DE69034107T2

DE69034107T2 - Impfstoffe gegen Bakterien, die zur Blutvergiftung führen

Info

Publication number: DE69034107T2
Application number: DE69034107T
Authority: DE
Inventors: Jean-Christophe Audonnet; Patrick Bruneau
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2010-03-20
Also published as: DE69034107D1; EP0389347B1; AU5415390A; ATE251666T1; JPH03143388A; EP0389347A1; CA2029906A1; WO1990011349A1; FR2644346B1; FR2644346A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterien aus Gattungen, die pathogene Bakterien umfassen und in großen Mengen durch Eisen regulierte antigenische Proteine der Außenmembran exprimieren.
Sie betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung dieser Bakterien.
Sie betrifft auch Impfstoffe gegen septikämische Bakterien, die als Wirkstoff Bakterien, die in großen Mengen durch Eisen regulierte antigenische Proteine der Außenmembran exprimieren, oder Fragmente dieser Bakterien oder durch diese Bakterien exprimierte Antigene enthalten.
Sie betrifft außerdem andere bakterielle, virale oder andere Vektoren, welche die Expression dieser antigenischen Proteine ermöglichen, sowie Impfstoffe, die diese Proteine als Wirkstoff enthalten.
Sie betrifft auch rekombinante, insbesondere bakterielle oder virale, Lebendimpfstoffe, die diese antigenischen Proteine im geimpften Organismus exprimieren.
Es ist bekannt, dass mit Ausnahme bestimmter Lactobazillen, Eisen ein notwendiger Nährstoff für alle Lebensformen einschließlich der Bakterien ist. Diese benötigen Eisen, damit sie sich in der Wirtszelle vermehren können. Die Fähigkeit des Bakteriums, sich in vivo zu vermehren, stellt einen wesentlichen Faktor der Virulenz dar.
Obwohl Eisen im menschlichen Organismus in großen Mengen vorhanden ist, verfügt das Bakterium zur Vermehrung nur über eine sehr beschränkte Menge an freiem Eisen.
Die überwiegende Teil des Eisens in einem Wirtstier ist tatsächlich intrazellulär (in Form von Ferritin, Hämosiderin oder Häm) und somit schwer zugänglich. Die kleine Menge an Eisen, die in den Körperflüssigkeiten vorliegt, existiert nur in Form von extrem stabilen Komplexen, die hauptsächlich mit zwei Eisen chelatisierenden Glycoproteinen gebildet werden: mit Transferrin im Plasma und mit Lactoferrin in den Sekreten. Die Existenz dieser Glycoproteine, die Eisen stark, aber reversibel binden, ist nötig, um dessen Nutzung durch die Zellen zu ermöglichen, wobei seine Ausfällung in Form von Eisen(III)hydroxid verhindert wird.
Das Plasma enthält Eisenkomplexe in Form von Haptoglobin-Häm, Ceruloplasmin, Ferritin, Lactoferrin und Transferrin.
Der Großteil des Eisens wird von den Transferrinen transportiert. Man unterscheidet drei Hauptklassen des Teansferrins: Serum-Transferrin, Lactoferrin und Ovotransferrin.
Transferrin fixiert etwa 95% des plasmatischen Eisens, und sein Sättigungsgrad beträgt in einem gesunden Individuum nur etwa 35%.
Lactoferrin besitzt einen sehr geringen Sättigungsgrad mit Eisen und behält seine Eisen chelatisierenden Eigenschaften in einen breiten pH-Bereich bei; sein Vorliegen in allen Sekreten des Organismus, d. h. in Höhe von möglichen Stellen einer mikrobiellen Invasion, stellt eine größere Beschränkung an Eisen an diesen Stellen als anderswo im Organismus dar.
Die Komplexierung von Eisen an den Glycoproteinen hat zur Folge, dass nur eine sehr kleine Konzentration an freiem dreiwertigen Eisen (10^–13 M) vorhanden bleibt, die völlig unzureichend ist, um das normale Wachstum von Bakterien zu ermöglichen.
Um an das Eisen zu gelangen, das sie für ihre Vermehrung im Wirt benötigen, verfügen die Bakterien über eine bestimmte Anzahl von Mitteln.
Bestimmte Mikroorganismen scheinen ihr Eisen durch einen Mechanismus erlangen zu können, an dem eine direkte Wechselwirkung zwischen der bakteriellen Zelloberfläche und den Proteinen, die das Eisen im Wirt binden, beteiligt ist. Diese Art der direkten Aufnahme betrifft jedoch nur eine sehr be schränkte Anzahl von Spezies. Der Großteil der Bakterien, pathogen oder nicht-pathogen, bekämpft die Nicht-Verfügbarkeit von Eisen im Wirt oder in bestimmten aeroben Umgebungen durch die Produktion von Eisen chelatisierenden Verbindungen, die man als Siderophore bezeichnet.
Die Siderophore bestehen aus Molekülen mit kleinem Molekulargewicht, die spezifische Komplexe mit sehr großer Affinität mit dem Eisen(III)ion eingehen. Ihre Biosynthese wird durch Eisen reguliert, und ihre Funktion ist es, die Bakterienzelle mit Eisen zu versorgen.
Diese Siderophore besitzen eine stark erhöhte Affinität zum Eisen(III)ion (ihre Assoziationskonstante beträgt etwa 10³⁰ M^–1). Dadurch können sie das Eisen verdrängen, das mit den Proteinen des Wirts assoziiert ist, oder das in Form des Hydroxids ausgefällte dreiwertige Eisen solubilisieren.
Der Großteil der bisher identifizierten Siderophore gehört zu zwei chemischen Klassen: den Phenolaten-Katecholaten (Derivaten der 2,3-Dihydroxybenzoesäure) und den Hydroxamaten (Derivaten der Hydroxamsäure).
Das bekannteste Siderophor aus der Klasse der Phenolate ist das Enterobactin, das durch Bakterien der Gattungen Escherichia, Klebsiella, Salmonella und Shigella ausgeschieden wird. Enterobactin besteht aus einem zyklischen Trimer von 2,3-Dihydroxy-N-benzoyl-L-serin und ist die chemische Verbindung, die die größte bekannte Affinität zum Eisen(III)-ion besitzen (Ka = 10⁵² M^–1).
Mehrere enterische Spezies synthetisieren Aerobactin, ein anderes Hydroxamat-Siderophor. Dieses Siderophor wird insbesondere durch septikämische oder invasive Stämme von Escherichia coli, die ein Plasmid des ColV-Typs tragen, Salmonella typhimurium und Shigella produziert.
Diese Biosynthese der Siderophore durch die Bakterien geht einher mit der Produktion von Proteinen in Höhe der Au ßenmembran, von denen bestimmte als Rezpetoren für Siderophore dienen, sowie mit Mechanismen, die den Transport und die Aussalzung von Eisen im Inneren des Bakteriums ermöglichen. Diese in der Außenmembran gebildeten Proteine, die oft mit dem Begriff "IROMP" für Iron Regulated Outer Membrane Protein (durch Eisen reguliertes Außenmembranprotein) bezeichnet werden, haben das gemeinsame Merkmal, dass sie eine Größe von 70 kDa bis 90 kDa besitzen und dass sie ebenso gut in vitro in einem an Eisen beschränkten Medium wie in vivo im Verlauf der Infektion synthetisiert werden.
Die Proteine der Außenmembran, die Siderophorenrezeptoren sind, bilden somit den zweiten Bestandteil der genannten hochaffinen Systeme zur bakteriellen Eisenaufnahme (den ersten Bestandteil bilden die Siderophore).
Neben diesen hochaffinen Systemen verfügen zahlreiche Bakterien über Transportsysteme mit niedrigerer Affinität, die es ihnen ermöglichen, die polymerisierten Formen von Eisen(III)hydroxid zu nutzen.
Die Mechanismen der Assimilation von Eisen wurden insbesondere in Escherichia coli untersucht, dem Mikroorganismus, der auf genetischer Ebene am besten bekannt ist.
Das endogene hochaffine Eisentransportsystem in E. coli verwendet das Siderophor Enterobactin. Enterobactin wird synthetisiert und ins Medium ausgeschieden, wenn E. coli in eine Umgebung mit beschränktem Eisengehalt eingebracht wird. Die Eisen(III)-Enterobactin-Komplexe werden dann in Höhe der Außenmembran abgefangen (Fep-A-Protein mit 81 kDa) und ins Cytoplasma transportiert. Wenn sie internalisiert worden sind, wird das Eisen durch Hydrolyse des Eisen(III)-Enterobactins freigesetzt und dann zu Eisen(II) reduziert.
Das Enterobactin-System von E. coli umfasst mindestens dreizehn Gene. Sieben Gene (ent) sind an der Biosynthese des Siderophors beteiligt, und fünf Gene (fep) codieren für Transportproteine.
Außer dem Enterobactin-System exkretieren und transportieren die septikämischen E.-coli-Stämme das Hydroxamat-Siderophor Aerobactin.
Im Jahr 1979 wurde von P. H. WILLIAMS (37) entdeckt, dass bestimmte Plasmide des ColV-Typs die Gene für das Siderophor Aerobactin und dessen Rezeptor tragen, der sich in der Außenmembran befindet und als Iut-A-Protein (Protein von 74 kDa) bezeichnet wird.
Obwohl Aerobactin eine niedrigere Konstante für die Assoziation mit dem Eisen(III)ion besitzt als Enterobactin, ist es trotzdem mit strukturellen Eigenschaften ausgestattet, die seine Fähigkeit verbessern, das an Transferrin oder Lactoferrin gebundene Eisen zu gewinnen.
Seit seiner Identifizierung im Jahr 1979 durch P. H. WILLIAMS haben sehr zahlreiche Studien gezeigt, dass das System zum Transport von Eisen durch Aerobactin eine maßgebliche Rolle bei der Virulenz pathogener E.-coli-Stämme und vieler anderer Bakterien spielt (GRIFFITHS et al. (13)).
Das Vorhandensein des Aerobactin-Siderophors fördert die Virulenz pathogener Stämme stark.
Auch wenn Aerobactin ein weniger starker Chelator ist als Enterobactin, ist es andererseits unter sehr viel variableren Umgebungsbedingungen aktiv (Enterobactin ist sehr empfindlich gegenüber Oxidation und pH-Schwankungen). So stellt Aerobactin für das Bakterium einen größeren Adaptationsgrad sicher.
Außerdem stimuliert Aerobactin das Bakterienwachstum besser und wird anscheinend, wahrscheinlich aufgrund einer bevorzugten genetischen Induktion, sehr viel schneller ausgeschieden als Enterobactin, wenn E. coli in Gegenwart eines Chelators kultiviert wird.
Mit dem Aerobactin-Operon gewinnt das Bakterium ein extrem leistungsfähiges Eisentransportsystem mit einer minimalen Anzahl an unterstützenden Genen, d. h. nur vier Genen für die Synthese von Aerobactin, das ein kleines einfaches Siderophor ist, und ein Gen, das den Außenmembranrezeptor codiert. Die anderen für den Transport von Hydroxamaten nötigen Gene liegen tatsächlich in allen Escherichia coli konstitutiv vor.
Die Expression aller Gene, die für die Membranproteine, die Siderophorenrezeptoren sind, sowie die entsprechenden Siderophore codieren, wird durch ein einziges Protein, Fur, reguliert, das als Repressor wirkt, wenn Eisen in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Diese zentrale Regulation wird überlagert durch eine individuelle Regulation, welche die Expression jedes Systems in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen moduliert.
Um die Expression von "IROMP" zu verbessern, haben bestimmte Autoren Bakterien in Medien kultiviert, die mithilfe chemischer Chelatoren, wie α,α'-Dipyridyl, an Eisen verarmt waren (A. BINDEREIF et al.: The cloacin receptor of ColV-bearing Escherichia coli is part of the Fe 3+ aerobactin system, J. Bacteriol., 1982, 150, 1472–1475; C. MAROLDA et al.: Flanking and internal regions of chromosomal genes mediating aerobactin iron uptake system in enteroinvasive Escherichia coli and Shigella flexneri, J. General Microbiology, 1987, 133, 2269–2278; A. BINDEREIF et al.: Cloning of the aerobactin-mediated iron assimilation system of plasmid col V, J. Bacteriol., 1983, 153, 1111–1113; De LORENZO et al.: Aerobactin biosynthesis and transport genes of plasmid col V – K 30 in Escherichia coli K 12, J. Bacteriol., 1986, 165, 570–578; P. WARNER et al.: col V-plasmid-specified aerobactin synthesis by invasive strains of Escherichia coli, Infection and Immunity, 1981, 33, 540–545). E. GRIFFITHS et al. haben in: Synthesis of aerobactin and a 76000 Daltons iron-regulated outer membrane protein by Escherichia coli K-12 – Shigella flexneri hybrids and by enteroinvasive strains of Escherichia coli, Infection and Immunity, 1985, 49, 67–71, gezeigt, dass enteroinvasive E.-coli-Stämme Aerobactin und ein Außenmembranprotein von 76 K in einer Kultur mit verringertem Eisengehalt in Gegenwart von Ovotransferrin produzieren.
Die vor kurzem erlangten Erkenntnisse über die Systeme zur Aufnahme von Eisen durch Bakterien ermöglichten die Erforschung neuer Wege zur Bekämpfung pathogener Bakterien.
Es wurde vorgeschlagen, Siderophoren-Analoga zu synthetisieren, die toxisch für das Bakterium sind und an die Eisentransportsysteme andocken können, um in die Bakterienzelle einzudringen. Diese synthetischen Chelatoren haben jedoch eine weniger hohe Affinität zu Eisen(III) als die natürlichen Siderophore und können das Eisen nicht aus den Transferrinen verdrängen.
ROGERS et al. schlagen die Herstellung von Komplexen zwischen Aerobactin und dreiwertigen Metallionen vor, die als Antimetabolite zum natürlichen Enterobactin-Fe³⁺-Komplex verwendet werden sollen. Nur die mit Scandium (Sc³⁺) und Indium (In³⁺) gebildeten Komplexe zeigen eine gewisse antibakterielle Aktivität (ROGERS et al. (26); ROGERS (27)).
Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, die Siderophore des Phenolattyps, die aromatische Moleküle sind, an bestimmte Serumproteine zu adsorbieren, die somit die Rolle eines Trägermoleküls übernehmen, was die Induktion spezifischer, gegen das Siderophor gerichteter Antikörper ermöglicht.
Außerdem beschreibt BYERS (5) einen Impfstoff gegen das durch Aeromonas hydrophila (ein für Septikämie beim Menschen und beim Fisch verantwortliches Bakterium) produzierte Phenolat-Siderophor, der in Fischen getestet wurde. Das Siderophor wurde kovalent an menschliches oder Rinder-Albumin gekoppelt. Mit diesen Zubereitungen immunisierte Fische produzierten Antikörper, die mit dem Siderophor reagierten. Es ist jedoch nicht genauer angegeben, ob die gebildeten Antikörper zur Neutralisation des Siderophors in der Lage sind.
Es wurde ebenfalls überlegt, das Einfangen von Siderophoren durch die Bakterien mithilfe von Antikörpern zu verhindern, die spezifisch gegen die Siderophorenrezeptoren gerichtet sind.
BOLIN et al. (4) berichten über Ergebnisse einer Studie, die auf eine gewisse passive Immunisierung mit Antikörpern hindeutet, die gegen die durch Eisen regulierten Proteine der Außenmembran gerichtet sind, wodurch Puten vor einer E.-coli-Septikämie geschützt waren.
Alle Versuche, die im Hinblick auf die Herstellung eines wirksamen Impfstoffs unternommen wurden, sind jedoch bisher wegen der Schwierigkeiten misslungen, dass man die durch Eisen regulierten Membranprotein in der Bakterienkultur nicht in ausreichenden Mengen durch ein Bakterium exprimieren lassen konnte.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Überwindung dieser Schwierigkeit, indem die Verwendung als Wirkstoff in einem Impfstoff von Bakterien vorgeschlagen wird, die durch Eisen regulierte Membranproteine in großen Mengen und insbesondere die Siderophorenrezeptoren in einem ausreichenden Spiegel exprimieren, dass die Bildung von Antikörpern induziert wird, welche die spezifische Erkennung von Siderophoren durch deren Rezeptoren verhindern.
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Bakterien, die durch Eisen regulierte Außenmembranproteine (IROMP) exprimieren, die als schützende Antigene verwendbar sind.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung der Synthese von durch Eisen regulierten Außenmembran proteinen von septikämischen Bakterien durch genetische Rekombination.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer großen Menge an IRCMP und insbesondere der Proteine Iut A und Fep A, die die Rezeptoren der Siderophore Aerobatin und Enterobactin in Escherichia coli und anderen Familien sind, durch die Synthese dieser Proteine mittels genetischer Rekombination.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Impfstoffen, die als Wirkstoff Bakterien oder Fragmente dieser Bakterien enthalten, die in ihrer Außenmembran große Mengen an IROMP und insbesondere der Proteine Iut A und Fep A aufweisen, die durch genetische Rekombination oder andere Verfahren erhalten werden.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Impfstoffen, die als Wirkstoff IROMP, beispielsweise die Proteine Iut A und/oder Fep A, oder Zubereitungen von Antigenen enthalten, welche diese Proteine umfassen.
Die vorliegende Erfindung verwendet daher Bakterien, die Proteine der Außenmembran exprimieren, die durch Eisen reguliert werden und von denen bestimmte als Rezeptoren für Siderophore fungieren, die sich als Impfstoffzubereitung verwenden lassen.
Die erfindungsgemäßen Bakterien sind dadurch gekennzeichnet, dass sie erhöhte Mengen dieser Außenmembranproteine und insbesondere der Rezeptoren für Transferrine und insbesondere der Rezeptoren für Siderophore exprimieren, um die Bildung von Antikörpern zu induzieren, die die Funktion der spezifischen Erkennung durch die Rezeptoren verhindern und dadurch die Versorgung des pathogenen Bakteriums mit Eisen verhindern, wenn diese Proteine in einem Impfstoff eingesetzt werden.
Die verwendeten Bakterien sind vorzugsweise Enterobakterien, und es sind diejenigen bevorzugt, welche die Siderophore Enterobactin und/oder Aerobactin ausscheiden.
Die Bakterien sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die von Escherichia coli, Klebsiella, Salmonella typhimurium, Shigella gebildet wird.
Die Bakterien scheiden vorzugsweise die Siderophore Aerobactin und Enterobactin zusammen aus.
Erfindungsgemäß und gemäß einer ersten Ausführungsform werden die Bakterien durch Kultur von in der Natur bereits existierenden oder in Labors oder Sammlungen verfügbaren Stämmen in einem Minimalmedium erhalten, in dem die Verfügbarkeit von Eisen auf einen Spiegel verringert wird, der eine zufriedenstellend erhöhte Expression von Membranproteinen ermöglicht. Die Kultur erfolgt vorzugsweise in Gegenwart eines Eisen(III) stark chelatisierenden Proteins, wie den Lactoferrinen, wobei die Chelatoren den Vorteil bereitstellen, dass sie eine Beschränkung an Eisen mit den gleichen Eigenschaften aufrechterhalten, wie sie in vivo existiert.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Produktion dieser Bakterien, die für die Verwendung zur Herstellung von Impfstoffen bestimmt sind, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Bakterien in einem Kulturmedium kultiviert, das ein Eisen(III) chelatisierendes Protein enthält, wie die Transferrine und insbesondere die Lactoferrine.
Als Minimalmedium lässt sich das von SIMON und TESSMAN (30) beschriebene einsetzen.
Diese Ausführungsform beruht jedoch auf einem schwierigen Ansatz, weil man mit den gewöhnlich verwendeten Eisen-Chelatoren den Gehalt an Eisen im Kulturmedium ausreichend verringern muss, um eine ausreichende Expression von Außenmembranproteinen zu erhalten. Es verbleiben oft geringe Mengen an Eisen, die die Expression von Membranproteinen verhin dern (Eisen, das zum Beispiel aus dem Fermenter oder den Rohrleitungen stammt, die gewöhnlich aus nichtrostendem Stahl sind). Somit muss man auf relativ komplizierte Verfahren zurückgreifen, um den Gehalt an Eisen auf einen Spiegel abzusenken, der die Expression von Proteinen der Außenmembran von Bakterien ermöglicht, und folglich ist die Durchführung kostspielig.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung, die zudem die bevorzugte Ausführungsform ist, werden die Bakterien, die in großen Mengen die Proteine der Außenmembran exprimieren, die Siderophorenrezeptoren sind, mit rekombinanten Plasmiden transformiert.
Die Synthese von Proteinen der Außenmembran, die Siderophoren- oder Transferrinrezeptoren sind, durch genetische Rekombination bietet tatsächlich viele Vorteile:

– sie ermöglicht den Erhalt einer erheblichen Expression dieser Proteine unabhängig von der Eisenkonzentration des Kulturmediums,
– sie ermöglicht die direkte Untersuchung von Immunreaktionen, die gegen diese Proteine gerichtet sind, wobei jeder andere Bestandteil des Ursprungsstamms ausgeschlossen ist,
– es handelt sich um die ökonomischste Lösung zur Expression von Membranproteinen in einer Umgebung, in der Eisen immer vorhanden ist (Fermenter, Rohrleitungen und verschiedene Ausrüstungsgegenstände aus rostfreiem Stahl).

Auch wenn der Anmelder besonders an der Synthese der Proteine Iut A und Fep A interessiert ist, die die Rezeptoren für die Siderophore Aerobactin und Enterobactin in E. coli sind, wird man verstehen, dass die nachstehend beschriebenen Techniken zur genetischen Rekombination analog auch auf die Synthese von Membranproteinen (IROMP), die Rezeptoren von Siderophoren (Aerobactin oder Enterobactin) oder Transferrin sind, von anderen pathogenen Bakterien als E. coli anwendbar sind.
Somit betrifft die Erfindung auch die Herstellung von Iut-A- und/oder Fep-A-Proteinen von E. coli durch genetische Rekombination.
Das Protein Iut A kann durch ein Verfahren synthetisiert werden, das insbesondere besteht aus:

– Isolieren des Plasmids oder des Chromosoms aus pathogenen Stämmen von E. coli, Salmonellen, Shigellen oder Klebsiellen, welches das Aerobactin-Operon trägt,
– Abtrennen von dem Plasmid oder Chromosom eines Fragments, welches das Gen iut A enthält,
– Ligieren des Fragments mit einem Klonierungsvektor,
– Inserieren der Klone, die das Gen iut A integriert haben, in einen Expressionsvektor (beispielsweise das Plasmid GTI 001),
– und Exprimieren des Iut-A-Proteins durch Kultur von Klonen.

Das Protein Fep A wird erhalten durch:

– Isolieren aus einem Plasmid (zum Beispiel dem von LAIRD und YOUNG (19) konstruierten Plasmid pMS 101) oder aus einem bakteriellen Chromosom von E. coli, Salmonellen oder Klebsiellen eines Fragments, welches das Gen fep A trägt,
– Klonieren des Fragments in einen Klonierungsvektor,
– Inserieren des Gens fep A in einen Expressionsvektor, vorzugsweise in den Vektor, der zur Expression des Proteins Iut A verwendet wird (Plasmid GTI 001),
– und Exprimieren des Fep-A-Proteins durch Kultur von Klonen.

Die Expressionsvektoren für die Proteine Iut A und/oder Fep A können aus Bakterien stammen, und die Verwendung von E. coli ist bevorzugt, dessen Expressionssysteme am besten bekannt sind. Man kann jedoch auch anderen Vektoren verwenden, insbesondere virale oder aus Hefen stammende, deren Konstruktionen durch den Fachmann vorgenommen werden können.
Die bakteriellen Klone, die die Proteine Iut A und/oder Fep A exprimieren, können in einem geeigneten Medium bei einer Temperatur vermehrt werden, die ausreichend niedrig ist, dass die Expression verhindert oder beschränkt wird, gewöhnlich bei unter 32°C. Die Expression wird dann durch Erhöhen der Temperatur, zum Beispiel auf 42°C, für etwa 4 Stunden induziert, so dass die Expression der Gene iut A und fep A induziert wird.
So werden Bakterien erhalten, welche die Proteine Iut A und Fep A sowie deren Vorläufer proIut A und proFep A enthalten, die sich in Form großer cytoplasmatischer Einschlüsse zeigen.
Diese Bakterien, in einem Impfstoff als Wirkstoff verwendet, induzieren die Bildung von Antikörpern, die gegen die Proteine Iut A und Fep A gerichtet sind und die Erkennung von deren jeweiligen Siderophoren Aerobactin und Enterobactin durch diese Proteine verhindern, was somit die Versorgung des Bakteriums mit Eisen stark verringert und seine Vermehrung blockiert.
Die Erfindung betrifft somit ebenfalls Impfstoffe, die als Wirkstoff rekombinante Bakterien enthalten, die durch Eisen regulierte Proteine der Außenmembran exprimieren.
Eine Aufgabe der Erfindung sind insbesondere Impfstoffe, die als Wirkstoff enthalten: rekombinante Bakterien oder Fragmente dieser Bakterien, insbesondere Membranfragmente, welche die Proteine Iut A und/oder Fep A und/oder deren Vorläufer proIut A und/oder proFep A; oder auch die Proteine Iut A und/oder Fep A und/oder deren Vorläufer enthalten, beispielsweise Extrakte des Cytoplasmas oder der Außenmembran von rekombinanten Bakterien.
Bei einer Art der Durchführung hat die Erfindung Impfstoffe zur Aufgabe, die als Wirkstoff enthalten: homologe Bakterien von septikämischen Bakterien oder Fragmente dieser Bakterien, die in einem Medium kultiviert werden, dessen Eisengehalt beschränkt ist, und die in erhöhten Mengen die Proteine Iut A und/oder Fep A und/oder deren Vorläufer; die angemessen extrahierten Proteine Iut A und/oder Fep A (und/oder deren Vorläufer) enthalten.
Vorzugsweise werden die letzteren Impfstoffe auf der Grundlage von Bakterien hergestellt, die in einem Medium kultiviert werden, das einen starken Chelator für Eisen(III) des Proteintyps und insbesondere Transferrin, Lactoferrin oder Ovotransferrin enthält.
Die Erfindung wird beim Lesen der folgenden Beschreibung besser verstanden, die sich auf die hier beigefügten Figuren bezieht und in denen:
die 1 das Proteinprofil zeigt, das durch Elektrophorese eines Klons erhalten wird, der das Iut-A-Protein exprimiert,
die 2 das Proteinprofil zeigt, das durch Elektrophorese eines Klons erhalten wird, der das Fep-A-Protein exprimiert.

Die im folgenden Text verwendeten Abkürzungen haben die nachstehenden Bedeutungen:

Amp^r	Ampicillin-resistent
Clo^s	Cloacin-sensitiv
dATP	Desoxyadenosintriphosphat
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure
Ent	Enterobactin
E.O.P.S.	frei von spezifischen pathogenen Organismen
IPTG	Isopropyl-β-thiogalactopyranosid
kbp	Kilobasenpaare
LB	Luria-Brühe
OMP	Outer Membrane Protein (Außenmembranprotein)
PAGE	Polyacrylamid-Gelelektrophorese
bp	Basenpaare
PBS	Phosphatpuffer (phosphate buffered saline)
SDS	Natriumdodecylsulfat
ST	Simon und Tessman
TEMED	N,N,N',N'-Tetramethylendiamintrishydroxyaminomethylmethan
tet^r	Tetrazyklin-resistent

MATERIALIEN UND VERFAHREN
I. MATERIALIEN
1. Stämme
In der Tabelle I sind die verwendeten Stämme zusammengefasst. Die untersuchten Stämme sind Stämme von Septikämie in Kälbern oder Hühnchen und stammen aus der RHONE-MERIEUX-Stammbibliothek.
Die zur Klonierung, Sequenzierung und Expression verwendeten Wirtsstämme sind alle von Escherichia coli K12 hergeleitet.
Man kann diese Stämme ohne Schwierigkeiten durch andere septikämische Wildtypstämme oder Laborstämme ersetzen.
2. Plasmide
Der Ursprung und die Eigenschaften der zur Klonierung und Expression verwendeten Plasmide sind in der Tabelle II dargestellt.
3. Medien
Minimalmedium von SIMON und TESSMAN (30)
Es hat die nachstehende Zusammensetzung:
Die einzige Kohlenstoffquelle besteht aus Natriumsuccinat, das in einer Endkonzentration von 10 g/l zugefügt wird.
Um in diesem Medium eine Beschränkung von Eisen herbeizuführen, wird Ovotransferrin (SIGMA) in einer Endkonzentration von 250 μg/ml hinzugegeben (Konzentrationen von mehr als 500 μg/ml sind möglich).

Das Eisen-reiche Vergleichsmedium wird durch Zugabe von FeCl₃, 6 H₂O (MERCK) in einer Endkonzentration von 40 μM erhalten. M9-Minimalmedium, MANIATIS (29)

zu diesem Basismedium wird hinzugefügt:

1 M MgSO₄	2 ml/1000 ml
20% Glucose	10 ml/1000 ml
1 M CaCl₂	0, 1 ml/1000 ml

LB-Vollmedium (MANIATIS et al. (23))

BTS-Vollmedium (BIO MERIEUX)

BHI-Vollmedium (Herz-Hirn, BIO MERIEUX)

"M9-SP"-Vollmedium zur Expression Medium:

SP (3,2% Trypton; 2% Hefeextrakt)	100 ml
M9 (6, 6X konzentriert) über 0,22 μm-Filter (Millipore) filtriert	15 ml
100 mM MgSO₄	1, 5 ml
0, 1 mM FeCl₃	1, 5 ml
Vitamin B1 (5%ige Lösung)	1,5 ml

Die festen Medien haben die gleiche Zusammensetzung wie die entsprechenden flüssigen Medien und enthalten 12 g Agar pro Liter Medium.
Die Antibiotika werden in den festen und flüssigen Medien in den folgenden Endkonzentrationen verwendet:

Ampicillin 25 μg/ml

Tetrazyklin 12,5 μg/ml
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird gegebenenfalls in einer Endkonzentration von 0,05 mM bis 0,4 mM zugefügt.
Die Sterilisation von festen und flüssigen Medien erfolgt durch Autoklavieren bei 120°C für 20 Minuten.
Die Lösungen von Antibiotika, Vitamin B1, Natriumsuccinat, 6, 6X M9, MgSO₄, FeCl₃, IPTG und Ovotransferrin werden in Form konzentrierter Stammlösungen hergestellt und mittels Filtration durch ein Filter mit einer Porosität von 0,22 μm (Millipore) sterilisiert.
Nach der Sterilisation werden die Kulturmedien bei Umgebungstemperatur aufbewahrt.
Die Antibiotika-, IPTG- und Ovotransferrin-Stammlösungen werden bei –20°C aufbewahrt.
Die übrigen Lösungen werden bei +4°C gehalten.
II. VERFAHREN
1. Bakterienkulturen
Mit Ausnahme von Klonen, die in dem Expressionsvektor pGTI 001 hergestellte Konstruktionen enthalten und bei +30°C kultiviert werden, werden alle Kulturen bei +37°C unter Schütteln für 18 Stunden durchgeführt.
Wenn nötig, wird das Bakterienwachstum durch die Trübung der Suspension bei 600 nm mithilfe eines BECKMAN-DU-40-Spektralphotometers gemessen.
Die Kulturen werden gewöhnlich in einem Volumen von 2 ml nach Animpfen mit einer Kolonie durchgeführt. Die Kulturen in einem größeren Volumen (20 ml bis 1000 ml) werden durch Animpfen zu einem Hundertstel mit einer Vorkultur in der stationären Phase durchgeführt.
2. Empfindlichkeit gegenüber Bakteriocinen
Die Produktion von Cloacin DF 13 und Colicin B wird jeweils mit den Stämmen Enterobacter cloacae DF 13 und Escherichia coli 1300 gemäß dem von DE GRAAF beschriebenen Verfahren durchgeführt (DE GRAAF et al. (8) und (9)).
Diese Stämme werden bei +37°C in BHI-Medium kultiviert, bis die optische Dichte 0,5 erreicht (1 cm, 600 nm). Dann wird zum Kulturmedium Mitomycin C so hinzugefügt, dass eine Endkonzentration von 1 μg/ml erhalten wird, wodurch die Induktion der Synthese von Bakteriocinen möglich ist. Die Kultur wird für 6 Stunden bei +37°C bis zur Lysephase fortgesetzt. Die Bakterienzellen werden abzentrifugiert (8000 × g, 30 min, +4°C), und der Überstand wird verwahrt. Dann wird Ammoniumsulfat langsam bei +4°C hinzugefügt, bis die Konzentration 365 g/l erreicht.
Der Überstand wird in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,0, aufgenommen und gegen mehrere aufeinander folgende Bäder dieses Puffers dialysiert. Das Dialysat wird über 0,22 μm (Millipore) filtriert und bei –20°C gelagert.
Etwa 10⁹ Bakterien des untersuchten Klons werden auf Gelose-LB mit dem geeigneten Selektionsantibiotikum ausplattiert. Wenn die aufgebrachte Flüssigkeit vollständig absorbiert ist, werden in die Mitte der Petrischale 75 μl der Bakteriocin-Lösung gegeben. Wenn auch dieser Tropfen getrocknet ist, wird die Petrischale in einem Brutschrank (je nachdem, bei +30°C oder +37°C) für 18 Stunden untergebracht. Die Klone, die eine Wachstumshemmung in Höhe der Ablagerung zeigen, haben eine Empfindlichkeit gegenüber dem Bakteriocin erworben. Die gegenüber der toxischen Wirkung der Bakteriocine resistenten Klone zeigen dagegen einen gleichmäßigen Bakterienrasen.
3. Herstellung von Antiseren, die gegen durch Eisen regulierte Proteine der Außenmembran gerichtet sind
Das verwendete Protokoll ist eine Wiederholung des von BOLIN und JENSEN (4) beschriebenen.
Die durch Eisen regulierten Proteine der Außenmembran werden mittels präparativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat aufgetrennt.
Nach Färbung der Gele wird die Bande mit dem IROMP, das zur Immunisierung dienen soll, ausgeschnitten und dann in Gegenwart von destilliertem Wasser durch aufeinander folgende Passagen durch Kanülen mit immer kleineren Durchmessern zerkleinert.
Das Zerkleinerungsprodukt wird E.O.P.S.-Kaninchen des Stamms White New Zealand, die aus der Zucht der Firma Rhone-Merieux stammen, gemäß dem in Tabelle III dargestellt Protokoll injiziert.
Um die Antikörper zu beseitigen, die gegen die anderen Proteine der Außenmembran, die Lipopolysaccharide und die anderen Antigene von Escherichia coli gerichtet sind, werden die aus den immunisierten Kaninchen gewonnenen Seren mit einem Escherichia-coli-Stamm adsorbiert, der keine IROMP exprimiert.
Pro ml Serum werden etwa 10¹⁰ Bakterienzellen hinzugefügt, die für 30 min bei 100°C inaktiviert wurden, und das Gemisch wird 1 Stunde bei +37°C inkubiert.
Nach Zentrifugation wird der Serumüberstand gewonnen und über ein Filter mit einer Porosität von 0,22 μm (Millipore) filtriert.
Er wird bei –20°C aufbewahrt.
5. Extraktion von Proteinen der Außenmembran
Die zur Extraktion von Proteinen der Außenmembran verwendete Technik ist aus den von VAN TIEL-MENKVELD et al. (36) und FISS et al. (12) beschriebenen Techniken hergeleitet.
Nach Zentrifugation wird das Bakteriensediment in 0,2 M Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, so resuspendiert, dass eine optische Dichte von etwa 10 erhalten wird. Die Bakterienzellen werden dann mittels Ultraschallbehandlung aufgebrochen, wobei man die Ultraschallwellen 3mal für 3 Minuten einwirken lässt und die Bakteriensuspension auf einem Eis-Ethanol-Bad untergebracht wird.
Die Zelltrümmer und die intakten Bakterien werden durch Zentrifugation bei 5000 × g für 20 min bei +4°C beseitigt.
Die bakteriellen Membranen in Suspension im Überstand werden mittels Ultrazentrifugation bei 110 000 × g für 60 Minuten bei +4°C gewonnen.
Das Membransediment wird in 5 ml des von SCHNAITMAN (29) beschriebenen Extraktionspuffers aufgenommen: 2% Triton X-100; 10 mM MgCl₂; 50 mM Tris/HCl pH 8,0.
Man inkubiert für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur, wobei alle 5 Minuten geschüttelt wird. Im Verlauf der Inkubation werden die Proteine der Cytoplasma-Membran durch Triton X-100 bevorzugt solubilisiert. Die Außenmembranen werden durch eine neue Ultrazentrifugation (110 000 × g, 60 min, +4°C) wiedergewonnen. Das erhaltene Sediment wird 3mal in destilliertem Wasser gewaschen, schließlich in 1 ml destilliertem Wasser resuspendiert und zur Lagerung bei –20°C eingefroren.
6. Konzentrationsbestimmung von Proteinen
Die Proteinkonzentration von Membranextrakten wird durch ein kolorimetrisches Verfahren bestimmt, das sich von dem von LOWRY et al. (20) veröffentlichten herleitet.
Zu 0,5 ml der zu messenden Proteinlösung werden 2,5 ml der nachstehenden Lösung gegeben:

1% CuSO₄-Lösung 1 ml

2% Natriumtartratlösung 1 ml

2% Natriumcarbonatlösung in 0,1 N NaOH Q. s.
Nach Inkubation für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur werden 0,25 ml 50% Folin-Reagenz (Merck) hinzugefügt.
Man inkubiert 30 Minuten bei Umgebungstemperatur, und die optische Dichte der sich entwickelnden blauen Färbung wird bei 779 nm gemessen.
Die Proteinkonzentration von Proben wird mithilfe eines Eichspektrums bestimmt, das mit Rinderserumalbumin hergestellt wird.
Die optische Dichte ist proportional zur Proteinkonzentration in einem Bereich von 5 bis 200 μM/ml.
7. Verfahren zur Analyse der Proteinzusammensetzung von Außenmembranen: Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen
Die Polyacrylamidgele werden gemäß den von LUGTENBERG et al. (21) beschriebenen Eigenschaften hergestellt.
Das Sammelgel hat die nachstehende Zusammensetzung:
5% Acrylamid-Bisacrylamid (30/0,8 Gew./Gew.); 130 mM Tris/HCl, pH 6,8; 3,5 mM SDS; 44 mM Ammoniumpersulfat; 8 mM TEMED.
Das Trenngel hat die gleiche Zusammensetzung wie das Sammelgel, mit Ausnahme der Konzentration von Acrylamid-Bisacrylamid (8 oder 10%) und 380 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,8.
Der verwendete Laufpuffer hat die nachstehende Zusammensetzung:
Die Extrakte, die analysiert oder mittels Elektrophorese gereinigt werden sollen, werden in mindestens einem gleichen Volumen des folgenden Dissoziationspuffer verdünnt: 100 mM Tris/HCl, pH 6,8; 20% Glycerin; 70 mM SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol; 75 μM Bromphenolblau.
Die so verdünnten Extrakte werden 5 Minuten bei 100°C erhitzt.
Zur Analyse der Proteinzusammensetzung der Außenmembran werden 30 bis 50 μg Proteine in Taschen untergebracht.
Für präparative Elektrophoresen werden bis zu 2 mg Proteine in einzelnen präparativen Taschen untergebracht.
Die Wanderung erfolgt bei +14°C für 5 Stunden bei 160 V oder 14 Stunden bei 60 V (LKB-Vertikalgelapparatur). Zur Verbesserung der Auflösung der durch Eisen regulierten Außenmembranproteine wurden bestimmte Elektrophoresen bei einer Spannung von 100 V für 16 Stunden durchgeführt. Am Ende der Elektrophorese werden die Proteine für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur durch 1,2 mM Coomassie-Blau in einem Gemisch von Methanol/Essigsäure/Wasser (50 : 10 : 50 Vol./Vol./Vol.) fixiert und gefärbt. Der nicht gebundene Farbstoff wird durch mehrere aufeinander folgende Bäder von Methanol/Essigsäure/-Wasser (40 : 15 : 145 Vol./Vol./Vol.) bei 37°C entfernt. Nach der Entfärbung wird das Gel fotografiert und getrocknet.
Die Profile der Außenmembranproteine jedes Stamms können anschließend mittels Densitometrie analysiert werden (LKB-ULTROSCAN-Densitometer).
8. Nachweis und Analyse von Anti-IROMP-Antikörpern
Das Vorliegen von spezifischen Anti-IROMP-Antikörpern wird mit der ELISA-Technik in Mikrotiterplatten untersucht (ENGWALL und PERLMANN (10); COULTON (7)). Die an die feste Phase gekoppelten Antigene sind Fraktionen, die stark mit dem Protein proFep A oder mit dem Protein proIut A angereichert sind.
Der Nachweis von Anti-IROMP-Antikörpern erfolgt unter Verwendung von Konjugaten von an Peroxidase gekoppeltem Kaninchen-Anti-IgG (Hühnchen-Anti-IgG) (Nordic). Das eingesetzte Substrat ist Orthophenylendiamin. Das Ablesen der optischen Dichten erfolgt bei 492 nm.
-"Western-Blot-" (oder "Immun-Saug-) Technik
Die mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von SDS aufgetrennten Proteine werden gemäß der von Towbin et al. (34) beschriebenen Technik auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF 0,45 μm, Millipore) übertragen.
Der Transfer erfolgt bei 24 V für 1 Stunde mit einer BIOLYON-Apparatur unter Verwendung der folgenden Anoden- und Kathodenpuffer:
Nach dem Transfer wird die PVDF-Membran für eine Stunde bei +37°C mit PBS-Puffer, der 1% Magermilch enthält, gesättigt.
Die Membran wird anschließend in Streifen geschnitten, die den Elektrophoresebahnen entsprechen.
Die zu untersuchenden Seren werden in PBS-Puffer, der 1% Magermilch enthält, verdünnt und dann mit dem Membranstreifen in Kontakt gebracht (4 ml verdünntes Serum pro Streifen).
Nach Inkubation für 1 Stunde bei +37°C unter leichtem Schütteln werden 3 Wäschen für 20 min mit PBS-Puffer, der 2% Magermilch enthält, bei Umgebungstemperatur vorgenommen.
Ein mit Peroxidase gekoppeltes Anti-IgG-Konjugat, das in PBS mit 1% Magermilch auf 1/1000stel verdünnt wird, wird in einem Verhältnis von 3 ml pro Streifen zugefügt.
Nach Inkubation für 1 Stunde bei +37°C unter leichtem Schütteln werden 3 Wäschen für 20 min mit PBS-Puffer bei Umgebungstemperatur vorgenommen.
Dann wird das Substrat Diaminobenzidin zugegeben, das in physiologischem Wasser, pH 7,15, auf 0,1% verdünnt wurde und zu dem kurz zuvor 30 Volumina 0,1% H₂O₂ hinzugefügt werden. Es erscheinen dann (nach 5 bis 20 min) bräunliche Banden in Höhe von Proteinen, die durch die im untersuchten Serum vorhandenen Antikörper erkannt werden.
Die Membran wird dann in destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
9. Verfahren zur Präparation von Plasmid-DNA
Die in den pathogenen Stämmen enthaltenen großen Plasmide werden gemäß der von KADO et al. (16) veröffentlichten Technik extrahiert.
Die im Verlauf verschiedener Klonierungs- und Subklonierungsschritte erhaltenen Plasmide und Konstruktionen in dem Expressionsvektor werden gemäß dem Verfahren von BIRNBOIM (BIRNBOIM und DOLY) (3) extrahiert. Die nach den präparativen Extraktionen, die gemäß der einen oder der anderen Technik durchgeführt werden, erhaltene Plasmid-DNA wird in einem Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt (MANIATIS et al. (23)).
Nach der Reinigung werden die Plasmide in einem Puffer aus 10 mM Tris; 1 mM EDTA, pH 8,0, so aufgenommen, das eine Endkonzentration von 1 μg DNA/μl erhalten wird, und für die Lagerung bei –20°C eingefroren.
10. Verfahren zur Analyse und Modifikation der DNA
Alle zur Klonierung, zur DNA-Spaltung, zur Analyse von Restriktionsfragmenten in Agarosegelen, zur Modifikation der Enden von Restriktionsfragmenten und zur Hybridisierung mit einer radioaktiven Sonde nach Transfer der DNA auf eine Nitrocellulosemembran eingesetzten Techniken sind die von MANIATIS (MANIATIS et al. (23)) beschriebenen. Nach besonderen Verfahren wurde die DNA wurde sequenziert und die Oligonucleotide synthetisiert.
11. DNA-Sequenzierung
Die zu sequenzierenden Gene werden in die Vektoren M13 mp18 und mp19 (YANISCH-PERRON et al. (38)) subkloniert und gemäß dem Kettenterminationsverfahren durch Didesoxynucleotide sequenziert (SANGER et al. (28)). Die Markierung der verschiedenen Ketten erfolgt mit ³⁵S-dATP (AMERSHAM).
Die Sequenzierung im eigentlichen Sinne erfolgt unter Verwendung von Reagenzien und Enzymen des Amersham-Sequenzierungskits und von Sequenase (USB). Die Polyacrylamid-Gelelektrophoresen in Gegenwart von Harnstoff erfolgen an einer Sequi-Gen-Apparatur (BioRad).
Die Behandlung der Sequenzdaten wird mithilfe des Microgenie-Programms (Beckman) durchgeführt.
12. Synthese von Oligonucleotiden
Die verschiedenen Oligonucleotide, die für die Konstruktionen in den Expressionsvektoren oder für die Mutagenesen benötigt werden, werden gemäß der Cyanoethylphosphoramidit-Technik an einer Applied-Systems-381-A-Apparatur synthetisiert.
Diese Oligonucleotide werden direkt nach der Entfernung der Schutzgruppen und nach Fällung mit Ethanol eingesetzt.
13. Gerichtete Mutagenesetechnik
Die Mutagenese erfolgt gemäß der von ECKSTEIN (TAYLOR et al. (33); NAKAYAME und ECKSTEIN (24)) beschriebenen Technik mithilfe eines von der Firma Amersham vertriebenen direkten Mutagenese-Kits.
ERGEBNISSE
1. ISOLATION UND ANALYSE VON iut-A-GENEN
Das Vorhandensein des Aerobactin-Operons wurde an Plasmiden untersucht, die in den Stämmen 15393, 15972 und 16003 enthalten waren.
Nachdem sie in einem Cäsiumchlorid-Gradienten isoliert wurden, wurden diese Plasmide durch die Restriktionsenzyme BamHI, HindIII, PvuI und SalI (Boehringer) gespalten. Die verschiedenen Restriktionsfragmente von jedem Plasmid wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und gemäß der "Southern-Blot"-Technik (SOUTHERN (31)) auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Diese Fragment wurden anschließend mit zwei (mittels terminalem Austausch mit ³²P markierten) radioaktiven Sonden hybridisiert, die ausgehend von Restriktionsfragmenten des Plasmids pABN1 hergestellt wurden, welches das Aerobactin-Operon von pColV-K30 trägt (BINDEREIF und NEILANDS (2)). Es wurde gefunden, dass sich das für den Rezeptor Iut A codierende Gen auf allen Plasmiden auf einem BamHI-BamHI- Fragment von 6,6 kb befindet. Diese Ergebnisse bestätigen die Arbeiten von Autoren, die das Gen ausgehend von einem äquivalenten Fragment von pColV-K30 subkloniert haben (KRONE et al. (17)).
– Klonierung von Plasmid-DNA-Fragmenten, die das Gen iut A tragen
Die Plasmide der Stämme 15393, 15972 und 16003 wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten. Nach Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel wurde die Gelbande, die das Fragment mit einer Größe von 6,6 kb von jedem Plasmid enthielt, ausgeschnitten und die DNA elektroeluiert.
Die drei 6,6 kb großen BamHI-BamHI-Fragmente wurden getrennt in den mit BamHI gespaltenen Vektor paT 153 ligiert. Die drei Ligationsgemische dienten zur Transformation von kompetenten HB-101-Bakterien (Tabelle IV).
Die DNA Ampicillin-resistenter, Tetrazyklin-sensitiver Klone wurde (mit der Technik von BIRNBOIM und DOLY) extrahiert und mit BamHI gespalten, um die Größe der Insertion zu bestätigen. Die Klone, die das 6,6-kb-Fragment integriert hatten, wurden aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber Cloacin DF 13 selektioniert.
Für jedes Ausgangsplasmid wurde ein Cloacin-sensitiver Klon für die Analysen und die abschließenden Konstruktionen gewonnen. Es handelte sich um die Klone:

Stamm 15393 Klon HB 101 p 5–15

Stamm 15972 Klon HB 101 p P-13

Stamm 16003 Klon HB101 p 4–18
– Analyse von Klonen
Untersuchung der Expression des Iut-A-Rezeptors
Die Tatsache, dass die gesuchten Klone mithilfe eines Tests der Sensitivität gegenüber Cloacin selektioniert werden konnten, zeigt, dass eine Expression des Rezeptors für Cloacin und für Aerobactin erfolgt. Die Expression des Gens iut A, das auf dem 6,6 kb großen BamHI-BamHI-Fragment getragen wird, ist wahrscheinlich abhängig von einem schwachen Promotor, der sich auf diesem Fragment befindet (KRONE et al. (17)), und ist im Gegensatz zu dem Hauptpromotor des Aerobactin-Operons unabhängig von der Eisenkonzentration. Tatsächlich wird die Sensitivität gegenüber Cloacin durch Kultur auf Eisen-reichem Gelose-Ampicillin-LB demonstriert.
Um die Höhe der Expression des Rezeptors Iut A zu untersuchen, wurden die verschiedenen Klone in LB-Ampicillin-Medium (für eine Nacht bei +37°C) in Gegenwart von Ovotransferrin (500 μg/ml) oder ohne Ovotransferrin kultiviert.
Die Außenmembranproteine der drei Klone wurden extrahiert und auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von SDS analysiert.
Wie auch immer die Kulturbedingungen waren, war es nicht möglich, die Expression eines zusätzlichen Proteins von 76 kDa in den Cloacin-sensitiven Klonen zu beobachten.
– Restriktionskarten
Die Plasmid-DNA der Klone 4–18, 5–15 und P-13 wurde in großer Menge extrahiert und über einen Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt.
Die Restriktionskarten der drei klonierten 6,6 kb großen BamHI-BamHI-Fragmente wurden mit den Enzymen BglII, BstEII, ClaI, EcoRI, KpnI, PstI, PvuII und SmaI hergestellt.
Diese drei Karten sind untereinander stark identisch und entsprechend der Restriktionskarte des 6,6 kb großen BamHI-BamHI-Restriktionsfragments des Aerobactin-Operons von pColV-K30, die aus veröffentlichten Karten von BINDEREIF und NEILANDS (1, 2) und KRONE und Mitarbeitern (17) hergeleitet wurde.
Diese vier Karten sind in der Tabelle V dargestellt.
– Sequenzierung von iut-A-Genen
Beim Vergleich der Restriktionskarten der drei 6,6 kb großen BamHI-BamHI-Fragmente mit derRestriktionskarte, die aus der Sequenz des Gens iut A hergeleitet wurde (KRONE et al. (18)), ist ersichtlich, dass das Gen iut A vollständig auf einem 3,2 kb großen BstEII-BstEII-Fragment lokalisiert ist (Tabelle VI).
Dieses Fragment wurde mittels Elektroelution isoliert, mit Ligase des Phagen T4 (Boehringer) mit sich selbst ligiert und mit mehreren Systemen von Restriktionsenzymen gespalten. Die verschiedenen, so erhaltenen Fragmente (Größe von 150 bis 600 bp) wurden mittels GeneClean (Bio 101) isoliert und in die Vektoren M13 mp18 und mp19 subkloniert, die zuvor mit den entsprechenden Enzymen gespalten worden waren. Die Sequenz jedes Subklons wurde anschließend gemäß der Technik von SANGER bestimmt, wobei die Sequenzierungskits von Amersham und Sequenaee (USB) verwendet wurden.
Nur das 3,2 kb große BstEII-BstEII-Fragment des Klons P-13 wurde vollständig sequenziert. Die anderen beiden iut-A-Gene wurden zwischen der BglII-Stelle (1) und der EcoRV-Stelle (2396) sequenziert.
Der BstEII-BglII-Bereich des Klons P-13 wurde mit der Sequenz des Gens iuc D verglichen, das sich gerade stromaufwärts von iut A befindet (HERRERO et al. (14)), und die Pvu-II-BstEII-Region dieses Klons wurde mit der Sequenz des IS1-Elements (OHTSUBO und OHTSUBO (25)) verglichen.
Diese Vergleiche sowie die Vergleiche der Sequenzen der drei iut-A-Gene mit der Sequenz des iut-A-Gens von pColV-K30 sind in der Tabelle VII dargestellt.
Die Analyse dieser vier Sequenzen ergab, dass das iut-A-Gen auf molekularer Ebene extrem konserviert ist. Mit Ausnah me von einer oder zwei Basen sind die drei iut-A-Gene, die aus E. coli-Stämmen tierischen Ursprungs isoliert wurden, untereinander identisch. Die beobachteten Unterschiede gegenüber der durch KRONE et al. (18) veröffentlichten Sequenz sind minimal.
Die drei untersuchten iut-A-Gene haben eine Homologie von 99,77% zu dem iut-A-Gen von pColV-K30.
Die Bereiche, in denen Unterschiede festgestellt wurden, sind in der Tabelle VIII dargestellt. (Die Zahlen verweisen auf die Position der Basen in den Sequenzen, die in Tabelle VII dargestellt sind).
Zwei wichtige Bereiche sind stark konserviert: die Sequenz, die das Signalpeptid codiert, und die Konsensussequenz ("Ton-B-Box"), die für Proteinrezeptoren der Außenmembran typisch ist, deren Funktion von Ton B abhängt.
In jeder der drei Gensequenzen wurde das Vorhandensein von vier Insertionen im Vergleich zu dem iut-A-Gen von ColV-K30 gezeigt. Diese Insertionen bewirken beschränkte Veränderungen des Leserahmens. Die Primärstruktur der Iut-A-Proteine, die durch die aus den verwendeten Stämmen isolierten Plasmide codiert werden, ist aufgrund dieser Tatsache etwas größer (+8 Aminosäuren) als die des Iut-A-Proteins von pColV-K30. Die Sequenz der aus den verwendeten Stämmen isolierten iut-A-Gene codiert ein Polypeptid von 733 Aminosäuren, die ein Signalpeptid von 25 Aminosäuren umfassen, das identisch mit demjenigen des Iut-A-Polypeptids des Stamms ColV-K30 ist. Die berechnete Masse des reifen Proteins beträgt 78097 Dalton, was sich von der auf dem Gel beobachteten Größe (76 kDa) leicht unterscheidet. Die Veränderungen in der Primärstruktur sind jedoch nicht groß genug, um die Sekundärstruktur und das Hydrophilieprofil zu verändern.
2. EXPRESSION DER KLONIERTEN iut-A- UND fepA-KLONE
– Eigenschaften des verwendeten Vektors
Der eingesetzte Expressionsvektor ist das Plasmid GTI 001, das vom Gentechniklabor des Institut Merieux konstruiert wurde.
Die Gene, die es trägt, sowie seine Restriktionskarte sind in der Tabelle IX dargestellt.
Dieses Plasmid kann wie folgt konstruiert werden:
Bei dem Plasmid pBRTac, das aus pBR322 (Bolivar, F., et al., Gene 2, 95–113 (1977)) besteht, das zwischen HindIII und BamHI den Tac-Promotor (Ammann, E., et al., Gene 25, 167 (1983)) propagiert, ist die XhoI-Stelle durch Kleenow-Polymerase (oder "Kleenow") zerstört, so dass das Plasmid pBRTacX^– erhalten wird. Dieses Plasmid wird mit NcoI gespalten, mit Kleenow behandelt, dann mit AvaI gespalten, und sein kleinstes Fragment wird an das Fragment von pMC9 ligiert (Casadaban, M. J., et al., Journal of Bacteriology 143, 971–980 (1980)), das mit MstII gespalten, mit Kleenow behandelt, dann mit AvaI gespalten wurde und das Lac i-Gen und den Replikationsursprung von pBR322 trägt.
Das so erhaltene (als pBRLaciX^– bezeichnete) Plasmid wird mit HindIII gespalten, mit Kleenow behandelt, dann mit PstI gespalten, und das Fragment von 2350 Basenpaaren (oder bp) wird mit dem 2300 bp großen Fragment des mit EcoRI gespaltenen, dann mit Kleenow behandelten, dann mit PstI gespaltenen pBRTac ligiert, wodurch das Plasmid pBRTaci hergestellt wird. Dessen 4406 bp-Fragment, das durch Spaltung mit EcoRI und PstI erhalten wird, wird mit einem EcoRI- und PstIgespaltenen Fragment von 1688 bp ligiert, das von den Sequenzen von pBR322 stammt und das Gen für die Tetrazyklinresistenz von pBR322 trägt.
Das erhaltene Plasmid wird als pBRTaciTet bezeichnet. Dessen Replikationsursprung wird durch Spaltung mit BamHI ab getrennt, und das verbleibende Fragment von 2096 bp wird mit dem 2033 bp-Fragment von mit XhoI gespaltenem pAT153 (Twigg, A. J., & Sherrat, D., Nature 283, 216–218 (1980)) ligiert, wodurch das Plasmid pATTaciOri hergestellt wird.
Dieses Plasmid wird mit EcoRI gespalten, dann mit Kleenow behandelt, dann mit AvaI gespalten, und das Fragment von 2704 bp wird mit einem 3076 bp großen Fragment ligiert, das den Pr-Promotor und seinen thermosensitiven Repressor CI857 des Baktierophagen Lambda trägt und aus pCQV2 (Queen, C., et al., J. Mol. Appl. Genet. 2, 1–10 (1983)) durch Spaltung mit PstI, Behandlung mit Mungbohnen-Nuclease und partielle Spaltung mit AvaI hervorgegangen ist. Das erhaltene Plasmid wird als pGTI001 bezeichnet.
Der Replikationsursprung dieses Plasmids steht unter der Kontrolle des tac-Promotors, wodurch die Kopienzahl mittels Kultivieren der Bakterien in einem Medium, das eine mehr oder weniger große Konzentration an IPTG (Induktor des lac i-Gens) enthält, eingestellt werden kann.
Das zu exprimierende Gen wird unter die Kontrolle des starken "Pr"-Promotors des Phagen CI857 gestellt (dessen Repressor temperatursensitiv ist). Das ATG des zu exprimierenden Gens wird durch das ATG des cro-Gens ersetzt. Dieses ATG wird erzeugt durch partiellen BamHI-Verdau von pGTI001, gefolgt von einer Spaltung mit Mungbohnen-Nuclease, um ein glattes ATG-Ende zu erhalten.
Das zu exprimierende Gen wird anschließend im Leserahmen (ausgehend vom Codon Nr. 2) zwischen das glatte ATG-Ende und die XhoI-Stelle inseriert. Ein Transkriptionsterminationssignal, das sich gerade stromabwärts dieser XhoI-Stelle befindet, verhindert die Bildung von zu langen Boten-RNA.
Weitere Plasmide dieser Art, die das Gen iut A (oder fep A) exprimieren können, lassen sich leicht erhalten oder konstruieren, und man kennt solche Plasmide, in denen das zu exprimierende Gen durch einen Promotor kontrolliert wird, dessen Repressor temperaturempfindlich ist.
– Konstruktion des Expressionsvektors für das iut-A-Gen
Die aus den Stämmen 15972 und 16003 isolierten iut-A-Gene wurden mit ihrer Signalsequenz in die BamHI-Expressionsstelle (899) von pGTI001 kloniert.
Um ein glattes 5'-Ende zu erhalten, das mit der zweiten Aminosäure der Signalsequenz (in diesem Fall Methionin) beginnt, wurde ein doppelsträngiges synthetisches Oligonucleotid verwendet, um den Bereich zwischen dem einleitenden ATG und der einzigen AccI-Stelle, die sich 5' von der codierenden Sequenz befindet, zu ersetzen. Die Sequenz dieses Oligonucleotids ist in der Tabelle X dargestellt.
Die beiden komplementären Stränge dieses Oligonucleotids wurden synthetisiert, und die doppelsträngige Form wurde durch Erhitzen eines äquimolaren Gemisch der beiden Einzelstränge bei 90°C in einem Puffer aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris, 10 mM MgCl, pH 7,5 und langsames Abkühlen auf Umgebungstemperatur erhalten.
Die folgende Strategie zur Insertion des iut-A-Gens des Stamms 15972 (Klon p P-13) ist in der Tabelle XI dargestellt.
Da die Ausbeute nicht sehr zufriedenstellend war, wurde eine modifizierte Strategie angewendet, um das iut-A-Gen des Stamms 16003 in den richtigen Leserahmen zu bringen. Diese neue Strategie verwendet eine Subklonierung der EcoRI-EcoRI-Region der Zwischenkonstruktion (Schritt 4, Tabelle XII) in den Vektor pSB118. Dieser Vektor ist ein Derivat von pUCl8. Er besitzt einen "Polylinker", der von den beiden EcoRI-Stellen eingerahmt ist. Die Subklonierung des EcoRI-EcoRI-Fragments in diesen Vektor ermöglichte so die Klonierung des iut-A-Gens im Leserahmen, wobei die partiellen Spaltungen vermieden wurden (Tabelle XII).
Die nach einer neuen Ligation mit dem doppelsträngigen "iut"-Oligonucleotid erhaltenen Klone wurden im Hinblick auf die Konservierung der AccI-Stelle des iut-A-Gens und das Verschwinden der BamHI-Stelle von pGTI001 selektioniert. Alle Klone, die dieses Restriktionsprofil zeigten, wurden anschließend bezüglich der Expression des Iut-A-Proteins überprüft.
– Überprüfung der Expression von Iut A
Qualitative Überprüfung
Die selektionierten Klone wurden in M9-SP-Tetrazyklin-Medium in Gegenwart von 0,4 mM IPTG bei 32°C (Beginn der Induktion) kultiviert. Die Sensitivität dieser Klone gegenüber Cloacin wurden durch die vorstehend beschriebene Technik untersucht.
Zwei Klone aus 25 waren für die GTI-iut-15972-Konstruktionen positiv.
Drei Klone aus 6 waren für die GTI-iut-16003-Konstruktionen positiv.
Die Cloacin-sensitiven Klone werden in 50 ml M9-SP-Tetrazyklin-Medium kultiviert, das 0,4 mM IPTG enthält.
Die Kultur erfolgt bei einer Temperatur von 30°C, bis die optische Dichte einen Wert von 1 erreicht. Die Induktion der Expression des iut-A-Gens wird dann durchgeführt, indem die Kultur für 4 Stunden bei +42°C fortgesetzt wird. Die Bakterien werden zentrifugiert, und ihre Gesamtproteine werden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Dadurch kann das Ausmaß der Produktion des Iut-A-Proteins direkt abgeschätzt werden (1). Die Analyse der Proteine des Klons CMK 603 GTI p-2 ergab, dass das Iut-A-Protein und sein Vorläufer nach der Induktion 25% der Gesamtproteine des Bakteriums darstellten. Das Iut-A-Protein allein macht 30% der Außenmembranproteine aus.
– Konstruktion des Expressionsvektors für das fep-A-Gen
Merkmale des Ausgangsklons pMS101
Gemäß den Ergebnissen von CODERRE und ERHART (6), die andeuten, dass sich das fep-A-Gen auf einem 6,3 kb großen BamHI-BamHI-Fragment des Plasmids pMS101 befindet, das von LAIRD und YOUNG (19) konstruiert wurde, wurde dieses Fragment in den durch BamHI gespaltenen Vektor pBR322 subkloniert. Es stellte sich heraus, dass die Restriktionskarte des erhaltenen Plasmids (F-1) der des Plasmids pITS (FLEMING et al. (11)) ähnelt (Tabelle XIV).
Die Veröffentlichung der fep-A-Sequenz (LUNDRIGAN und KADNER (22)) ermöglichte eine genaue Lokalisierung dieses Gens auf einem 2530 bp großen SspI-StuI-Restriktionsfragment des Plasmids F-1.
Die folgende Strategie wurde zur Insertion des fep-A-Gens in pGTI001 verwendet.
Eine gerichtete Mutagenese wurde in der 5'-terminalen codierenden Region durchgeführt, um die Sequenz:
5' ATGAACAAG 3'
in eine HpaI-Restriktionsstelle
umzuwandeln.
Diese Stelle wird auf die folgende Weise zu einem stumpfen Ende geschnitten: GTT AA C. Dies ermöglicht eine direkte Ligation des fep-A-Gens mit dem in pGTI001 hergestellten ATG-Ende.
Die Mutagenese wurde gemäß der Technik von ECKSTEIN ausgehend von einem Oligonucleotid (Tabelle XV) nach Subklonierung des 800-bp-SspI-EcoRI-Fragments in die replikative Form des Phagen M13 mp19 durchgeführt.
Das mutierte Fragment wurde vollständig sequenziert, um zu bestätigen, dass die Sequenz nicht an anderer Stelle als der beabsichtigten modifiziert wurde.
Die Bedingungen der Integration des fep-A-Gens sind in den Tabellen XVI und XVII zusammengefasst.
Die verschiedenen Klone, die nach der Ligation des 2350 bp großen HpaI-XhoI-Fragments in das Plasmid GTI001 erhalten wurden, wurden bezüglich des Vorhandenseins eines 1700 bp großen EcoRI-EcoRI-Fragments selektioniert.
– Überprüfung der Expression von Fep A
Qualitative Überprüfung
Das Ligationsgemisch zwischen dem 2350 bp großen HpaI-XhoI-Fragment und dem Plasmid GTI001 diente zur Transformation kompetenter RWB-18-Bakterien. Dieser fep A-Stamm ist resistent gegenüber Colicin B.
Die Klone mit der gesuchten Restriktionskarte (Tabelle XVII) wurden bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber Colicin B getestet.
Ein Klon (RWB 18 GTI F-12) erwies sich als empfindlich gegenüber der Wirkung von Colicin B.
Quantitative Überprüfung
Die Expression des Fep-A-Proteins und seines Vorläufers wurden auf einem SDS-Polyacrylamidgel analysiert (2). Der Klon CMK 603 GTI F-12 exprimiert Fep A und dessen Vorläufer in sehr großer Menge (20% der Gesamtproteine).
Das Fep-A-Protein macht 32% der Proteine der Außenmembran aus.
– Physiologische und morphologische Studie der Iut A und Fep A exprimierenden Klone
Kultivierbarkeit
Die Kultivierbarkeit der erhaltenen Klone wurde bei verschiedenen Kulturtemperaturen in LB-Tetrazyklin-IPTG-Medium getestet.
Alle Klone wurden in einer Schicht auf Gelose-LB-Tetrazyklin-0,1-mM-IPTG angeimpft und bildeten gegenüber Bakteriocinen sensitive Bakterienrasen, wenn sie bei Temperaturen zwischen 30°C und 34°C kultiviert wurden.
Über 34°C bildeten sich keine Bakterienrasen mehr. Dieses Phänomen wurde ebenfalls mit flüssigem LB-Medium beobachtet.
Die Sensitivität gegenüber Bakteriocinen wird für IPTG-Konzentrationen von nur 0,05 mM und bei einer Temperatur von 30°C gefunden. Somit gibt es ein gewisses Expressionsniveau der Gene iut A und fep A in Rbwesenheit der Induktion des pGTI001-Vektors.
Morphologische Untersuchung
Nach der Überexpression von Iut A und Fep A unterliegen die verschiedenen Klone morphologischen Modifikationen.
Die Bakterien, die nach der Induktion bei +42°C für 4 Stunden im optischen Phasenkontrastmikroskop betrachtet wurden, zeigten eine erhebliche Verlängerung (bis zu dem Zehnfachen der mittleren Länge von normalen Escherichia coli K12). Das auffallendste Merkmal ist jedoch das Vorhandensein von einem bis mehreren intracytoplasmatischen Einschlüssen im Inneren jeder Bakterienzelle.
Die im optischen Mikroskop beobachteten Einschlüsse werden bei der Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop nach Negativfärbung von Schnitten der bei +42°C für 4 Stunden kultivierten Bakterien wiedergefunden.
Diese Einschlüsse sind peripher und befinden sich nahe der Innenseite der Cytoplasma-Membran.
3. IMMUNOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN DER PROTEINE Iut A UNF Fep A
– Immunogenität von Iut A und Fep A
Die aus Außenmembranen der E. coli-Stämme 15022, 15393, 16003 und des rekombinanten Escherichia-coli-Stamms CMK 603 GTI P-2 extrahierten Iut-A-Proteine wurden mittels präparativer Polyacrylamidgele isoliert und gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll in Kaninchen injiziert.
Die Entwicklung des Titers der Anti-Iut-A-Antikörper, die von jedem Kaninchen produziert wurden, wurde mithilfe der ELISA-Technik untersucht, indem eine Lösung von "Granula" (präzipitiertem proIut-A-Protein), die aus einer Kultur des E.-coli-Stamms CMK 603 GTI P-2 extrahiert worden waren, als Antigen verwendet wurde.
Das verwendete positive Bezugsserum ist ein gegen das Iut-A-Protein von E. coli ColV-K30 gerichtetes Kaninchenserum, das von B. OUDEGA zur Verfügung gestellt wurde.
Das gleiche Protokoll wurde für die Fep-A-Proteine verwendet, die aus Membranen des Stämme E. coli 15022 und E. coli RWB 18 GTI F12 extrahiert wurden.
In allen Fällen reagierten die Kaninchen auf die Injektion der Proteine Iut A und Fep A mit der Produktion eines erhöhten Titers an spezifisch gegen diese Proteine gerichteten Antikörpern.
– Antigenische Eigenschaften der Proteine Iut A und Fep A
Die Spezifität der verschiedenen erhaltenen Antikörper wurde anhand mehrerer Außenmembranpräparationen (der Stämme E. coli 15022, 15393, CMK 603 GTI P-2, CMK 603 GTI B-5 und RWB 18 GTI F-12) untersucht. Diese Untersuchung erfolgte mithilfe der "Western-Blot"-Technik.
Die vier erzeugten Anti-Iut-A-Seren sowie das Anti-Iut-A-ColV-K30-Bezugsserum erkannten spezifisch ein Protein von 76 kDa in allen Präparationen von Außenmembranen der Stämme, die das Aerobactin-System exprimierten. Gleich welches Iut-A-Protein (Wildtyp oder rekombinant) zu ihrer Induktion gedient hatte, erkannten die Antikörper des gleichen Serums spezifisch das Iut-A-Protein, das von den aus Vögeln oder Rindern stammenden E.-coli-Stämmen exprimiert wurde, und die zwei Iut-A-Proteine, die von den rekombinanten E.-coli-Stämmen CMK 603 GTI P-2 und CMK 603 GTI B-5 produziert wurden.
Der Vorläufer des Iut-A-Proteins, das Protein proIut A, wird ebenfalls spezifisch durch alle Anti-Iut-A-Seren erkannt. (Immunblots wurden mit den gereinigten "Granula" durchgeführt, die von den Stämmen CMK 603 GTI P-2 und CMK 603 GTI B-5 produziert worden waren).
Das Fep-A-Protein wird nicht durch die Anti-Iut-A-Seren erkannt, und umgekehrt erkennen die Anti-Fep-A-Seren nicht die Iut-A-Proteine.
Die Klonierung der Gene iut A und fep A in den Expressionsvektor GTI 001 ermöglicht die Produktion der Proteine Iut A und Fep A sowie deren jeweiliger Vorläufer in großen Mengen. Die Proteine Iut A und Fep A und ihre Vorläufer, die nach der Induktion der Transkription durch Kultur der Bakterien bei 42°C synthetisiert werden, häufen sich schnell in Form großer cytoplasmatischer Einschlüsse (Granula) an, die im optischen Phasenkontrastmikroskop sichtbar sind. Die Betrachtung von Schnitten der induzierten Bakterien im Elektronenmikroskop ergibt, dass diese Granula eng an die Innenseite der Cytoplasma-Membran angeheftet sind.
Man beachte das erhebliche Expressionsniveau der Vorläufer von Iut A und Fep A (durchschnittlich 25% der Gesamtproteine unter nicht optimierten Bedingungen). Die reifen Proteine stellen bis zu 35% des Proteingehalts der Außenmembran dar. Man kann diesen Prozentsatz als die obere Grenze für die Integration dieses Proteintyps in die Außenmembran betrachten. Zum Vergleich sei gesagt, dass die Proteine Iut A und Fep A, die durch den Wildtypstamm Escherichia coli 15022 exprimiert werden, zusammen 30% der Proteine der Außenmembran ausmachen. Somit ist anscheinend die Gesamtexpression der Proteine Iut A und Fep A und ihrer Vorläufer durch erfindungsgemäße rekombinante Stämme viel höher als die natürliche Expression.
Der Nachweis einer Sensitivität gegenüber Cloacin DF 13 der Klone, die das Iut-A-Protein exprimieren, und einer Sensitivität gegenüber Colicin B bei denjenigen, die das Protein Fep A exprimieren, zeigt, dass die Synthese und die Integration dieser Proteine in die Außenmembran normal verläuft.
Die Identität der durch genetische Rekombination erhaltenen Proteine mit den Wildtypproteinen wird ebenfalls durch die Erkennung dieser Proteine durch Antikörper demonstriert, die gegen die nativen Iut-A- und Fep-A-Proteine gerichtet sind. Man beachte, dass diese Antikörper mit der gleichen Spezifität auch die Vorläufer proIut A und proFep A erkennen, die in den intracytoplasmatischen Einschlüssen ausgefällt wurden.
Die Antikörper, die durch die mittels genetischer Rekombination erhaltenen Proteine Iut A und Fep A induziert werden, erkennen auf die gleiche Weise spezifisch die Proteine Iut A und Fep A, die von verschiedenen pathogenen Escherichia-coli-Stämmen exprimiert werden.
Die Überexpression der Rezeptoren Iut A und Fep A mittels Klonierung ihrer Gene in einen Expressionsvektor ermöglicht es, in einem Eisen-reichen Medium Proteine der Außenmembran zu erhalten, die funktionell und antigenisch identisch mit den Proteinen sind, die von den pathogenen Bakterien im Verlauf ihrer Vermehrung in vivo exprimiert werden.
Die Synthese der Proteine Iut A und Fep A durch genetische Rekombination liefert somit zahlreiche Vorteile:

– Sie ermöglicht es, die Proteine Iut A und Fep A in sehr großer Menge völlig unabhängig von der Regulation durch Eisen zu erhalten,
– die synthetisierten Proteine sind funktionell und antigenisch identisch mit den Proteinen, die von den pathogenen Bakterien im Verlauf ihrer Vermehrung in vivo exprimiert werden, und induzieren die Bildung von Antikörpern,
– als Wirkstoff in einem Impfstoff eingesetzt, induzieren sie die Bildung von Antikörpern, welche die spezifische Erkennung durch die Siderophore, die durch Eisen regulierten Membranproteine, verhindern und gleichzeitig die Versorgung mit Eisen unterbrechen und ihre Vermehrung im Wirt blockieren; als solche ermöglichen sie somit die Herstellung von Impfstoffen, die zur Vorbeugung oder Bekämpfung von Infektionen, einschließlich Septikämien, gut geeignet sind.

Die Impfstoffe lassen sich außerdem ausgehend von inaktiven rekombinanten Klonen oder ausgehend von Membranfragmenten, die durch Lyse der rekombinanten Klone erhalten werden, nach einer Reinigung gemäß den üblichen Techniken zur Herstellung von Impfstoffen auf der Grundlage von Oberflächen- oder Zellwandantigenen einfach herstellen.
IV. HERSTELLUNG VON IROMP DURCH KULTUR IN EINEM MEDIUM MIT BESCHRÄNKTEM EISENGEHALT
1) Stamm: E. coli 078 Bezug 15022:
Ursprung Hühnchen
2) Kultur:
– Medium
ST-Medium + Succinat (Simon, E. H., und Tessman (1963) Proc. Natl. Acad. Sci USA 50, 526–532)
Zugabe von Lactoferrin (250 μg/ml) um ein Eisenmangelmedium zu erhalten,
oder Zugabe von FeCl₂, 6 H₂O (40 μM), um ein Eisenreiches Medium zu erhalten.
– Kultur:

– Drei Passagen des Stamms in Eisen-reichem Medium, gefolgt von einer Passage zur Adaptation in Mangelmedium vor der endgültigen Kultur in Mangelmedium,
– parallel wird eine Kultur des gleichen Stamms in einem Eisen-reichen Medium vorgenommen,
– die Kulturen werden 24 Stunden bei 37°C gehalten.

3) Analyse:
Bei Beendigung der Kultur in jedem Medium werden die folgenden Arbeitsschritte durchgeführt:

– Gewinnung mittels Zentrifugation,
– Gewinnung des Sediments in 0,2 M Tris-HCl, pH 8, und Ultraschallbehandlung,
– Zentrifugation (30 Minuten 5000 × g),
– Überstand erneut zentrifugiert (1 Stunde, 100000 × g),
– Aufnehmen des Sediments in Tris-HCl (50 mM, pH 8), MgCl₂ (10 mM), 1 mM EDTA, Triton X-100 (2%) und Schütteln für 20 Minuten bei 37°C,
– Zentrifugation für 1 Stunde bei 100000 × g und dann Reextraktion des Sediments,
– Waschen des Sediments in entmineralisiertem Wasser,
– Analyse des Sediments auf einem Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) unter denaturierenden Bedingungen (Mercaptoethanol, SDS).

4) Ehrgebnis:

– Membranen der in Gegenwart von Lactoferrin kultivierten Bakterien: Vorhandensein von zwei Proteinen in erheblicher Menge mit einem apparenten Molekulargewicht von 80000 Da (Enterobactinrezeptor Fep A) und 76000 (Aerobactinrezeptor Iut A),
– Membranen von Bakterien, die in einem Eisen-reichen Medium kultiviert wurden: Fehlen der Banden von 76000 und 80000 Da.

V. HERSTELLUNG VON IMPFSTOFFEN
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in den Impfstoffen in Verbindung mit antigenischen Zubereitungen verwendet, die in den bekannten menschlichen oder veterinärmedizinischen antibakteriellen Impfstoffen üblich sind, und dies insbesondere, wenn gereinigte Proteine verwendet werden.
Diese Impfstoffe können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in den flüssigen Vehikeln enthalten, die zur Verabreichung auf parenteralem Weg üblich sind. Sie können herkömmliche, beispielsweise ölhaltige, Adjuvantien umfassen.
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TABELLE I
TABELLE II
TABELLE III
TABELLE IV
TABELLE V
TABELLE VI
TABELLE VII
TABELLE VII (Fortsetzg.)
TABELLE VII (Fortsetzg.)
TABELLE VII (Fortsetzg.)
TABELLE VIII
TABELLE IX
TABELLE X
TABELLE XI
TABELLE XII
TABELLE XIII
TABELLE XIV
TABELLE XV
TABELLE XVI
TABELLE XVII

Claims

Verwendung von (a) ganzen Bakterien, die durch Kultur in einem Medium erhalten werden, in dem der Gehalt an Eisen genügend verringert wird, dass man eine erhöhte Expression von Außenmembranproteinen erhalten kann, die durch Eisen reguliert werden und von denen bestimmte Rezeptoren für Siderophore oder Transferrine sind, oder (b) Fragmenten dieser Bakterien, wobei diese Fragmente Rezeptorproteine für Transferrine oder Siderophore beinhalten, wie insbesondere das Protein IutA und/oder FepA und/oder deren Vorläufer proIutA und/oder proFepA, oder (c) Rezeptorproteinen für Transferrine oder Siderophore und insbesondere die Proteine IutA und/oder FepA, die aus Bakterien extrahiert sind, als Wirkstoff zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, die eine Immunisierung gegen Septikämiebakterien ermöglicht.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien aus der Gruppe stammen, die von den Enterobakterien der Familien Escherichia coli, Klebsiella, Salmonella typhimurium, Shigella gebildet wird.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Bakterien ausgeschiedenen Siderophore Aerobactin- und/oder Enterobactin-Siderophore sind.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die exprimierten Proteine die Proteine IutA und/oder FepA sind.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ganzen Bakterien Bakterien sind, die durch Kul tur in einem Medium erhalten werden, in dem der Gehalt an Eisen mit einem Eisen stark chelatisierenden Protein, wie einem Lactoferrin, verringert wird, wobei das Eisen stark chelatisierende Protein in einer Konzentration von mindestens 250 μg/ml vorliegt.