeinsam hat. Weiter stromaufwärts werden zwei mögliche Promotoren bei -35 und -10 (Figur 3) festgestellt.

Durch Berechnung der Anzahl von Basen, die für die Kodierung des gesamten Proteins erforderlich sind, scheint es, daß sowohl pSPA1 als auch pSPA3 das gesamte Protein-A-Strukturgen enthalten.

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3H

Analyse des Genprodukts von E. coli, enthaltend pSPAI

E.-coli-Zellen, welche pSPAI tragen, wurden über Nacht in 400 ml LB mit 35 μg/ml zugefügtem Ampicillin gezüchtet. Die Zellkultur wurde bei 6000 Upm mit einem Sorvall-GSA-Rotor während 10 min zentrifugiert, und die Zellpellets wurden in 20 ml TE (0,05 M, pH 8,5, 0,05 M EDTA) gewaschen und erneut wie oben zentrifugiert. Diesmal wurden die Zellpellets in 1 5 iftl eines Proteaseinhibitorpuffers (0,02 M Kaliumphosphat, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Triton X-100, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) resuspendiert· Die Zellen wurden dann in einem MSE-Sonicator während 4 χ 40 sec auf einem Eisbad beschallt und bei 15 000 Upm (Sorvall-SS-34-Rotor) 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und durch eine IgG-Sepharose -4B-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (Hjelm u.a., FEBS Lett. 2jS, 73-76 (1972)) geleitet, welche mit einem Natriumacetatpuffer (0,1 M Natriumacetat, 2% NaCl, pH 5,5) equilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Puffer wie oben gewaschen, und das adsorbierte Protein A wurde mit einem Glycinpuffer (0,1. M Glycin, 2% NaCl, pH 3,0) eluiert. Zu den eluierten Fraktionen gab man 1/9 Volumen 100%ige Trichloressigsäure (TCA) hinzu.

Die Proben wurden 6 Stunden bei +4⁰C präzipitiert und bei 12 000 Upm in einer Eppendorf-Zentrifuge während 15 min zentrifugiert. Die Pellets wurden einmal in 1 ml kaltem Aceton gewaschen und dann wie oben zentrifugiert. Die verbleibenden Pellets wurden getrocknet, in TE gelöst und gesammelt, wodurch man ein Gesamtvolumen von 400 μΐ erhielt.

Die Proteinkonzentration wurde bestimmt, und 20 ug wurden auf einem 13%-SDS-Polyacrylamidgel bei 100 V während 12 h analysiert. Das Gel wurde mit Amidoblack (0,1%, 45% Methanol, 10% Essigsäure) angefärbt. Ein Extrakt von Zellen, welche pBR322 tragen, wurde parallel hergestellt, und das glei-

ehe Volumen wie oben wurde auf dem Gel analysiert. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese sind in Figur 5 dargestellt, die anzeigt, daß das Protein A, welches in E. coli, welches pSPA1 trägt, erzeugt wurde, eng an dem reinen Protein A von -> S. aureus (von Pharmacia, Uppsala, Schweden) migriert. Der Extrakt von Zellen, die das pBR322-Plasmid trugen, besaß kein entsprechendes Protein.

Analyse der Lokalisierung von Protein A in E. coli *

Enzyme, die in gram-positiven Bakterien extrazellular sind, sind in gramnegativen Bakterien oft zwischen der inneren und äußeren Membran im sogenannten Periplasma oder periplasmischen Raum gelagert. Da Protein A in der Zellwand und somit außerhalb der Zellmembran in S. aureus lokalisiert ist, wurde die Lokalisierung des Proteins in den transformierten E.-coli-ZeIlen, welche pSPA1 enthielten, bestimmt. Zu diesem Zweck wurde das osmotische Schockverfahren, wie von Heppel, L.A. , Science 158, 1451-1455 (1967) beschrieben, angewandt.

In diesem Verfahren werden Proteine aus dem periplasmischen Raum, aber nicht intrazellulare Enzyme freigegeben. Alkalische Phosphatase wurde als Beispiel für ein Protein, welches in dem periplasmischen Raum nachgewiesen wurde, und Phenylalanin-tRNA-Synthetase als Beispiel für ein intrazelluläres Protein verwendet.

E. coli, enthaltend pSPA1, wurde in einem niedrigen Phosphatmedium (genau wie von Neu, H.G. und Heppel, L.A., J. Biol. Chem. 240, 3685-3692 (1965) beschrieben) zur Derepression der Synthese alkalischer Phosphatase gezüchtet. Ein Li-

ter einer Übernachtkultur (etwa 7,5 χ 10 CFU/ml) wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde dreimal mit kaltem 0,01 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,1 gewaschen, und die Zellen wurden erneut in 20 ml 20%iger Saccharose-0,03-M-Tris-HCl, pH 8,1, 1 itiM EDTA suspendiert. Nach 10 min auf einer Rotationsschüttelvorrichtung bei Raumtemperatur wurde das Gemisch 10

OvJJU I

min bei 13 00Ox g in einer Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert.

Der überstand wurde entfernt, und die gut abgetropften PeI-

-4 lets wurden schnell mit 20 ml kalter 5x10 M MgCl₂-Lösung

vermischt. Die Suspension wurde in einem Eisbad auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 10 min vermischt und zentrifugiert. Der überstand, welcher als "osmotische Schockwaschlösung" bezeichnet wird, wurde für die weitere Prüfung gesammelt. Zum Vergleich wurde der andere Teil von Zellen zentrifugiert, gewaschen und in 5 ml Polymix-Puffer (I) (genau wie von Jelenc, P.C., Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980) beschrieben) wieder suspendiert. Die Zellen wurden in einer X-Presse, wie vom Hersteller (Biotec, Stockholm, Schweden) empfohlen, desintegriert. Die Zelldebris wurden durch Zentrifugieren bei 13 000 Upm während 15 min in einer Sorvall-SS-34-Rotorzentrifuge entfernt, und der Überstand wurde für die weitere Prüfung gesammelt.

Die zwei erhaltenen Extrakte, welche periplasmisches und Gesamtzellenprotein enthielten, wurden jeweils mit den unten angegebenen enzymatischen Versuchen auf die alkalische Phosphatase und Phenylalanin-t RNA-Synthetase und auf Protein A, wie oben unter den Routineverfahren beschrieben, analysiert.

Enzymatische Assays
25

Alkalische Phosphatase wurde in einem Tris-Puffer, 0,05 M,

-4 pH 8,0 unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (4 χ 10

M) als Substrat (Sigma 104) untersucht. Die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat wurde in einem Spektrophotometer bei 410 πιμ gemessen. Eine Einheit der Aktivität stellte eine Änderung der Absorption bei 410 mu von 1,0 pro Minute dar. (Heppel, L.A., Harkness, D.R. und Hilmoe, R.J., J. Biol. Chem. 237, 841-846 (1962)).

Phenylalanin-tRNA-Syηthetase

Die Analyse erfolgte in einem Gemisch, welches in einem Gesamtvolumen von 100 μΐ enthielt: 5 mM Mg(OAc)-, 0,5 mM CaCl_?, 95 mM KCl, 5 mM NH₄Cl, 8 mM Putrescin, 1 mM Spermidin, 5 mM K-Phosphat, pH 7,5, 1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP, 6 mM Phosphoenolpyruvat, 1 μg Pyruvatkinase (Sigma, St. Louis,

1 4

USA), 1 Einheit Myokinase (Sigma), 100 μΜ ( C)-Phenylalanin (4 cpm/pmol) (Radiochemical Centre, Amersham, England), 300 μg Gesamt-E. -coli-tRNA (Boehringer Mannheim, Bundesrepublik Deutschland).

Der X-gepreßte Zellextrakt und die osmotische Schockwaschlösung wurden durch Zugabe von 10 μΐ geeigneter Verdünnungen geprüft. Die Enzymanalysen wurden während 15 min bei 37°C durchgeführt. Kaltes 10%iges TCA wurde zur Unterbrechung der Reaktion und zur Präzipitation von PhenylalanintRNA zugegeben. Das Präzipitat wurde auf Glasfaserfiltern (GFA, Whatman) gesammelt, mit 10%igem kaltem TCA und kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, und die Radioaktivität wurde bestimmt. Eine Aktivitätseinheit wird als die Bildung von 1 pmol Phe-tRNA pro Minute definiert. (Wagner, E.G.H., Jelenc, P.C., Ehrenberg, M. und Kurland, CG. Eur. J. Biochem. 122, 193-197 (1982)) .

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Alle Zahlen in der Tabelle sind pro 500 ml Zellkultur (ca. 7,5 χ 10⁸ CFU/ml) berechnet.

Tabelle 1

Enzymaktivitäten und Protein-A-Gehalt von E.-coli-Zellen, welche pSPA1 enthalten

Periplasma der Zellen Gesamtzellen

Alkal. Phosphatase

(Einheiten) 160 210

Phenylalanin-tRNA-

Synthetase (Einheiten) 0 1530

Protein A Ug)^a 24 - 48 24 - 48

\J C»

Da die Bestimmung in reihenweisen Zweifachverdünnungen er folgt, werden die Mengen angegeben, die im Bereich von zwei Verdünnungsstufen liegen.

Aus Tabelle 1 folgt, daß Protein A und alkalische Phosphata se freigegeben wurden, wenn die Zellen osmotischem Schock unterworfen wurden, wohingegen keine Aktivität des intrazellularen Enzyms Phenylalanin-tRNA-Synthetase in der osmotischen Schockwaschlösung nachgewiesen wurde. Diese Ergebnis zeigt an, daß die S.-aureus-Signalseguenz, welche entsprechend den Sequenzwerten (Figur 3) in der klonierten DNA vorhanden ist, in E. coli ausgedrückt bzw. erzeugt wird und daß das Signalpeptid von der Membran erkannt wird. In einem grampositiven Bakterium, dem die Außenmembran fehlt, wie Bacillus subtilis, hätte das Signalpeptid höchstwahrscheinlich die Sekretion des Proteins A in das Wachstumsmedium bewirkt.

Die Mengen an Protein A, die durch die pSPA1 tragenden E.-coli-Zellen erzeugt wurden, betragen etwa 1 bis 2 mg/Liter Medium.

Beispiel II Klonierung von Protein A in verschiedenen staphylococcen Stämmen

I. Konstruktion des Shuttle-Vektors, welcher das Protein-Α-Gen enthält

Zwei Shuttle-Vektoren, welche das Protein-A-Gen enthielten, wurden erzeugt, um eine Replikation sowohl in E. coli, S. aureus als auch coagulasenegativen Staphylococcen zu ermöglichen. Der Plasmid-Vektor pHV33 auf der Grundlage des staphylococcen Plasmids pCl94 wurde verwendet, um Ampicillin- und Tetracyclinresistenz in E. coli und Chloramphenicolresistenz in Staphylococcen auszudrücken.

A. Konstruktion des Shuttle-Vektor-Plasmids pSPAI5 (Fig.6)

Der erste Shuttle-Vektor wird durch Klonierung des 2,1-kb-EcoRV-Fragments, enthaltend das Protein-A-Gen, wie in Beispiel I, Stufe G beschrieben, in die EcoRV-Stelle von Plasmid pHV33 aufgebaut bzw. konstruiert. 2 μg des Plasmids pSPA3 aus Stufe G von Beispiel I und 1 μg pHV33 wurden mit EcoRV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben unter Routineverfahren beschrieben, durchgeführt. Kolonien, welche Rekombinanten enthielten, wurden als ampicillinresistent und tetracyclin- und chloramphenicolempfindlich auf analoge Weise, wie in Stufe D von Beispiel I beschrieben, ausgewählt. Die Restriktionsanalyse entsprechend der Stufe F in Beispiel I zeigte, daß von 8 geprüften Klonen alle das in Figur 6 schematisch dargestellte Plasmid enthalten. Alle Klone besaßen den Einsatz in gleicher Orientierung wie im Plasmid pSPA3 (vgl. Stufe G, Beispiel I). Ein Klon, der dieses Plasmid enthielt, bezeichnet als pSPA15, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß dieses Plasmid das gesamte Strukturgen von Protein A, Kodierung für ein vollentwickeltes Protein von 44 7 Aminosäuren, enthielt und ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 49 604 hatte.

B. Konstruktion bzw. Aufbau des Shuttle-Vektor-Plasmids pSPA16 (Figur 8)

B1 Subklonierung des 5'-Endes des Protein-A-Gens von

pSPAI in das Plasmid pTR262 unter Bildung des Plasmids pSPA2_(Figur Ί)

1 μg Plasmid pSPAI (siehe Figur 1) von Stufe E von Beispiel I und 1 μg Plasmid pTR262 wurden mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I geschnitten bzw. gespalten, gemischt,

- 99 HO

mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation erfolgten wie oben unter Routineverfahren beschrieben.

Plasmid pTR262 enthält ein Lambda-Repressorgen, welches bei der Expression das Gen für die Tetracyclinresistenz inaktiviert. Das Lambda-Repressorgen besitzt eine Hind-III-Stel-Ie, und daher inaktiviert der Einsatz einer DNA-Sequenz in die letztere das Lambda-Repressorgen und aktiviert das Tetracyclinresistenzgen. Plasmid pTR262 erlaubt somit die positive Selektion für tetracyclinresistente Rekombinanten.

Kolonien, die Rekombinanten enthielten, wurden somit als tetracyclinresistent ausgewählt. Es wurde gefunden, daß eine Kolonie dieser 20 Rekombinanten Protein-A-positiv war, wenn man das ELISA-Verfahren anwendet, welches zuvor unter den Routineverfahren beschrieben wurde. Die Restriktionsanalyse zeigte, daß es das Vektorplasmid pTR262 mit einem 2,1-kb-Protein-A-Gen-Einsatz, der sich von dem Fragment, welches 0,0 bis 2,1 kb der pSPA1-Restriktionskarte der Figuren 1 und 2B entspricht, ableitet, enthielt. Dieses Plasmid wurde als pSPA2 bezeichnet und ist schematisch in Figur 7 dargestellt. Es besitzt eine einzigartige Pst-I-Restriktionsstel-Ie am 3'-Ende des Protein-A-Gen-Fragments, welches bei der folgenden Stufe B5 verwendet wird.

B2 Herstellung eines DNA-Fragments, enthaltend das Prol~A—Geil

100 \ig des Plasmids pSPA5 aus Stufe G von Beispiel I wurden mit dem Restriktionsenzym Eco RI während 1 h bei 37°C geschnitten bzw. gespalten. Dabei erhielt man zwei DNA-Fragmente, nämlich das eingesetzte DNA-Fragment, welches das Protein-A-Gen (2,1 kb) enthielt, zwischen den Positionen 0,2 5 kb und 2,3 kb in Figur 2B, und den Vektor pHV14 (7,2 kb). Dieses digerierte Material wurde in der Hitze inaktiviert,

HA

mit Ethanol präzipitiert, in 100 μΐ TE gelöst und mittels eines 10 bis 30%igen Saccharosegradienten in TE-Puffer sedimentiert. Ein Beckman-SW40-Rotor wurde bei 5⁰C, 35 000 Upm während 20 h verwendet. Der Gradient wurde in 0,5-ml-Fraktionen fraktioniert, wovon jede mittels Agarosegelelektrophorese analysiert wurde. Die Fraktionen, welche das 2,1 kb-Fragment enthielten, wurden gesammelt, mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. Aus den Figuren 2A und B folgt, daß das Fragment zusätzlich zu dem gesamten Protein-A-Gen eine E.-coli-Sequenz, die sich von Plas mid pBR322 ableitet, und einen staphylococcen Genrest enthält.

B3 Herstellung eines DNA-Fragments, welches einen Teil desProtei.n2Ä^Gens en;thä.l t. _

5 ng des gereinigten 2,1-kb-Fragments aus Stufe B2 wurden mit Restriktionsenzym Sau 3A während 1 h bei 37°C geschnitten bzw. gespalten. Das digerierte Material wurde einer prä parativen Gelelektrophorese an 8%igem Polyacrylamid in TEB Puffer unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid (1 ng/ ml) angefärbt, und ein DNA-Fragment von ungefähr 600 -Basenpaaren wurde herausgeschnitten.Dieses Fragment entspricht dem Teil des Gens zwischen den Positionen 1,15 und 1,8 kb in Figur 2B. Die DNA wurde über Nacht bei 37°C in 5 ml TE + 0,3 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde über eine Säule geleitet, welche ungefähr 300 μΐ sedimentiertes DE-52 (Whatman, England), equilibriert mit 5 ml TE, enthielt. Nach dem Waschen mit 2 ml Te + 0,3 M NaCl wurde die DNA mit zwei VoIumen von jeweils 0,5 ml TE + 0,6 M NaCl eluiert. Das Eluat, welches das DNA-Fragment enthielt, wurde mit einem Volumen TE verdünnt, mit Ethanol präzipitiert und in TEB-Puffer gelöst. Das entstehende gereinigte Protein-A-Gen-Fragment besitzt kohäsive Enden, die einer Sau-3A-Restriktionsstelle und einer Zwischen-Hind-III-Stelle entsprechen.

HZ

B 4 He r j3t e 1 lun g_von_Ve k t ο r_p ^a sm i₁d_pU R 2^2 2^

Das Plasmid pUR222 ist ein im Handel erhältlicher Vektor, welcher die Genkodierung für das Enzym ß-Galactosidase (lac Z) enthält. Das Gen enthält einen Multilinker mit verschiedenen Restriktionsstellen, wie Pst I, Barn H1 und Eco RI. Da ß-Galactosidase durch enzymatische Analysen leicht nachweisbar ist, können Rekombinanten mit einem DNA-Fragment, welches in eine der Restriktionsstellen eingesetzt ist, unter Verwendung geeigneter Wirtstämme leicht nachgewiesen werden. Oft werden Xgal-Platten verwendet (Xgal ist ein chromogenes Substrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid, welches ein blaues Indolylderivat freisetzt, wenn es mit ß-Galactosidase gespalten wird), auf denen ß-Galactosidase-negative Rekombinanten als weiße Kolonien im Gegensatz zur blaugrünen Farbe der Kolonien, welche Plasmide ohne Einsatz enthalten, erscheinen.

Zur Spaltung des Plasmids pUR222 im ß-Galactosidase-Kodierungsgen unter Bildung kohäsiver Enden, die komplementär zu den kohäsiven Enden des Protein-A-Fragments der Stufe B3 für den Einsatz davon in das Plasmid sind, wurde die Bam-H1-Restriktionsstelle verwendet. 1 ng pUR222, erhalten von Boehringer-Mannheim, Deutschland, wurde mit dem Restriktionsenzym Barn H1 während 1 h bei 37°C digeriert. Darauf wird das Enzym bei 65°C während 10 Minuten inaktiviert. Diese Spaltungspräparation wurde bei der folgenden Stufe B5 für die Ligation mit dem Protein-A-Fragment verwendet.

B5 Konstruktion eines pSPA2 und pTR26 2 enthaltenden Hybridpl.asmidj3 £SPAj_0_(Figor ]_)___

200 ng pUR222, digeriert mit Barn H1, wie in Stufe B4 beschrieben, und 200 ng eluiertes Protein-A-Fragment, wie in Stufe B2 beschrieben, wurden vermischt und in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ über Nacht bei +14⁰C der Ligation unter-

- te -

worfen. Das Enzym wurde bei 65°C 10 Minuten lang inaktiviert, mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. Das gesamte DNA-Gemisch, welches u.a. rekombinante Plasmide mit dem Protein-A-Einsatz in dem 3-Galactosidasegen enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I während 1 h bei 37°C in dem für Hind III empfohlenen Puffer gespalten bzw. geschnitten. Dabei wird das rekombinante Plasmid in das 3-Galactosidasegen (Pst I) und in das Protein-A-Gen (Hind III) gespalten, wobei zwei Fragmente erzeugt werden, nämlich ein kleines Fragment, welches aus einer kleineren ß-Galactosidase-DNA-Sequenz, gebunden an den Teil des Protein-A-Gen-Fragments von der Sau-3A-Steile an der Position 1,15 kb an die Hind-III-Stelle in Figur 2B, besteht, und aus einem großen Fragment, welches aus dem Rest des rekombinanten Plasmids besteht, das den größeren Teil des ß-Galactosidasegens enthält, welcher an das Protein-A-Gen-Fragment von der Hind-III-Stelle an die Sau-3A-Stelle in Position 1,8 kb in Figur 2B gebunden ist. Wie aus Figur 7 folgt, besitzt das 3-Galactosidasefragment eine Eco-RI-Restriktionsstelle nahe an der Stelle der Verschmelzung mit dem Protein-A-Fragment ( die Bam-H1-Stelle) .

200 ng Plasmid pSPA2 von Stufe B1 wurden mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I auf gleiche Weise wie oben geschnitten bzw. gespalten, um das Plasmid in drei Fragmente zu spalten (siehe Figur 7), nämlich ein Fragment, welches sich von der Hind-III-Stelle zwischen dem Tet-Gen und dem 5'-Ende des Protein-A-Gens zu der Hind-III-Stelle innerhalb des Protein-A-Gens erstreckt, ein Protein-A-Gen-Fragment, welches sich von der letzteren Hind-III-Stelle zu der Pst-I-Stelle am 3'-Ende des Protein-A-Gens erstreckt, und ein größeres Fragment vom pTR262-Ursprung, welches den Rest des Plasmids enthält.

Die beiden oben hergestellten Digests wurden bei 65°C während 10 Minuten inaktiviert, vermischt und mit Ethanol prä-

HH

zipitiert. Die DNA wurde in Ligationspuffer gelöst und mit T4-Ligase behandelt. Das gewünschte rekombinante Plasmid enthält das oben erwähnte große Fragment, welches bei der Spaltung der pUR222-Rekombinante, eingesetzt in pSPA2 zwisehen der Hind-III-Stelle innerhalb des Protein-A-Gens und der Pst-I-Stelle, erhalten wird und das 5'-Ende des Protein-A-Gens enthält. Ein Teil davon leitet sich somit von pSPA2 ab, und der andere stammt aus der püR222-Rekombinante. Weiter ist das Plasmid ampicillin- und tetracyclinresistent und sollte auf Xgal-Platten, wie im folgenden erläutert wird, eine blaue Farbe ergeben.

Das der Ligation unterworfene DNA-Gemisch wurde daher zur Transformierung von E. coli RRI del M15 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Rekombinanten wurden auf Xgal-Platten, welche Ampicillin und Tetracyclin enthielten, aufgebracht. Einer dieser Klone erschien als hellblau, und die Restriktionsanalyse wurde auf seinem Plasmid durchgeführt. Man erhielt ein Plasmid, welches als pSPAIO (Figur 7) bezeichnet wurde, das aus Teilen von Plasmid pUR222, Plasmid pTR262 und dem Protein-A-Gen, welches aus Plasmid pSPAi stammt, besteht und eine einzigartige Eco-RI-Stelle am stromabwärtigen Ende des Gens aufweist.

Obgleich das Plasmid pSPAIO nicht die gesamte lac-Z-Gen-Kodierung für ß-Galactosidase, sondern nur die Genkodierung für das α-Fragment davon (lac Z¹) enthält, ist es bei der Spaltung des Xgal-Substrats aktiv und erzeugt bei den oben angewandten Bedingungen eine blaue Farbe. Dies ist auf eine Komplementation zwischen dem α-Fragment, kodiert mit dem Plasmid, und einem chromosomalen Genprodukt zurückzuführen, welches das carboxvterminale Fragment von ß-Galactosidase enthält, das ein aktives Enzym ergibt. Der E.-coli-RRI-del-M15-Wirtstamm, wie er oben verwendet wurde, besitzt so ein chromosomales Genmaterial und komplementiert das α-Fragment,

das von dem pSPA1O-Plasmid gebildet wurde, zu einem aktiven ß-Galactosidasemolekül.

B6 Subklonierung des Protein-A-Kodierungsgens in das Plas mJ.dpBR322 zur KonstxuktiondesPl.asm.ids

1 ug des gereinigten 2,1-kb-Protein-A-Fragments von der Stufe B2 wurde mit dem Restriktionsenzym Tag I während 1 h bei 60⁰C gespalten, um es innerhalb der DNA des Staphylococcen-Ursprungs zu spalten. Das Enzym wurde durch Extraktion mit
einem gleichen Volumen Phenol inaktiviert, darauf folgte eine mehrfache Etherextraktion, und schließlich wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. 1 μg des
Plasmids pBR322 wurde mit den Restriktionsenzymen CIa I und Eco RV (welche auf gleiche Weise spalten und somit komplementäre kohäsive Enden ergeben) während 1 h bei 37°C in Bam-H1-Puffer gespalten und dann während 10 Minuten bei 65⁰C in der Hitze inaktiviert. Die DNA-Proben wurden vermischt, der Ligation unterworfen und zur Transformierung von E. coli

HB101, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben, verwendet. Transformante wurden auf Ampicillin (35 μg/ml) ausgestrichen. Die Kolonien wurden auf Platten, welche 10 μg/ml Tetracyclin bzw. 35 μg/ml Ampicillin enthielten, gegeben.
Die Transformanten, die auf Ampicillin, jedoch nicht auf

Tetracyclin wuchsen,, wurden als Rekombinanten angesehen. Es wurde gefunden, daß 4 Kolonien von diesen 12 Rekominanten
Protein-A-positiv waren bei Anwendung des ELISA-Verfahrens, beschrieben unter den Routineverfahren. Die Restriktionsanalyse, bei der gereinigtes Plasmid mit einem, zwei oder drei Restriktionsenzymen gespalten wurde, wurde mit einem dieser Klone durchgeführt. Die entstehende Restriktionskarte dieses Plasmids, welches als pSPA8 bezeichnet wird, ist in Figur 7 dargestellt. Das so konstruierte Plasmid besitzt keinen E.-coli-Promotor stromaufwärts vom Protein-A-Gen, vor

dem Protein-A-Gen-Fragment ist nur der eigene staphylococce Promotor vorhanden.

\J \J \S \J I Vrf

B_7_ _Kons_truktipn de£3 P_la_smids_pS_PAi 6_ _CF_igur_8]_

Ein zweiter Shuttle-Vektor wurde konstruiert, welcher für das abgestumpfte (truncated) Protein A kodiert (d.h. dem der X-Bereich fehlt). Die Konstruktion ist schematisch in Figur 8 dargestellt. 5 ug Plasmid pSPAIO von Stufe B5 wurden mit Eco RI und Hind III gespalten, und ein 0,4-kb-Fragment wurde aus einem 5%-Polyacrylamidgel nach der Elektrophorese herausgeschnitten. Das Fragment wurde wie oben bei den Routineverfahren beschrieben eluiert und gereinigt. 5 μg Plasmid pSPA8 aus Stufe B6 wurden auf gleiche Weise behandelt, und ein 0,7-kb-Fragment wurde isoliert und gereinigt. Schließlich wurden 2 \ig Plasmid pHV33 mit Eco RI digeriert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den beiden gereinigten DNA-Fragmenten vermischt. Nach der Behandlung mit T4-Ligase wurde die DNA zur Transformierung von E. coli HB 101 verwendet. Spaltung, alkalische Phosphatase-Behandlung, Ligation und Transformation erfolgten, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben. Die Restriktionsanalyse von 12 ampicillinresistenten Klonen zeigte einen Klon an, welcher Plasmid pHV33 mit einem 1,1-kb-Einsatz in der Eco-RI-Stelle enthielt. Das als pSPA16 bezeichnete Plasmid ist in Figur 8 schematisch dargestellt. In Figur 9 sind die Nucleotidsequenz und die deduzierten Aminosäuren, die dem Stopkodon dieses abgestumpften Protein-Α-Gens vorhergehen, dargestellt. Das vollentwickelte Protein, dem der Bereich X fehlt, das so gebildet wurde, enthält 2 74 Aminosäuren, was ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 30 938 ergibt. Dieses abgestumpfte Protein-A-Molekül, welches schematisch in Figur 10 dargestellt ist, enthält alle IgG-Bindungsteile von Protein A in intakter Form, ausgenommen dem C-terminalen Teil des Bereichs C.

II. Retransformation der Shuttle-Vektoren pSPA15 und pSPA16 in E. coli

Die Shuttle-Vektoren pSPAi5 und pSPAi6, die im Abschnitt I oben konstruiert wurden, wurden in E. coli HB101 retransformiert mit der Selektion für Ampicillin (amp) -resistenz (50 μg/ml) wie in Abschnitt I. Die Transformanten wurden auf ihre Protein-A-Produktion nach dem ELISA-Test, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben, geprüft. Plasmid-DNA wurde aus Protein-A-positiven Klonen, welche die entsprechenden Plasmide enthielten, ebenfalls, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben wurde, isoliert.

III. Transformation von Stämmen von S. aureus, S. xylosus 5 und S. epidermidis

A. Herstellung und Transformation von Protoplasten von S. ^aü^reus

Unterschiedliche Spezies und gleiche Stämme von Staphylococcen enthalten unterschiedliche Restriktions- und Modifikationssysteme, und die meisten Stämme tragen mehrere davon (vgl. Stobberingh, E.E. und K. Winkler, J. Gen. Microbiol. 99; 359-367 (1977) und Sjöström, J.-E. u.a., J. Bacteriol. 22_^: 1144-1149 (1978)).

Dies verursacht Schwierigkeiten, wenn das Plasmid-DNA, welches aus E. coli isoliert wurde, in Staphylococcen durch Transformation eingeführt werden soll.

Zur Beseitigung des Restriktionsproblems wurde eine restrik tionsarme Mutante von S. aureus 8325, bezeichnet als SA113, ursprünglich von Iordanescu u.a. (J. Gen. Microbiol. 96: 277-281 (1976)) isoliert, daher verwendet, um die primären Transformationen in S. aureus der Plasmid-DNA, isoliert aus E. coli HB101, durchzuführen. Der ursprüngliche Stamm SA113

MS"

ist lysogen für Prophagen 011, 012 und 013 und wurde weiterhin mit der Phage 8 3A lysogeniert. Der Stamm besitzt den folgenden Phagentyp: 29/47/75/85/ . Zur weiteren Abnahme der Restriktion wurden die Protoplasten auf 56⁰C während 30 Sekünden unmittelbar vor der Zugabe von DNA erhitzt (vgl. Asheshov u.a., J. Gen. M.i.crobiol. _3J_^: 97-107 (1963), und Sjöström, J.-E. u.a., Plasmid _2: 529-535 (1979)).

Verfahren und Medien für die Herstellung der Protplasten waren hauptsächlich diejenigen, die für Bacillus subtilis von Wyrick und Rogers in J. Bacteriol. 116: 456-465 (1973)beschrieben und von Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 (1979) modifiziert wurden. Es wurden jedoch einige Modifizierungen für Staphylococci durchgeführt, wie von Lindberg in J. JeIjaczewicz: Staphylococci and Staphylococcal Infections, ZbI. Bakt. Suppl. j_0_: 535-541; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart-New York (1981) und Götz u.a. in J. Bacteriol. 145: 74-81 (1981) beschrieben.

10-ml-Proben von S. aureus SA113, gezüchtet in Trypticase-Soja-Kulturmedium (BBL, Cockeysville, Md., USA), zu der

9
stationären Phase (ca. 2 χ 10 koloniebildende Einheiten pro ml) wurden isoliert und auf das gleiche Volumen in einem hypertonischen gepufferten Medium (HBM), welches aus 0,7 M Saccharose, 0,02 M Na-Maleat und 0,02 M MgCl₂ bestand und dessen pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt wurde, plus 43 g Difco-Penassy-Medienpulver (Difco Lab., Detroit, Michigan, USA) pro Liter suspendiert. Lysostaphin (Schwarz/Mann Orangeburg, N.Y., USA) und Lysozym (Sigma Chemical Co., St.

Louis, Mo., USA) wurden bei 20 und 2000 ug/ml Endkonzentration zugegeben, und die Zellsuspensionen wurden bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Zur Entfernung der Zellwand ist Lysozym nicht erforderlich, es hilft jedoch bei der Abtrennung der Protoplasten, die, wie intakte Zellen von Staphylococci, die Tendenz besitzen, sich zusammenzuballen. Diese Inkubation wurde weitergeführt, bis die Ab-

- & HS

sorption bei 540 nm konstant wurde, was normalerweise innerhalb von 3 Stunden geschah. Die verbleibenden intakten Bakterien und Zellendebris wurden durch Zentrifugieren bei 2 500 χ g während 10 min pelletisiert. Die überstände wurden gesammelt und erneut bei 16 000 χ g während 10 min zentrifugiert. Die pelletisierten Protoplasten wurden erneut in HBM auf 1/10 des Volumens der Ausgangskultur suspendiert. 0,4-ml-Suspensionen der hergestellten SA113-Protoplasten in HBM (ca. 2 χ 10 Zellwandregenerierungsprotoplasmen pro ml) wurden mit E.-coli-Plasmid-DNA aus Stufe II oben wie folgt transformiert.

10 bis 20 ug Protein-A-positive Plasmid-DNA wurden in einem Maximalvolumen von 20 μΐ unter leichtem Mischen zugegeben.

2 ml 40% PEG 6000 (Stock-Lösung von Polyethylenglykol (PEG), hergestellt durch Auflösung von 40 g PEG mit einem Molekulargewicht von 6 000 (PEG 6000) in 100 ml hypertonischem Puffer (HB): 0,7 M Saccharose, 0,02 M Na-Maleat und 0,02 M MgCl₂, pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt) wurden unmittelbar zugegeben, und 2 Minuten später wurden 8 ml HBM zugegeben. Die Suspension wurde bei 48 200 χ g während 15 min zentrifugiert. Die pelletisierten Protoplasmen wurden dann erneut in 1 ml HBM suspendiert, und nach geeigneten Verdünnungen in HBM-Proben wurden sie für die Regenerierung der Zellwand plattiert bzw. auf Platten aufgetragen. Das Regenerationsmedium war DM3, ein Casaminosäuren-Hefeextrakt-Rinderserumalbumin-Medium, welches 0,5 M Natriumsuccinat und 8 g Agar pro Liter entsprechend Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet. 168; 111-115 (1979) enthielt. Zur Selektion der chloramphenicolresistenten Transformanten wurde CY-Medium (Novick, R. P., J. Gen. Microbiol. 33_: 121-136 (1963)) mit 0,5 M Natriumsuccinat, 0,02 M MgCl₂, 0,08% Rinderserumalbumin und 4 g Agar pro Liter als weiche Agarüberschicht mit Chloramphenicol verwendet, so daß man eine Endkonzentration von 10 μg/ml in dem Gesamtagarmedium erhielt. Die phenotypische Expression konnte bei 37°C während 3 Stunden vor der Zugabe

von weichem Agar mit Chloramphenicol ablaufen. Die Platten wurden bei 37°C während 3 Tagen inkubiert. Chloramphenicolresistente Transformanten wurden auf TSA-Platten (Trypticase Soy Agar) mit Chloramphenicol (10 μg/ml) wieder ausgestrichen.

B._ _Na.chweis^ vori Protein A

Ein qualitativer Test von Protein A wurde durchgeführt, indem man Transformanten auf Brain-Hearfc-Infusions- (BHI) -Agar (Gehirn-Herz-Infusions-Agar) (Difco Lab., Detroit, Michigan, USA) -Platten mit 1% Hundeserum ausstrich. Die Protein-AProduktion wurde als Halo des präzipitierten IgG-Protein-A-Komplexes um die Kolonien (Kronvall, G. u.a., J. Immunol. 104: 140 (1970)) nachgewiesen. Der Rezipientenstamm S_. aureus SA113 erzeugte sehr geringe Mengen an Protein A, fast ohne nachweisbaren Halo um die Kolonien.

C_. __ _He_rs^te_lJLung_von_ ^__2;__

Das Plasmid-DNA wurde aus dem Protein A hergestellt, welches SA113-Transformanten erzeugt, die in Stufe Ä erhalten wurden, indem man ein Schnellkochverfahren, wie es von Holmes u.a. (Anal. Biochem. 114:193 (1981)) beschrieben wird, anwandte, ausgenommen, daß Lysozym durch Lysostaphin bei einer Endkonzentration von 50 μg/ml ersetzt wurde.

D.__ _Transf_ormatix>n von S^aphylococci.

Die folgenden staphylococcen Stämme wurden mit Plasmiden pSPAi5 und pSPAi6, wie oben in Stufe A für S_. aureus SA1 13 beschrieben, transformiert:

Staphylococcus aureus U320, eine Protein-A-negative Mutante des Stammes §_. aureus SA1 13, isoliert beim Department of Microbiology, The Biomedical Centre, Uppsala, Schweden; Staphylococcus epidermidis 247, ein coagulasenegativer Sta-

phylococcus, der Protein A nicht erzeugt; Staphylococcus xylosus KL117, ein coagulasenegativer Staphylococcus, der Protein A nicht erzeugt.

IV. Herstellung von Protein A, kodiert mit den Plasmiden pSPA15 und pSPA16

Transformanten, die bei den Stufen III A bis D oben erhalten wurden, wurden in Trypticase-Soy-Medium, angereichert mit Thiamin (1 mg/Liter), Nicotinsäure (1,5 mg/Liter) und Ca-Pantothenat (1,5 mg/Liter), gezüchtet, und die Produktion von extrazellularem wie auch an die Zellwand gebundenem Protein A wurde bestimmt. Das an die Zellwand gebundene Protein A ist die Menge an Protein A, die nach der Gesamtlyse von 1 ml gewaschener Zellen in der stationären Wachs-

g
tumsphase (ca. 8x10 CFU/ml) freigesetzt wird, und das extrazellulare Protein A ist die Menge an Protein A in dem Wachstumsmedium.

Das mit der Zellwand assoziierte Protein A wurde quantitativ

125 bestimmt, indem man die Bindung von J-markiertem Human-IgG an die Zellen mißt (Kronvall, G., J. of Immunol. 104; 273-278 (1970)) oder indem man den ELISA-Test anwendet, wie er unter den Routineverfahren beschrieben worden ist, nach Beendigung der Lyse der Zellen mit Lysostaphin.

Das extrazellulare Protein A wurde unter Anwendung des ELI-SA-Tests gemessen.

S.-aureus-Stämme Cowan I und A6 76 wurden als Referenzstämme für die Produktion von an die Zellwand gebundenem und extrazellularem Protein A verwendet.

Der Stamm Cowan I ist der Typ von Stamm für Untersuchungen der Zellwand, an welche Protein A gebunden ist (Nordström, K., Acta Universitatis Upsaliensis. Abstracts of Uppsala

Dissertations from the Faculty of Medicine 271 (1977)). Geringe Mengen an Protein, d.h. extrazellulares Protein A, wurden in dem Wachstumsmedium nachgewiesen, vermutlich bedingt durch Autolyse.
5

Der Stamm A676 ergibt nur extrazellulares Protein A (Lindmark u.a., Eur. J. Biochem. 74_^: 623-628 (1977)) und wird von Pharmacia AB zur industriellen Produktion von Protein A verwendet.
10

Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 aufgeführt. Alle Werte in den Tabellen sind für die Zelldichten korrigiert und somit direkt vergleichbar.

Tabelle 2

Produktion von an die Zellwand gebundenem Protein A in unterschiedlichen staphylococcen Spezies, kodiert durch Plas-

mid pSPA15

an die Zeil- extrazellu-

_ ,. . , wand gebunde- lares Pro-

Bakterienstamm _ ^ , . _ . .

nes Protein A tem A

Staphylococcus aureus:

Cowan I 100 12

113 1,5 0

113 (pSPA15) 3 0,3

U320 0 0

U320 (pSPAi5) 50 6

Staphylococcus epidermidis:

247 0 0

247 (pSPA15) 3 0,3

Staphylococcus xylosus:

KL117 0 0

KL117 (pSPA15) 3 0,3

In Tabelle 2 wird die Menge an Protein A, welches an die Zellwand gebunden ist, beim Stamm Cowan I als 100% angenommen, entsprechend einer Verdünnung von 1/256 beim ELISA-Test, gleich 120 mg Protein A/Liter mit Lysostaphin behandelter Kultur. Alle anderen Zahlen in der Tabelle sind auf diese Zahl bezogen.

Tabelle 3

Produktion von extrazellularem Protein A in unterschiedlichen staphylococcen Spezien, kodiert durch Plasmid pSPA

extrazellu- an die Zellwand

_ ,. . , lares Pro- gebundenes Pro-

Bakterienstamm , . - Z · Λ

tem A tem A

Staphylococcus aureus:

A676 100 0

113 0 1,5

113 (pSPA16) 3 1,5

U320 0. 0

U320 (pSPA16) 100 0

Staphylococcus epidermidis:

247 0 0

247 (pSPA16) 12 0

Staphylococcus xylosus:

KLI17 0 0

KL117 (pSPA16) 25 0

In der Tabelle 3 wird die Menge an Protein A in dem Wachstumsmedium (d.h. das extrazellulare Protein A) als 100% angenommen, entsprechend einer Verdünnung von 1/256 im ELISA-Test und entsprechend zu 90 mg Protein A/Liter Medium. Alle anderen Zahlen beziehen sich auf diese Zahl.

Aus den Tabellen 2 und 3 oben folgt, daß das Protein A, welches durch das Plasmid pSPAIS kodiert ist, im wesentlichen

- se -

an die Zellwand gebunden ist, wohingegen das ganze abgestumpfte Protein A, welches mit dem Plasmid pSPA16 kodiert ist, dem der Bereich X fehlt, in das Wachstumsmedium abgeschieden bzw. abgegeben wird.
5

Staphylococcus xylosus wird als Starterkultur für die Herstellung von "Rohwurst" (Liepe, H.-U., Forum Mikrobiologie _5; 10-15 (1982), Fisher u.a., Fleischwirtschaft 6_0: 1046-1051 (1980)) verwendet und kann somit als apathogene staphylococce Spezies angesehen werden. Aus diesem Grund ist §.· xylosus ι welcher kloniertes Protein-A-Gen enthält, eine Alternative zu S. aureus für die industrielle Erzeugung von Protein A.

Ein Protein A erzeugender Klon von Staphylococcus xylosus KL117, welcher das Plasmid pSPA16 enthält, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DMS), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, am 15. August 1983 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 2706.

Die Menge an Protein A, die bei den obigen Beispielen erhalten worden ist, ist keine maximale Ausbeute. Der Fachmann kann innerhalb seiner Fachkenntnisse die Ausbeute erhöhen, beispielsweise durch geeignete Wahl des Nährmediums etc.

Die oben erläuterten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bewirken nicht, daß die vorliegende Erfindung darauf beschränkt ist. Es können viele Variationen und Modifizierungen der Verfahren und der rekombinanten Materialien gemäß der Erfindung durchgeführt werden, die alle unter den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen, wie er durch die nachfolgenden Ansprüche definiert wird.

Die Erfindung umfaßt somit beispielsweise ebenfalls Klonierungsvehikel, die mehr als eine getrennte Deoxynucleotidsequenzkodierung für das gewünschte Protein oder Polypeptid enthalten. Die Erfindung umfaßt weiterhin ebenfalls rekombinante DNA-Moleküle, die Deoxynucleotidsequenzen enthalten und von irgendeiner beliebigen Quelle stammen, einschließlich natürlicher, synthetischer oder semisynthetischer Quel len, die den Deoxynucleotidsequenzkodierungen für das Protein A oder ein aktives Fragment davon, wie oben definiert, verwandt sind, durch Mutation einschließlich einzelner oder mehrfacher Basensubstitutionen, Weglassungen, Einsätzen und Inversionen.

Claims (22)

-η - PATENTANSPRÜCHE

1. Ein rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Deoxynucleotidsequenzkodierung für Protein A oder sein Polypeptidfragment, welches fähig ist, mindestens ein Immunoglobulin an seinem Fc-Teil zu binden, enthält.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekenn ze ichnet, daß die Deoxynucleotidsequenzkodierung für Protein A oder sein Polypeptidfragment sich von einem staphylococcen Donor ableitet.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß der staphylococce Donor ein Stamm von Staphylococcus aureus ist.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche bis 3, dadurch gekennzeichnet . daß die Deoxynucleotidsequenz eine funktioneile Signal-DNA-Sequenz umfaßt.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Signalsequenz

das Protein-A-Kodierungsgen des staphylococcalen Donors ist.
25

6. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Deoxynucleotidsequenz die Promotorsequenz des Protein-A-Kodierungsgens eines Protein A erzeugenden staphylococcen Donors enthält.

st

7. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Deoxynucleotidsequenz sich von E. coli SPA11, DSM Nr. 2434

ableitet.
5

8. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß zwei oder mehr der Deoxynucleotidsequenzen zusammen für ein oligomeres Protein oder Polypeptid von Protein A und/oder ein akti ves Fragment davon oder eine Vorstufe davon kodieren.

9. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß es ein
rekombinantes Plasmid ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Mo leküls nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß man mindestens eine Deoxynucleotidsequenzkodierung für das Protein A oder ein Polypeptidfragment davon, welches mindestens ein Immunoglobulin an den Fc-Teil davon binden kann, in ein Klonierungsvehikel
einsetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Deoxynucleotidsequenz durch Digerierung von staphylococcer DNA mit mindestens einem Restriktionsenzym erhalten wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch g e kennzeichnet , daß es eine oder mehrere Subklonierungsstufen umfaßt.

13. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er durch das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 transformiert worden ist.

14. Mikroorganismus nach Anspruch 13, dadurch g e kennzeichnet, daß er ein Bakterium_/bevorzugt ein grampositives Bakterium, ist.

15. Mikroorganismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Bacillus- oder Staphylococcus-Stamm ist.

16. Mikroorganismus nach Anspruch 15, dadurch g e kennzeichnet, daß er ein Stamm von Bacillus subtilis ist.

17. Mikroorganismus nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß er ein Stamm von Staphylococ- cus xylosus ist.

18. Mikroorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß er eine Hefe ist.

19. Verfahren zur Herstellung des transformierten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß in einen Wirtorganismus das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 eingeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß es mindestens eine Subklonierungsstufe umfaßt.

21. Verfahren zur Herstellung von Protein A oder eines Derivats davon, welches mindestens ein Immunoglobulin an seinem Fc-Teil binden kann, dadurch gekennzeichnet, daß man den transformierten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 13 bis 18 in einem geeigneten Nährmedium züchtet und das gewünschte Produkt daraus isoliert.

- en -

22. Protein A oder ein Derivat davon, welches mindestens ein Immunoglobulin an seinem Fc-Teil binden kann, dadurch gekennzeichnet , daß es nach dem Verfahren nach Anspruch 21 erhalten worden ist.