DE3750094T2

DE3750094T2 - Klonierung und Expression einer Bordetella pertussis-Toxin-kodierenden DNS.

Info

Publication number: DE3750094T2
Application number: DE3750094T
Authority: DE
Inventors: Maria Beatrice Arico; Alfredo Nicosia; Rino Rappuoli
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1986-01-28
Filing date: 1987-01-28
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2007-01-29
Also published as: US5427788A; US6350612B1; CA1340373C; ATE107692T1; US5785971A; EP0232229A2; JP2685442B2; ES2054701T3; EP0232229B1; DE3750094D1; HK3396A; EP0232229A3; JPS62228286A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein cloniertes und sequenziertes EcoRI-Fragment aus chromosomaler DNA von Bordetella pertussis, das die Gene enthält, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, und das für die Herstellung des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer Untereinheiten des Pertussistoxins verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridplasmid, das das clonierte und sequenzierte DNA-Fragment oder weitere Fragmente davon enthält, und einen Mikroorganismus, der mit dem Hybridplasmid transformiert ist und das clonierte DNA-Fragment oder weitere Fragmente davon exprimieren kann, wobei das Pertussistoxin oder eine oder mehrere Untereinheiten des Pertussistoxins synthetisiert werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer Untereinheiten des Pertussistoxins, was das Wachstum des von dem Hybridplasmid transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium umfaßt.
Das Pertussistoxin oder eine oder mehrere Untereinheiten des so erhaltenen Pertussistoxins kann für die Herstellung von Impfstoffen und Diagnosekits verwendet werden.
Pertussis ist eine von Bordetella pertussis (B. pertussis), einem gram-negativen Coccobacillus, der direkt über die Luft während des Stadium catarrhale oder des Stadium convulsivum von einem Kranken auf ein empfindliches gesundes Individuum übertragen wird, verursachte Infektion der Atemwege.
Pertussis kann Komplikationen der Atemwege, Nervenschäden und hohe Mortalität verursachen, insbesondere bei Kindern niederer sozialökonomischer Schichten und bei neugeborenen Babys ohne mütterliche anti-Pertussisantikörper. Der klinische Verlauf von Pertussis umfaßt vier Stadien: Inkubationszeit, Stadium catarrhale, Stadium convulsivum (Hustenanfälle) und Rekonvaleszenz.
Während der ersten zwei Stadien treten Symptome auf, die vergleichbar einem gewöhnlichen Schnupfen sind, und das B. pertussis kann leicht von den Patienten isoliert werden.
Während des Stadiums der Hustenanfälle, das durch die Symptome von Keuchhusten selbst gekennzeichnet ist, wird das Bakterium nur in 50% der Fälle isoliert.
Während der Rekonvaleszenz ist es nicht mehr möglich, B. pertussis aus dem Nasopharynx zu isolieren, obwohl die Patienten noch Symptome von Keuchhusten aufweisen.
Daraus geht hervor, daß die heftigeren klinischen Anzeichen der Krankheit nach dem Verschwinden der Bakterien auftreten und daraus kann abgeleitet werden, daß Pertussis nicht vom Eindringen der Bakterien in den Respirationstrakt abhängt, sondern von einem durch die Bakterien bedingten toxischen Zustand, der aber nach Verschwinden der Bakterien bleibt.
Der Übergang von B. pertussis von Stadium I (virulent) in Stadium III (nicht-virulent) wird von einem Verlust der Fähigkeit begleitet, bestimmte Substanzen zu synthetisieren wie: das Pertussistoxin (PT) Hämolysin (hly), die Adenylatcyclase (Adc) und das dermonekrotische Toxin (Dmt).
Die von Munoz. J.J. et al. (1981) (Inf. Immun. 32. 243) durchgeführten Tests haben gezeigt, daß ein aus dem Pertussistoxin allein hergestellter Impfstoff, geeigneterweise mit Glutaraldehyd entgiftet, Mäuse vor dem Tod durch intracerebrale Applikation von Bakterien in Stadium I schützen kann.
Studien in den letzten Jahren (Weiss, A.A. et al. (1983) Inf. Immun. 42 33; Weiss, A.A. et al (1984) J. Inf. Dis. 150, 219) haben gezeigt, daß nicht alle diese fünf (vier) Substanzen gleichermaßen zur Virulenz von B. pertussis beitragen, und Weiss gelang es, die Mutanten, die selektiv nur einen der Virulenzfaktoren durch Insertion eines transponierbaren Elements, eines Transposons (TN5), in das Genom von B. pertussis verloren haben, zu isolieren. Aus den in Tieren durchgeführten Tests ging hervor, daß nur die Mutanten, die die Fähigkeit zur Synthese von PT oder Adc verloren hatten, gleichzeitig die Virulenz verloren haben.
So ist das Pertussistoxin (PT) der Hauptfaktor bei der Virulenz von Bordetella pertussis.
Das Pertussistoxin (PT), ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 100000 Dalton, wird während des Stadiums I von Bordetella pertussis produziert und in den extrazellulären Raum freigesetzt.
PT weist enzymatische Aktivität auf und inaktiviert ADP-Ribosilandol, ein GTP-abhängiges Protein, das an der Inaktivierung der zellulären Adenylatcyclase beteiligt ist.
Wie andere Toxine wird auch das Pertussistoxin durch zwei verschiedene Fragmente gebildet: A und B.
Das Fragment A, das toxisch ist, umfaßt ein einzelnes Polypeptid S1 (Untereinheit S1) mit einem Molekulargewicht von etwa 28 000 Dalton, das eine ADP-Ribosegruppe an ein an der Übertragung von Signalen von außen in das Innere der Zellen beteiligtes GI-Protein binden kann.
Das Fragment B umfaßt fünf (vier) Polypeptide S2, S3, S4 und S5 (Untereinheiten S2, S3, S4, S5) mit einem Molekulargewicht von 23 000, 22 000, 12 000 bzw. 9 000 Dalton, in Form von zwei Dimeren S2 + S4 und S3 + S4 und einem Monomer S5.
Das Fragment B bindet an Membranrezeptoren von eukaryotischen Zellen und ermöglicht S1 den Zugang zu Zellen.
Zur Zeit wird ein Pertussisimpfstoff verwendet, der, obwohl er permanente Immunität verleiht, zahlreiche Nachteile aufweist.
Der Impfstoff besteht in der Tat aus virulenten Bakterien (Stadium I) , die zur Entfernung eines Toxins, das hitzelabil (dermonekrotisches Toxin) ist, 30 Minuten bei 56ºC behandelt und die mit Merthiolat abgetötet werden.
Da die Bakterien keiner Entgiftungsbehandlung unterworfen werden, ist jeder toxische Stoff, der gegenüber einer 30minütigen Behandlung bei 56ºC resistent ist, in dem Impfstoff enthalten.
Die Gegenwart solcher toxischer Stoffe, insbesondere von PT, verursacht Nebenwirkungen, die von der einfachen Rötung bis zu ständigen neurologischen Schäden und/oder Tod reichen.
All dies hatte zur Folge, daß in den letzten zehn Jahren die Verwendung des Impfstoffes drastisch reduziert wurde, wobei in der Folge verstärkt Pertussisfälle auftraten.
In den letzten Jahren wurde ein Impfstoff hergestellt, der im wesentlichen aus fibrösem Hämagglutinin (FHA) und mit Formaldehyd entgiftetem Pertussistoxin besteht (Sato Y., et al: Lancet Jan. 21. 122 (1984))
Dieser Impfstoff hat jedoch Nachteile wie: Auftreten von Nebenwirkungen, wenn auch in geringerem Maße als beim üblichen Impfstoff; Gewinnung eines Produktes, das zu wenig gereinigt ist, um als solches verwendet zu werden, und außerordentliche Vielfältigkeit des Produkts von Präparation zu Präparation.
So besteht ein Bedarf, einen wirksamen Impfstoff bereitzustellen, der im großen Maße hergestellt werden kann und der die vorstehend erwähnten Nachteile nicht hat.
So haben es zum Beispiel Entwicklungen auf biochemischen Gebiet und auf dem Gebiet der Gentechnologie in den letzten Jahren möglich gemacht, synthetische Impfstoffe zu produzieren und Mikroorganismen, die Proteine herstellen können, die für die Produktion von Impfstoffen mit hoher Ausbeute verwendet werden können.
In jedem Fall ist ein Schlüsselelement für die Herstellung der Impfstoffe die Kenntnis der Aminosäuresequenz des Proteins und der Nucleotidsequenz des Gens/der Gene, die das Protein codieren.
Ist das Gen, das ein bestimmtes Protein codiert, cloniert und sind seine Nucleotid- und Aminosäuresequenzen bestimmt, ist die Produktion dieser in großem Maßstab und die Konstruktion der synthetischen Impfstoffe mit gängigen Techniken möglich.
Gegenwärtig ist nichts über die Natur, die Struktur und die Expression des Gens und/oder der Gene des Pertussistoxins bekannt und keine anderen Daten als die Aminosäurezusammensetzung der einzelnen Untereinheiten des Pertussistoxins sind verfügbar.
Entsprechend ist durch die vorliegende Erfindung die aminoterminale Aminosäuresequenz der Untereinheiten S1, S2, S3 und S4 des Pertussistoxins bestimmt worden und ein EcoRI-Fragment der chromosomalen DNA aus Bordetella pertussis, wobei das Fragment 4696 Basenpaare aufweist und die Gene enthält, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, ist cloniert und sequenziert worden und kann für die Herstellung des Pertussistoxins oder einer oder mehr Untereinheiten des Pertussistoxins verwendet werden. Somit ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein cloniertes und sequenziertes 4696-Basenpaar-EcoRI-Fragment der chromosomalen DNA aus Bordetella Pertussis, enthaltend die Gene, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins oder Fragmente davon codieren, das für die Produktion des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer Untereinheiten des Pertussistoxins verwendet werden kann.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Hybridplasmid, enthaltend das clonierte und sequenzierte DNA-Fragment oder weitere Fragmente davon.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Mikroorganismus, der mit dem Hybridplasmid transformiert wurde und das clonierte DNA- Fragment oder seine weiteren Fragmente exprimieren kann, wobei das Pertussistoxin oder eine oder mehrere Untereinheiten des Pertussistoxins synthetisiert werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer Untereinheiten des Pertussistoxins durch Züchtung des transformierten Mikroorganismus.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Verwendung des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer Untereinheiten des Pertussistoxins zur Herstellung von anti-Pertussisimpfstoffen und Diagnosekits.
Noch ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist das Protein des Pertussistoxins, bei dem die Untereinheiten S1, S2, S3, S4 die in den Fig. 2 und 3 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen. Weitere erfindungsgemäße Gegenstände gehen aus der Beschreibung und den folgenden Versuchsbeispielen hervor.

Kurze Beschreibung der in der Beschreibung verwendeten Begriffe

Genetischer Code:
bedeutet die Beziehung zwischen der Nucleotidsequenz in der DNA und der Aminosäuresequenz in einem Protein.
Ein wichtiges Kennzeichen des genetischen Code ist die Tatsache, daß die Synthese jeder Aminosäure durch eine Sequenz von drei Nucleotiden in der DNA, auch Triplett oder Codon genannt, spezifiziert wird.
Der genetische Code ist universell, das heißt, ein spezielles Triplett codiert die gleiche Aminosäure in allen Lebewesen.
Leseraster:
bedeutet eine Gruppe von Tripletts, die von einer Zelle zur Entschlüsselung der genetischen Botschaft verwendet wird.
Clonierungsvektoren:
das sind DNA-Moleküle, die die gesamte genetische Information enthalten, die ihnen ermöglicht, sich zu replizieren, wenn sie in einen Wirts-Mikroorganismus transferiert werden.
Beispiele für häufig in der Gentechnologie verwendete Clonierungsvektoren sind die Plasmide und die DNA mehrerer Bakteriophagen.
Die Plasmid-DNA, die zirkulär ist, kann durch geeignete Techniken gespalten werden und ein heterologes DNA-Fragment kann inseriert und der Ring wieder geschlossen werden, wobei ein größeres Molekül, das die heterologe DNA enthält, das sogenannte rekombinante DNA-Molekül oder Hybridplasmid, gebildet wird.
Die Bakteriophagen-DNA kann ein Segment heterologer DNA, das an Stelle mehrerer nicht-essentieller Gene inseriert ist, enthalten. Diese beiden Vektoren werden zur Insertion von heterologen DNA- Fragmenten und zur nachfolgenden Transformation von Mikroorganismen, den sogenannten Wirtszellen, verwendet.
Restriktionsenzyme:
sind hydrolytische Enzyme, die ein DNA-Molekül an speziellen Stellen, den sogenannten Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, spalten können.
Transposons:
sind DNA-Segmente, die transponieren und sich selbst an verschiedenen Punkten in das Genom inserieren und ein als Transposition bekanntes Verfahren auslösen können.
Promotor:
ein spezieller Bereich des DNA-Moleküls, bei dem die RNA- Polymerase die Transkription beginnt.
Der Promotor umfaßt eine Erkennungsstelle und eine Bindungsstelle für das Enzym.
Terminatorbereich:
ein spezieller Bereich des DNA-Moleküls, bei dem die Transkription endet.
Translation:
ist die Weitergabe von genetischer Information von der mRNA an das Protein nach den Regeln des genetischen Code.
Expression:
bedeutet den Mechanismus, durch den ein Organismus ein von einem spezifischen Gen codiertes Protein synthetisieren kann.
In diesem Fall sagt man, daß das Gen von dem Mikroorganismus exprimiert wird.
Im allgemeinen erfordert ein Verfahren zur Gewinnung eines heterologen Proteins durch rekombinante DNA-Techniken die Clonierung des Gens, das das Protein codiert, wobei Clonierung Sequenzierung, Isolierung und Reinigung des Gens und/oder der Gene bedeutet, die das Protein codieren. Einmal cloniert, kann das Gen in einen Expressionsvektor inseriert werden und das so erhaltene rekombinante DNA-Molekül kann in einen Wirts-Mikroorganismus eingeführt werden, wobei das Gen gleichzeitig mit der Replikation des Mikroorganismus, aus dem es durch übliche Verfahren wieder isoliert werden kann, repliziert wird.
Mit diesem Verfahren ist es möglich, eine dauernd erneuerbare Quelle des Gens bereitzustellen, das weiter manipuliert, modifiziert und in andere Vektoren oder an verschiedene Stellen im gleichen Vektor inseriert werden kann.
Der transformierte Mikroorganismus, der in einem geeigneten Kulturmedium gewachsen ist, ermöglicht es, daß das von dem Gen codierte Protein synthetisiert wird.
Erfindungsgemäß wurde ein EcoRI-Fragment aus der chromosomalen DNA von Bordetella pertussis BP 165, enthaltend die Gene, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, cloniert und sequenziert und die aminoterminale Sequenz der Untereinheiten S1, S2, S3 und S4 des Pertussistoxins wurde bestimmt. Insbesondere wurde das von Bordetella pertussis 165 gebildete Pertussistoxin mittels Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend die Untereinheiten mittels Elektrophorese in Polyacrylamid- Natriumdodecylsulfatgelen aufgetrennt, wie in Fig. 1 gezeigt.
Die einzelnen Untereinheiten wurden dann getrennt und mittels Elektroelution (Hunkapiller M.W. et al.; Methods in Enzymology 91 227-236, 1983) gereinigt und in einem Gasphasen-Mikrosequenator analysiert.
Die aminoterminale Sequenz der Untereinheiten S1, S2, S3 und S4 ist in Fig. 2 dargestellt.
Eine Genbank wurde dann unter Verwendung des E. coli lambda-Phagen EMBL4 (gekauft von Promega Biotec 2800 S.Fish Hatchery Road, Madison, WI 53711 USA) konstruiert, wobei man von dem Stamm Bordetella Pertussis BP 356 ausging.
Dieser Stamm ist eine Mutante, die kein aktives Toxin produziert und ein einzelnes Transposon TN5, das in ihr Chromosom inseriert ist, aufweist (Weiss, A.A. et al., Infect. Immun. 42. 33-41 (1983))
Die chromosomale DNA des Stamms wurde von den Zellen abgetrennt und nach der Reinigung mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 mittels des Verfahrens und unter den von Maniatis T. et al.: Molecular Cloning, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor N.Y., (1982) beschriebenen Bedingungen verdaut. Die chromosomalen DNA-Fragmente mit 15 000 bis 20 000 Basenpaaren wurden dann getrennt und in dem zuvor, wie von Frischauf A. et al. (J. Mol. Biol. 170, 827-842 (1983)) berichtet, hergestellten E. coli lambda-Phagenvektor EMBL4 unter Verwendung des Promega Biotec "Packagene" Kit nach dem von Maniatis T. et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor N.Y. 1982) beschriebenen Verfahren cloniert.
Die rekombinanten Phagen wurden dann zur Transformation der E. coli NNM 539-Zellen (Promega Biotec) verwendet.
Die DNA-Fragmente enthaltenden Phagen, in die das Transposon TN5 inseriert worden war, wurden dann aus den transformierten Zellen mittels Platten-Hybridisierungstechnik mit einer radioaktiven Sonde für die TN5-DNA ausgewählt.
Die rekombinante Phagen-DNA wurde dann aus den positiven rekombinanten Phagen extrahiert und nach der Verdauung mit dem Restriktionsenzym EcoRI wurden die das Transposon TN5 enthaltenden DNA-Fragmente abgetrennt und mittels Hybridisierung mit einer Sonde für TN5-DNA selektiert.
Auf diese Weise war es möglich, ein Eco-RI-DNA-Fragment mit etwa 10500 Basenpaaren, enthaltend die gesamte Sequenz des TN5- Transposons, das auf der einen Seite von etwa 1100 Basenpaaren und auf der anderen von etwa 3500 Basenpaaren chromosomaler DNA aus Bordetella pertussis BP 356 flankiert ist, zu isolieren.
Die Eco-RI-Fragmente mit 10500 Basenpaaren wurden dann mit dem Restriktionsenzym Hinc II verdaut und die DNA-Fragmente, die die Verbindung zwischen dem TN5 und der chromosomalen DNA enthalten, wurden mittels Hybridisierung mit einer Sonde für TN5-DNA isoliert.
Zwei Fragmente wurden auf diese Weise identifiziert, eines mit etwa 500 Basenpaaren und das andere mit 1900 Basenpaaren.
Die zwei durch Elektroelution gereinigten Fragmente wurden dann in dem Phagenvektor M13mp8 (New England Biolabs) cloniert, dessen DNA vorher mit dem Restriktionsenzym HincII gespalten worden war.
Die Nucleotidsequenzen der zwei Fragmente wurden dann bestimmt, von der HincII-Stelle beginnend nach dem von Sanger F.S.: Proc. Natl. Acad. Sci. 74 5463 (1977) beschriebenen Verfahren.
Das Fragment mit 1900 Basenpaaren hatte, etwa 400 Nucleotide von der HincII-Stelle entfernt, eine Nucleotidsequenz (Fig. 3A von 3030 bis 3100 Bp) die, gemäß dem genetischen Code in die entsprechenden Aminosäuren translatiert, genau der Aminosäuresequenz, die vorher für die Untereinheit S3 bestimmt und in Fig. 2 dargestellt wurde, entsprach.
Dieses Ergebnis bestätigt, daß das clonierte DNA-Fragment mit 10500 Basenpaaren das Gen für das Pertussistoxin enthielt.
Das Fragment mit 1900 Bp wurde dann als Hybridisierungssonde zur Identifizierung und Isolierung eines DNA-Fragments, enthaltend das Gen für und/oder das Gen, das das Pertussistoxin codiert, aus der chromosomalen DNA von B. pertussis BP 165 verwendet, für die eine Genbank, wie vorstehend für B. pertussis BP 356 beschrieben, konstruiert worden war.
Am Ende der Clonierungsverfahren wurde ein 4696-Basenpaar-großes Eco RI-Fragment aus chromosomaler DNA isoliert, das, wie wir wußten, mindestens das Gen enthält, das die Untereinheit S3 codiert, da das Fragment mit der spezifischen Sonde für S3 hybridisiert.
Das Fragment oder Teile davon wurden dann in den Phagenvektor M13mp8 und M13mp9 cloniert und die so erhaltene rekombinante Phagen-DNA wurde sequenziert.
Die Analyse der Sequenzen ermöglichte die Identifizierung verschiedener offener Leseraster (ORFS).
Ein Vergleich ihrer Codierungseigenschaften und der aminoterminalen Sequenzen der Untereinheiten des Toxins haben gezeigt, daß vier dieser ORFS in der Tat die Untereinheiten S1, S2, S3 und S4 des Pertussistoxins codieren.
Darüberhinaus stimmten das Molekulargewicht, die Aminosäurezusammensetzung und die elektrischen Ladungen exakt mit den veröffentlichten Daten (Tabelle 1) überein. Auch eine fünfte ORFS zwischen jenen, die S4 und S3 codieren, wurde identifiziert, die ein Protein mit einem Molekulargewicht und einer Aminosäurezusammensetzung codiert, die identisch mit denen für die Untereinheit S5 beschriebenen sind.
Diese fünf offenen Leseraster sind in einem Fragment mit 3200 Basenpaaren in der folgenden Anordnung angeordnet: S1, S2, S4, S5 und S3 und der ORFS-Leseraster, der S4 codiert, wird von jenen, die S2 und S3 codieren (Fig. 3), überlagert. Aufgrund dieser Ergebnisse kann geschlossen werden, daß die bestimmten Sequenzen die Gene enthalten, die die Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, und so werden die offenen Leseraster nachstehend Gene genannt.
Erfindungsgemäß wurde ein Transkriptionssignal, sehr ähnlich der Consensussequenz für die E. coli-Promotoren, vor dem Gen, das S1 codiert, identifiziert.
In der Tat ist ein Bereich - 10, TAAAAT, der fünf der sechs Basenpaare der Consensussequenz enthält, mit einem Bereich -35, TGCTGACC, der sechs der acht Basen der Consensussequenz - 35 enthält, verbunden.
Der Abstand zwischen den beiden Bereichen -35 und -10 beträgt 21 Basenpaare.
Am 3'-Ende des Gens, das S3 codiert, ist eine "inverted-repeat"- Sequenz, gefolgt von einer Poly-T-Sequenz, die eine Terminationsstelle darstellen könnte, identifiziert worden.
Da kein anderer Promotor vor den vier Genen S2, S3, S4 und S5 in dem DNA-Fragment identifiziert worden ist, kann abgeleitet werden, daß diese Gene in einem einzelnen Operon organisiert sind und als einzelne polycistronische mRNA transkribiert werden.
Das Vorliegen einer einzelnen Shine-Dalgarno-Sequenz, die neun Basenpaare vor der ATG des Gens S1 liegt, legt stark nahe, daß dies die ribosomale Bindungsstelle ist, die die Translation der S1-mRNA ermöglicht.
Das Vorliegen einer neuen Consensussequenz, TCC (T) GG, die acht bis zwölf Basenpaare vor jedem ATG-Startcodon für die vier Gene liegt, legt nahe, daß diese Stelle für die Translation der gesamten mRNA verantwortlich ist.
Darüberhinaus wurde herausgefunden, daß das Gen S4, das in stöchiometrischen Mengen von 2 zu 1 im Verhältnis zu anderen Genen hergestellt wird, das einzige ist, dem eine leicht modifizierte Consensussequenz, TCCTGG, die wahrscheinlich die Translationswirksamkeit erhöht, vorangeht.
Ein Kennzeichen, das allen Untereinheiten des Pertussistoxins gemein ist, ist das Vorliegen einer Sequenz, die unmittelbar dem reifen Protein vorangeht, und die ein 27-42-Aminosäurepeptid codiert, das typisch für die bei der Sekretion der Proteine beteiligten Signalpeptide ist.
Dies legt nahe, daß die verschiedenen Untereinheiten als Proproteine synthetisiert, prozessiert und einzeln in den periplasmatischen Raum sezerniert werden und anschließend prozessiert, zusammengebaut und in den extrazellulären Raum in Form eines einzelnen Proteins freigesetzt werden.
Es ist auch herausgefunden worden, daß das Signalpeptid für S4 unerwartet lang (42 Aminosäuren) ist und die höchste bis jetzt beschriebene aminoterminale positive Ladung aufweist.
Da die positiv geladenen aminoterminalen Bereiche eine wichtige Rolle bei der Produktionseffizienz der sezernierten Proteine spielen, könnte die ungewöhnliche Struktur des Signalpeptids für S4 eine erhöhte Translation des Gens S4 verursachen.
Es wurde auch bemerkt, daß, in Abwesenheit der Untereinheit S3, wie in der Mutante BP356, das Pertussistoxin nicht in das Kulturmedium ausgeschieden wird. Folglich ist dieses Protein zur vollständigen Zusammenlagerung ("assembly") des Pertussistoxins notwendig.
Das clonierte DNA-Fragment oder weitere Fragmente davon, wobei die Fragmente mindestens ein Gen enthalten, das mindestens eine Untereinheit des Pertussistoxins codiert, müssen in einen Expressionsvektor inseriert werden können und das so erhaltene Hybridplasmid kann zur Transformation eines Mikroorganismus verwendet werden.
Die transformierten Mikroorganismen, die in einem geeigneten Kulturmedium gewachsen sind, können das DNA-Fragment oder Fragmente davon exprimieren, wobei das Pertussistoxin oder eine oder mehrere Untereinheiten des Pertussistoxins synthetisiert werden.
Die Clonierungsvektoren, die für den Zweck geeignet sind, können aus auf dem Fachgebiet bekannten, natürlichen Plasmiden oder aus durch rekombinante DNA-Techniken gewonnenen synthetischen Vektoren ausgewählt werden.
Insbesondere wird das E. coli pEMBL8-Plasmid mit etwa 4000 Basenpaaren verwendet, wobei dieses das Gen für die Ampicillinresistenz und die für die Clonierung nützlichen Restriktionsstellen enthält, wie: HindIII, PstI, AccI, HincII, SalI, BamHI, AvaI, SmaI, XmaI, EcoRI (Dente L. et al (Nucleic Acids Research 11 1645-1655 (1983)) , und die aus dem Vektor PEX29 stammenden Plasmide 31A, 31B und 31C (Klinkert M. et al., Inf. Imm. 49. 329-335 (1985)), die das Gen enthalten, das die DNA-Polymerase des Phagen MS2, der unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors pb ist, und einen vor dem Ende des Gens der MS2-Polymerase inserierten Polylinker in drei möglichen Rastern codiert, so daß es jedes mögliche DNA-Fragment im gleichen Raster der MS2-Polymerase brechen kann.
Beispiele der als Wirtszellen verwendeten Mikroorganismen sind Stämme von Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces oder eukaryontische Zellen.
Erfindungsgemäß werden E.coli JM 101-Zellen (New England Biolabs 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915-9990, USA) und E.coli K-12 Hl trp- Zellen (beschrieben von Remant E., Gene 15 : 81-93 (1981)) verwendet, die einen hitzeempfindlichen Repressor produzieren, der bei 30º die Transkription des Gens der MS2-Polymerase vollständig hemmt und dabei die Produktion der daran fusionierten Proteine verhindert und bei 42ºC inaktiviert wird, wobei eine gute Produktion der Polymerase und der daran fusionierten Proteine erhalten wird.
Die Wahl des Clonierungsvektor und des zu transformierenden Mikroorganismus sind jedoch erfindungsgemäß nicht begrenzt.
Erfindungsgemäß wurde das wie vorstehend erhaltene 4696 Basenpaar- Fragment aus chromosomaler DNA in den E. coli-Plasmidvektor pEMBL-8 nach Verdauung der Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI inseriert.
Das erhaltene Hybridplasmid, pPT101 genannt, wurde dann zur Transformation der E. coli JM 101-Zellen (New England Biolabs), die durch das von Cohen S. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 69, 2110 (1972)) beschriebene Verfahren kompetent gemacht wurden, verwendet.
Der E. coli-Stamm (pPT101) wurde bei der American Type Culture Collection am 6.8.85 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53212 hinterlegt.
Um die Fähigkeit der transformierten Mikroorganismen zur Expression des clonierten DNA-Fragments zu untersuchen, wurde der E. coli-Stamm (pPT101) in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet.
Insbesondere wurde der Stamm in LB-Medium (DIFCO) bei einer Temperatur von 37ºC bis zu einer in der Kulturbrühe bei 590 nm gemessenen Absorption von 0,75 gezüchtet.
Die Zellen wurden dann lysiert und das Pertussistoxin wurde im zellulären Lysat direkt mittels immunenzymatischer Verfahren bestimmt.
Die biologische Aktivität des Pertussistoxins wurde mittels des von Hewlett E.L. et al. (1983) (Infect. Immun. 40. 1198-1203) beschriebenen Verfahrens bestimmt, wobei die Änderung in Form der mit dem zu untersuchenden zellulären Lysat inkubierten CHO-Zellen analysiert wurde.
Die so erhaltenen Ergebnisse bestätigen, daß das 4696 Basenpaar-große Fragment aus der chromosomalen DNA aus Bordetella pertussis die Gene enthält, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, und das Toxin durch die gegen das Toxin selbst gerichteten Antikörper neutralisiert werden kann.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden die Gene, die die einzelnen Untereinheiten von PT codieren, in den aus dem Vektor PEX29 stammenden Plasmiden 31A, 31B und 31C cloniert und die so erhaltenen und PTE255 (S1), PTE211 (S2), PTE221 (S3), PTE240 (S4) und PTE230 (S5) genannten Hybridplasmide wurden zur Transformation der E. coli K-12 H1 trp-Zellen verwendet.
Die so transformierten Zellen wurden dann in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und die als fusionierte Proteine erhaltenen Untereinheiten wurden gewonnen, gereinigt und zur Bestimmung ihrer biologischen Aktivitäten getestet.
Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß alle fünf Untereinheiten bei Injektion in Kaninchen die Bildung von spezifischen Antikörpern auslösen.
Darüberhinaus zeigt das fusionierte S1-Protein die gleiche enzymatische Aktivität wie das gesamte PT-Toxin und zeigt auf diese Weise nicht nur eine immunologische, sondern auch eine funktionelle Identität mit dem natürlichen S1.
In der Tat zeigen die in Gegenwart von ³²P-markiertem NAD durch Inkubation des fusionierten S1 mit homogenisierter Ochsenretina (ROS) durchgeführten ADP-Ribosylierungstests, daß die Untereinheit S1 die ADP-Ribosegruppe an das in der Retina vorliegende Transducin bindet.
Auf diese Weise können sowohl das Pertussistoxin als auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen einzelnen Untereinheiten für die Herstellung von Pertussisimpfstoffen und für Diagnosekits zur Bestimmung der spezifischen Antikörper in klinischen Proben aus mit Pertussis infizierten Individuen verwendet werden.
Die Analyse der in der vorliegenden Erfindung verabreichten Sequenzen zeigt auch eine gewisse Ahnlichkeit zwischen der Aminosäuresequenz in der Untereinheit S1 des Pertussistoxins und der der Untereinheit A des Choleratoxins (J. Mekalanos et al., Nature 306. 551-557, 1983) (Fig. 7).
Auf diese Weise gibt es unter Verwendung des durch chemische Synthese oder rekombinante DNA-Techniken hergestellten Peptids S1 eine Möglichkeit zur Herstellung eines Impfstoffes, der Cholera und Pertussis gleichzeitig neutralisieren kann.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: Elektrophorese des durch Affinitätschromatographie gereinigten Pertussistoxins auf 15%igem Polyacrylamid (PAGE)- Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gel.
Das Toxin in Bahn A wurde vor dem Auftragen auf das Gel mit einem Reduktionsmittel behandelt.
Das Toxin in Bahn B wurde nicht reduziert.
S2 und S3 wiesen, obwohl sie das gleiche abgeleitete Molekulargewicht (Tabelle 1 - Daten aus der Literatur) hatten, verschiedene Mobilitäten auf dem SDS-PAGE auf.
S5 war leicht gefärbt und wanderte wegen seines geringeren Molekulargewichts als S4 (Tabelle 1 - Daten aus der Literatur) unter Reduktionsbedingungen langsamer als S4.
Fig. 2: Mittels eines Gasphasen-Mikrosequenators unter Verwendung der in Fig. 1 beschriebenen gereinigten einzelnen Untereinheiten bestimmte aminoterminale Sequenz der Untereinheiten S1, S2, S3 und S4.
A=Alanin; C=Cystein, D=Asparaginsäure; E=Glutaminsäure; F=Phenylalanin; G=Glycin; H=Histidin; I=Isoleucin; K=Lysin; L=Leucin; M=Methionin; N=Asparagin; P=Prolin; Q=Glutamin; R=Arginin; S=Serin; T=Threonin; V=Valin; W=Tryptophan; Y=Tyrosin; X=nicht-identifizierter Aminosäurerest.
Alle dargestellten Sequenzen stimmen genau mit den Nucleotidsequenzen überein, mit Ausnahme von Glutamin-2 in S2, das sich als Threonin herausstellte (Fig. 3)
Fig. 3A: Nucleotidsequenz des EcoRI-Fragments, enthaltend die fünf Gene, die das Pertussistoxin codieren.
Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz der fünf Untereinheiten des Pertussistoxins ist auch dargestellt.
Die Pfeile vor den Aminosäuresequenzen geben den Start der reifen Untereinheiten an, so wie er durch Vergleich mit den aminoterminalen Sequenzen in Fig. 2 identifiziert wurde.
Im Falle von S5 gibt der Pfeil den erwarteten Start der reifen Untereinheit an.
Vor der Sequenz jeder Untereinheit ist die Aminosäuresequenz der erwarteten Signalpeptide dargestellt.
Stromaufwärts des Gens, das S1 codiert, sind die erwarteten Promotor- und Shine-Dalgarno-Sequenzen angegeben.
Die Sequenzen TCC (T) GG liegen vor S2, S3, S4 und S5.
Am Ende des Gens, das S3 codiert, geben die Pfeile oberhalb der Nucleotidsequenz eine "inverted-repeat" -Sequenz mit nachfolgender Poly-T-Sequenz (unterstrichen) an, die eine mögliche Transkriptionsterminationsstelle darstellt.
Vier offene Leseraster (ORFS) mit der gleichen Verwendung wie die Codons der Gene des Pertussistoxins werden durch gepunktete Linien angegeben.
Fig. 3B: Schematische Darstellung der ORFS-Raster in der in Fig. 3A dargestellten Sequenz.
Die Raster 1, 2 und 3 sind von oben bis unten gezeigt und nur die offenen Leseraster mit mindestens 200 Basenpaaren sind angegeben.
P: erwartete Promotorsequenz
T: erwartete Stopsequenz
Fig. 4: Aminosäuresequenz der Signalpeptide der fünf Untereinheiten des Pertussistoxins.
Die Sequenz (S) (P) A · A liegt vor der Stelle, an der gespalten wird.
Fig. 5A: Translations- und Transkriptionssignale. Die Start-ATGs der Codons der verschiedenen ORFS sind ausgerichtet und rechts gezeigt.
Stromaufwärts von ATG von S1 sind die erwarteten Promotor- und Shine- Dalgarno-Sequenzen gezeigt.
Die entsprechenden Sequenzen von E.coli sind vorstehend gezeigt.
Stromaufwärts von ATG der anderen ORFS ist die Sequenz TCC (T) GG angegeben.
Diese Sequenz wurde erst nach den anderen ATG-Codons der in Fig. 3 dargestellten gesamten Nucleotidsequenz identifiziert.
Fig. 5B: Dies gibt die Struktur der erwarteten Stopsequenz an.
Fig. 6: Dies zeigt die Übereinstimmung zwischen den Aminosäuresequenzen S2 und S3. Die Pfeile geben die Stellen an, an denen die Präproteine herausgeschnitten werden, und den Beginn der reifen Untereinheiten.
Fig. 7: Vergleich der Aminosäuresequenz der Untereinheit S1 des Pertussistoxins und der Untereinheit A des Choleratoxins. Die entsprechenden Aminosäuren in den zwei Proteinen sind eingekastet.
Fig. 8: Die drei Plasmide 31A, 31B und 31C und die Einführung der Polylinker in die drei möglichen Raster werden gezeigt.
Fig. 9: Dies zeigt das Clonierungsschema für die Gene, die die fünf Untereinheiten-des Pertussistoxins in den Plasmiden 31A, 31B und 31C codieren, und die Konstruktion der Hybridplasmide PTE255 (S1), PTE211 (S2), PTE221 (S3), PTE240 (S4) und PTE230 (S5)
Fig. 10A: Dies zeigt die Elektrophorese des Gesamtlysats der Stämme, die die MS2-Polymerase und die fünf daran fusionierten Untereinheiten (51-55) produzieren.
Fig. 10B: Elektrophorese der teilweise gereinigten fusionierten Proteine (S1, S2, S3, S4 und S5) auf 15%igem Acrylamidgel.
Fig. 10C: Elektrophorese der gereinigten fusionierten Proteine (S1, S2, S3, S4, S5) auf 15%igem Acrylamidgel.
Fig. 11 zeigt:
A) : Westernblot des mit Ziegenserum gegen das gesamte Toxin inkubierten Pertussistoxins; dieses Serum reagiert mit allen fünf Untereinheiten;
B) : Westernblot des mit Antiserum gegen fusioniertes S1 inkubierten PT: nur die Untereinheit S1 wird nachgewiesen
C) : Westernblot des mit Antiserum gegen fusioniertes S2 inkubierten PT: nur die Untereinheit S2 wird nachgewiesen
D) : Westernblot des mit Antiserum gegen fusioniertes S3 inkubierten PT: nur die Untereinheit S3 wird nachgewiesen
E) : Westernblot des mit Antiserum gegen fusioniertes S4 inkubierten PT: nur die Untereinheit S4 wird nachgewiesen;
F) : Westernblot des mit Antiserum gegen fusioniertes S5 inkubierten PT: nur die Untereinheit S5 wird nachgewiesen;
Fig. 12: Autoradiographie auf Polyacrylamidgel, das die enzymatische Aktivität des fusionierten S1 und des Pertussistoxins angibt.
Fig. 13: Nucleotidsequenz des DNA-Bereichs, der die Gene des Pertussistoxins enthält. Die Sequenz im Zentrum ist die von Bordetella pertussis, während oberhalb bzw. unterhalb die in den Sequenzen von B. bronchiseptica und B. parapertussis gefundenen Unterschiede dargestellt sind.
Fig. 14: Southernblot, der zeigt, daß Bordetella pertussis von B. parapertussis und bronchiseptica durch die Größe des Eco RI- Fragments, das mit dem Clon pPT101 hybridisiert, unterschieden werden kann.
Fig. 15: Aminosäuresequenz der fünf Untereinheiten des Pertussistoxins. Die Sequenz im Zentrum ist die von Bordetella Pertussis, während oberhalb bzw. unterhalb die in B. bronchiseptica und B. parapertussis gefundenen Unterschiede dargestellt sind.
Fig. 16: Enzymatische Aktivität der in E. coli als fusioniertes Protein hergestellten Untereinheit S1.
A: S1 von B. Pertussis
B: MS2-Polymerase aus dem Vektor pEx31a
C: Untereinheit S3
D: S1 von B. parapertussis
E: S1 von B. bronchiseptica
Tabelle 1: Vergleich der Aminosäurezusammensetzung in Prozent, Molekulargewichte und Gesamtladungen der fünf Untereinheiten des Pertussistoxins. A: Von Tamura et al. angegebene Daten (Biochem. 21. 5516-5522 (1982)).
B: Aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Daten. Tabelle 1 Ladung
a) Molekulargewicht in Kilodalton.
b) Zum Vergleich der Gesamtladung der Untereinheiten haben wir den experimentellen isoelektrischen Punkt bei A angegeben und die Nettoladung für jede Untereinheit bei B berechnet.
Die Nettoladung wird für ((Lys+Arg)-(Glu+Asp)) berechnet.
Die folgenden Versuchsbeispiele erläutern die Erfindung, aber begrenzen sie nicht.

Beispiel 1

Bestimmung der aminoterminalen Sequenz der Untereinheiten des Pertussitoxins.

Ein Stamm B. pertussis BP165 wurde in einem Fermenter (Palias System N.B. App. Fabr. Van door De Bilt) gezüchtet, der mit einem Rührer ausgestattet ist und eine Kapazität von 50 1 aufweist, enthaltend 40 l Verwey-Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung.
Bacto-Casaminosäuren (DIFCO) 14 g
KCl 0,2 g
K&sub2;PO&sub4; 0,5 g
MgCl&sub2;·6H&sub2;O 0,1 g
Nicotinsäure 0,02 g
Glutathion 0,01 g
Stärke 1,00 g
H&sub2;O 1 Liter
pH 6,8
das zuvor 15 Minuten bei 120ºC sterilisiert worden war, unter Belüftung 28 Stunden bei einer Temperatur von 36,5ºC.
Am Ende diesen Zeitraums wurden die Zellen von der Kulturbrühe durch Zentrifugation getrennt und das Pertussistoxin aus der überstehenden Flüssigkeit mittels Affiniätschromatographie auf Affi-Gel blue(100- 200 mesh) von Biorad und auf Fetuin-Sepharose, wie von Sekura R.D. et al. (The J. Biol. Chem. 258, 23, 14647-14651 (1983)) beschrieben, gewonnen. Das so erhaltene Protein hatte eine Reinheit von mehr als 95%.
Das Protein wurde dann 5 Stunden bei 125 Volt einer Elektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfat enthaltenden 15%igen (p/p) Polyacrylamidgel unterworfen und die fünf Untereinheiten wurden, wie in Fig. 1 angegeben, getrennt.
Jede dieser Banden wurde ausgeschnitten und der Elektroelution mittels des Verfahrens von Hunkapiller M.W. et al (Methods in Enzymology 91. 227-236 (1983)) unterworfen.
Auf diese Weise wurden die fünf Untereinheiten erhalten.
Die aminoterminale Sequenz jeder der erhaltenen Untereinheiten wurde danach unter Verwendung eines Gasphasen-Mikrosequenators Modell 470A (Applied Biosystems, Foster City, CA-USA) gemäß den Bedienungsanleitungen bestimmt.
Fig. 2 zeigt die aminoterminale Sequenz der Untereinheiten S1, S2, S3 und S4.

Beispiel 2

Clonierung des DNA-Fragments enthaltend die Gene, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren.

Der Stamm B. pertussis BP 356 ist ein Mutantenstamm, enthaltend ein Transposon (TN5), das in das Chromosom inseriert ist.
Der Stamm, wie er von Weiss A.A. et al. in Infect. Immun. 42 33-41 (1983) beschrieben ist, wurde von Stanley Falkow, Stanford University, hergestellt.
Eine Kultur von B. pertussis BP 356 im exponentiellen Stadium (100 ml Verwey-Medium) wurde zentrifugiert und die Zellen in 2 ml 25%iger Saccharose, 50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH8) resuspendiert.
Der Suspension wurden dann 50 ul Lysozym (40 mg/ml) und nach 5 Minuten 10 ul Proteinase K (20 mg/ml) zugesetzt.
Die gerührte Suspension wurde mit 0,4 ml EDTA (0,05 M) versetzt.
Die Zellen wurden durch Zugabe von 0,25 ml Sarkosil (10%) zur Zellsuspension bei 0ºC lysiert.
Die lysierten Zellen wurden dann in 35 ml einer Lösung, enthaltend 69,6 g CsCl in 55,2 ml Puffer, 50 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8), das 50 ug Phenylmethylsulfonylfluorid, einen Inhibitor für die Proteinase K. enthält, suspendiert. Die Lösung wurde dann bei 50 000 Umdrehungen pro Minute (Upm) 16 Stunden in einer 70 t i Beckmann SOV t i zentrifugiert und die auf diese Weise abgetrennte chromosomale DNA wurde dann als viskose Bande gewonnen. 500 ug der so erhaltenen chromosomalen DNA wurden gegen 100 ml destilliertes Wasser zur Entfernung von CsCl dialysiert und dann teilweise mit fünf Einheiten (E) des Restriktionsenzyms Sau 3 A1 (Boehringer) in 5 ml 50 mM NaCl, 10 mM Tris, 10 mM MgSO&sub4;, 1 mM Dithiotreit-Puffer (pH 7,4) verdaut.
Die verdaute DNA wurde durch Zusetzen von 12 ml Ethanol präzipitiert und nach der Abtrennung in 0,5 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA-Puffer (pH 7,5) resuspendiert.
Dieses Volumen wurde auf einen 10%- bis 40%igen Saccharosegradienten, der in 35 ml 1 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA-Puffer (pH 7,5) gelöst war, geladen.
Der Gradient wurde dann 16 Stunden bei 26 000 Upm in einem Beckman SW 28-Rotor zentrifugiert.
Danach wurden 1 ml-Fraktionen gesammelt und das Molekulargewicht des DNA-Gehalts jeder Fraktion wurde durch Elektrophorese in Agarose bestimmt, wie von Maniatis T. et al. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor N.Y. (1982) berichtet.
Die die DNA-Fragmente mit 15 000-20 000 Basenpaaren (Bp) enthaltenden Fraktionen wurden dann dialysiert und die DNA mit Ethanol, wie vorstehend beschrieben, präzipitiert.
Die präzipitierte DNA wurde durch Zentrifugation getrennt und in 100 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA-Puffer (pH 7,5) bis zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml DNA resuspendiert.
Die chromosomalen DNA-Fragmente wurden dann cloniert.
Dies wurde unter Verwendung eines E. coli Lambda-Phagen-Vektor EMBL 4 durchgeführt, der wie von Frischauf A. et al., J. Mol. Biol. 170. 827-842 (1983) beschrieben, hergestellt wurde.
1 ug DNA des Phagen-Vektors EMBL 4, der zuvor mit zwei E Restriktionsenzym BamHI gespalten wurde, und 1 ul der Lösung, enthaltend die DNA-Fragmente mit 15000-20 000 Bp, wurden in 5 ul 1 mM ATP, 20 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;&sub1; 10 mM Dithiotreit-Puffer (pH 7,6) in Gegenwart einer Einheit T4 DNA-Ligase gemischt.
Die Ligase-Reaktion wurde 16 Stunden bei einer Temperatur von 15ºC durchgeführt.
Am Ende dieses Zeitraums wurde die erhaltene rekombinante DNA unter Verwendung des Packagene Kit von Promega Biotec (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor N.Y. (1982)) in Lambda-Phagen ohne DNA inseriert.
Die so erhaltenen rekombinanten Phagen wurden zur Transformation des E. coli-Stamms NM 539 (Promega Biotec.) verwendet.
Die transformierten E.coli NM 539-Zellen wurden auf LB-Medium (Bacto Tripton 10 g, Bacto Y.E. 5 g, NaCl 10 g, H&sub2;O 1 Liter, pH 7,5) plattiert, wobei etwa 30 000 Platten rekombinanter Phagen erhalten wurden.
Etwa 5 000 rekombinante Phagen wurden auf einer Platte mit einer radioaktiven Sonde für die TN5-DNA hybridisiert, zur Identifizierung jener Phagen, die das DNA-Fragment, in das das Transposon TN5 inseriert wurde, enthalten.
Zwölf rekombinante Phagen waren in Bezug auf die Hybridisierung positiv. Die DNA wurde dann aus diesen Phagen mittels der vorstehend dargestellten Extraktionsverfahren extrahiert.
1 ug der rekombinanten Phagen-DNA wurde mit zwei E des Restriktionsenzyms Eco RI in 20 ul 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO&sub4;-Puffer (pH 7,4) gespalten, wobei die Lösung 1 Stunde bei einer Temperatur von 37ºC gehalten wurde.
Die verdaute DNA-Lösung wurde dann auf ein 1%iges Agarosegel geladen und 2 Stunden bei 120 Volt 6 Stunden der Elektrophorese unterworfen.
Die Fragmente der so getrennten rekombinanten Phagen-DNA wurden auf Nitrocellulose transferiert und mit einer radioaktiven Sonde für TN5- DNA hybridisiert, zur Identifizierung des das Transposon TN5 enthaltenden EcoRI-Fragments.
Auf diese Weise wurde ein positives EcoRI-Fragment von etwa 10500 Bp isoliert, das die gesamte TN5-Sequenz, die auf einer Seite von etwa 1100 Bp und auf der anderen von etwa 3500 Bp chromosomaler DNA von B. pertussis BP 356 flankiert ist, enthält.
1 ug des EcoRI-Fragments wurde mit zwei E des Enzyms Hinc II in 25 ul 50 mM NaCl, 10 mM Tris, 10 mM MgSO&sub4;, 1 mM Dithiothreit-Puffer (pH 7,4), bei 37ºC 1 Stunde gespalten.
Am Ende dieses Zeitraums wurde die die verdauten DNA-Fragmente enthaltende Lösung 6 Stunden der Elektrophorese auf einem 1%igem Agarosegel bei 120 Volt unterworfen, auf Nitrocellulose transferiert und dann zur Identifizierung der Fragmente, die die Verbindung zwischen TN5-DNA und der chromosomalen DNA enthalten, mit der radioaktiven Sonde für TN5-DNA hybridisiert.
Auf diese Weise wurden zwei Fragmente identifiziert, eines mit etwa 500 Bp und das andere mit etwa 1900 Bp.
Die zwei Fragmente wurden dann mittels Elektroelution gereinigt und in den Phagenvektoren M13 mp8 und M13 mp9 (New England) cloniert, deren DNA vorher mit dem Restriktionsenzym Hinc II gespalten worden war.
Die Nucleotidsequenz der zwei Fragmente wurde dann bestimmt, wobei von der HincII-Stelle unter Verwendung des von Sanger F.S. (Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977) verwendeten Verfahrens begonnen wurde.
Etwa 400 Nucleotide von der HincII-Stelle des größeren Fragments (1900 Bp) entfernt wurde die in Fig. 3A - 2 dargestellte Nucleotidsequenz von 3030 bis 3100 Bp identifiziert und ergab, in die entsprechenden Aminosäuren translatiert, die von uns für die Untereinheit S3 bestimmte Aminosäuresequenz, wie in Beispiel 1 beschrieben und in Fig. 2 dargestellt.
Dieses Ergebnis zeigt, daß im Stamm B. pertussis 356 das TN5 in das Gen inseriert ist, das die Untereinheit S3 von PT codiert, und bestätigt, daß das von uns clonierte DNA-Fragment das Gen für das Pertussistoxin enthält.
Das auf diese Weise identifizierte Fragment wurde dann als Hybridisierungssonde zur Identifizierung des Gens für PT verwendet, das in der chromosomalen DNA von B. pertussis BP165 vorliegt.
Eine Genbank wurde wieder für diesen Stamm im Phagenvektor EMBL 4 auf die gleiche Weise wie für B. Pertussis BP 356 beschrieben, konstruiert.
Am Ende des Clonierungsverfahrens wurde ein Eco RI-Fragment mit 4696 Bp isoliert, das, wie wir wußten, mindestens das Gen enthält, das die Untereinheit S3 codiert, da es mit der spezifischen Sonde S3 hybridisierte.
Um zu testen, ob dieses Fragment auch die Gene enthält, die die anderen PT-Untereinheiten codieren, wurden das Fragment oder Teile davon in den Phagenvektoren M13 mp8 und M13 mp9 cloniert und dann wurde die Nucleotidsequenz des gesamten Fragments bestimmt.
Die Analyse der in Fig. 3 dargestellten Nucleotidsequenz des gesamten Fragments zeigt, daß dieses Fragment auch die Gene enthält, die die Untereinheiten S1, S2 und S4 codieren, da die Translation der Nucleotidsequenz des DNA-Fragments in die entsprechende Aminosäuresequenz den von uns für die Untereinheiten S1, S2 und S4 bestimmten und in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenzen entspricht.
Sobald der Beginn der Aminosäuresequenz aus den in Fig. 2 dargestellten Daten identifiziert worden war, war es möglich, die gesamte Aminosäuresequenz der Untereinheiten abzuleiten.
Die Analysen der aus der Aminosäuresequenz abgeleiteten chemischen und physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Untereinheiten, wie das Molekulargewicht, die Aminosäurezusammensetzung und die elektrische Ladung, stimmen mit den Daten in der Literatur überein (Tamura et al. (1982) Biochemistry 21, 5516-5522).
Es wurde auch festgestellt, daß eine gemeinsame Eigenschaft aller fünf Untereinheiten das Vorliegen einer Sequenz in dem Gen unmittelbar vor dem reifen Protein ist, die ein Peptid mit 27-42 Aminosäuren codiert und die für Peptide, die bei der Sekretion der Proteine beteiligt sind, typische Eigenschaften aufweist, ist, das heißt, das Vorliegen einer oder mehr positiver Ladungen auf der terminalen Aminogruppe mit nachfolgender hydrophober Zone (Fig. 4).
Dies zeigt, daß die Untereinheiten in Form von Präproteinen produziert wurden und diese anschließend während der Sekretion prozessiert wurden.
Alle Sekretionssignale endeten auch mit der Sequenz (S) (P)A X A, die typisch für andere Sekretionssignale ist.
Unter den Genen, die S4 und S3 codieren wurde auch eine Nucleotidsequenz von 2461 bis 2862 Bp identifiziert, die ein Peptid codiert, das die gleichen Eigenschaften wie die anderen Sekretionssignale hat und mit der Sequenz SPADVA endet, gefolgt von einer Aminosäuresequenz, die genau die gleiche Aminosäurezusammensetzung wie die in der Literatur für die Untereinheit S5 dargestellte Aminosäuresequenz hat (Tabelle 1).
Dies hat uns ermöglicht, festzustellen, daß das von uns clonierte Eco RI-Fragment mit 4696 Bp auch das Gen für die Untereinheit S5 enthält und hat uns so ermöglicht, die Aminosäuresequenz der letzteren zu bestimmen (Fig. 3).
Die weitere Analyse der Nucleotidsequenz des von uns isolierten und clonierten DNA-Fragments hat uns die Lokalisierung eines Promotors im Bereich von 440 Bp bis 485 Bp, der die gleichen Eigenschaften wie jene von E. coli hat, und einer Stopsequenz im Bereich von 3608 bis 3670 Bp ermöglicht.
Dies bedeutet, daß die fünf Gene des Pertussistoxins in einem typischen bakteriellen Operon organisiert und in einer einzelnen mRNA transkribiert werden.

Beispiel 3

Konstruktion des Hybridplasmids pPT 101, enthaltend die Gene, die das Pertussistoxin codieren

1 ug Plasmid-DNA des von Dente L. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 1645- 1655 beschriebenen E. coli PEMBL-8, enthaltend das Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht, wurde mit zwei Einheiten EcoRI-Enzym in 20 ul 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 10 mM MgSO&sub4;-Puffer (pH 7,4) 1 Stunde bei 37ºC gespalten.
Am Ende der Verdauungsreaktion wurden 3 ug des EcoRI-DNA-Fragments mit 4696 Bp, dessen Sequenz in Fig. 3 dargestellt ist, der die herausgeschnittene Plasmid-DNA enthaltenden Lösung zugesetzt und reagierten in Gegenwart von einer E T4-DNA-Ligase (BRL) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen.
Das Ligasegemisch wurde dann zur Transformation von kompetent gemachten Ampicillin-sensitiven E. coli JM 101-Zellen (New England Biolabs) verwendet.
Die transformierten Zellen wurden auf LB-Platten, enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, zur Isolierung dieser Zellen, die das Hybridplasmid enthalten, selektiert.
Unter den so erhaltenen Clonen Ampicillin-resistenter (AmpR) E. coli war es möglich, mittels Hybridisierungstechnik mit einer Sonde für die Sequenz des PT-Gens Clone zu isolieren, die das Hybridplasmid pEMBL 8 mit dem DNA-Fragment, das PT codiert, enthalten.
Eines dieser Hybridplasmide wurde von uns pPT 101 genannt.
Der das Plasmid enthaltende E. coli JM 101-Stamm wurde von uns in der American Type Culture Collection am 6.8.85 unter der Hinterlegungsnummer ATCC-53212 hinterlegt.

Beispiel 4

Konstruktion des Hybridplasmids PTE 255, enthaltend das Gen, das die Untereinheit S1 codiert.

Die Konstruktion des Hybridplasmids wurde auf die vorstehend im Beispiel 3 dargestellte Weise durch Ligierung des Plasmids 31B, das vorher mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xba I verdaut worden war, mit dem Sau3al-Xbal von 612- 1317 des 4696 Bp-Fragments, das dem S1 codierenden Gen entspricht, durchgeführt.
Das Ligasegemisch wurde dann zur Transformation von kompetenten E. coli-Zellen verwendet, wobei die transformierten Zellen auf Ampicillin enthaltenden LB-Platten (DIFCO) selektiert wurden.
Das Hybridplasmid PTE 255 (S1) wurde von einem der Positiven Clone abgetrennt und seine Sequenz ist in Fig. 9 dargestellt, wo die Kleinbuchstaben die Codierungssequenz für die MS2-Polymerase und die Großbuchstaben die Sequenz, die S1 codiert, angeben.
Das so erhaltene Protein enthält abgesehen von der ersten Aminosäure Asp die gesamte S1-Untereinheit.

Beispiel 5

Konstruktion des Hybridplasmids PTE 211, enthaltend das Gen, das die Untereinheit S2 codiert.

Dies wurde wie vorstehend in Beispiel 3 unter Verwendung des mit BamHI verdauten und mit der DNA-Polymerase zur Auffüllung der kohäsiven Enden behandelten Plasmids 31A durchgeführt und das Sau96- 5mal-Fragment von 1433 bis 2064 des 4696 Bp-Fragments entsprechend dem Gen, das S2 codiert, wurde mit der DNA-Polymerase (Klenow) zur Auffüllung der kohäsiven Enden behandelt.
Das aus einem der Positiven Transformanten isolierte Hybridplasmid PTE 211 (S2) hatte die in Fig. 9 dargestellte Sequenz.
Das so erhaltene fusionierte Protein enthielt die Sequenzen der MS2- Polymerase (Kleinbuchstaben links), die an die Aminosäure des Leaderpeptids der Untereinheit S2 (Großbuchstaben) und so an das Protein S2 (Kleinbuchstaben rechts) fusioniert ist.

Konstruktion des Hybridplasmids PTE 221, enthaltend das Gen, das die Untereinheit S3 codiert.

Dies wurde wie vorstehend in Beispiel 3 unter Verwendung des mit BamHI verdauten und mit DNA-Polymerase zur Auffüllung der kohäsiven Enden behandelten Plasmids 31C durchgeführt, und das SpH1-DDE1- Fragment von 3014 bis 3628 des 4696 Bp-Fragments, das dem Gen, das S3 codiert, entspricht, wurde mit der DNA-Polymerase zur Eliminierung der kohäsiven Enden behandelt.
Das aus einem der positiven Transformanten isolierte Hybridplasmid PTE 221 (S3) hatte die in Fig. 9 dargestellte Sequenz.
Das fusionierte Protein, das sich daraus ergab, enthielt die MS2- Polymerase(Kleinbuchstaben links), die an die fünf Aminosäuren des Leaderpeptids der Untereinheit S3 (Großbuchstaben) und so an die natürliche Untereinheit S3 (Kleinbuchstaben rechts) gebunden war.

Beispiel 7

Konstruktion des Hybridplasmids PTE 240, enthaltend das Gen, das die Untereinheit S4 codiert.

Dies wurde wie vorstehend in Beispiel 3 unter Verwendung des mit BamHI gespaltenen und mit Polymerase behandelten Plasmids 31B und des BstN1-BstN1-Fragments von 2151 bis 2600 des 4696 Bp großen Fragments, das dem S4 codierenden Gens entspricht, durchgeführt.
Die Sequenz des so erhaltenen Hybridplasmids PTE 240 (S4) ist in Fig. 9 dargestellt.
Das daraus resultierende, fusionierte Protein enthält die an zwei Aminosäuren des Leaderpeptids der Untereinheit S4 (Großbuchstaben) und so an die natürliche Untereinheit S4 fusionierte MS2-Polymerase (Kleinbuchstaben).

Beispiel 8

Konstruktion des Hybridplasmids PTE 230, enthaltend das Gen, das die Untereinheit S5 codiert.

Dies wurde wie vorstehend in Beispiel 3 unter Verwendung des mit BamHI gespaltenen und mit der DNA-Polymerase zur Auffüllung der kohäsiven Enden behandelten Plasmids 31A und des Aat2-SnaBI-Fragments von 2558 bis 3210 des 4696 Bp-Fragments, das dem S5 codierenden Gen entspricht, durchgeführt.
Die Sequenz des erhaltenen Hybridplasmids PTE230 ist in Fig. 9 dargestellt.
Das so erhaltene fusionierte Protein enthielt die MS2-Polymerase (Kleinbuchstaben links), zwei Aminosäuren des Leaderpeptids der Untereinheit S5 (Großbuchstaben), und so die natürliche Untereinheit S5 (Kleinbuchstaben rechts).

Beispiel 9

Herstellung des Pertussistoxins und Versuch zur Bestimmung seiner Aktivität

Der Stamm E.coli JM 101 (pPT 101) wurde in einem 10 ml LB enthaltenden 100 ml-Kolben unter vorsichtigem Rühren 16 Stunden bei einer Temperatur von 37ºC gezüchtet.
0,1 ml dieser Kultur wurde dann zur Inokulation von 10 ml LB-Medium verwendet und bei 37ºC bis zu einer Absorption bei OD&sub5;&sub9;&sub0; von 0,75 gezüchtet.
Die Kulturbrühe wurde dann bei 4ºC zentrifugiert und die so abgetrennten Zellen wurden in 0,5 ml 10 mM Tris (pH 7,5) resuspendiert.
Die Zellsuspension wurde mittels Ultraschall in einem Branson Sonifier-cell-Disruptor 200 (Bransonsonic Power Co., a Smith Kline Company) lysiert.
Das Vorliegen und die biologische Aktivität des Pertussistoxins wurden dann direkt am zellulären Lysat mittels CHO-Zellen durch das von Hewlett, E. L. et al. (1983) , Infect. Immun. 40, 1198-1203 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die verwendeten CHO-Zellen wurden in unserem Labor durch Mutation der CHO ATCC CCL 61-Zellen gewonnen. 10 000 CHO-Zellen wurden in 2,5 ml Medium (dessen Zusammensetzung von Hewlett s. L. et al. (1983) (Infect. Immun. 40, 1198-1203 dargestellt ist) in Gegenwart von 5 ul E. coli JM 101-Zellextrakt (pPT 101), 5 ul E. coli JM 101-Zellen, enthaltend das unveränderte Plasmid PEMBL-8 und 0,1 ng Pertussistoxin als Standard, inkubiert.
Ein Teil des Zellextrakts war zuvor mit einer 1:100-Verdünnung eines normalen Ziegen-Antiserums (A) und ein anderer Teil mit einer 1 : 100- Verdünnung des gleichen, nach der Immunisierung mit dem Pertussistoxin abgenommenen Ziegen-Antiserums inkubiert worden.
Nach 48 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Ergebnisse in einer Weise abgelesen, wie sie von Hewlett im vorstehend angegebenen Text beschrieben ist.
Ein Wert von 4 (+) wurde einer maximalen Formänderung der CHO-Zellen, ein Wert von 1 (+) einer minimalen Formänderung und (-) einem Mangel an Formänderung zugeschrieben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Aktivität des von rekombinanten Clonen produzierten Toxins auf CHO-Zellen Probe Gesamt Ziegen-anti-Toxin-Antikörper Ziegen-Antikörper vor der Immunisierung Toxin E. coli-Extrakt
0,1 ng des gereinigten Pertussistoxins wurde als Positive Kontrolle verwendet. Die Probe wurde aus 5 ul E.coli-Lysat, enthaltend das Plasmid PT101, gebildet. Die Negativkontrolle wurde aus dem gleichen E. coli-Stamm, enthaltend das als Vektor verwendete Plasmid ohne die Gene für das Pertussistoxin (pEMBL8), gebildet.
Man kann aus Tabelle 2 ersehen, daß der Extrakt aus E. coli-Zellen (pPT101) ATCC 53212 ein positives Ergebnis ergab, und das Toxin konnte von anti-Pertussistoxin-Antikörpern, aber nicht von Antikörpern aus der gleichen Ziege, bevor sie immunisiert worden ist, neutralisiert werden.
Der E. coli-Stamm JM 101 (pEMBL8) zeigte in diesem Test keine Aktivität.
So können wir schlußfolgern, daß das von uns in das Plasmid PEMBL8 clonierte EcoRI-Fragment aus chromosomaler DNA mit 4696 Basenpaaren ein Toxin synthetisieren kann, das funktionell identisch mit dem von B. Pertussis BP165 produzierten Pertussistoxin ist, und daß das Pertussistoxin von Antikörpern für das Toxin selbst neutralisiert werden kann.

Beispiel 10

Expression und Reinigung der 5 Untereinheiten des Pertussistoxin

a) Expression der 5 Untereinheiten

Die wie in den Beispielen 4 bis 8 beschrieben konstruierten Hybridplasmide PTE255 (S1), PTE211 (S2), PTE221 (S3), PTE240 (S4) und PTE230 (S5) wurden durch Transformation des E. coli K12 HI trp- Stammes eingeführt.
Jeder der transformierten Stämme wurde dann eine Nacht bei 30ºC in 10 ml LB-Medium gezüchtet. Am Ende dieses Zeitraums wurden die 10 ml jeder Kultur 400 ml frischem LB-Medium in Zwei-Liter-Kolben zugesetzt.
Die Kolben wurden unter Rühren 2 Stunden bei 30ºC und 2,5 Stunden bei einer Temperatur von 42ºC gehalten.
Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Zellen abgetrennt und in 3 ml 25% Saccharose, 10 ml Tris - HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA resuspendiert.
5 ul jeder der Kulturen wurden 80 ul Lysepuffer (4% SDS, 125 mM Tris (pH 6,8), 10% Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 0,02% Bromphenolblau) zugesetzt und dann wurden sie 5 Minuten bis zum Siedepunkt gebracht und auf ein 15%iges Polyacrylamidgel geladen.
Die Proteine wurden dann fünf Stunden einer Elektrophorese bei 15 Milliampere unterworfen und dann das Gel gefärbt und entfärbt, wie von Laemmli (Nature, 227, 680-85, 1970) berichtet.
Fig. 10A zeigt die Elektrophorese des Gesamtlysats der Stämme, die die MS2-Polymerase (A) und die 5 daran gebundenen, ungereinigten Untereinheiten (51-55) produzieren.

b) Reinigung der 5 Untereinheiten

Die Zellen jeder der Kulturen wurden in 3,2 ml 2,5%iger Saccharoselösung resuspendiert, 0,1 ml Lysozym (40 mg/ml) und 0,8 ml 0,5M EDTA wurden zugesetzt und sie wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Am Ende dieses Zeitraums wurden jeder der Suspensionen 8 ml Lysepuffer (1% Triton X 100, 50 mM Tris pH 6,00, 63 mM EDTA) zugesetzt und sie wurden 15 Minuten bei 0ºC und 30 Minuten bei 37ºC gehalten.
Anschließend wurden die Zellen mit Ultraschall aufgebrochen und 10 Minuten bei 10 000 Umdrehungen zentrifugiert.
Das so abgetrennte Präzipitat wurde in 5 ml 1M Harnstoff resuspendiert, 30 Minuten bei 37ºC gehalten, zentrifugiert und nach der Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit in 5 ml 7M Harnstoff resuspendiert.
Auf diese Weise wurde die teilweise Reinigung der Produzierten Untereinheiten erzielt, wie in Fig. 10B dargestellt.
Die teilweise gereinigten Proteine wurden wieder in 5 ml 7M Harnstoff resuspendiert, auf ein Präparatives Polyacrylamidgel (3 mm · 50 cm) geladen und 8 Stunden bei 50 Milliampere der Elektrophorese unterworfen.
Nach der Anfärbung wurde die Bande, die das fusionierte Protein enthielt, ausgeschnitten und 48 Stunden bei 200 Volt in einem Dialysebeutel elektroeluiert.
Das elektroeluierte Protein wurde dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Zusatz von 9 Volumina Aceton präzipitiert.
Das Protein wurde dann durch Zentrifugation gewonnen und in 0,1 M NaHCO&sub3; resuspendiert.
Fig. 10C zeigt die für die einzelnen gereinigten Proteine gewonnenen Ergebnisse.

Herstellung von Seren gegen die 5 Untereinheiten

Die gereinigten, fusionierten und wie vorstehend in Beispiel 10 angegeben, gewonnenen Proteine (S1, S2, S3, S4 und S5) wurden zur Immunisierung von Kaninchen gemäß dem folgenden Schema verwendet:
Tag 1: 1 ml Lösung, enthaltend etwa 1 mg fusioniertes Protein, wurden mit 1 ml komplettem Freund'schem Adjuvans gemischt und subcutan in ein Kaninchen injiziert.
Tag 18: Die Behandlung von Tag 1 wurde unter Verwendung von inkomplettem Adjuvans wiederholt.
Tag 27: 1 ml Lösung mit einem Proteingehalt von etwa 1 mg wurde intravenös injiziert.
Tag 37: Den Kaninchen wurde Blut entnommen und das Serum gewonnen.
Die so hergestellten Antisera zu den 5 Untereinheiten wurden dann durch die Westernblot-Technik zum Test,ob sie die fünf natürlichen Proteine erkennen, untersucht.
Etwa 100 mg des in Beispiel 1 angegebenen, gereinigten Pertussistoxins wurden auf ein 15%iges Polyacrylamidgel geladen und der Elektrophorese unterworfen.
Die so getrennten Untereinheiten wurden dann auf Nitrocellulose durch Elektroblotting transferiert.
Das die Untereinheiten enthaltende Nitrocelluloseblatt wurde vertikal in eine Anzahl von identischen Streifen geschnitten, von denen jeder nachfolgend mittels Westernblottechnik analysiert wurde.
In der Praxis wurden die Nitrocellulosestreifen in PBS 0,15 M NaCl, 10 mM Phosphat pH 7,4, enthaltend 1 · Denhardt (0,03% Rinderalbumin, 0,02% Ficoll 70 und 0,02% Polyvinylpyrrolidon) und 0,05% Tween 2 Stunden suspendiert und zweimal je 3 Minuten, mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen.
Sie wurden nachfolgend eine Nacht bei Raumtemperatur mit einer 1/100 Verdünnung des gewünschten Serums in PBS unter Zusatz von 0,05% Tween 20 inkubiert.
Sie wurden dreimal je 15 Minuten mit einer Lösung von 10 mM Tris, 0,9% NaCl und 0,1% Tween 20 (TBS) gewaschen, mit einem Konjugat aus Gammaglobulin-anti-Ziegen-Globulin-Peroxidase oder Globulin-anti- Kaninchen-Globulin-Peroxidase (Miles), 1/100 in TBS verdünnt, inkubiert, und schließlich 3mal in TBS und einmal 10 Minuten in Tris 0,01 M (pH 6,8) gewaschen. Jeder der Lösungen wurde dann das Substrat für die Peroxidase zugesetzt: 20 ml Tris 0,05M, pH 6,8, 5 ml 0,3% 4- Chlor-1-naphthol in Methanol und 7 ul H&sub2;O&sub2;.
Die Reaktion wurde durch Waschen der Filter in destilliertem Wasser gestoppt.
Die in Fig. 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die gewonnenen fusionierten Proteine unter Verwendung der Gene, die die fünf Untereinheiten von PT codieren, wenn sie in Kaninchen injiziert werden, die Bildung von spezifischen Antikörpern auslösen, die jede der Untereinheiten des natürlichen Toxins erkennen können.

Beispiel 12

Analyse der enzymatischen Aktivität des fusionierten Proteins S1.

10 ul des fusionierten Proteins S1 und 10 ul PT, die bei Raumtemperatur 30 Minuten mit 25 mM Dithiothreit vorinkubiert waren, wurden einer Lösung, enthaltend 10 ul Ochsen-Retina (ROS), 80 ul H&sub2;O, 5 ul Tris 2M (pH 7,5), 1 ul ATP 100 mM, 1 ul GTP 10 mM, 10 ul Thymidin und 1 ul (1 uCi) ³²P NAD, zugesetzt.
Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit abgetrennt und das die ROS enthaltende Präzipitat wurde in Natriumdodecylsulfat- Beladungspuffer gelöst, auf ein 15%iges Polyacrylamidgel geladen und 5 Stunden einer Potentialdifferenz von 125 Volt unterworfen.
Am Ende dieses Zeitraums wurde das Gel getrocknet und der Autoradiographie unterworfen.
Die Ergebnisse (Fig. 12) zeigen, daß: 1) das Pertussistoxin (PT) das Transducin mit ADP ribosyliert, 2) in Abwesenheit des Pertussistoxins dies nicht markiert wird und 3) das fusionierte, elektroeluierte S1 die gleiche ADP-Ribosylierungs-Aktivität wie PT hat.

Beispiel 13

Clonierung, Sequenzierung und Expression der Gene von Bordetella bronchiseptica und Bordetella parapertussis

Obwohl B. bronchiseptica und B. pertussis kein aktives Pertussistoxin Produzieren, haben wir herausgefunden, daß sie die dafür codierenden Gene enthalten. Mittels Verfahren, wie in den Beispielen 2, 3 und 4 beschrieben, haben wir die Gene von Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617) und Bordetella Parapertussis (ATCC 9305), die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, cloniert und sequenziert.
Die gewonnene, in Fig. 13 dargestellte Nucleotidsequenz zeigt, daß es kleine Unterschiede zwischen den drei Stämmen gibt. Einem dieser fehlt die EcoRI-Stelle bei 4696 und so sind die Gene von B. bronchiseptica und B. parapertussis in den EcoRI-Fragmenten mit 4935 statt 4696 Bp enthalten. Dieser Unterschied in den Dimensionen kann als diagnostisches Kriterium für die Unterscheidung von B. Pertussis von B. Parapertussis und B. bronchiseptica auf die folgende Weise verwendet werden: Chromosomale DNA aus Bordetella wurde mit EcoRI auf einem Agarosegel verdaut, auf Nitrocellulose transferiert und mittels den für das Plasmid PPT 101 und seinen clonierten DNA-Fragmenten beschriebenen Techniken hybridisiert.
Die Ergebnisse der Autoradiographie ermöglichen die Unterscheidung von B. pertussis von B. parapertussis und bronchiseptica, die mit einer Bande höheren Molekulargewichts hybridisieren (Fig. 14).
Fig. 15 gibt die aus den fünf Untereinheiten in den drei Arten von Bordetella abgeleiteten Aminosäuresequenzen an. Wie man sehen kann, liegen mehrere Aminosäureänderungen vor. Zur Überprüfung, ob diese Änderungen die Funktion und die Immunogenität der Untereinheiten ändern, gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, haben wir die Gene exprimiert, die die Untereinheit S1 von B. bronchiseptica und parapertussis codieren. Die erhaltenen fusionierten Proteine waren immunologisch jenen von B. pertussis ähnlich und wurden in der Tat im Westernblot durch Pertussis-Antitoxin-Antikörper erkannt.
Darüberhinaus fanden wir, durch Verfahren wie in Beispiel 12, daß beide Proteine die gleiche enzymatische Aktivität wie die Untereinheit S1 von B. pertussis (Fig. 16) haben. Dieses Beispiel zeigt, daß die Proteine mit der in Fig. 15 dargestellten Sequenz, obwohl sie mehrere Variationen enthalten, als Impfstoff gegen Pertussis verwendet werden können.

Claims

1. EcoRI-Fragment aus chromosomaler DNA von Bordetella pertussis mit 4696 Basenpaaren, das die Gene enthält, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren, oder ein weiteres Fragment davon, wobei das weitere Fragment mindestens ein Gen enthält, das mindestens eine Untereinheit des Pertussistoxins codiert.

2. DNA-Fragment oder weiteres Fragment nach Anspruch 1 mit der in Fig. 3 gezeigten Sequenz.

3. DNA-Fragment oder weiteres Fragment nach Anspruch 1 oder 2, das Gene enthält, die die Untereinheiten S1, S2, S3, S4 und S5 des Pertussistoxins codieren, und mindestens eines der offenen Leseraster (ORF) A, B, C und D.

4. Hybridplasmid, enthaltend das DNA-Fragment oder das weitere Fragment davon gemäß der Definition in Anspruch 1 oder 2, das das DNA-Fragment oder das weitere Fragment exprimieren kann, wenn es in einem Mikroorganismus enthalten ist, wobei das Pertussistoxin oder eine oder mehrere Untereinheiten des Pertussistoxins synthetisiert werden.

5. Hybridplasmid nach Anspruch 4, wobei das DNA-Fragment oder das weitere Fragment davon unter der Kontrolle eines Bereiches ist, der die Expression reguliert.

6. Hybridplasmid pT101 nach Anspruch 4 oder 5, in dem das 4696 Basenpaare umfassende EcoRI-Fragment in die EcoRI- Restriktionsstelle von pEMBL8 inseriert ist.

7. Hybridplasmid PTE255 nach Anspruch 4 oder 5, in dem das Sau3A-XbaI-Fragment, das die Untereinheit S1 codiert, in die BamHI-XbaI-Stelle des Plasmids 31B inseriert ist.

8. Hybridplasmid PTE211 nach Anspruch 4 oder 5, in dem das Sau96-5mal-Fragment, das die Untereinheit S2 codiert, in die BamHI-Stelle des Plasmids 31A inseriert ist.

9. Hybridplasmid PTE221 nach Anspruch 4 oder 5, in dem das SpH1-DDE1-Fragment, das die Untereinheit S3 codiert, in die BamHI-Stelle des Plasmids 31C inseriert ist.

10. Hybridplasmid PTE240 nach Anspruch 4 oder 5, in dem das BstN1-BstN1-Fragment, das die Untereinheit S4 codiert, in die BamHI-Stelle des Plasmids 31B inseriert ist.

11. Hybridplasmid PTE230 nach Anspruch 4 oder 5, in dem das Aat2-SnaBI-Fragment, das die Untereinheit S5 codiert, in die BamHI-Stelle des Plasmids 31A inseriert ist.

12. Mikroorganismus, der mit einem Hybridplasmid gemäß der Definition in einem der Ansprüche 4 bis 11 transformiert ist.

13. Mikroorganismus Escherichia coli, der mit einem Hybridplasmid nach Anspruch 7 transformiert ist.

14. Transformierter Mikroorganismus Escherichia coli ATCC 53212.

15. Verfahren zur Herstellung des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer der Untereinheiten des Pertussistoxins, umfassend die Züchtung eines transformierten Mikroorganismus gemäß der Definition in einem der Ansprüche 12 bis 14 in einem geeigneten Kulturmedium.

16. Verfahren zur Clonierung und Sequenzierung des DNA-Fragments nach Anspruch 1 oder 2, umfassend:

a) In einem E. coli lambda-Phagen EMBL4 stattfindende Isolierung und Clonierung von Fragmenten der chromosomalen DNA mit 15 000 bis 20 000 Basenpaaren, erhalten durch die Verdauung der chromosomalen DNA von Bordetella pertussis BP 356, einem Mutantenstamm, der Pertussistoxin nicht produziert, der ein Transposon Tn5 in seiner eigenen chromosomalen DNA enthält;

b) Isolierung eines Fragments von rekombinanter Phagen- DNA, das mit einer Sonde hybridisiert, die für Tn5- DNA markiert ist, aus den erhaltenen positiven rekombinanten Phagen;

c) Spalten des Fragments von rekombinanter Phagen-DNA mit dem Restriktionsenzym HincII und Isolierung eines Fragments mit 1900 Basenpaaren, das eine Nucleotidsequenz enthält, die die Untereinheit S3 codiert, durch Hybridisierung mit einer Sonde für Tn5-DNA;

d) In einem E. coli lambda-Phagen EMBL4 stattfindende Isolierung und Clonierung von Fragmenten von chromosomaler DNA mit 15 000 bis 20 000 Basenpaaren, erhalten durch die Verdauung der chromosomalen DNA von Bordetella pertussis BP165;

e) Isolierung eines Fragments von rekombinanter Phagen- DNA, das mit einer gemäß Schritt c) erhaltenen Sonde für 53 hybridisiert, aus den dabei erhaltenen positiven rekombinanten Phagen;

f) Spalten des rekombinanten Phagen-DNA-Fragments mit dem Restriktionsenzym EcoRI und Isolierung eines EcoRI-Fragments aus chromosomaler DNA mit 4696 Basenpaaren durch Hybridisierung mit einer Sonde für S3-DNA;

g) Insertion des erhaltenen Fragments in den Plasmidvektor pPEML8 in die EcoRI-Restriktionsstelle, Bestimmung der Nucleotidsequenz des DNA-Fragments und Identifizierung der Gene, die die fünf Untereinheiten des Pertussistoxins codieren.

17. Verwendung des Pertussistoxins oder einer oder mehrerer Untereinheiten des Pertussistoxins, erhalten gemäß Anspruch 15, zur Herstellung eines anti-Pertussisimpfstoffes, in dem das Pertussistoxin frei ist von anderem B. pertussis-Material.

18. Mittel für die gleichzeitige Stimulierung des Schutzes gegen Infektionen durch Bordetella pertussis und Vibrio cholerae, enthaltend mindestens eine wirksame Menge des Peptids S1, erhalten durch chemische Synthese oder von Mikroorganismen, die mit rekombinanten DNA-Molekülen transformiert wurden, die das S1 codierende Gen enthalten.

19. Verwendung des Fragments von chromosomaler DNA nach Anspruch 1 zur Herstellung von Diagnosekits zur Bestimmung von Pertussisinfektionen.

20. Verwendung des Fragments von chromosomaler DNA nach Anspruch 1 zur Unterscheidung zwischen B. pertussis und B. parapertussis bzw. bronchiseptica.