DE3390106T1 - Ein DNA-Fragment, welches eine Signal-DNA-Sequenz enthält, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein damit transformierter Mikroorganismus - Google Patents

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KRAUS ■ WEISERT & PARTNER PATENTANWÄLTE

UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PAT E N fA. M T» m. Λ Λ Λ DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. DIPL.-ING. ANNEKÄTE WEISERT ■ DIPL.-PHMB. «JawH U\l Λ Ββ WPIES

IRMGARDSTRASSE 15 ■ D-8ÖOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077 TELEGRAMMKRAUSPATENT · TELEX 5-212156 kpat d ■ TELEFAX (Ο89) 7 91 82 33

4 419 AW/an

PHARMACIA AB ..'·.. ■ Uppsala, Schweden

Ein DNA-Fragment, welches eine Signal-DNA-Sequenz enthält, ein Verfahren zu seiner Herstellung und ein damit transformierter Mikroorganismus

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Gentechnologie, und sie betrifft insbesondere eine neue staphylococcale Signalsequenz und ihre Verwendung bei der Rekombinations-DNA-Technologie für die Herstellung von Proteinen und Polypeptiden, die durch eine Zellmembran abgeschieden werden können.

Von den Proteinen und Polypeptiden, die innerhalb der Zellen von prokaryotischen wie auch eukaryotischen Organismen synthetisiert werden, werden einige innerhalb der Zellen zurückgehalten, während andere längs der Zellmembran exportiert werden, die sogenannten extrazellularen Proteine und Polypeptide. Die Zelle besitzt somit die Fähigkeit, Proteine und Polypeptide, die innerhalb der Zelle zurückgehalten werden, und solche, die exportiert bzw. abgegeben oder abgeschieden werden, zu erkennen. Diese Fähigkeit wird im allgemeinen einem metabolisch kurzlebigen "Signal"-Peptid in dem Führungsende des Proteins oder Pölypeptids, d.h. dem Ende, das zuerst in der Zelle während der Translation von mRNA synthetisiert wird, zugeschrieben. Obgleich der genaue Mechanismus nicht

vollständig bekannt ist, nimmt man an, daß das Signalpeptid mit der Zellmembran zusammenwirkt, diese durchdringbar macht und den Rest des Proteins oder Polypeptids dadurch dirigiert. Die Initiierung des Sekretionsverfahrens kann während der Translation stattfinden. Das Signalpeptid wird während des Verfahrens gespalten und wird nicht außerhalb der Zelle nachgewiesen. ■

Was oben gesagt wurde, ist für grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacillus-Spezies, wahr, welche nur eine Membran besitzen, die das Cytoplasma umschließt. Bei gramnegativen Bakterien jedoch, wie beispielsweise Escheric.hia coil (E. coli), ist die cytoplasmische Membran durch eine äußere Membran umgeben, wobei die Außen- und die Innenmembran zusammen zwischen sich einen periplasmischen Raum begrenzen. Das Signalpeptid beeinflußt nur die Penetration der inneren Membran, und die Proteine und Polypeptide, die dadurch sekretieren, werden zwischen den beiden Membranen eingeschlossen. Solche Proteine und Polypeptide, die zu dem periplasmischen Raum transportiert bzw. exportiert werden, werden als periplasmische Proteine und Polypeptide bezeichnet.

Entsprechend dem obigen ist ein extrazellulares oder periplasmisches Protein oder Polypeptid das Spaltungsprodukt eines Präpeptids oder einer Vorstufe, das aus dem vollentwikkelten Protein oder Polypeptid mit einem Signalpeptid, gebunden an sein terminales Aminoende, besteht.

Die bis heute bekannten prokaryotischen Signalpeptide besitzen viele gemeinsame Merkmale, die die Aminosäuresequenz betreffen. So besitzen derartige Signalpeptide normalerweise etwa 15 bis 35 Aminosäuren, wobei deren Zahl und Sequenz einem relativ regelmäßigen Muster folgen. Die ersten Aminosäuren, d.h. solche am Führungs- oder terminalen Aminoende, sind basisch. Auf diese basische Sequenz folgt eine hydrophobe Sequenz von etwa 10 bis 25 Aminosäuren, wovon mehrere "flexibel" sind, wie GIy und Pro. Schließlich ist eine Spaltungsstelle für die Abtrennung des Signalpeptids von dem vollentwickelten Protein, welche normalerweise eine Amino-

saure mit einer kleinen Nebengruppe bzw. Seitenkette, wie Ala oder GIy, enthält, vorhanden.

Durch die relativ neue Rekombinations-DNA-Technologie kann ein Gen von einem Stamm oder Spezies in einen anderen eingeführt werden und diesem die gewünschte Eigenschaft übertragen. Als Beispiele für erfolgreiche Gentransfere kann man die Einführung humaner Genkodierungen für das Wachstumshormon Somatostatin, von Insulin und Interferon in Bakterien, wie E. coli, erwähnen. In Fällen, bei denen das eingesetzte extrachromosomale Gen für ein intrazellulares Protein oder Polypeptid kodiert, wird das innerhalb der Zelle synthetisierte Protein oder Polypeptid jedoch nicht sekretiert bzw. abgeschieden werden, und die Zelle des gezüchteten transformierten Mikroorganismus muß aufgebrochen oder zerstört werden, bevor das Protein oder Polypeptid gewonnen werden kann. Eine derartige Zellzerstörung kann vermieden werden, indem man das Führungsende des Genkodes für das volientwickelte Protein oder Polypeptid an eine DNA-Sequenzkodierung für ein geeignetes Signalpeptid, eine sogenannte Signal- oder Führungssequenz, bindet. Eine Vorstufe des gewünschten Proteins oder Pölypeptids wird dann innerhalb der Zelle synthetisiert, und das vollentwickelte Protein oder Polypeptid wird während der Spaltung der Vorstufe längs der Zellmembran abgeschieden. Hierdurch wird die Gewinnung und Reinigung des Protein- oder Polypeptidprodukts wesentlich vereinfacht und verbessert, da es nicht länger erforderlich ist, die Zelle zu zerstören, und dadurch wird die Freigabe unerwünschter Bakterienproteine vermieden. Ein weiterer Vor· teil ist der, daß höhere Konzentrationen von nichtspezifischen Wirtproteinen innerhalb der Wirtzellen, die starke Einflüsse auf die Lebensfähigkeit des Wirtes besitzen, vermieden werden, da derartige heterologe Proteine sofort abgeschieden bzw. sekretiert werden. Eine sofortige Sekretion verhindert irgendeine Feedback-Inhibierung der Produktsynthese bei Fällen, bei denen die Produktion gegenüber einem solchen Mechanismus empfindlich ist.

■ Die Zahl der DNA-Sequenzen, die identifiziert wurden und die für die Verwendung bei Rekombinations-DNA-Techniken verfügbar sind, ist jedoch relativ niedrig, und über die Spezies-Spezifizität ist wenig bekannt, da nur wenige Beispie-Ie ihrer Wirkung in anderen Spezies untersucht wurden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein DNA-Fragment zur Verfügung zu stellen, welches eine neue identifizierte Signal- oder Führungssequenz aufweist und in der Rekombinations-DNA-Technologie nützlich und mit fremdem DNA-Material funktionsfähig ist. Zusätzlich zu der Signalsequenz enthält das DNA-Fragment eine Insertionsstelle für eine DNA-Sequenzkodierung für ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid, so daß die Signalsequenz zusammen mit der DNA-Sequenz für eine Vorstufe des Proteins oder Polypeptids kodiert. Das erfindungsgemäße DNA-Fragment ist dadurch gekennzeichnet, daß die Signalsequenz diejenige eines Protein-A-Kodierungsgens einer Staphylococcusspezies, wie Staphylococcus aureus, oder eines chemisch synthetisierten Äquivalents davon ist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Erzeugung eines solchen DNA-Fragments. ■ .:

Die genaue Aminosäuresequenz des Protein-A-Signalpeptids kann zwischen verschiedenen Stämmen und Mutanten von Staphylococci variieren. Die Erfindung betrifft jedoch alle DNA-Fragmente, welche eine Signalsequenz enthalten, die sich von einem staphylococcen Protein-A-Gen oder einem chemisch synthetisierten Äquivalent davon ableiten.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Klonvehikel· oder -vektor, welches bzw. welcher eine Signalsequenz, die ein DNA-Fragment enthält, aufweist, wie auch ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der durch ein solches Klonvehikel transformiert wurde, wie auch ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Rekombinanten-DNA-Molekül, welches ein Klonvehikel mit eingesetztem Gen oder einem Teil davon enthält und für ein ausgewähltes Protein oder Po·*- lypeptid kodiert, wie auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Rekombinanten-DNA-Moleküls bzw. Rekombinations-DNA-Moleküls. .

Die Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der durch ein solches Rekombinanten-DNA-Molekül transformiert

ist. . .. . .

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Erzeugung eines ausgewählten Proteins oder Polypeptids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen solchen transformierten Mikroorganismus züchtet.

Ein Beispiel für eine identifizierte Staphylococcen-DNA-Sequenz, welche eine Signalsequenz aufweist, die in dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment vorhanden sein kann, wird im folgenden mit der entsprechenden Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet ist, aufgeführt, (in der vorliegenden Anmeldung werden die IUPAC-Aminosäuren-Abkürzungen .verwendet; J.Biol. Chem. 24±, 527 und 2491 (1966)).

TTGAAAAAGAAA AACATTTATTCA ATTCGTAAACTA GGTGTAGGTATT LeuLysL'jsLuc; AsnlleTwrGer IlcArüLv/üLou GlyVcjlGluIle

1 /ο

GCATCTGTAACT TTACiGTACATTA CTTATATCTGGT GGCGTAACACCT AliiSerVolThr LeuGl'-dhrlcu LeulIeSorGlu -GlyVcilThr.F'rö ^io 30

,GCTGCAAATGCT GCGCAACACGAT GAAGCT

ΑΙ.ΛΙ,ΛΜ,Αγ^Γ,Η^ G₁U_nI.,

Die obige Aminosäuresequenz, welche 42 Aminosäurereste enthält, besitzt die in der Vergangenheit diskutierten allge-. meinen Merkmale eines prokaryotischen Signalpeptids. So

enthält sie eine basische aminoterminale Region von 11 Aminosäuren, die ein Tyrosin-, ein Arginin- und vier Lysinreste enthalten. Darauf folgt eine hydrophobe Stretch (= Kette bzw. dilatierende Kette bzw. dehnbare Kette)(im folgenden wird der angelsächsische Ausdruck verwendet) von 23 Aminosäuren einschließlich verschiedener flexibler Reste, d.h. fünf Glycinresten und einem Prolinrest. Stromabwärts von der hydrophoben Region sind mehrere Alanine vorhanden, welche Spaltungsstellen für eine Protease sind. Mögliche Spaltungsstellen (cleavage sites) werden durch Pfeile (t) angegeben. Es ist derzeit nicht bekannt, welches die tatsächliche Spaltungsstelle ist, aber aus verschiedenen Gründen liegt diese Stelle höchstwahrscheinlich zwischen den beiden Ala-Resten 36 und 37. Dies würde ein Signalpeptid ergeben, welches aus den ersten 36 Aminosäureresten in der Formel besteht.

Die besonderen Verfahren für die Einführung des erfindungsgemäßen DNA-Fragments in ein besonderes Klonierungsvehikel oder einen -vektor wie auch die Einführung einer Restriktionsstelle in ein DNA-Fragment sind gut bekannt und werden hier nicht weiter beschrieben. Solche Verfahren können die Spaltung des Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym, den Einsatz des DNA-Fragments, welches die Signalsequenz enthält, in den Vektor und, wenn das DNA-Fragment keine geeignete Restriktionsstelle stromabwärts von der Signalsequenz entsprechend dem obigen enthält, die Einführung einer solchen Stelle darin umfassen. Verfahren für die Einführung eines DNA-Fragments, welches eine Signalsequenz enthält, in einen Vektor werden beispielsweise von James Kroyer und Shing Chang, Gene _1_5, 343 bis 347 (1981) beschrieben, und die Einfügung einer Restriktionsstelle in ein DNA-Fragment wird beispielsweise von Gillam, S. und Smith, M., Gene 8^, 81 bis 97 (1979) beschrieben. Auf diese Offenbarungen wird expressis verbis Bezug genommen.

Klonierungsvehikel oder Vektoren, die mit dem DNA-Fragment versehen sein können, welches eine Signalsequenz entsprechend der vorliegenden Erfindung aufweist, hängen unter anderem von der Natur der Wirtzelle, die transformiert werden soll, ab. Geeignete Klonierungsvehikel können beispielsweise Segmente von chromosomalen, nichtchfomosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen enthalten, wie verschiedene bekannte bakterielle Plasmide, beispielsweise Plasmide von E. coli inschließlich pBR322 und ihre Derivate, Phage-DNA, wie

1.0 Derivate von Phage lamda, Vektoren, die sich von Kombinatio- ; nen von Pläsmiden und Phage-DNAn ableiten, Hefeplasmide, Verbundplasmide bzw. Kompositplasmide etc. Die besondere Auswahl des Klönierungsvehikels hinsichtlich eines besonderen Wirtes kann durch den Fachmann erfolgen.

Wirtorganismen, die mit einem Klonierungsvehikel, welches ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment enthält, transformiert werden können, sind bevorzugt grampositive Bakterien, aber andere geeignete Wirte können ebenfalls verwendet werden, wie Hefen und andere Fungi, Pflanzenzellen in Kultur etc..

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße DNA-Fragment den Promotor des Protein-A-Kodierungsgens, der sich von einem Staphylococcendonor ableitet,

2.5 so daß der Promotor funktionell in einem Klonierungsvehikel ist, welches das erfindungsgemäße DNA-Fragment enthält. Bevorzugt leitet sich der Promotor von dem gleichen Protein-A-Kodierungsgen wie die Signalsequenz ab. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße DNA-Fragment die gesamte Expressionskontrollregion eines Prötein-A-Kodierungsgens.

Wie zuvor erwähnt, kann das erfindungsgemäße DNA-Fragment, welches eine Signalsequenzkodierung für ein Signalpeptid einer Protein-A-Vorstufe enthält, aus der DNA irgendeines Protein A erzeugenden Staphylococcenspezies nach an sich

bekannten Verfahren erhalten werden. Ein derartiges DNA-Fragment kann ebenfalls durch chemische Synthese oder durch Kombination einer chemisch synthetisierten DNA-Sequenz mit einer DNA-Sequenz, die sich von einem Staphylococcendonor ableitet, hergestellt werden.

Der Ausdruck "Protein A" in den Ausdrücken "Protein-A-Kodierungsgen" und "Protein-A-Vorstufe" bedeutet ein Makromolekül, welches durch Staphylococcenspezies, wie Staphylococcus aureus, gebildet worden ist. Dieses Protein ist dadurch gekennzeichnet, daß es an den Fc-Teil von Immunoglobulin Typ G bindet, und es wird weiter von Sjödahl, J., Eur. J. Biochem. 73.. 343 bis 351 (1977) und 7_8, 471 bis 490 (1977) wie auch in der schwedischen Patentanmeldung 82 04 810-9 der gleichen Anmelderin beschrieben.

Die oben erwähnte Insertions- bzw. Einsatzstelle für ein Gen oder einen Teil davon in dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment kann unmittelbar nach der Signalsequenz sein; sie kann jedoch auch weiter stromabwärts sein. Im letzteren Fall wird die gebildete Vorstufe eine Zahl von "extra" Peptideinheiten zwischen dem Signalpeptid und der Polypeptidsequenz entsprechend dem eingesetzten Gen oder Genteil enthalten. Als Folge wird das vollentwickelte Protein oder Polypeptid, welches erhalten wird, nachdem das Signalpeptid abgespalten wird, diese extra Peptideinheiten in seinem Führungsende enthalten. Dies hat im allgemeinen keine nachteiligen Wirkungen auf das Produkt. Der Ausdruck "Vorstufe eines Proteins oder Polypeptide" soll auch solche Moleküle mit umfassen, bei denen das Signalpeptid im Abstand von dem besonderen Protein oder Polypeptid durch eine derartige extra Peptidsequenz vorhanden ist.

Die Erfindung wird anhand der folgenden, nichteinschränkenden Beispiele näher erläutert. In der ausführlichen Beschreibung (wie auch in der obigen Beschreibung) gelten die folgenden Definitionen:

Nucleotid -- Eine monomere Einheit von DNA oder RNA, die einen Zuckermolekülteil (Pentose), ein Phosphat und eine stickstoffhaltige heterocyclische Base aufweist. Die Base ist an den Zuckermolekülteil über ein glycosidisches. Kohlenstoffatoni (1 '-Kohlenstoff der Pentose) gebunden, und diese Kombination von Base und Zucker ist ein Nucleosid. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").

■..··..

DNA-Sequenz — Eine lineare Reihe von Nucleotiden, die aneinander über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'-; und 5'-Kohlenstoffatomen benachbarter Pentosen gebunden sind.

15. Codon — Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplet), welche über Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssignal verschlüsselt. Beispielsweise verschlüsseln die Nucleotid- ·■ triple tte TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstopsignale, und ATG ist ein Translationsstartsignal.

Plasmid -- Eine nichtchromosomale doppelstrangige DNA-Sequenz, welche ein intaktes "Replikon" aufweist, so daß das Plasmid in der Wirtzelle vervielfältigt wird. Wenn das Plasmid in einen unizellularen Wirtorganismus gegebenen wird, ändern sich die Eigenschaften des Organismus oder werden transformiert als Ergebnis der DNA des Plasmids. Beispielsweise transformiert ein Plasmid, welches ein Gen für die Tetracyclinresistenz (Tet) trägt, eine Wirtzelle, die zuvor gegenüber Tetracyclin empfindlich war, in eine, die dagegen resistent ist. Eine Wirtzelle, die durch ein Plasmid transformiert worden ist, wird als "Transformant" bezeichnet.

Phage oder Bacteriophage — Bakterieller Virus, wovon viele DNA-Sequenzen aufweisen, die in eine Proteinumhüllung oder -schutzüberzug eingekapselt sind.

Klonierungsvehikel bzw. Klonvehikel — Ein Plasmid, Phage-DNA oder andere DNA-Sequenz, welche sich in einer Wirtzelle vervielfältigen kann und durch eine oder eine kleine Anzahl von Endonucleaserekognitionsstellen oder Restriktionsstellen ausgezeichnet ist, wo seine DNA-Sequenz auf bestimmbare Art gespalten bzw. geschnitten werden kann, ohne nennens- . werten Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA, beispielsweise der Replikation, die Produktion von Umhüllungs- bzw. Einkapselungsproteinen oder Verlust des Promotors oder der Bindungsstellen, und welche einen Marker
aufweist, der für die Verwendung der Identifizierung der
transformierten Zellen, beispielsweise der Tetracyclinresistenz oder der Ampicillinresistenz, geeignet ist. Ein KIonierungsvehikel .ist ebenfalls als Vektor bekannt.

. . ■ ,

Wirt bzw. Host — Ein Organismus, der bei der Transformation durch ein Klonierungsvehikel das Klonierungsvehikel befähigt, sich zu vervielfältigen und seine anderen biologischen Funktionen auszuüben, beispielsweise die Produktion von Polypeptiden oder Proteinen durch Expression der Gene eines
Plasmids.

Klonierung ·— Das Verfahren, bei dem man eine Population
von Organismen oder DNA-Sequenzen, die sich von solchen Organismen oder Sequenz ableiten, durch asexuelle Reproduktion erhält.

Expression — Das Verfahren, das ein Gen unter Bildung eines Polypeptids oder Proteins durchmacht. Es ist eine Kombination der Transkription und Translation.

Transkription — Das Verfahren zur Erzeugung von mRNA aus
einem Gen.

Translation — Das Verfahren zur Erzeugung eines Proteins
oder Polypeptids aus mRNA.

4ft

-Vi-

Promotor — Der Bereich von DNA eines Gens, wo sich RNA-Polymerase bindet und die Transkription initiiert. Ein Promotor ist vor der Ribosomenbindungsstelle des Gens lokalisiert,

Ribosomenbindungsstelle -- Der Bereich der DNA eines Gens, der für eine Stelle auf mRNA kodiert, die hilft, das mRNA an- das Ribosom zu binden, so daß die Translation beginnen kann. Die Ribosomenbindungsstelle liegt nach dem Promotor und vor dem Translationsstartsignal des Gens. 10

Gen — Eine DNA-Sequenz, welche als Templat für mRNA eine

■ ■ ψ ■ .

Sequenz der Aminosäuren, die für ein spezifisches Polypeptid oder Protein charakteristisch ist, verschlüsselt. Ein Gen enthält einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, ein Translationsstartsignal und eine strukturelle DNA-Sequenz. Im Falle eines exportierten oder abgeschiedenen Proteins oder Polypeptids enthält das Gen ebenfalls eine Signal-DNA-Sequenz .

Expressionskontrollsequenz -- Eine DNA-Sequenz in einem Klonierungsvehikel, welche die Expression der Gene des KIonierungsvehikels kontrolliert und reguliert, wenn sie arbeitsfähig bzw. betriebsfähig an solche Gene gebunden ist.

Signal-DNA-Sequenz -- Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens für ein Polypeptid oder Protein, welche als Templat für . rtiRNA eine Sequenz von hydrophoben Aminosäuren am Aminoterminus des Polypeptids oder Proteins verschlüsselt, d.h. eine "Sighalsequenz" oder "hydrophobe Führungssequenz" des PoIypeptids oder Proteins. Eine Signal-DNA-Sequenz ist in einem Gen für ein Polypeptid oder Protein unmittelbar vor der strukturellen DNA-Sequenz des Gens und nach dem Translationsstartsignal (ATG) des Gens lokalisiert. Eine Signal-DNA-Sequenz kodiert für die Signalsequenz des Polypeptids oder Proteins, welche (Signalsequenz) charakteristisch für die Vorstufe des Polypeptids oder Proteins ist.

Vorstufe — Ein Polypeptid oder Protein, wie es innerhalb einer Wirtzelle mit einer Signalsequenz synthetisiert wird.

Stromabwärts und stromaufwärts — Bei einer Kodierungs-DNA-Sequenz ist stromabwärts die Richtung der Transkription, d.h. in der Richtung von 5' zu 3'. Stromaufwärts ist die entgegengesetzte Richtung.

Rekombinations- bzw. Rekombinanten-DNA-Molekül oder Hybrid-DNA — Ein Molekül, welches Segmente von DNA von unterschiedlichen Genomen enthält, die Ende, an Ende außerhalb lebender Zellen zusammengefügt mw. aneinandergebunden wurden und die Fähigkeit haben, einige Wirtzellen zu infizieren, und die darin gehalten werden können.

" . ■ . · Strukturelle DNA-Sequenz bzw. Struktur-DNA-Sequenz -- Eine DNA-Sequenz innerhalb eines Gens, welche als Templat für mRNA eine Sequenz von Aminosäuren verschlüsselt, die für ein spezifisches vollentwickeltes Polypeptid oder Protein charakteristisch ist, d.h. die aktive Form des Polypeptids oder Proteins.

In den beigefügten Zeichnungen:

Figur 1 ist eine schematische Erläuterung einer zirkulären Restriktionskarte einer Plasmid-DNA (pSPAT)-Kodierung für Protein A. Die Größe der Karte wird in Kilobasen, ausgehend von der Eco-RI-Restriktionsstelle bei 12 Uhr angegeben, welche eine Restriktionsstelle innerhalb des Vektors pBR322 ist. Die Stellungen der Eco-RI- Eco-RV-Hind-III-, Pst-I- und Barn HI-Restriktionsstellen sind angegeben. Die Verbindungen bzw. Junktionen zwischen dem Vektor und der eingesetzten DNA sind mit Pfeilen angegeben .

Figur 2A ist eine schematische Darstellung des Protein-A-Kodierungsgens und zeigt dessen verschiedene Regionen. Die dunklere Linie stellt die DNA des Vektors pBR322 dar". S ist eine Signalsequenz, A-D sind IgG-Bindungsregionen, .5 die zuvor identifiziert wurden, E ist eine Region homolog zu A-D, und X ist der C-terminale Teil des Proteins A, der keine IgG-Bindungsaktivität hat.

Figur 2B ist eine detaillierte Restriktionskarte der DNA-Sequenz entsprechend Figur 2A und zeigt die Restriktionsstellen für Taq I, Hind III, Eco RV, Pst I, Bei I und Sau 3A. Die Größe ist"'in Kilobasen angegeben, ausgehend von der gleichen Eco-RI-Restriktionsstelle wie in Figur. 1 angegeben. Die Verbindungsstelle zwischen dem Vektor pBR322 und dem eingesetzten DNA-Fragment ist mit einem Pfeil angegeben. Die Restriktionsstellen für Tag I (zwei) und Rsa I (eine) innerhalb der Vektorsequenzen wurden weggelassen.

In den Figuren 3A bis D ist die Basensequenz für das strukturelle Protein-A-Gen angegeben. Zwei mögliche Promotoren (-35 und -10) und eine-mögliche Shin-Dalgarno-Sequenz (angezeigt durch "=") sind angegeben. Die Aminosäuresequenz, wie sie sich von der DNA-Sequenz ableitet, ist ebenfalls aufgeführt (die IUPAC-Aminosäureabkürzungen werden verwendet; J. Biol. Chem. 241, 527 und 2491 (1966)). Die fünf Aminosäuren (Reste 99, 101, 120, 199 und 273), die sich, verglichen mit der Aminosäuresequenz, die von Sjödahl oben angegeben wurde,, unterscheiden, sind angegeben wie auch die acht Reste (von 50) im Bereich E, die sich von der entsprechenden Aminosäure des Bereichs D unterscheiden. Die Startreste der Bereiche S, E, D, Av:B, c und X sind durch Pfeile angegeben.

Figur 4 ist ein Autoradiograph (eine autoradiographische Darstellung) eines Nucleotidsequenzgels, wo die Verbin-

dungssteile zwischen den Bereichen D und E der Figur. 3 dargestellt sind. Die Sequenzierung (entsprechend Maxafn u.a., P.N.A-S. 7_4, ⁵⁶⁰ bis 564 (1977)) erfolgte auf einem DNA-Fragment, welches an der Bcl-I-Stelle in der Position 0,9 kb in Figur 2 markiert war. Die teilweise chemisch abgebauten Produkte wurden in einem 8%igen Polyacrylamidsequenzgel (Maize! u.a., Methods in Vir. 5, 179 bis 246 (1970)) aufgelöst bzw. aufgespalten.

Figur 5 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

R
von IgG-Sepharose -gereinigten Zellextrakten. pBR322 und pSPA1 stellen Extrakte von E.-coli-Zellen dar, die das entsprechende Plasmid tragen. SPA ist ein im Handel erhältliches Protein A von S_. aureus (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Adeno-2 (AD 2)-Proteine werden als Größenmarker verwendet.

Figur 6 ist eine schematische Kartendarstellung von Plasmid pSPAi5, AMP und CML und erläutert Gene, die für Am- . picillin- und Chloramphenicolresistenz kodieren, wobei Ori Replikationsursprünge sind und SPA das strukturelle Protein-A-Gen bezeichnet.

Figur 7 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide, welche das gesamte Protein-A-Gen oder Teile davon enthalten. Einige Restriktionsstellen werden dargestellt. Kästen bzw. Rechtecke bedeuten Strukturgene, und die Pfeile zeigen die Orientierung (vom Startcodon in Richtung zum Stopcodon). Der Replikationsursprung wird ebenfalls durch Ori angegeben. AMP und TET sind die Gene, die für die Ampicillin- bzw. Tetracyclinresistenz kodieren. PROT A ist das Gen, das für Protein A kodiert und lac Z¹ ist das Gen, das für den N-terminalen Teil von ß-Galactosidase kodiert. (Rüther u.a., Nucl. Acids Res. 9, 4087 bis 4098 (1981)). .

■ ■■■ .· ■ ■ ■' ■ ft ■ ·. ;:;^^:. ■ ν-.O¹I-

Figur 8 ist eine schematische Erläuterung der Konstruktion des Plasmids pSPA16. Die verwendeten Abkürzungen sind die gleichen wie in Figur 6. S, E, D und B besitzen die . gleiche Bedeutung wie in Figur 2, und A¹ und C sind Tei-Ie der entsprechenden IgG-Bindungsregionen A und C des Protein-A-Kodierungsgens.

Figur 9 ist eine Präsentation der Nucleotidsequenz und der entsprechenden deduzierten Aminosäuresequenz um das 3'-Ende des Protein-Α-Gens im Plasmid pSPA16. xxx bedeu-. tet das neue Stopcodon.

Figuren 10A bis C sind eine kombinierte Darstellung, ähnlich wie Figur 2, der Plasmide pSPA15 (B) und pSPA16 (C) zusammen mit der entsprechenden Restriktionskarte (A), die daran angefügt ist. Die dunkle Linie bedeutet das Protein-A-Strukturgen.

Figur 11 ist eine schematische Darstellung der Sequenz-Strategie (C), die für die Sequenzierung des 1,8 kb Taq-I-Eco-RV-DNA-Fragments (B) verwendet wurde, die das Protein-A-Kodierungsgen (A) enthält, wobei man die in Figur 3 dargestellte Sequenz erhält.

In den Beispielen wurden die folgenden Ausgangsmaterialien, Puffer, Zellmedieh und Routineverfahren verwendet.

Äusgangsmaterialien

Bakterienwirte: Vier Stämme von E. coli K12 wurden in den Beispielen verwendet: HB101, beschrieben von Boyer u.a., J. Mol. Biol. 4J_, 459-472. (1969) ; 259, beschrieben von Jacob, F. und Wollman, E.C. Ann. Inst. Pasteur 9J_, 486-510 (1956); GM 161, beschrieben von Marinus, M.G., MoIeC gen. Genet. 127, 47-55 (1973) ; RRI del M15 (Langey u.a., Proc. Natl. Ac ad·. Sei., USA, 72, 1 254-1 257 (1 975) ).

(Die Stämme sind beim Department of Microbiology (N), Biomedial Centre, Uppsala, Schweden erhältlich.)

Weiterhin wurden die folgenden vier Staphylococcus-Stämme verwendet: S. epidermidis 24 7, beschrieben von Rosendorf u. a., J. Bacteriol. 120: 679-686 (1974); erhalten von Inst, of Medical Microbiology, Universität von Zürich, Schweiz; S. xylosus KL117, beschrieben von Schleifer u.a., Int. J. Syst. Bacteriol. 25: 50-61 (1975) und Schleifer u.a., Arch.

Microbiol. 122: 93-101 (1979); erhalten von Inst.f.Mikrobiologie, Technische Universität München, Bundesrepublik Deutschland; S. aureus SA113, beschrieben von Iordanescu u. a. (J. Gen. Microbiol. 9_6: 277-281 (1976)); S. aureus 320, eine Protein-A-negative Mutante des Stammes

S. aureus 113, isoliert beim Department of Micorbiology, Biomedical Centre, Uppsala, Schweden und beschrieben von Jonsson u.a., Curr. Microbiol. ^: . . (1983).

Klonierungsvehikel: Die in den Beispielen verwendeten Klonierungsvehikel waren pBR322, wie von Bolivar u.a., Gene 2_, 95-113 (1977) konstruiert und beschrieben; pBR328, wie von Soberon, X. u.a.,.Gene j?, 287-305 (1980) konstruiert und beschrieben; pTR262, wie von Roberts, T.M. u.a., Gene 12, 123-127 (1980) konstruiert und beschrieben; pHV14, wie von Ehrlich, S.D., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7£, 3240-3244 (1978) konstruiert und beschrieben, und pHV33, wie von Primrose, S.B. und Ehrlich, S.D., Plasmid £, 193-201 (1981) konstruiert und beschrieben; pUR222, wie von Rüther u.a., Nucl. Acids Res., 9_, 4087-4098 (1981) konstruiert und beschrieben.

Puffer und Medien

Triton-Gemisch: 0,1% Triton X-100, 0,125 M EDTA und 20

mM Tris (pH 8,0) Tris-EDTA-Puffer

("TE") : 0,001 M EDTA.und 0,01 M Tris (pH 7,8)

CY-Brühe (Nährmedium): Difco-Casein-Hydrolysat 1%, Difco-

Hefeextrakt 1% und Glucose 0,5%; 4 ml 1,5 M Glycerinphosphat wird bis 100 ml CY-Nährmedium zugegeben

Beschichtungs- bzw.

Coating-Puffer 1,5 9 Na₃CO₃, 2,9 3 g NaHCO₃ und 0,2 g

(Carbonat - Bicarbonat - pH 9,6.) :

NaN₃, mit destilliertem H₃O auf 1 Liter aufgefüllt

10 PBS-TWEEN

8,0 g NaCl, 0,2 g KH₂PO₄, 2,9 g Na₃HPO₄

(phosphatgepuffer- χ 12 H₂O, 0,2 g KCi, 0,5 ml TWEEN 20 und te Salzlösung 0,2g NaN₃, mit destilliertem Wasser auf plus 0,05% TWEEN^R): 1 Liter aufgefüllt; pH 7,4

Diethanolaminpuf fer 1096:

Luria-Kultürmedium ("LB"):

97 ml Diethanolamin, 800 ml destilliertes H₂O, 0,2 g NaN₃ und 100. mg MgCl₃ χ 6 H₂O; pH mit 1 M HCl auf 9,8 eingestellt; mit destilliertem H₃O auf 1 Liter aufgefüllt

10g Difco-Trypton, 5 g Difco-Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 2 ml 1 M NaOH; mit 1 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt; 10 ml 20%ige Glucose nach Behandlung im Autoklaven zugegeben

LA-Medium

TEB-Puffer:

Luria-Kulturmedium mit 1% Difco^Agar Supplementiert 0,09 M Trisborat, 0,09 M Borsäure und 0,002 M EDTA

Routineverfahren

Bestimmte Verfahren wurden in den Beispielenwiederholt durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden sie jedesmal genau wie folgt durchgeführt.

Transformationen: Transformation von E. coli K12 mit Plasmid-DNA erfolgte genau, wie durch Morrison, D.A., Methods in Enzymology, Academic Press 6_8, 326-331 (1979) beschrieben. Die transformierten Zellen wurden in an sich bekannter Weise auf Platten selektiert, indem man die einzelnen Kolonien auf LA-Platten, die geeignete Antibiotika, beispiels- . weise 35 μg/ml Ampicillin oder 25 μg/ml Chloramphenicol, enthalten, aufbrachte. ,

Isolierung der Plasmide: Die Präparation der Plasmide in großem Maßstab erfolgte genau, wie von Tanaka, T. und Weisblum, B. in J. Bacteriol. 121, 354-362 (1975) beschrieben. Zum Nachweis einer großen Zahl von Klonen für Plasmide wurde das ".Mini-Alkaliverfahren" genau, wie von Birnboim, H.C. und DoIy, J. in Nucl. Acids Res. Ί_, 1513-1523 (1979) be- . schrieben, angewendet.

Restriktionsenzymdigestion von DNA: DNA wurde mit bekannten Restriktionsenzymen, die von New England Bio Labs, Waltham MA, USA gekauft wurden, gespalten. Die Restriktionsenzyme wurden zu DNA bei üblichen Konzentrationen und Temperaturen und mit Puffern, wie von New England Bio Labs empfohlen, zugegeben.

Abbindung bzw. Ligation der DNA-Fragmente: Alle DNA-Fragmente wurden bei 14⁰C über Nacht mit T4-DNA-Ligase, erhalten von New England Bio Labs, Waltham, MA, USA, in einem vom Hersteller empfohlenen Puffer abgetrennt bzw. abgebunden.

Agarosegelelektrophorese: 0,7%-Agarosegelelektrophorese für die Abtrennung der geschnittenen Plasmidfragmente, der supercoiled Plasmide und der DNA-Fragmente mit einer Länge von 1000 bis 10 000 Nucleotiden erfolgte genau, wie von Helling u.a., J. Vir. J_£, 1235-1244 (1974) beschrieben.

Polyacrylamidgelelektrophorese: 5%-Polyacrylamidgelelektrophorese für die Abtrennung der DNA-Fragmente mit einer Länge von 100 bis 4000 Nucleotiden erfolgte genau, wie von Maxam u.a. in P.N.A.S. 7_4_, 560-564 (1977) beschrieben. Die 13%-Polyacrylamidgelelektrophorese für die Abtrennung von Proteinen mit Molekulargewichten von 5 000 bis 120 000 erfolgte genau, wie von Maizel u.a. in Methods in Vir. 5_, 179 -246 (1970) beschrieben.

Geleluierung: Die DNA-Fragmente wurden entweder von Polyacrylamid- oder Agarosegelstücken genau, wie von Maxam u.a. in P.N.A.S. 21 560-564 (1970) beschrieben, eluiert.

DNA-Sequenzierung: DNA-Fragmente wurden am 5'-Ende markiert, und ihre DNA-Sequenzen wurden genau, wie von Maxam u.a., oben, beschrieben, bestimmt. Das 5'-Ende von aus Endonuclea-

■■■■■"'■-■■ . ■ ■ ■ ■ ■ ·■ 32 -

se erzeugten DNA-Fragmenten wurde mit (γ- P)-ATP (New England Nuclear, USA, 2700 Ci/mmol) unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase (Boehringer, Mannheim, Westdeutschland) markiert.

Herstellung von Zellysat für den Nachweis von Protein A: E.-

. coli-Klone wurden über Nacht bei 37⁰C in 50 ml Luria-Nährmedium (LB) mit bei 35 iiq/ml zugegebenem Ampicillin gezüchtet.

Nach dem Zentrifugieren wurden die Zellen in 5 ml Tris-EDTA (0,05 M, pH 8,5, 0,05 M) erneut suspendiert und zentrifugiert. Die Zellen wurden in 5 ml des gleichen Puffers erneut suspendiert, und Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben. Nach 1 Stunde bei 37°C wurde das Lysat in einem Sorvall-SS-34-Rotor bei 15 000 Upm während 15 Minuten zentrifugiert. Der überstand wurde gesammelt und das Protein A analysiert.

Nachweis und quantitative Bestimmung des Proteins A aus E.-coli-Klonen: Ein ELISA-Test (Enzym Linked Immunosorbent Assay) (enzymgebundener Immunsorbenz-Assay) wurde für den

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Nachweis und die quantitative Bestimmung von hergestelltem Protein A angewendet. Bei dem Test wird eine spezielle Mikrotiterplatte (Titertek, Amstelstad, Niederlande) ohne Nettoladung (neutral) verwendet, deren Vertiefungen mit humanem IgG (Kabi, Schweden) beschichtet sind. Testproben werden dann zugegeben, damit das Protein A an die Fc-Teile der IgG-Moleküle gebunden werden kann. Die Menge an verbleibenden freien Fc-Stellen wird dann durch Zugabe von alkalischer Phosphatase, die an Protein A gebunden ist, titriert. Nach dem Waschen der Vertiefungen wird p-Nitrophenylphosphat als Substrat für die alkalische Phosphatase zugegeben.

Assay: Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden mit 50 μΐ einer Lösung von humanem IgG (Kabi, Schweden) bei 500 ug/ml in einem Beschichtungspuffer gefüllt,.und die

Platte wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann dreimal mit PBS + 0,05% TWEEN^R 20 gewaschen, was in allen Waschvorgängen in dem Assay verwendet wurde, und 50 μΐ des zu untersuchenden Lysats wurden

zugegeben. Die quantitativen Bestimmungen der zweifachen

Reihenverdünnungen der Lysate in PBS + 0,05% TWEEN 20 wurden durchgeführt. 10 ixl PBS + 0,1% TWEEN^R 20 wurden dann zugegeben, und die Inkubation konnte während 1 Stunde bei Raumtemperatur ablaufen. Die Vertiefungen wurden erneut dreimal gewaschen, und 50 ul Konjugat von Protein A und alkalischer Phosphatase (hergestellt genau, wie in Immunochemistry, Pergamon Press 1969, Band 6, Seiten 43-52 beschrieben) wurden zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen erneut dreimal gewaschen, und 100 μΐ Substrat aus alkalischer Phosphatase (Sigma 104 = p-Nitrophenylphosphat mit 1 mg/ml) wurden zugegeben. Die Enzymreaktion wurde nach 30 Minuten durch Zugabe von 10 μΐ 3 M NaOH unterbrochen. Das Ergebnis wurde visuell bestimmt. Ein positives Ergebnis, d.h. die Anwesenheit von Protein A, ist ein farbloses Reaktionsgemisch, da keine freien Fc-Stellen von IgG verfügbar sind, um das Konjugat zu binden.

Ein negatives Ergebnis, d.h. kein Protein A, wird durch eine gelbe Farbe festgestellt, die auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase des gebundenen Konjugats zurückzuführen ist. Quantitative Bestimmungen von Protein A erfolgten durch Durchführung von reihenweisen Zweifachverdünnungen einer Protein-A-Standärdlösung bekannter Konzentration parallel zu den Testproben.

Beispiel I Klonierung von Protein A in E. coli A. Herstellung staphylococcer chromosomaler Donor-DNA

S. aureus Stamm 8325-4 (0 1 1) mec-4916, str-4916, nov-142 (beschrieben von Sjöström, J.-E. u.a. in J. Bacteriol. 123, 905-915 (1975) und erhältlich vom Department of Microbiologie (N) , Biomedical Centre, Uppsala, Schweden) wurde bis OD₅₄₀ = 0,2 in Cy-Nährmedium gezüchtet. Ein Liter der ZeIl-

kultur wurde durch Zentrifugieren bei 5 000 Upm in einem Sorvall-GSA-Rotor aufgearbeitet, erneut in 100 ml 0,9%iger NaCl und 10 mM Tris, pH 7,2, suspendiert und bei 5 000 Upm in einem Sorvall-GSA-Rotor zentrifugiert. Das Zellpellet wurde schließlich in 10 ml 25%iger Saccharose, 50 mM Tris, pH 7,2 resuspendiert, und Protoplasten wurden hergestellt durch Lysostaphihbehandlung (15 ug/ml) bei 37°C während 20 min. Die Protoplasten wurden durch Zugabe von 10 ml Triton-Gemisch und 5 ml H-O lysiert. Das Gemisch wurde auf Eis stehen gelassen und gelegentlich leicht geschüttelt, bis die Lyse vervollständigt war. Die DNA wurde mit Proteinase K (0>1 mg/ml) und SDS (Natriumdodecylsulfat) (0,5%) während 1 h bei 37°C behandelt, und danach erfolgten fünf Phenolextraktionen mit gleichen Volumina von Phenol und schließlich zwei Chloroformextraktionen. Natriumacetat, pH 7,0, wurde bis zu 0,3 M zugegeben, und die DNA wurde mit zwei Volumen kaltem Ethanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde stufen-

weise mit 70, 80, 90 und 99% kaltem Ethanol gewaschen. Das Präzipitat wurde in TE-Puffer durch sanftes Mischen bei 37t gelöst. Schließlich wurde die DNA gegen TE-Puffer dialysiert

B. Partielle Digestion von chromosomaler DNA und Isolierung von Donorfragmenten ' '

Gereinigte staphylococcale DNA aus Stufe A wurde mit verschiedenen Konzentrationen des Restriktionsenzyms Mbο I di- geriert. Jede Reaktion erfolgte in 50 μΐ Volumen mit 1 μg DNA, und die Reaktion wurde durch Wärmeinaktivier.ung bei 65°C während 10 min beendet. Das Ausmaß der Digerierung wurde durch Agarosegelelektrophorese bestimmt. Die Konzentration von Mbo I, die ein großes partielles Spaltungsprodukt von 5 bis 20 Kilobasen ergibt, wurde für eine präparative Digerierung von 100 ug von staphylococcaler DNA in 5 ml gewählt. Dieses digerierte Material wurde durch Hitze inaktiviert, mit Ethanol präzipitiert, in 100 μΐ TE gelöst und durch einen 10 bis 30%igen Saccharosegradienten in TE-Puffer sedimentiert. Ein Beckman-Sw4 0-Rotor wurde bei 5°C, 35 Upm während 20 h verwendet. Der Gradient wurde in 0,5-ml-Fraktionen fraktioniert, wovon jede mittels Agarosegelelektrophorese analysiert wurde. Die Fraktionen mit 8 bis 10 kb Fragmenten wurden gesammelt, mit -2 Volumen Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst.

C. Digestion und Behandlung mit alkalischer Phosphatase des Vektors pBR322 -

1 μg pBR322 wurde mit Bam HI während 2 h bei 37°C digeriert, und das Enzym wurde bei 65°C während 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wurde mit alkalischer Phosphatase zur Entfernung des 5'-Phosphats behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Möglichkeit der Religation des Vektors ausgeschlossen.

Die Reaktion erfolgte in 50 mM Tris, pH 7,9, 5% DMSO und 1 Einheit intestinaler alkalischer Kalbsphosphatase bei 37°C

während 30 Minuten in 1 ml. 0,5% SDS wurde zugegeben, und die DNA wurde zweimal mit Phenol extrahiert. Spuren von Phenol wurden .mit Ether entfernt, und die DNA wurde mit zwei Volumen Ethanol präzipitiert.

D. Insertion bzw. Einsatz von staphylococcaler DNA in pBR32 2, Transformation von E. coli und negative Selektion für die Rekombinanten ■ '

Der Vektor pBR322, der für die ursprüngliche Klonierung von staphylococcer DNA verwendet wurde, kodiert für Tetracyclin-(tet) und Ampicillin (amp) -Resistenz. Wenn pBR322 durch Digestion mit Bam HI wie in Stufe C oben geöffnet wird und ein DNA-Fragment eingesetzt wird, wird das Gen für die Tetracyclinresistenz inaktiviert. Durch Prüfung der Transformanten für die Sensitivität gegenüber Tetracyclin können die Rekombinanten festgestellt werden - sogenannte negative Selektion. 0,5 μg von pBR322, behandelt entsprechend Stufe C, und 2 wg staphylococce DNA, behandelt entsprechend Stufe B, wurden vermischt und in einem Gesamtvolumen von 25 μΐ über Nacht bei 14°C der Ligation unterworfen. Das Gemisch wurde verwendet, um E. coli 259 mit Selektion für Ampicillinresistenz (35 μg/ml) zu transformieren. Die Transformanten wurden herausgenommen und auf Platten, welche 10 μg/ml Tetracyclinbzw. 35 μg/ml Ampicillin enthielten, aufgestrichen.

Transformanten, welche auf Ampicillin, aber nicht auf Tetracyclin wuchsen, wurden als Rekombinanten angesehen.

E.■ Nachweis von Protein-A-positiven E.-coli-Klonen

Fünfhundert tetracy.clinempf indliche Klone aus Stufe D wurden als getrennte Kolonien auf LA-Platten (hergestellt von LA-Medium), welche Ampicillin (35 μg/ml) enthielten, gezüchtet. Gruppen von 25 Kolonien wurden gesammelt und in 50 ml LB-Brühe mit 35 μg Ampicillin inokuliert und über Nacht gezüchtet. Die Zellextrakte wurden durch Lysozym+EDTA-

Behandlung (wie bei Routineverfahren beschrieben) hergestellt und nach dem ELISA-Test, der bei den Routineverfahren beschrieben wurde, auf Protein A untersucht. Eine dieser Gruppen von Klonen war positiv, und diese positive Gruppe wurde weiter in 5 Gruppen von je 5 Klonen unterteilt und wie oben gezüchtet und behandelt. Schließlich wurde in einer letzten Versuchsreihe ein Protein A produzierender Klon, E. coli SPA 11, enthaltend das Plasmid pSPA1, festgestellt. Kulturen dieses Klons wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, am 12. Juli 198.2 unter der Hinterlegungsnummer DSM 2434 hinterlegt.

F. Restriktionskarte bzw. -mappe von pSPAi 15

Um Informationen für die Subklonierung und Sequenzierung der Genkodierung für Protein A zu erhalten, wurde eine Restriktionskarte von pSPA1, erhalten in Stufe E, gemacht. Dies erfolgte mit einfachen, doppelten und/oder dreifachen Digerierungen mit den in den Figuren 1 und 2 angegebenen Enzymen. In Figur 2 ist eine genauere Karte in der Fläche, die für Protein A kodiert, dargestellt. Addiert man die Größen der verschiedenen Restriktionsfragmente, so erhält man die Gesamtgröße von 12 kb für pSPA1, und somit beträgt das staphylococce Donorfragment ungefähr 7,6 kb.

G. Subklonierung des Protein-A-Kodierungsgens von pSPA1 in Plasmide pBR328 und pHV14 ■ ■

Zur Lokalisierung der Position des Gens wurden verschiedene Subklone konstruiert und auf Protein-A-Aktivität untersucht. 2 μg Plasmid pSPA1 von Stufe E und 1 μg pBR328 wurden mit dem Restriktionsenzym Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierunq 5 von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben bei den Routineverfahren beschrie-

ben, durchgeführt. Kolonien, welche Rekombinanten enthielten, wurden als chloramphenicolresistent und .tetracyclinempfindlich. auf analoge Weise, wie in Stufe D beschrieben, ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß 8 Kolonien von 48 dieser Rekombinanten Protein-A-positiv unter Verwendung des ELISA-Verfahrens, das bei den Routineverfahren beschrieben wurde/ sind. Die Restriktionsanalyse, entsprechend Stufe F, zeigte, daß alle 8 Klone pBR328 mit einem 2,15-kb-Eco-RV-Einsatz, der sich von dem Fragment, entsprechend 0,2 kb bis 2,35 kb der pSPA1-Restriktionskarte von Figur 1, ableitet, enthielten. Alle Klone enthielten den Einsatz bzw. das Insert in der gleichen Orientierung und ergaben einen funktioneilen tet^-Promotor, ablesend in dem eingesetzten Gen.

Ein Klon, der dieses Plasmid, bezeichnet als pSPA3, enthielt, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Um zu bestimmen, ob das Protein-A-Gen aus einem eigenen Promotor transkribiert werden konnte, wurde das Plasmid pSPA3 als Quelle verwendet, um es in das Plasmid pHV14 zu reklonieren. Dieses Plasmid, welches sich von pBR322 ableitet, besitzt einen 2,8-kb-Einsatz in der Hind-III-Restriktionsstelle, wodurch der tet-Promotor inaktiviert .wird. Irgendein Einsätz in der Eco-RV-Restriktionsstelle dieses Plasmids muß daher einen eigenen funktionellen Promotor besitzen, damit es durch E. coli-RNA-Polymerase transkribiert werden kann. 1 \ig pSPA3 und 1 \xq pHV14 werden mit Eco RV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation erfolgten, wie oben beschrieben. Kolonien wurden gesammelt, die ampicillinresistent und tetracyclinempfindlich waren, wie in Stufe D beschrieben .

Plasmide von 52 dieser Kolonien wurden nach dem "Mini-Alkali-Verfahren", welches unter Routineverfahren erläutert wurde, isoliert und geprüft, indem man eine 0,7%'-Agarose-

gelelektrophorese durchführte. Eine dieser Kolonien war eine Rekombinante von pHV14 mit dem oben erwähnten 2,15-kb-E£O-RV-Einsatz von pSPA3. Der Klon, der dieses Plasmid, bezeichnet als pSPA5, enthielt, war Protein-A-empfindlich, als er unter Anwendung des ELISA-Verfahrens geprüft wurde. Man schloß daraus, daß der Einsatz eines staphylococcen Promotors, ablesbar in das Protein-A-Gen, welches ebenfalls in E. coli HB101 funktionell ist, enthalten muß.

Analyse der DNA-Sequenz des Protein-A-Gens

Die Ergebnisse der Subklonierung zeigten an, daß die DNA-Sequenzbildung an der Hind-III-Stelle bei der Kartenposition 1,4 kb beginnen sollte und im Gegenuhrzeigersinn abläuft (Figur 1). Die DNA-Quelle für die Sequenzierungsanalyse war gereinigtes pSPA3. Durch Vergleich der teilweise bekannten Aminosäuresequenz von ProteinA (wie oben von Sjödahl beschrieben) mit der erhaltenen DNA-Sequenz konnte die Position der HIND-III-Stelle in dem Gen lokalisiert werden. Wie aus den Figuren 2 und 3 folgt, liegt die Restriktionsstelle innerhalb der Region A des Proteins A. Durch weitere Analyse entsprechend Stufe F wurden die Restriktionsstellen für die Enzyme Taq1, Rsa I, Bei I, Sau 3A und Pst I bestimmt (Figur 2). Diese Stellen wurden für die Sequenzierung in einer oder beiden Richtungen verwendet, die in den meisten Fällen Nucleotidsequenzen von beiden Strängen bzw. strands ergaben. Die für die Sequenzbildung angewandte Strategie ist in Figur 11 erläutert. Da Bei I DNA, gereinigt von E. coli HB101, nicht spaltet, wurde pSPA3 in den Stamm E. coli GM 161 transformiert, dem das Enzym D-Alaninmethylase fehlt. pSPA3, welches aus diesem Stamm wieder gereinigt wurde, wurde mit Bei I für die Sequenzbildung gespalten. .

In Figur 3 ist die DNA-Sequenz des gesamten staphylococcen Protein-A-Gens dargestellt. Die Aminosäuresequenz, die sich

von den DNA-Sequenzen ableitet, ist ebenfalls angegeben, zusammen mit den unterschiedlichen Aminosäuren, verglichen mit der Sequenz, die von Sjödahl, oben vorgeschlagen wurde, welche auf einem anderen Stamm von S. aureus (Cowan I) bestimmt wurde. '

Die DNA-Sequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, zeigt einen N-terminalen Bereich, der mit E bezeichnet wird, ähnlich den sich wiederholenden Regionen D-A-B-C, über die Sjödahl, oben berichtet. Diese Region von 50 Aminosäuren besitzt 4 2 Aminosäuren, die mit der Region D identisch sind.

Vor der Region E ist eine Führungssequenz mit den Charakteristiken eines Signalpeptids angebracht, welches eine basisehe Region von 11 Aminosäuren, gefolgt von einem hydrophoben Stretch (dehnbare Kette) von 23 Aminosäuren, enthält. Die genaue Spaltungsstelle ist nicht bekannt, aber mögliche Stellen sind bei den Alaninresten 36, 37 oder 42, vermutlich bei 36. Wenn dies so ist, gehört die Aminosäuresequenz 37-42 zu der Region E des Protein-A-Moleküls. Der Initiierungscodon für die Translation ist TTG, ähnlich einigen anderen beschriebenen Initiierungscodons von grampositiven Bakterien. Sechs Nucleotide stromaufwärts von TTG, wird eine Shine-Dalgarno-Sequenz festgestellt (definiert in Shine,

J. und Dalgarno, L., Nature (London) 254, 34-38 (1975)), die viele Merkmale mit anderen grampositiven Ribosomenbindungsstellen gemeinsam hat. Weiter stromaufwärts werden zwei mögliche Promotoren bei -35 und -10 (Figur 3) festgestellt.

Durch Berechnung der Anzahl von Basen, die für die Kodierung des gesamten Proteins erforderlich sind, scheint es, daß sowohl pSPAi als auch pSPA3 das gesamte Protein-A-Strukturgen enthalten. .

Analyse des Genprodukts von E. coli, enthaltend pSPA1

E.-coli-Zellen, welche pSPA1 tragen, wurden über Nacht in 400 ml LB mit 35 μg/ml zugefügtem Ampicillin gezüchtet. Die Zellkultur wurde bei 6000 üpm mit einem Sorvall-GSA-Rotor während 10 min zentrifugiert, und die Zellpellets wurden in 20 ml TE'(0,05 M, pH 8,5, 0,05 M EDTA) gewaschen und erneut wie oben zentrifugiert. Diesmal wurden die Zellpellets in 1,5 ml eines Proteaseinhibitorpuffers (0,02 M Kaliumphosphat, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 1% Triton X-100, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), und VmM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) resuspendiert. Die Zellen wurden dann in einem MSE-Sonicator während 4 χ 40 sec auf einem Eisbad.beschallt und bei 15 000 Upm (Sorvall-SS-34-Rotor) 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und durch

R
eine IgG-Sepharose -4B-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) (Hjelm u.a., FEBS Lett. !28, 73-76 (1972) ) geleitet, welche mit einem Natriumacetatpuffer (0,1 M Natriumacetat, 2% NaCl, pH 5,5) equilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Puffer wie oben gewaschen, und das adsorbierte Protein A wurde mit einem Glycinpuffer (0,1 M Glycin, 2% NaCl, pH 3,0) eluiert. Zu den eluierten Fraktionen gab man 1/9 Volumen 100%ige Trichloressigsäure (TCA) hinzu.

Die Proben wurden 6 Stunden bei +4⁰C präzipitiert und bei 12 000 Upm in einer Eppendorf-Zentrifuge während 15 min zentrifugiert. Die Pellets wurden einmal in 1 ml kaltem Aceton gewaschen und dann wie oben zentrifugiert..Die verbleibenden Pellets wurden getrocknet, in TE gelöst und gesammelt, wodurch man ein Gesamtvolumen von 400 μΐ erhielt.

Die Proteinkonzentration wurde bestimmt, und 20 |ig wurden auf einem 13%-SDS-Polyacrylamidgel bei 100 V während 12 h analysiert. Das Gel wurde mit Amidoblack (0,1%, 4 5% Methano.1,,10% Essigsäure) angefärbt. Ein Extrakt von Zellen, welche pBR322 tragen, wurde parallel hergestellt, und das glei-

ehe Volumen wie oben wurde auf dem Gel analysiert. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese sind in Figur 5 dargestellt, die anzeigt, daß das Protein A, welches in E. coil, welches pSPAl trägt, erzeugt würde, eng an dem reinen Protein A von S . aureus (von Pharmacia, Uppsala, Schweden) migriert. Der Extrakt von Zellen, die das pBR322-Plasmid trugen, besaß kein entsprechendes Protein.

Analyse der Lokalisierung von Protein A in E. coli

1G ■ ■■'.".

Enzyme, die in gram-positiven Bakterien extrazellular sind, sind in gramnegativen Bakterien oft zwischen der inneren und äußeren Membran im sogenannten Per!plasma oder periplasmischen Raum gelagert. Da Protein A in der Zellwand und somit außerhalb der Zellmembran in S. aureus lokalisiert ist, wurde die Lokalisierung des Proteins in den transformierten E.-coli-Zellen, welche pSPA1 enthielten, bestimmt. Zu diesem Zweck wurde das osmotische Schockverfahren, wie von Heppel, L.A. , Science 158, 1451-1455 (1967) beschrieben, angewandt.

In diesem Verfahren werden Proteine aus dem periplasmischen Raum, aber nicht intrazellulare Enzyme freigegeben. Alkalische Phosphatase wurde als Beispiel für ein Protein, welches in dem periplasmischen Raum nachgewiesen wurde, und Phenylalanin-tRNA-Synthetase als Beispiel für ein intrazelluläres Protein verwendet.

E. coli, enthaltend pSPAI, wurde in einem niedrigen Phosphatmedium (genau wie von Neu, H.G. und Heppel, L.A., J. .Biol. Chem. 240, 3685-3692 (1965) beschrieben) zur Derepression der Synthese alkalischer Phosphatase gezüchtet. Ein Li- ',

8 ■ ■ '

ter einer Ubernachtkultur'(etwa 7,5 χ 10 CFU/ml) wurde in zwei Teile geteilt. Ein Teil wurde dreimal mit kaltem 0,01 i M Tris-HCl-Puffer, pH 8,1 gewaschen, und die Zellen wurden j erneut in 20 ml 20%iger Saccharose-0,03-M-Tris-HCl, pH 8,1, j 1 mM EDTA suspendiert. Nach 10 min auf einer Rotations- / schüttelvorrichtung bei Raumtemperatur wurde das Gemisch 10 /

min bei 13 OOOx g in einer Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert.

Der überstand wurde entfernt, und die gut abgetropften PeI-

-4 lets, wurden schnell mit 20 ml kalter 5x10 M MgCl₂-Lösung

vermischt. Die Suspension wurde in einem Eisbad auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 10 min vermischt und zentrifugiert. Der überstand, welcher als "osmotische Schockwaschlösung" bezeichnet wird, wurde für die weitere Prüfung gesammelt. Zum Vergleich wurde der andere Teil von Zellen zentrifugiert, gewaschen und in 5 ml Polymix-Puffer (I) (genau wie von Jelenc, P.C., Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980) beschrieben) wieder suspendiert. Die Zellen wurden in einer X-Presse, wie vom Hersteller (Biotec, Stockholm, Schweden) empfohlen, desintegriert. Die Zelldebris wurden durch Zentrifugieren bei 13 000 Upm während 15 min in einer Sorvall-SS-34-Rotorzentrifuge entfernt, und der überstand wurde für die weitere Prüfung gesammelt.

Die zwei erhaltenen Extrakte, welche periplasmisches und Gesamtzellenprotein enthielten, wurden jeweils mit den unten angegebenen enzymatischen Versuchen auf die alkalische Phosphatase und Phenylalanin-t RNA-Synthetase und auf Protein A, wie oben unter den Routineverfahren beschrieben, analysiert.

Enzymatische Assays ·

25

Alkalische Phosphatase wurde in einem Tris-Puffer, 0,0 5 M,

— 4 pH 8,0 unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat (4 χ 10

M) als Substrat (Sigma 104) untersucht. Die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat wurde in einem Spektrophotometer bei 410 mn gemessen. Eine Einheit der Aktivität stellte eine Änderung der Absorption bei 410 mn von 1,0 pro Minute dar. (Heppel, L.A., Harkness, D.R. und Hilmoe, R.J., J. Biol. Chem. 237, 841-846 '(1962)).

\ 35

Phenylalanin-tRNA-Synthetase

Die Analyse erfolgte in einem Gemisch, welches in einem Gesamtvolumen von 100 μΐ enthielt: 5 mM Mg(OAc)-, 0,5 mM CaCl-, 95 mM KCl, 5 mM NH₄Cl, 8 mM Putrescin, 1 mM Spermidin, 5 mM K-Phosphat, pH 7,5, 1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP, 6 mM Phosphoenolpyruvat, 1 μg Pyruvatkinase (Sigma, St. Louis, USA), 1 Einheit Myokinase (Sigma), 100 μΜ ( C)-Phenylalanin (4 cpm/pmol) (Radiochemical Centre, Amersham, England), 3.00 ng Gesamt-E.-coli-tRNA (Boehringer Mannheim, Bundesrepublik Deutschland).

Der X-gepreßte Zellextrakt und die osmotische Schockwaschlösung wurden durch Zugabe von 10 μΐ geeigneter Verdünnungen geprüft. Die Enzymanalysen wurden während 15 min bei 37°C durchgeführt. Kaltes 10%iges TCA wurde zur Unterbrechung der Reaktion und zur Präzipitation von PhenylalanintRNA zugegeben. Das Präzipitat wurde auf Glasfaserfiltern (GFA, Whatman) gesammelt, mit 10%igem kaltem TCA und kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, und die Radioaktivität wurde bestimmt. Eine Aktivitätseinheit wird als die Bildung von 1 pmol Phe-tRNA pro Minute definiert. (Wagner, E.G.H., Jelenc, P.C., Ehrenberg, M. und Kurland, CG. Eur. J. Biochem. 122, 193-197 (1982)) .

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Alle Zahlen in der Tabelle sind pro 500 ml Zellkultur (ca. 7,5 χ 10⁸ CFU/ml) berechnet.

Tabelle 1 ■

———^-——^_ _x

Enzymaktivitäten und Protein-A-Gehalt von E.-coli-Zellen, \ welche pSPA1 enthalten ! \ Periplasma der Zellen Gesamtzellen :

Alkal. Phosphatase

(Einheiten) 160 210 J

Phenylalanin-tRNA- Γ

Synthetase (Einheiten) 0 1530 j

Protein A ^g)^a 24 - 48 24 - 48

Da die Bestimmung in reihenweisen Zweifachverdünnungen erfolgt, werden die Mengen angegeben, die im Bereich von zwei Verdünnungsstufen liegen.

Aus Tabelle 1 folgt, daß Protein A und alkalische Phosphatase freigegeben wurden, wenn die Zellen osmotischem Schock unterworfen wurden, wohingegen keine Aktivität des intrazellularen Enzyms Phenylalanin-tRNA-Synthetase in der osmotischen Schockwaschlösung nachgewiesen wurde. Diese Ergebnis zeigt an, daß die S.-aureus-Signalsequenz, welche entsprechend den Sequenzwerten (Figur 3) in der klonierten DNA vorhanden ist, in E. coli ausgedrückt bzw. erzeugt wird und daß das Signalpeptid von der Membran erkannt wird. In einem grampositiven Bakterium, dem die Außenmembran fehlt, wie Bacillus subtilis, hätte das Signalpeptid höchstwahrscheinlich die Sekretion des Proteins A in das Wachstumsmedium bewirkt. .

Die Mengen an Protein A, die durch die pSPAl tragenden E.-coli-Zellen erzeugt wurden, betragen etwa 1 bis 2 mg/Liter Medium.

Beispiel· II

Klonierung von Protein A in verschiedenen staphylococcen Stämmen

I. Konstruktion des Shuttle-Vektors, welcher das Protein-Α-Gen enthält .

Zwei Shuttle-Vektoren, welche das Protein-A-Gen enthielten, wurden erzeugt, um eine Replikation sowohl in E. coli, S.. aureus als auch coagulasenegatxven Staphylococcen zu ermöalichen. Der Plasmid- Vektor pHV33 auf der Grundlage des staphylococcen Plasmids pC194 wurde verwendet, um Ampicillin- und Tetracyclinresistenz in E. coli und Chloramphenicolresistenz in Staphylococcen auszudrücken.

A. Konstruktion des Shuttle-Vektor-Plasmjds pSPA15 (Fig.6)

Der erste Shuttle-Vektor wird durch Klonierung des 2,1-kb-EcoRV-Fragments, enthaltend das Protein-A-Gen, wie in Beispiel I, Stufe G beschrieben, in die EcoRV-Stelle von Plasmid pHV33 aufgebaut bzw. konstruiert. 2 ug des Plasmids pSPA3 aus Stufe G von Beispiel I und 1 μg pHV33 wurden mit EcoRV geschnitten bzw. gespalten, vermischt, mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben unter Routineverfahren beschrieben, durchgeführt. Kolonien, welche Rekombinanten enthielten, wurden als ampicillinresi- ·■■■ stent und tetracyclin- und chloramphenicolempfindlich auf analoge Weise, wie in Stufe D von Beispiel I beschrieben, ausgewählt. Die Restriktionsanalyse entsprechend der Stufe F in Beispiel I zeigte, daß von 8 geprüften Klonen alle das in Figur 6 schematisch dargestellte Plasmid enthalten. Alle Klone besaßen den Einsatz in gleicher Orientierung wie im Plasmid pSPA3 (vgl. Stufe G, Beispiel I). Ein Klon, der dieses Plasmid enthielt, bezeichnet als pSPA15, wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt. Es wurde festgestellt, daß dieses Plasmid das gesamte Strukturgen von Protein A, Kodierung für ein .vollentwickeltes Protein von 447 Aminosäuren, enthielt und ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 49 604 hatte.

B. Konstruktion bzw. Aufbau des Shuttle-Vektor-Plasmids . PSPA16 (Figur 8) ,

B1 Subklonierung des 5'-Endes des Protein-A-Gens von

pSPA1 in das Plasmid pTR262 unter Bildung des Plasmids PSPA2_(Figur T)

1 ug Plasmid pSPAi (siehe Figur 1) von Stufe E von Beispiel I und 1 μ.^ Plasmid pTR262 wurden mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I geschnitten bzw. gespalten, gemischt,

mit T4-Ligase behandelt und zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation erfolgten wie oben unter Routineverfahren beschrieben.

Plasmid pTR262 enthält ein Lambda-Repressorgen, welches bei der Expression das Gen für die Tetracyclinresistenz inaktiviert. Das Lambda-Repressorgen besitzt eine Hin_d-III-Steile , und daher inaktiviert der Einsatz einer DNA-Sequenz in die letztere das Lambda-Repressorgen und aktiviert das Tetracyclinresistenzgen. Plasmid pTR262 erlaubt somit die positive Selektion für tetracyclinresistente Rekombinanten.

Kolonien, die Rekombinanten enthielten, wurden somit als tetracyclinresistent ausgewählt. Es wurde gefunden, daß eine Kolonie dieser 20 Rekombinanten Protein-A-positiv war, wenn man das ELISA-Verfahren anwendet, welches zuvor unter den Routineverfahren beschrieben wurde. Die Restriktionsanalyse zeigte, daß es das Vektorplasmid pTR262 mit einem 2,1-kb-Protein-A-Gen-Einsatz, der sich von dem Fragment, Welches 0,0 bis 2,1 kb der pSPA1-Restriktionskarte der Figuren 1 und 2B entspricht, ableitet, enthielt. Dieses Plasmid wurde als pSPA2 bezeichnet und ist schematisch in Figur 7 dargestellt. Es besitzt eine einzigartige Pst-I-Restriktionsstel-Ie am 3'-Ende des Protein-A-Gen-Fragments, welches bei der folgenden Stufe B5 verwendet wird.

B2 Herstellung eines DNA-Fragments, enthaltend das -Pro- _ _ _te_in-A-Gen _____________________

100 μg des Plasmids pSPA5 aus Stufe G von Beispiel I wurden mit dem Restriktionsenzym Eco RI während 1 h bei 37°C geschnitten bzw. gespalten. Dabei erhielt man zwei DNA-Fragmente, nämlich das eingesetzte DNA-Fragment, welches das Protein-A-Gen (2,1 kb) enthielt, zwischen den Positionen 0,2 kb und 2,3 kb in Figur 2B, und den Vektor pHV14 (7,2 kb), Dieses digerierte Material wurde in der Hitze inaktiviert,

mit Ethanol präzipitiert, in 100 μΐ TE gelöst und mittels eines 10 bis 30%igen Saccharosegradienten in TE-Puffer se-, dimentiert. Ein Beckman-SW40-Rotor wurde bei 5°C, 35 000 Upm während 20 h verwendet. Der Gradient wurde in 0,5-ml-Fraktionen fraktioniert, wovon jede mittels Agarosegelelektrophorese analysiert wurde. Die Fraktionen, welche das 2,1-kb-Fragment enthielten, wurden gesammelt, mit 2 Volumen Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. Aus den Figuren 2A und B folgt, daß das Fragment zusätzlich zu dem gesamten Protein-A-Gen eine E.-coli-Sequenz, die sich von Plas-

mid pBR322 ableitet, und einen staphylococcen Genrest ent- : hält.;

B3 Herstellung eines DNA-Fragments, welches.einen Teil d£sProtern^A^Gens enthä.lt

5 μg des gereinigten 2,1-kb-Fragments aus Stufe B2 wurden mit Restriktionsenzym Sau 3A während 1 h bei 37°C geschnitten bzw. gespalten. Das digerierte Material wurde einer präparativen Gelelektrophorese an 8%igem Polyacrylamid in TEB-Puffer unterworfen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid (1 \ig/ ml) angefärbt, und ein DNA-Fragment Von ungefähr 600 Basenpaaren wurde herausgeschnitten. Dieses Fragment entspricht dem Teil des Gens zwischen den Positionen 1,15 und 1,8 kb in Figur 2B. Die DNA wurde über Nacht bei 37°C in 5 ml TE+ 0,3 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde über eine Säule geleitet, welche ungefähr 300 μΐ sedimentiertes DE-52 (Whatman, England), equilibriert mit 5 ml TE, enthielt. Nach dem Waschen mit 2 ml Te + 0,3 M NaCl wurde die DNA mit zwei VoIumen von jeweils 0,5 ml TE + 0,6 M NaCl eluiert. Das Eluat, welches das DNA-Fragment enthielt, wurde mit einem Volumen TE verdünnt, mit Ethanol präzipitiert und in TEB-Puffer gelöst. Das entstehende gereinigte Protein-A-Gen-Fragment besitzt kohäsive Enden, die einer Sau-3A-Restriktionsstelle und einer Zwisehen-Hind-III-Stelie entsprechen.

"3t

B4_ Her^tel_lung_von_Vektorp]^asini.d_pUR2^22

Das Plasmid pUR222 ist ein im Handel erhältlicher Vektor, welcher die Genkodierung für das Enzym ß-Galactosidase (lac Z) enthält. Das Gen enthält einen Multilinker mit verschiedenen Restriktionsstellen, wie Pst I, Barn H1 und Eco RI. Da ß-Galactosidase durch enzymatische Analysen leicht nachweisbar ist, können Rekombinanten mit einem DNA-Fragment, welches in eine der Restriktionsstellen eingesetzt ist, unter Verwendung geeigneter Wirtstämme leicht nachgewiesen werden. Oft werden Xgal-Platten verwendet (Xgal ist ein chromogenes Substrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-3-D-galactosid, welches ein blaues Indolylderivat freisetzt, wenn es mit ß-Galactosidase gespalten wird), auf denen ß-Galactosidase-negative Rekombinanten als weiße Kolonien im Gegensatz zur blaugrünen Farbe der Kolonien, welche Plasmide ohne Einsatz enthalten, erscheinen.

Zur Spaltung des Plasmids pUR222 im ß-Galactosidase-Kodierungsgen unter Bildung kohäsiver Enden, die komplementär zu den kohäsiven Enden des Protein-A-Fragments der Stufe B3 für den Einsatz davon in das Plasmid sind, wurde die Bam- '■'. H1-Restriktionsstelle verwendet. 1 ng püR222, erhalten von Boehringer-Mannheim, Deutschland, wurde mit dem. Restriktionsenzym Barn H1 während 1 h bei 37°C digeriert. Darauf wird das Enzym bei 65⁰C während 10 Minuten inaktiviert. Diese Spaltungspräparation wurde bei der folgenden Stufe B5 für die Ligation mit dem Protein-A-Fragment verwendet.

B'5 Konstruktion eines pSPA2 und pTR262 enthaltenden Hybridp^asinidjs p_SPAK>_( Figur 7_) _ _______

200 ng pUR222, digeriert mit Barn H1, wie in Stufe B4 beschrieben, und 200 ng eluiertes Protein-A-Fragment, wie in Stufe B2 beschrieben, wurden vermischt und in einem Gesamt^ volumen von 20 μΐ über Nacht bei +14⁰C der Ligation unter-

worfen. Das Enzym wurde bei 65°C 10 Minuten lang inaktiviert, mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. Das gesamte DNA-Gemisch, welches u.a. rekombinante Plasmide mit dem Protein-A-Einsatz in dem ß-Galactosidasegen enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I während 1 h bei 37°C in dem für Hind III empfohlenen Puffer gespalten bzw. geschnitten. Dabei wird das rekombinante Plasmid in das ß-Galactosidasegen (Pst I) und in das Protein-A-Gen (Hind III) gespalten, wobei zwei Fragmente erzeugt werden, nämlich ein kleines Fragment, welches aus einer kleineren 3-Galactosidase-DNA-Sequenz, gebunden an den Teil des Protein-Ä-Gen-Fragments von der Sau-3A-Stelle an der Position 1,15 kb an die Hind-III-Stelle in Figur 2B, besteht, und aus einem großen Fragment, welches aus dem Rest des rekombinanten Plasmids besteht, das den größeren Teil des 3-Galactosidasegens enthält, welcher an das Protein-A-Gen-Fragment von der Hind-III-Stelle an die Sau-3A-Stelle in Position 1,8 kb in Figur 2B gebunden ist. Wie aus Figur 7 folgt, besitzt das ß-Galactosidasefragment eine Eco-RI-Restriktionsstelle nahe an der Stelle der Verschmelzung mit dem Protein-A-Fragment ( die Bam-H1-Stelle) .

200 ng Plasmid.pSPA2 von Stufe B1 wurden mit den Restriktionsenzymen H_ind IJI und Pst I auf gleiche Weise wie oben geschnitten bzw. gespalten, um das Plasmid in drei Fragmente zu spalten (siehe Figur 7), nämlich ein Fragment, welches sich von der Hind-III-Stelle zwischen dem Tet-Gen und dem 5'-Ende des Protein-A-Gens zu der Hind-III-Stelle innerhalb des Protein-A-Gens erstreckt, ein Protein-A-Gen-Fragment, welches sich von der letzteren Hind-III-Stelle zu der Pst-I-Stelle am 3'-Ende des Protein-A-Gens erstreckt, und ein größeres Fragmentvom pTR262-Ursprung, welches den Rest des Plasmids enthält.

Die beiden oben hergestellten Digests wurden bei 65°C während 10 Minuten inaktiviert, vermischt und mit Ethanol prä-

zipitiert. Die DNA wurde in Ligationspuffer gelöst und mit T4-Ligase behandelt. Das gewünschte rekombinante Plasmid enthält das oben erwähnte große Fragment, welches bei der Spaltung der pUR222-Rekombinante, eingesetzt in pSPA2 zwisehen der Hind-III-Stelle innerhalb des Protein-A-Gens und der Pst-I-Stelle, erhalten wird und das 5'-Ende des Protein-A-Gens enthält. Ein Teil davon leitet sich somit von pSPA2 ab, und der andere stammt aus der pUR222-Rekombinante. Weiter ist das Plasmid ampicillin- und tetracyclinresistent und sollte auf Xgal-Platten, wie im folgenden erläutert wird, eine blaue Farbe ergeben.

Das der Ligation unterworfene DNA-Gemisch wurde daher zur Transformierung von E. coli RRI del M15 verwendet. Spaltung, Ligation und Transformation wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Rekombinanten wurden auf Xgal-Platten, welche Ampicillin und Tetracyclin enthielten, aufgebracht. Einer dieser Klone erschien als hellblau, und die Restriktionsanalyse wurde auf seinem Plasmid durchgeführt. Man erhielt ein Plasmid, welches als pSPAlO (Figur 7) bezeichnet wurde, das aus Teilen von Plasmid pUR222, Plasmid pTR262 und dem Protein-A-Gen, welches aus Plasmid pSPA1 stammt, ^: besteht und eine einzigartige Eco-RI-Stelle am stromabwärtigen Ende des Gens aufweist.

Obgleich das Plasmid pSPAlO nicht die gesamte lac-Z-Gen-Kodierung für ß-Galactosidase. sondern nur die Genkodierung . für das α-Fragment davon (lac Z¹) enthält, ist es bei der Spaltung des Xgal-Substrats aktiv und erzeugt bei den oben angewandten Bedingungen eine blaue Farbe. Dies ist auf eine Komplementation zwischen dem α-Fragment, kodiert mit dem Plasmid, und einem chromosomalen Genprodukt zurückzuführen, welches das carboxyterminale Fragment von ß-Galactosidase enthält, das ein aktives Enzym ergibt. Der E. -coli-RJRI-del-M15-Wirtstamm, wie er oben verwendet wurde, besitzt so ei^ chromosomales Genmaterial und komplementiert das α-Fragment,

das von dem pSPATO-Plasmid gebildet wurde, zu einem aktiven ß-Galactosidasemolekül.

B6 Subklonierung des Protein-A-Kodierungsgens in das Plas-

1 μg des gereinigten 2,1-kb-Protein-A-Fragments von der Stufe B2 wurde mit dem Restriktionsenzym Tag I während 1 h bei 6O⁰C gespalten, um es innerhalb der DNA des Staphylococcen-Ursprungs zu spalten. Das Enzym wurde durch Extraktion mit
einem gleichen Volumen Phenol inaktiviert, darauf folgte eine mehrfache Etherextraktion, und schließlich wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer gelöst. 1 μg des
ι Plasmids pBR322 wurde mit den Restriktionsenzymen CIa I und Eco RV (welche auf gleiche Weise spalten und somit komplementäre kohäsive Enden ergeben) während 1 h bei 37°C in Bam-H1-Puffer gespalten und dann während 10 Minuten bei 65°C in der Hitze inaktiviert. Die DNA-Proben wurden vermischt, der Ligation unterworfen und zur Transformierung.von E. coli

HB101, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben, verwendet. Transformante wurden auf Ampicillin (35 ug/ml) aus-■;..· gestrichen. Die Kolonien wurden auf Platten, welche 10 ug/ml Tetracyclin bzw. 35 ug/ml Ampicillin enthielten, gegeben.
Die Transformanten, die auf Ampicillin, jedoch nicht auf .

Tetracyclin wuchsen, wurden als Rekombinanten angesehen. Es wurde gefunden, daß 4 Kolonien von diesen 12 Rekominanten
Protein-A-positiv waren bei Anwendung des ELISA-Verfahrens, beschrieben unter den Routineverfahren. Die Restriktionsanalyse, bei der göreinigtes -Plasmid mit einem, zwei oder drei Restriktionsenzymen gespalten wurde, wurde mit einem dieser Klone durchgeführt. Die entstehende Restriktionskarte dieses Plasmids, weiches als pSPA8 bezeichnet wird, ist in Figur 7 dargestellt. Das so konstruierte Plasmid besitzt kei^nen E.-coli-Promotor stromaufwärts vom Protein-A-Gen, vor

dem Protein-A-Gen-Fragment ist nur der eigene staphylococce Promotor vorhanden.

B7 Kons^ruktion des;

Ein zweiter Shuttle-Vektor wurde konstruiert, welcher für das abgestumpfte (truncated) Protein A kodiert (d.h. dem der X-Bereich fehlt). Die Konstruktion ist schematisch in Figur 8 dargestellt. 5 μg Plasmid pSPAIO von Stufe B5 wurden mit Ecq RI und Hind III gespalten, und ein 0,4-kb-Fragment wurde aus einem 5%-Polyacrylamidgel nach der Elektrophorese . herausgeschnitten. Das Fragment wurde wie oben bei den Roütineverfahren beschrieben eluiert und gereinigt. 5. μg Plasmid pSPA8 aus Stufe B6 wurden auf gleiche Weise behandelt, und ein 0,7-kb-Fragment wurde isoliert und gereinigt. Schließlich wurden 2 μg Plasmid pHV33 mit Eco RI digeriert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den beiden gereinigten DNA-Fragmenten vermischt. Nach der Behandlung mit T4-Ligase wurde die DNA zur Transformierung von E. coli HB 101 verwendet. Spaltung, alkalische Phosphatase-Behandlung, Ligation und Transformation erfolgten, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben. Die Restriktionsanalyse von 12 ampicillinresistenten Klonen zeigte einen Klon an, welcher Plasmid pHV33 mit einem 1,1-kb-Einsatz in der Eco-RI-Stelle enthielt. Das als pSPA16 bezeichnete Plasmid ist in Figur 8 schematisch dargestellt. In Figur 9 sind die Nucleotidse-, quenz und die deduzierten Aminosäuren, die dem Stopkodon dieses abgestumpften Protein-A-Gens vorhergehen, dargestellt. Das vollentwickelte Protein, dem der Bereich X.fehlt, das so gebildet wurde, enthält 274 Aminosäuren, was ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 30 938 ergibt. Dieses abgestumpfte Protein-A-Molekül, welches schematisch in Figur 10 dargestellt ist, enthält alle IgG-Bindungsteile von Protein A in intakter Form, ausgenommen dem C-terminalen Teil des Bereichs C.

II. Retransformation der Shuttle-Vektoren pSPA15 und pSPA16 in E. coli

Die Shuttle-Vektoren pSPA15 und pSPA16, die im Abschnitt I oben konstruiert wurden, wurden in E. coli- HB101 retransformiert mit der Selektion für Ampicillin (amp) -resistenz (50 μg/ml) wie in Abschnitt I. Die Transformanten wurden auf ihre Protein-A-Produktion nach dem ELISA-Test, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben, geprüft. Plasmid-DNA wurde aus Protein-A-positiven Klonen, welche die entsprechenden Plasmide enthielten, ebenfalls, wie oben bei den Routineverfahren beschrieben wurde, isoliert.

III. Transformation von Stämmen von S. aureus, S.· xylosus 5 und S. epidermidis '

A. Herstellung und Transformation von Protoplasten von S. aureus SAJJ 2 ■

Unterschiedliche Spezies und gleiche Stämme von Staphylococcen enthalten unterschiedliche Restriktions- und Modifikationssysteme, und die meisten Stämme tragen mehrere davon (vgl. Stobberingh, E.E. und K. Winkler, J. Gen. Microbiol. 9J3: 359-367 (1977) und Sjöström, J.-E. u.a., J. Bacteriol. _23: 1144-1149 (1978)).

Dies verursacht Schwierigkeiten, wenn das Plasmid-DNA, welches aus E. coli isoliert wurde, in Staphylococcen durch Transformation eingeführt.werden soll.

Zur Beseitigung des Res1;riktionsproblems wurde eine restriktionsarme Mutante von S. ,aureus 8325, bezeichnet als SA113, ursprünglich von Iordanescu u.a. (J. Gen. Microbiol. 96: 277-281 (1976)) isoliert, daher verwendet, um die primären Transformationen in S. aureus der Plasmid-DNA, isoliert aus E. coli HB101, durchzuführen. Der ursprüngliche Stamm SA113

ist lysogen für Prophagen 011, 012 und 013 und wurde weiterhin mit der Phage 83A lysögeniert. Der Stamm besitzt den folgenden Phagentyp: 29/47/75/85/. Zur weiteren Abnahme der Restriktion wurden die Protoplasten auf 56⁰C während 30 Sekünden unmittelbar vor der Zugabe von DNA erhitzt (vgl. Asheshov u.a., J. Gen. Microbiol. 3j_: 97-107 (1963), und Sjöström, J.-E. u.a., Plasmid 2% 529-535 (1979)).

Verfahren und Medien für die Herstellung der Protplasten waren hauptsächlich diejenigen, die für Bacillus subtilis von Wyrick und Rogers in J. Bacteriol. 116: 456-465 (1973)beschrieben und von Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 (1979) modifiziert wurden. Es wurden jedoch einige Modifizierungen für Staphylococci durchgeführt, wie von Lindberg in J. JeIjaczewicz: Staphylococci and Staphylococcal Infections, ZbI. Bakt. Suppl. _1_0_: 535-541; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart-New York (1981) und Götz u.a. in J. Bacteriol. 145: 74-81 (1981) beschrieben.

10-ml-Proben von S. aureus SAI13,. gezüchtet in Trypticase-Soja-Kulturmedium (BBL, Cockeysville, Md., USA), zu der

9
stationären Phase (ca. 2 χ 10 koloniebildende Einheiten pro ml) wurden isoliert und auf das gleiche Volumen in einem hypertonischen gepufferten Medium (HBM), welches aus 0,7 M Saccharose, 0,02 M Na-Maleat und 0,02 M MgCl₂ bestand und dessen pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt wurde, plus 43 g Difco-Penassy-Medienpulver (Difco Lab., Detroit, Michigan, USA) pro Liter suspendiert. Lysostaphin (Schwarz/Mann Orangeburg, N.Y., USA) und Lysozym (Sigma Chemical Co., St.

Louis, Mo., USA) wurden bei 20 und 2000 μg/ml Endkonzentration zugegeben, und die Zellsuspensionen wurden bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Zur Entfernung der Zellwand ist Lysozym nicht erforderlich, es hilft jedoch bei der Abtrennung der Protoplasten, die, wie intakte Zellen von Staphylococci, die Tendenz besitzen, sich zusammenzuballen. Diese Inkubation wurde weitergeführt, bis die Ab-

sorption bei 540 nm konstant wurde, was normalerweise innerhalb von 3 Stunden geschah. Die verbleibenden intakten Bakterien und Zellendebris wurden durch Zentrifugieren bei .2 500 χ g während 10 min pelletisiert. Die überstände wurden gesammelt und erneut bei 16 000 χ g während 10 min zentrifugiert. Die pelletisierten Protoplasten wurden erneut in HBM auf 1/10 des Volumens der Ausgangskultur suspendiert. 0,4-ml-Suspensionen der hergestellten SA113-Protoplasten in HBM (ca. 2 χ 10 Zellwandregenerierungsprotoplasmen pro ml) wurden mit E.-coli-Plasmid-DNA aus Stufe II oben wie folgt transformiert.

10 bis 20 \iq Protein-A-positive Plasmid-DNA wurden in einem Maximalvolumen von 20 μΐ unter leichtem Mischen zugegeben.

2 ml 40% PEG 600.0 (Stock-Lösung von Polyethylenglykol (PEG), hergestellt durch Auflösung von 40 g PEG mit einem Molekulargewicht von 6 000 (PEG 6000) in 100 ml hypertonischem Puffer (HB): 0,7 M Saccharose, 0,02 M Na-Maleat und 0,02 M MgCl₂, pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt) wurden unmittelbar zugegeben, und 2 Minuten später wurden 8 ml HBM zugegeben. Die Suspension wurde bei 48 200 χ g während 15 min zentrifugiert. Die pelletisierten Protoplasmen wurden dann erneut in 1 ml HBM suspendiert, und nach geeigneten Verdünnungen in HBM-Proben wurden sie für die Regenerierung der Zellwand plattiert bzw. auf Platten aufgetragen. Das Regenerationsmedium war DM3, ein Casaminosäuren-Hefeextrakt-Rinderserum-. albümin-Medium, welches 0,5 M Natriumsuccinat und 8 g Agar pro Liter entsprechend Chang und Cohen, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 (1979) enthielt. Zur Selektion der chloramphenicolresistenten Transformanten wurde CY-Medium (Novick, R. P. , J. Gen. Microbiol. 33_^: 121-136 (1963)) mit 0,5 M Natriumsuccinat, 0,02 M MgCl₂, 0,08% Rinderserumalbumin und 4 g Agar pro Liter als weiche Agarüberschicht mit Chloramphenicol verwendet, so daß man eine Endkonzentration von 10 ug/ml in dem Gesamtagarmedium erhielt. Die phenotypische Expression konnte bei 37°C während 3 Stunden vor der Zugabe

4:?

-H-

von weichem Agar mit Chloramphenicol ablaufen. Die Platten wurden bei 37⁰C während 3 Tagen inkubiert. Chloramphenicolresistente Transformanten wurden auf TSA-Platten (Trypticase Soy Agar) mit Chloramphenicol (10 \ig/ml) wieder ausgestrichen.

B._ _Nachweis_ vori Protein A

Ein qualitativer Test von Protein A wurde durchgeführt, indem man Transformanten auf Brain-Hearfe-Infusions- (BHI) -Agar (Gehirn-Herz-Infusions-Agar) (Difco Lab., Detroit, Michigan, USA) -Platten mit 1% Hundeserum ausstrich. Die Protein-AProduktion wurde als Halo des präzipitierten IgG-Protein-A-Komplexes um die Kolonien (Kronvall, G. u.a., J. Immunol. 104: 140 (1970)) nachgewiesen. Der Rezipientenstamm S_. aureus SA113 erzeugte sehr geringe Mengen an Protein A, fast ohne nachweisbaren Halo um die Kolonien.

C.

Das Plasmid-DNA wurde aus dem Protein A hergestellt, welches SA1ΐ3-Transformanten erzeugt, die in Stufe A erhalten wurden, indem man ein Schnellkochverfahren, wie es von Hol mes u.a. (Anal. Biochem. 114:193 (1981)) beschrieben wird» anwandte, ausgenommen, daß Lysozym durch Lysostaphin bei einer Endkonzentration von 50 μg/ml ersetzt wurde.

D. T£änsformation von

Die folgenden staphylococcen Stämme wurden mit Plasmiden pSPA15 und pSPAi6, wie oben in Stufe A für S_. aureus SA113 beschrieben, transformiert:

Staphylococcus aureus U320, eine Protein-Α-negative Mutante des Stammes S_. aureus SA113, isoliert beim Department of Microbiology, The Biomedical Centre, Uppsala, Schweden j . Staphylococcus epidermidis 247, ein coagulasenegativer Sta-

phylococcus, der Protein A nicht erzeugt; Staphylococcus xylosus KL117, ein coagulasenegativer Staphylococcus , der Protein A nicht erzeugt.

IV. Herstellung von Protein A, kodiert mit den Plasmiden pSPA15 und pSPAi6 .

Transformanten, die bei den Stufen III A bis D oben erhalten wurden, wurden in Trypticase-Soy-Medium, angereichert mit Thiamin (1 mg/Liter), Nicotinsäure (1,5 mg/Liter) und Ca-Pantothenat (1,5 mg/Liter), gezüchtet, und die Produktion von extrazellularem wie auch an die Zellwand gebundenem Protein A wurde bestimmt. Das an die Zellwand gebundene Protein.A ist die Menge an Protein A, die nach der Gesamtlyse von 1 ml gewaschener Zellen in der stationären Wachs-

9
tumsphäse (ca. 8x10 CFU/ml) freigesetzt wird, und das extrazellulare Protein A ist die Menge an Protein A in dem Wachstumsmedium.

Das mit der Zellwand assoziierte Protein A wurde quantitativ

125 bestimmt, indem man die Bindung von J-markiertem Human-IgG an die Zellen mißt (Kronvall, G., J. of Immunol. 104; 273-278 (1970)) oder indem man den ELISA-Test anwendet, wie er unter den Routineverfahren beschrieben worden ist, nach Beendigung der Lyse der Zellen mit Lysostaphiri. '.'■...

Das extrazellulare Protein A wurde unter Anwendung des ELI-SA-Tests gemessen.

S.-aureus-Stämme Cowan I und A676 wurden als Referenzstämme für die Produktion, von an die Zellwand gebundenem und extrazellulären! Protein A verwendet.

Der Stamm Cowan I ist der Typ von Stamm für Untersuchungen der Zellwand, an welche Protein A gebunden ist (Nordström, K., Acta Universitatis Upsaliensis. Abstracts of Uppsala

Dissertations from the Faculty of Medicine 271 (1977)). Geringe Mengen an Protein, d.h. extrazellulares Protein A, wurden in dem Wachstumsmedium nachgewiesen, vermutlich bedingt durch Autolyse.
■ 5 '■

Der Stamm A676 ergibt nur extrazellulares Protein A (Lindmark u.a., Eur. J. Biochem. 74 ^: 623-628 (1977)) und wird von Pharmacia AB zur industriellen Produktion von Protein A verwendet.

'.■'■.·■ Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 aufgeführt. Alle Werte in den Tabellen sind für die Zelldichten korrigiert und somit direkt vergleichbar.

Tabelle 2

Produktion von an die Zellwand gebundenem Protein A in unterschiedlichen staphylococcen Spezies, kodiert durch Plas-

mid pSPA15

Bakterienstamm	an die Zell wand gebunde nes Protein A %	•	0 3	extrazellu lares Pro tein A %
Staphylococcus aureus:
Cowan I 113 113 (pSPA15) U320 U320 (pSPA15)	100 1,5 3 0 50	0 3	12 0 0,3 0 6
Staphylococcus epidermidis
247 247 (pSPA15)	0 0,3
Staphylococcus xylosus:
KL117 KL117 (pSPA15)	0 0,3

In Tabelle 2 wird die Menge an Protein A, welches an die Zellwand gebunden ist, beim Stamm Cowan I als 100% angenommen, entsprechend einer Verdünnung von 1/256 beim ELISA-Test, gleich 120 mg Protein A/Liter mit Lysostaphin behandelter Kultur* Alle anderen Zahlen in der Tabelle sind auf diese Zahl bezogen.

Tabelle 3

Produktion von extrazellularem Protein A in unterschiedlichen staphylococcen Spezien, kodiert durch Plasmid pSPA

extrazellu- an die Zellwand

_, , , . , . lares Pro- gebundenes Pro-Bakterienstamm , . _ ■ L · * '

tem A tem A

Staphylococcus aureus:

A6 76 . 100 0

113 0 ■ 1,5

113 (pSPA16) 3 ; 1,5

U3 20 0 0

U320 (pSPA16) 100 0

Staphylococcus epidermidis:

247 0 0

247 (pSPA16) 12 0

Staphylococcus xylosus:

KL117 0 0

KL117 (pSPA16) 25 0

In der Tabelle 3 wird die Menge an Protein A in dem Wachstumsmedium (d.h. das extrazellulare Protein A) als 100% angenommen, entsprechend einer Verdünnung von 1/256 im ELISA-Test und entsprechend zu 90 mg Protein A/Liter Medium. Alle anderen Zahlen beziehen sich auf diese Zahl.

Aus den Tabellen 2 und 3 oben folgt, daß das Protein A, welches durch das Plasmid pSPA15 kodiert ist, im wesentlichen

an die Zellwand gebunden ist, wohingegen das ganze abgestumpfte Protein A, welches mit dem Plasmid pSPA16 kodiert ist, dem der Bereich X fehlt, in das Wachstumsmedium abgeschieden bzw. abgegeben wird. .
■ Aus Tabelle 3 folgt weiterhin, daß die S.-aureus-Signalsequenz funktionell ist, ebenfalls bei anderen Staphylococcenspezies als S_. aureus, wie S_. epidermidis und S_. xylosus.

Staphylococcus xylosus wird als Starterkultur für die Produktion von "Rohwurst" (Liepe, H.-U., Formu Mikrobiologie 5_: 10-15 (1982), Fisher u.a., Fleischwirtschaft 6_0: 1046-1051 (1980)) verwendet und kann somit als apathogene Staphylococcenspezies angesehen werden. Aus diesem Grund wäre S_. xylosus, welcher das klonierte Protein-A-Gen enthält, eine Alternative zu S_. aureus zur industriellen Herstellung von Protein A.

Ein Protein A erzeugender Klon von Staphylococcus xylosus KL117, enthaltend das Plasmid pSPA16, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland am 15. August 1983 hinterlegt, und ihm wurde, die Nr. DSM 2706 zugeordnet.

Die Mengen an Protein A, die bei den obigen Beispielen erhalten wurden, stellen keine maximalen Ausbeuten dar. Der Fachmann kann die Ausbeuten erhöhen, beispielsweise durch geeignete Auswahl der Nährmedien etc.

Oben wurden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erläutert, und die vorliegende Erfindung ist selbstverständlich darauf nicht beschränkt, sondern viele Variationen und Modifizierungen der Verfahren und Rekombinanten gemäß der Erfindung durchgeführt werden, ohne daß der Umfang, wie er in den folgenden Ansprüchen definiert wird, geändert wird.

Internationales Aktenzefcnen: PCT/SE83V00298

3J9UIUb MIKROORGANISMEN

Angaben über den auf Seite .1.5 , Zeile-J-A7.1 P. . der Beschreibung genannten Mikroorganismus

A. KENNZEICHNUNG DER HINTERLEGUNG²

Weitere Hinterlegungen sind auf einem zusatzlichen Blatt angegeben

Name der Hinterlegungsitelle⁴

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

Anschrift der Hinterlegungsstelle (einschließlich Postleitzahl und Land)⁴

3risebachstrasse 8 . .

)-3400 Göttingen Bundesrepublik Deutschland Datum der Hinterlegung⁵

12.JÜÜ 1982 (12-07-82)

Eingangsnummer⁶ DSM 2434

B. WEITERE ANGABEN (die Angaben werden auf einem gesonderten Blatt fortgesetzt I I)

C. BESTIMMUNGSSTAATEN, FÜR DIE ANGABEN GEMACHT WERDEN³ (falls die Angaben nicht alle Bestimmungsstaaten

betreffen)

D. NACHREICHUNG VON ANGABEN⁸

Folgende Angaben werden später beim Internationalen Büro eingereicht (allgemeine Bezeichnung der Angaben, z.B. "Eingangsnummer der Hinterlegung")

E. |X I Dieses Blatt wurde zusammen mit der internationalen Anmeldung eingereicht (vom Anmeldeamt nachzuprüfen)

(Bevollmächtigter Beamter)

Datum des Eingangs dieses (vom Anmelder nachgereichten) Blattes beim Internationalen Büro

.■•10

(Bevollmächtigter Beamter)

Formblatt PCT/RO/134 (Januar 1981)

RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS', FOR THE PURPOSE OF PATENT PROCEDURE

-Bn-

INTERNATIONAL FORM

Martin Lindberg
Department of Microbiology Blomedical Center Box 581

S-75123 Uppsala Schweden

RECEIPT IN THE CASE OF AN ORlCIIiAL DEPOSIT issued pursuont to Rule 7.1 by th« INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Identified at the bottom of this page

_l

I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGAiJISM	Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY:	II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR TAXONOMIC DESIGNATION	(Date of the original deposit)
Identification reference given by the DEPOSITOR:	DSM 2k3k	The microorganism identified under I above was accompanied by:
E. coli SPA11	^] a scientific description	Signoture(s) of pcrEon(s) hoving the power to represent the International Depositary Authority or of authorized official(s): J^N V__JvAJLL4 f
	0 a proposed taxonomic designation	Date: July 13, 1982
(Mark with a cross where applicable)
III. RECEIPT AND ACCEPTANCE .
This International Depository Authority accepts the microorganism identified under I above, which
was received by it on July 12, 19Θ2
IV. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN Address: Grisebochstracse 8 D-31,00 Göttingen

Whore Rule 6.Md) applies, .such date is the date on which the status of lnternotional depositary authority was acquired; whore u deoooit maae outside the Budapest Treaty after the acquisition.' of the status of international depositary authority is converted into ο deposit under the Budapest Treaty, such date is the date on which the microorganism was received by the International depositary authority.

form DSM-BP/i. (sole page) 0582

FOR THE PURPOSE OF PATENT PROCEmJfrE 33901 06 INTERNATIONAL FORM

Martin Lindberg Department of Microbiology Blomedical Center Box 581

S-75123 Uppsala Schweden

VIABILITY STATEMENT issued pursuant to rule 10.2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Identified on the'bottom of this page

J .

I. DEPOSITOR

II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM

Name: Martin Llndberg

. Department of Microbiology

Address: Biomedical Center

. Box 581

S-75123 Uppsala. Schweden

Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

DSM 2434

Date of the deposit br of the transfer: July 12, 1982

III. VIABILITY STATEMENT

The viability of the microorganism identified under II above was tested on On that date, the said microorganism was

3
[y| viable

|~~) no longer viable

IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PERFORMED V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

Name:

DEUTSCHE SAWMLUNG VON MIKROORGANISMEN

Address: Grisebcchstr. 8 D-31,00 Göttingen

Signature(s) of person(s) having the power to represent the International Depositary Authority or of authorized official(s):

Date: J_u|y -^ -|₉₈2

Indiente the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the moot recent relevant date (date of the new deposit or dote of the transfer).

In the cases referred to in Rule 10.2(a)(li) and (Hi), refer to the most recent viability test.

Moirk with ο cross the applicable box.

pill in if the Information hex; been requested and if the results of the tests were negative.

Forn RCM-flP 9 (sole page) O502

Claims (19)

PATENTANSPRÜCHE

1. Ein DNA-Fragment, welches eine Signal-DNA-Sequenzkodierung für ein Signalpeptid enthält und welches stromabwärts davon eine Einsatzstelle für ein Gen oder einen Teil davon, die für ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid ko-,5 diert, enthält oder damit versehen sein kann, dadurch g e kennzeichnet , daß die Signalsequenz diejenige eines Staphylococcen-Proteih-A-Kodierungsgens oder eines chemisch synthetisierten Äquivalents davon ist.

2. . DNA-Fragment nach Anspruch T, dadurch gekennzeichnet, daß es sich von einem Stamm von Staphylococcus aureus ableitet.

3. DNA-Fragment nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenzkodierung für ein Polypeptid der folgenden Aminosäuresequenz enthält: Leu-Lys-Lys-Lys-Asn-Üe-Tyr-Ser-Üe-Arg-Lys-Leü-Gly-Val-Gly-Ue-Ala-Ser-Val-

Thr-Leu-Gly-Thr-Leu-Leu-Ile-Ser-Gly-Gly-Vai-Thr-Pro-Aia-Ala-Asn-X / worin X AIa, Ala-Ala oder Ala-Ala-Gln-His-Asp-Glu-Ala ist. 20

4. DNA-Fragment nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß X AIa bedeutet.

5. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Signal-DNA-Sequenz wie folgt ist:

TTGAAAAAGAAA AACATTTATTCA ATTCGTAAACTA GGTGTAGGTATT GCATCTGTAACT TTAGGTACATTA CTTATATCTGGT GGCGTAACACCT GCTGCÄAATGCT.

6. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß vor der Signalsequenz ein Promotor eines Staphylococcen-Protein-A-Kodierung gens vorhanden ist.

7. DNA-Fragment nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß es die gesamte Expressionskontrollregion eines Staphylococcen-Protein-A-Kodierungsgens enthält,

8. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß es sich von E. coil. SPA11, DSM Nr. 2434, seinen Varianten oder Mutanten ableitet. ■■■■■.'

9. Verfahren zur Herstellung des DNA-Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß ein DNA-Fragment, welches die Signalsequenz eines Protein-A-Kodierungsgens enthält, aus staphylococcer DNA extrahiert wird und gegebenenfalls eine Einsatzstelle eines Gens oder eines Teils davon stromabwärts von der Signalsequenz eingeführt wird.

10. Klonierungsvehikel, dadurch g e k e η η zeichnet , daß es das DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, wobei das Klonierungsvehikel bevorzugt ein Plasmid ist. .

11. Verfahren zur Herstellung eines Klonierungsvehikels nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß ein Klonierungsvehikel mit einem Restriktionsenzym gespalten wird und das DNA-Fragment in die .Spaltungsstelle eingesetzt wird. ,

12. Ein Mikroorganismus, der mit dem Klonierungsvehikel nach Anspruch 10 transformiert worden ist.

13. Verfahren zur Herstellung des Mikroorganismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirtorganismus mit dem Klonierungsvehikel nach Anspruch 10 transformiert wird.

14. Ein Rekombinanten-DNA-Molekül, dadurch g e k e η η ■ zeichnet , daß es das Klonierungsvehikel nach Anspruch 10 mit einem darin eingesetzten Gen oder einem Teil davon umfaßt, welches für ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid kodiert, so daß die Expression der Signal-DNA-Sequenz zusammen mit dem ausgewählten Gen Oder dem Teil davon eine Vorstufe des Proteins oder Polypeptids ergibt.

15. Verfahren zur Herstellung des DNA-Moleküls nach Anspruch 14, dadurch g e k e η η ζ e i c hn et , daß ein Gen oder ein Teil davon, welches für ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid kodiert, in das Klonierungsvehikel nach Anspruch 9 stromabwärts von der Signal-DNA-Sequenz davon eingesetzt wird.
· .

16. Ein Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet , daß er durch das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 14 transformiert worden ist.

17. Mikroorganismus nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß er ein Bakterium ist.

18. Verfahren zur Herstellung des Mikroorganismus nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet , daß ein Wirtorganismus mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 14 transformiert wird..

19. Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Proteins oder Polypeptids, dadurch gekenn ze ichnet, daß der transformierte Mikroorganismus nach Anspruch 15 gezüchtet bzw. kultiviert wird.