DE69736000T2

DE69736000T2 - Identifizierung und klonierung eines mycobakterien antigens der einer heparin-bindenden hemaglutinin entspricht

Info

Publication number: DE69736000T2
Application number: DE69736000T
Authority: DE
Inventors: Franco Menozzi; Camille Locht
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2017-05-21
Also published as: ATE328085T1; WO1997044463A3; DE69736000D1; ES2267142T3; AU3036297A; DK0914437T3; FR2748748A1; EP0914437B1; WO1997044463A2; EP0914437A2; FR2748748B1; PT914437E

Description

Die Erfindung betrifft Peptidsequenzen, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen, insbesondere an Epithelzellen, ermöglichen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein mycobakterielles Antigen vom Typ Heparin-bindendes Hämagglutinin (HBHA), das ausgehend von Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium tuberculosis erhalten wird. Die Erfindung betrifft auch eine rekombinante Peptidsequenz, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen ermöglicht. Die Erfindung betrifft insbesondere das Expressionsprodukt eines Escherichia coli-Stammes, der mit einer Nucleotidsequenz transformiert wurde, die ein Protein codiert, das das Anheften von Mycobakterien an diese Wirtszellen ermöglicht. Diese Polypeptide können in immunogenen Zusammensetzungen, zur Herstellung von Impfstoffen gegen mycobakterielle Infektionen und zur serologischen Diagnose von mycobakteriellen Infektionen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Nucleotidsequenz, die eine Peptidsequenz codiert, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen ermöglicht, und genauer gesagt eine Nucleotidsequenz, die ein mycobakterielles Antigen vom Typ Heparin-bindendes Hämagglutinin (HBHA) codiert. Die Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren, die die Nucleotidsequenz umfassen, sowie die Verwendung dieser Vektoren, um rekombinante Wirtszellen zu erhalten, die für die Therapie, insbesondere für die Anti-Krebstherapie, verwendet werden können.
Die Mycobakterien sind unter den pathogenen Mikroorganismen die Wichtigsten, die sowohl beim Menschen als auch beim Tier Krankheiten verursachen. Die mycobakteriellen Infektionen sind weltweit immer unter den Hauptursachen für Todesfälle. Die menschliche Tuberkulose, die durch Mycobacterium tuberculosis verursacht wird, führt alleine zu etwa 3 Millionen Toten jährlich (1,2). Mycobcterium bovis verursacht die Tuberkulose bei Rindern, aber es ist auch für den Menschen sehr virulent. Lepra, die von Mycobacterium leprae verursacht wird, stellt nach wie vor ein Hauptproblem für die Gesundheit dar, das in den Entwicklungsländern nicht gelöst ist (3).
Die Infektionen durch die Mitglieder des Komplexes Mycobacterium avium-intracellulare verursachen Krankheiten bei Vögeln und Schweinen und sind die häufigsten der opportunistischen Infektionen, die man bei den Patienten findet, die am erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) leiden (4,5). Außerdem unterstreichen das jüngste dramatische Wiederauftreten der Tuberkulose in den Entwicklungsländern sowie das Auftreten und die Verbreitung von M. tuberculosis-Stämmen, die gegen Medikamente resistent sind (6), die Schwierigkeit, die mycobakteriellen Krankheiten zu kontrollieren.
Die molekulare Charakterisierung der verschiedenen Phasen in der Pathogenese der mycobakteriellen Krankheiten ist für die Entwicklung vernünftiger und gegen diese Krankheiten optimierter Therapie- und Entwicklungsansätze grundlegend. Die Virulenzfaktoren sind häufig gute Antigene, die als Kandidaten-Impfstoffe genutzt werden können. Trotz der Bedeutung der mycobakteriellen Infektionen weiß man wenig über die Tatsachen in Bezug auf die grundlegenden molekularen Mechanismen, die an ihrer Pathogenese beteiligt sind (7).
Ein Protein mit 28 kDa wurde früher aus Gesamtzellextrakt, aus Membranpräparationen oder Kulturüberständen von Mycobakterien isoliert (21,22). Man hat in denselben Publikationen gezeigt, dass dieses Protein die Erythrocyten agglutinieren oder die Mycobakterien auto-agglutinieren konnte. Die Analysen durch Immuno-Blotverfahren mit Hilfe polyclonaler und monoclonaler Antikörper haben gezeigt, dass sich dieses Protein von den Proteinen des Antigenkomplexes 85 unterscheidet und daher ein neues Protein darstellt. Menozzi et al. beschreiben die Identifizierung eines Proteins, das als HBHA bezeichnet wird, und haben gezeigt, dass anti-HBHA-Antikörper in der Lage waren, die Bindung von Mycobakterien an Epithelzellen zu hemmen (23). Dagegen wird in keinem dieser Dokumente über ein Antigen oder ein rekombinantes Polypeptid berichtet, das den C-terminalen Teil von HBHA oder Teile dieses C-terminalen Teils ausmacht.
Eines der ersten und wichtigen Ereignisse in der bakteriellen Pathogenese ist die Anheftung des Mikroorganismus an dessen Zielgewebe. Die Mycobakterien zeigen einen Tropismus für die Lungenmakrophagen (8). Jedoch sind, insoweit als diese Mikroorganismen leicht durch Aerosol übertragen werden, die ersten Strukturen des Wirtes, auf die sie im Verlauf der Infektion treffen, diejenigen des respiratorischen Epithels. Folglich können die Interaktionen mit den epithelialen Zellen oder mit der extrazellulären Matrix (EZM) während der Anfangs- und weiteren Phasen der Pathogenese wichtig sein (9), obwohl die Untersuchungen daran noch nicht vorangetrieben wurden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein neues mycobakterielles Antigen erhalten, das an der Anheftung von Mycobakterien an Wirtszellen vom epithelialen Typ beteiligt ist. Es handelt sich um den C-terminalen Teil eines Heparin-bindenden Hämagglutinins (heparin binding hemagglutinin oder HBHA) mit 28 kDa, das ausgehend von Kulturüberständen und Zellwandpräparationen von Mycobacterium bovis BCG und von Mycobacterium tuberculosis erhalten wurde. Ausgehend von diesem C-terminalen Teil konnten die Erfinder die Entwicklung einer Reihe von Polypeptiden bewerten und vorschlagen, die zur Diagnose, Therapie und Prophylaxe verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft daher eine Peptidsequenz, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen, insbesondere an epitheliale Zellen ermöglicht. Genauer gesagt ist die erfindungsgemäße Peptidsequenz dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein mycobakterielles Antigen vom Typ Heparin-bindendes Hämagglutinin (HBHA) handelt, insbesondere um ein Antigen, das ausgehend von Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium tuberculosis erhalten wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Peptidsequenz dadurch gekennzeichnet, dass sie aus dem C-terminalen Teil der Sequenz besteht, die der Sequenz von 10 entspricht.
Im gesamten Text verkörpert der Begriff Polypeptidsequenz oder Polypeptid die ganze oder einen Teil der Sequenz von 10, die die DNA selbst und das Protein HBHA als solches darstellt. Der Begriff „Protein" bezeichnet de facto die vollständige modifizierte oder nicht-modifizierte Polypeptidsequenz.
Vorzugsweise betrifft die Erfindung insbesondere eine Polypeptidsequenz, die aus einer Region besteht, die an den Interaktionen mit den sulfathaltigen Glycokonjugaten und an der Bindung an Heparin beteiligt ist.
Diese Peptidsequenz ist die Folgende:
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
Die Erfindung betrifft daher eine Peptidsequenz, die aus dem C-terminalen Teil der Sequenz von 10 besteht, und insbesondere die Sequenzen, die etwa die 30 bis 50 letzten Aminosäuren des C-terminalen Teils der Sequenz von 10 umfassen. Diese Region der Sequenz von 10 ist an der Interaktion des Proteins mit Heparin beteiligt, obwohl eine kürzere Sequenz, insbesondere von etwa 10 bis 20 Aminosäuren, ausreichend sein kann.
Die Erfinder haben auch die Nucleotidsequenz, die die erfindungsgemäße Peptidsequenz codiert, in E. coli exprimiert. Das erhaltene Polypeptid weist ein geringeres Molekulargewicht auf als das des Proteins, das gereinigt wurde ausgehend von M. bovis BCG oder M. tuberculosis. Diese Unterschiede sind das Ergebnis posttranslationaler Modifikationen, die in E. coli nicht erfolgen.
Die Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante Peptidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen ermöglicht. Genauer gesagt ist die rekombinante Sequenz der vorliegenden Erfindung ein Expressionsprodukt einer Nucleotidsequenz, die eine Peptidsequenz codiert, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen ermöglicht, und insbesondere eine Antigensequenz, die ausgehend von M. bovis BCG oder M. tuberculosis erhalten wird, wobei die rekombinante Sequenz beispielsweise das Expressionsprodukt eines mit einer geeigneten Nucleotidsequenz transformierten E. coli-Stammes ist.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer der vorstehend beschrieben Peptidsequenzen, die rekombinant ist oder nicht, und insbesondere in ihrer nativen Form, zur serologischen Diagnose auf das Vorhandensein von Mycobakterien. Die Erfindung betrifft auch eine immunogene Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine der vorstehend beschriebenen Peptidsequenzen enthält, sowie die Verwendung dieser Peptidsequenz zur Herstellung von Impfstoffen gegen die mycobakteriellen Infektionen, insbesondere die Infektionen, die durch M. bovis BCG oder M. tuberculosis verursacht werden.
Die Erfinder haben auch gefunden, dass die Anheftung von Mycobakterien an Epithelzellen durch sulfathaltige Kohlenhydrate spezifisch gehemmt werden konnte. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines sulfathaltigen Kohlenhydrats, um die Anheftung von Mycobakterien an epitheliale Zellen zu hemmen. Die besonders interessanten sulfathaltigen Kohlenhydrate umfassen Heparin, Chondroitinsulfat und Dextransulfat sowie deren synthetische Derivate.
Die Erfinder haben auch das gesamte Gen, das HBHA codiert, von der DNA von M. bovis BCG isoliert. Die Erfindung betrifft daher auch eine Nucleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Peptidsequenz codiert, die die Anheftung von Mycobakterien an Wirtszellen ermöglicht. Insbesondere codiert die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz für ein mycobakterielles Antigen vom Typ Heparin-bindendes Hämagglutinin (HBHA), insbesondere den C-terminalen Teil der Sequenz von 10.
Die Erfindung betrifft auch eine rekombinante Wirtszelle, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie in ihrem Genom eine der vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen umfasst. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die rekombinante Wirtszelle BCG, jedoch nicht darauf eingeschränkt, für die Expressionsvektoren entwickelt wurden, die direkt zur Entwicklung von BCG-Rekombinanten verwendbar sind, die beim Menschen oder Tier verwendet werden können.
BCG wird für die Therapie, genauer gesagt für die Anti-Krebstherapie und insbesondere gegen Oberflächenkrebs der Blase verwendet. Bei dieser Art der therapeutischen Anwendung scheint eine Korrelation zwischen der Anheftungsfähigkeit von BCG und seinem antitumoralen Vermögen zu existieren. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Identifizierung von HBHA und die Clonierung seines Gens eine Erhöhung der Anheftungskapazität über eine Überexpression des HBHA codierenden Gens.
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung erfolgt unter Bezugnahme auf folgende Figuren:
1 zeigt die Auswirkung von sulfathaltigen und nicht-sulfathaltigen Kohlenhydraten auf die mycobakterielle Anheftung an CHO-Zellen und an Makrophagen;
2 zeigt die Daten, die die Reinigung eines Heparin-bindenden Proteins von M. bovis BCG zeigen;
3 zeigt einen Vergleich des Heparin-bindenden Proteins von M. bovis mit dem Antigenkomplex 85;
4 zeigt die Auswirkung der sulfathaltigen und nicht-sulfathaltigen Kohlenhydrate auf die durch HBHA induzierte Hämagglutination;
5 zeigt die Hemmung der Anheftung von BCG an CHO-Zellen durch anti-HBHA-Antikörper;
6 zeigt Immuno-Blot-Analysen, die mit Tuberkulose-Antiserum durchgeführt wurden;
7 zeigt die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz eines HBHA-Fragments, das von einem PCR-Fragment der chromosomalen DNA von BCG abgeleitet wurde;
8 zeigt eine Southern-Blot-Analyse der chromosomalen DNA von BCG;
9 zeigt die Sequenzierstrategie des HBHA codierenden Gens;
10 zeigt die DNA-Sequenz des HBHA codierenden Gens von BCG;
11 zeigt die Polyacrylamidgelelektrophorese-Analyse und die Immuno-Blot-Analyse der Expression von HBHA in E. coli.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Hemmung der mycobakteriellen Anheftung an Epithelzellen durch sulfathaltige Kohlenhydrate.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von sulfathaltigen Kohlenhydraten, um die Anheftung von Mycobakterien an epitheliale Zellen zu hemmen. Um zu zeigen, dass die Mycobakterien durch die Vermittlung von sulfathaltigen Kohlenhydraten anheften können, haben die Erfinder getestet, ob lösliche sulfathaltige Polysaccharide in der Lage sind, die Anheftung von M. bovis BCG an epitheliale Zellen zu hemmen.
M. bovis (BCG) (Stamm 1173P2, OMS, Stockholm, Schweden, Passagen 3 bis 8) wurde im exponentiellen Wachstum markiert, indem die Mycobakterien drei Tage in Sauton-Medium, enthaltend 5 μCi/ml [6-³H]Uracil (New England Nuclear, 24 Ci/mMol), gezüchtet wurden. Die Mycobakterien wurden dann durch Zentrifugation (5 Min bei 3000 × g) gesammelt, zweimal mit Dulbecco phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) gewaschen und in RPMI 1640-Kulturmedium, enthaltend 300 mg/l L-Glutamin (GIBCO) ohne fötales Kälberserum (RPMI), resuspendiert.
Am Vortag des Anheftungstests wurden die Vertiefungen der Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (Nunclon, Nunc, Dänemark) mit 10⁵ frisch gezüchteten chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO) (vgl. 1A und 1B, graue Balken), oder Makrophagen J774A.1 (ATCC TIB67) angeimpft (vgl. 1B, schwarze Balken), die in 2 ml RPMI resuspendiert wurden, dem 10 Vol./Vol.% dekomplementiertes fötales Kälberserum (RPMI-SVF) zugegeben wurde. Kurz vor dem Test wurden die Zellen dreimal mit 2 ml RPMI gewaschen und jeder Vertiefung wurde 1 ml Mycobakterien-Suspension in RPMI zugegeben, um eine Infektionsmultiplizität von 10 Bakterien pro eukaryontischer Zelle zu erhalten.
Der Anheftungstest wurde in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen von D(+)-Galaktose- (Sigma) (vgl. 1A, schwarze Kreise) oder Heparin der Schweine-Darmschleimhaut (M_r 6 kDa, Sigma) (vgl. 1A, weisse Kreise) oder mit 20 μg/ml der angegebenen Kohlenhydrate (Sigma) (vgl. 1B) durchgeführt. Nach 6-stündiger Inkubation bei 37°C in einer Atmosphäre, enthaltend 5% CO₂, wurden die Zellen dreimal mit 2 ml DPBS gewaschen und anschließend durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser, enthaltend 0,1 % (Gew./Vol.%) Natriumdesoxycholat lysiert. Die mit den Zelllysaten assoziierte Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers (Beckman, Modell LS 6000SC) gezählt. Die restliche Anheftung wird in prozentualen radioaktiven Counts pro Minute gegenüber den Counts, die in Abwesenheit von Kohlenhydraten erhalten werden, ausgedrückt. Die Daten der 1A und 1B zeigen die Mittelwerte der vierfach durchgeführten Versuche, und die Fehlerbalken der Standardabweichung sind dargestellt.
Wie 1A zeigt, hemmten schwache Heparinkonzentrationen deutlich die Anheftung von mit [³H]Uracil markiertem BCG an CHO-Zellen, während Galaktose bis 100 μg/ml keine signifikante Auswirkung hatte. Dextransulfat, Fucoidan und Chondroitinsulfat konnten die Anheftung verringern, aber es konnte sogar bei stärkeren getesteten Konzentrationen (1 mg/ml) keine signifikante Hemmung mit Mannose oder nicht-sulfathaltigem Dextran beobachtet werden.
Diese Ergebnisse führen dazu, vorzuschlagen, dass die Mycobakterien auf ihrer Oberfläche ein Hauptadhäsin zur Bindung von sulfathaltigen Kohlenhydraten besitzen. Jedoch sind, da die Hemmung der Anheftung 70% nicht überschritten hat, wahrscheinlich andere Komponenten an diesem Vorgang beteiligt.
Interessanterweise werden die Interaktionen von BCG mit den Makrophagen J774A.1 weder durch die sulfathaltigen Kohlenhydrate noch durch die nicht-sulfathaltigen Zucker (1B), sogar bei Konzentrationen bis zu 1 mg/ml, betroffen (Ergebnisse nicht dargestellt). Dies stimmt mit vorherigen Berichten überein, die die Komplement-Rezeptoren CR1, CR3 und CR4 als mycobakterielle Liganden auf der Oberfläche von Blut-Monocyten und Lungen-Makrophagen (10-12) in Frage stellen.
Reinigung eines Heparin-bindenden Proteins, das bei M. bovis (BCG) und M. tuberculosis vorhanden ist.
Die Erfindung betrifft eine Peptidsequenz, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen zulässt. Die Hemmung der Anheftung von BCG an epitheliale Zellen durch sulfathaltige Zucker legt nahe, dass die Mycobakterien ein Adhäsin exprimieren, das mit sulfathaltigen Glycokonjugaten, wie sulfathaltigen Glycoproteinen oder Glycolipiden interagiert, die auf der Oberfläche der Wirtszellen vorliegen. Um die fraglichen Adhäsine zu identifizieren, wurden Kulturüberstände von BCG durch Chromatographie über Heparin-Sepharose fraktioniert.
M. bovis BCG wurde in statischen Kulturen bei 37°C in 175 cm²-Roux-Fläschchen (Falcon, Becton-Dickinson), enthaltend etwa 150 ml Sauton-Medium, gezüchtet. In der stationären Phase wurden die Kulturen zentrifugiert (20 Minuten bei 10.000 × g), und 500 ml Überstand wurden auf eine mit DPBS äquilibrierte Heparin-Sepharose CL-6B-Säule (1 × 5 cm) (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde dann mit 100 ml DPBS gewaschen und die zurückgehaltenen Moleküle wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten 0-500 mM in 100 ml DPBS eluiert. Der Durchfluss während aller Phasen wurde bei 1,5 ml/min aufrechterhalten und die Absorption des Eluats, das in 1 ml-Fraktionen gesammelt wurde, bei 280 nm kontinuierlich verfolgt. Diese Fraktionen wurden durch SDS-PAGE (13) unter Verwendung eines 12%-igen Gels analysiert, gefolgt von einer Färbung in Coomassie R-250 Brilliantblau.
Die nach Beginn des Gradienten analysierten Fraktionen sind in den Spuren 1-8 von 2 gezeigt. Die rechten Spuren zeigen das Heparin-bindende Protein, das ausgehend von einer Zellwand-Präparation von M. bovis BCG gereinigt wurde.
Die M_r-Größenmarker, die in kDa ausgedrückt sind, sind am rechten Rand angegeben.
Wie 2 zeigt, wird ein einziges Protein mit 28 kDa bei etwa 350 mM NaCl eluiert. Die Interaktion zwischen diesem Protein und Heparin ist vom Sulfatgehalt des Zuckers abhängig, denn dieses konnte auch unter Verwendung von Dextransulfat-Kügelchen, jedoch nicht von Dextran-Kügelchen gereinigt werden (nicht dargestellt). Dasselbe Heparin-bindende Protein wurde auch aus Filtraten von M. tuberculosis-Kulturen gereinigt.
Das Erhalten von zwei ähnlichen Heparin-bindenden Proteinen aus zwei unterschiedlichen Mycobakterien-Stämmen bestätigt, dass Proteine dieser Art in den meisten pathogenen Mycobakterien-Stämmen vorhanden sind. Prozentuale Homologien, die unter 100% liegen, können zu strukturellen Unterschieden führen, obwohl die grundlegenden Eigenschaften dieser Proteine nicht betroffen sind. Die Erfindung betrifft daher auch die Heparin-bindenden Proteine mit einer Struktur, die der des isolierten Proteins ähnlich ist, und die ausgehend von ihren Anheftungseigenschaften an sulfathaltige Kohlenhydrate erhalten werden können. Diese Proteine können sich vom erfindungsgemäßen Protein durch Additionen, Substitutionen und Deletionen von Aminosäuren unterscheiden, ohne dass dies im Wesentlichen ihre Anheftungseigenschaften an epitheliale Zellen beeinträchtigt.
Die Lokalisierung auf der Zelloberfläche des Heparin-bindenden Mycobakterien-Proteins.
Um zu bestimmen, ob dieses Protein ein streng sekretiertes Protein ist oder ob es an der mycobakteriellen Oberfläche assoziiert sein kann, wurden Fraktionen von Zellwänden ausgehend von BCG hergestellt, dann einer Chromatographie über Heparin-Sepharose unterzogen.
Zur Herstellung der Zellwände wurden die Mycobakterien in 2 Liter Sauton-Medium oder auch in synthestischem Long-Medium (Quality Biological Inc., Gaithersburg, MD) 12 bis 14 Tage gezüchtet. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation gesammelt, einmal in DPBS, enthaltend 0,05 % (Vol./Vol.%) Tween 80 (DPBS/Tw), gewaschen, in 100 ml DPBS/Tw resuspendiert und 1 Stunde auf 80°C erhitzt. Die Bakterien wurden 20 min bei 13.000 × g zentrifugiert, mit DPBS/Tw gewaschen, in 25 ml DPBS/Tw, enthaltend 5 mM Proteaseinhibitor AEBSF, RNase A und DNase I, resuspendiert, einem 25-minütigem intermittierendem Ultraschall unterzogen, dann 20 min bei 13.000 × g zentrifugiert. Dieser Schritt wurde wiederholt, und die Überstände wurden vereinigt und 3 Stunden bei 34.000 × g bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand 1:2 in DPBS verdünnt und einer Chromatographie über Heparin-Sepharose CL-6B unterzogen.
Wie 2 zeigt, war das Heparin-bindende Protein mit 28 kDa auch in diesen Präparationen vorhanden, was bestätigt, dass es an die Oberfläche assoziiert ist. Es war auch in Zellwandfraktionen von M. tuberculosis und von M. tuberculosis stammenden Tuberkulin-Präparationen (von Protein stammendes gereinigtes Antigen für die Hautreaktion) vorhanden.
Hämagglutinationsaktivität des Heparin-bindenden mycobakteriellen Proteins.
Die Kapazität bakterieller Adhäsine, die roten Blutkörperchen zu agglutinieren, wird häufig als Modell verwendet, um die mikrobielle Bindung nach Art der Lektine an den Rezeptor eukaryontischer Zellen zu untersuchen. Die Erfinder haben folglich das gereinigte Heparin-bindende Protein auf seine Kapazität, Erythrocyten zu agglutinieren, getestet.
Die Hämagglutinationsaktivität des Heparin-bindenden Proteins, das aus Kulturüberständen gereinigt wurde, wurde in U-Mikrotiterplatten (Falcon) in Abwesenheit oder Gegenwart von Heparin (4, schwarze Quadrate) der Schweine-Darmschleimhaut, von Dextransulfat (4, schwarze Kreise) oder von Dextran (4, weiße Kreise) in Konzentrationen im Bereich von 0 bis 50 μg/ml dosiert. Die Standardtests enthielten 70 μl einer frischen in DPBS hergestellten Kaninchen-Erythrocytensuspension und 70 μl gereinigtes HBHA, entsprechend 1 μg Protein. Die Hämagglutinationstiter wurden nach 5-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur abgelesen. Die Daten stellen die Mittelwerte der vierfach angesetzten Versuche dar, und die Fehlerbalken der Standardabweichung sind dargestellt.
Weniger als 0,1 μg gereinigtes Protein konnte die Hämagglutination der Kaninchen-Erythrocyten, aber nicht der menschlichen, Schaf-, Gans- oder Hühner-Erythrocyten induzieren (Daten nicht dargestellt). Daher haben die Erfinder dieses Protein als ein Heparin-bindendes Hämagglutinin (HBHA) bezeichnet. Die durch HBHA induzierte Hämagglutination wurde durch Heparin oder Dextransulfat gehemmt, jedoch nicht durch Dextran (vgl. 4), was den beim Anheftungstest der Mycobakterien an die CHO-Zellen erhaltenen Ergebnissen ähnelt. Die Hämagglutinationsaktivität ist insofern wärmeempfindlich, als dass die 60-minütige Inkubation der Proteine bei 80°C die Hämagglutination aufhebt.
Hemmung der von der auf die Vermittlung durch HBHA zurückzuführenden Hämagglutinationsaktivitäten und der Anheftung durch spezifische polyclonale und monoclonale Antikörper.
Da einerseits die mycobakterielle Anheftung an epitheliale Zellen durch sulfathaltige Kohlenhydrate gehemmt wird und andererseits ein Protein mit 28 kDa durch Chromatographie auf Heparin-Sepharose gereinigt wurde, war es wichtig zu etablieren, ob die mycobakterielle Anheftung auf die Vermittlung durch HBHA zurückzuführen ist.
Infolgedessen wurden polyclonale Ratten-anti-HBHA-Antikörper folgendermaßen hergestellt: 200 μg gereinigtes BCG-HBHA wurden einer präparativen Elektrophorese auf einem 15%-igen Polyacryamidgel in Gegenwart von SDS unterzogen, dann auf eine Nitrocellulosemembran elektrotransferiert. Nach der Schnellfärbung mit Ponceau-Rot wurden die HBHA entsprechenden Banden vorsichtig ausgeschnitten, in kleine quadratische Stücke zerschnitten und kurz in 1,5 ml sterilem PBS einem Ultraschall unterzogen. Nach Zugabe von 1 ml einer Monophosphoryl-Lipid A-Lösung (MPL + Système Adjuvant TDM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), hergestellt nach der Empfehlung des Herstellers, wurden zwei Fischer-Ratten jeweils mit 1 ml der Antigensuspension immunisiert. Für jede Immunisierung wurden 400 μl auf intraperitonealem Weg und zweimal 300 μl auf subkutanem Weg verabreicht. Die Tiere erhielten auf dieselbe Weise mit derselben Antigenmenge einen Monat später Auffrischungen und das Serum wurde 3 Wochen nach der Auffrischung gewonnen.
BCG wurde mit [6-³H]Uracil, wie vorstehend beschrieben, markiert. Etwa 4 × 10⁶ radiomarkierte BCG-Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert und mit den angegebenen Volumen aus Aszitesflüssigkeit mit dem monoclonalen anti-HBHA-Antikörper 3921E4 (14) (5, Tafel A) oder mit 250 μl polyconalem Antiserum von Ratten-anti-HBHA (Immunserum, 5, Tafel B) oder blankem Serum (5, Kontrollserum, Tafel B) 30 min bei Raumtemperatur vorinkubiert. Die Bakteriensuspensionen wurden dann zweimal mit 2 ml DPBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, dann im Anheftungstest mit CHO-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität von 10 verwendet, wie vorstehend beschrieben.
Wie 5 zeigt, wurde die Anheftung von BCG an CHO-Zellen auf dosisabhängige Weise durch das Vorliegen von anti-HBHA-Antikörpern deutlich gehemmt. Die Aszitesflüssigkeiten, die nicht relevante monoclonale Antikörper enthalten, oder blanke Antiseren, hatten keinen Effekt. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Anheftung der Mycobakterien an epitheliale Zellen teilweise auf die Vermittlung durch HBHA zurückzuführen ist.
Untersuchung der Eigenschaften von HBHA.
Da die Größe dieses Proteins nahe bei derjenigen der Fibronectin-bindenden Proteine des Antigenkomplexes 85 liegt (15), wurden Western-Blot-Analysen angewendet, um zu bestimmen, ob sie verwandt sind.
Das aus einer Zellwandpräparation von M. bovis BCG (3, Spuren 1) oder aus Kulturüberstand (Spuren 2) gereinigte Heparin-bindende Protein wurde mit dem gereinigten Antigenkomplex 85 (Spuren 3) durch Immuno-Blot-Analyse (Felder A, B, C) und Coomassie-Blau-Färbung (Feld D) nach SDS-PAGE verglichen. Die Immuno-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von gegen das Heparin-bindende Protein gerichteten, polyclonalen Antikörpern (Feld A), des monoclonalen Antikörpers 4057D2 (Feld B), oder von gegen den Antigenkomplex 85 gerichteten, polyclonalen Antikörpern durchgeführt (Feld C). Die Spuren 1 und 2 der Felder A, B und C enthalten 2 μg gereinigtes Protein, die Spuren 3 der Felder A, B und C enthalten 7 μg gereinigtes Protein, die Spuren 2 und 3 des Feldes D enthalten 4 μg bzw. 15 μg gereinigtes Protein. Die M_r-Größenmarker sind am Rand angegeben.
3 zeigt, dass polyclonale Antikörper, die gegen das Heparin-bindende Protein mit 28 kDa, das aus BCG gereinigt wurde, gerichtet sind, die Proteine des gereinigten Antigenkomplexes 85 nicht erkannt haben. Umgekehrt gelang es gegen den Antigenkomplex 85 von BCG gerichteten polyclonalen und monoclonalen Antikörpern (nicht dargestellt) nicht, das Heparin-bindende Protein zu erkennen, was bedeutet, dass es sich um unterschiedliche Proteine handelt. Dieses Ergebnis wird durch die unterschiedlichen Wanderungsprofile dieser Proteine bei der SDS-PAGE unterstützt (3, Feld D).
Die Heparin-bindenden Proteine, die aus M. tuberculosis H37Ra und BCG gereinigt wurden, wurden einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterzogen.
Dazu wurden 25 μg HBHA einer Polyacrylamid-SDS-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 15 %-igen Polyacrylamidgels unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde die Substanz auf eine PVDF-Membran (ProBlott, ABI) durch einen Elektro-Blot transferiert. Nach der Färbung mit Coomassie-Blau wurde die HBHA entsprechende Bande ausgeschnitten und einem automatisierten Edman-Abbau unterzogen. Die ersten 16 Aminosäuren waren Ala-Glu-Asn-Ser-Asn-Ile-Asp-Asp-Ile-Lys-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-Ala. Die ersten 16 Aminosäuren des Heparin-bindenden Proteins von BCG wurden ebenfalls bestimmt, und es stellte sich heraus, dass sie mit denjenigen von M. tuberculosis identisch waren. Durch eine Ähnlichkeitssuche in den Proteindatenbanken wurde festgestellt, dass das Heparin-bindende Protein vorher nicht identifiziert wurde und dass es folglich ein neues mycobakterielles Protein darstellt. Zudem zeigten die ersten 16 Aminosäuren keine signifikante Sequenzähnlichkeit gegenüber anderen bekannten Proteinsequenzen.
Clonierung des HBHA codierenden BCG-Gens.

Für die Clonierung des HBHA codierenden Gens wurden zuerst die N-terminalen Sequenzen von internen HBHA-Fragmenten bestimmt. Dafür wurde gereinigtes HBHA einer Elektrophorese unterzogen, wie vorstehend beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde das Protein mit Trypsin im Inneren des Gels gespalten. Die sich ergebenden Peptide wurden dann durch Umkehrphasen-HPLC isoliert, dann einem Edman-Abbau unterzogen. Für vier Peptide konnte die Sequenz bestimmt werden:

Peptid S 1441:	Lys-Ala-Glu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Ala-Ala-Thr
Peptid S 1443:	Xxx-Glu-Gly-Tyr-Val-Asp-Gln-Ala-Val-Glu-Leu-Thr-Gln-Glu-Ala-Leu-Gly-Lys
Peptid S 1446:	Xxx-Gln-Glu-Xxx-Leu-Pro-Glu-Xxx-Leu
Peptid S 1447:	Phe-Thr-Ala-Glu-Glu-Leu-Arg.

Die Sequenz von zwei Oligonucleotidpaaren wurde von internen Peptidsequenzen von HBHA abgeleitet. Der im Allgemeinen hohe G + C-Gehalt der mycobakteriellen DNA führte dazu, dass die Erfinder G oder C an der dritten Position der Codons („Wobble") bevorzugten. Das erste Oligonucleotidpaar stammte vom Peptid S1441 und hatte die folgenden Sequenzen: 5' AAG GC(G/C) GAG GG(G/C) TAC CT 3' (Oligo S1441) und 5' AGG TA(G/C) CCC TC(G/C) GCC TT 3' (Oligo S1441 invers). Das zweite Oligonucleotidpaar stammte vom Peptid S1443 und hatte die folgenden Sequenzen: 5' GAC CAG GC(G/C) GT(G/C) GAG CT 3' (Oligo S1443) und 5' AGC TC(G/C) AC(G/C) GCC TGG TC 3' (Oligo S1443 invers).
Die chromosomale DNA von BCG wurde extrahiert, wie von Kremer et al. (16) beschrieben. Die Polymerisationskettenreaktionen (PCR) unter Verwendung von 50 ng chromosomaler DNA von BCG und 1 μg von entweder Oligo S1441 und S1443 invers oder Oligo S1443 und S1441 invers wurden bei einer Hybridisierungstemperatur von 50°C und einer Anzahl von 30 PCR-Zyklen durchgeführt. Nur die PCR-Reaktion mit den Oligonucleotiden S1441 und S1443 invers ergab ein spezifisch amplifiziertes DNA-Fragment mit etwa 150 bp. Dieses amplifizierte Fragment wurde auch beobachtet, wenn die Hybridisierungstemperatur auf 57°C erhöht wurde.
Das amplifizierte Fragment wurde in die HindII-Schnittstelle von pUC18 (Boehringer, Mannheim) eingebaut und in Escherichia coli XL1-Blue (New England Biolabs) eingeführt. Der Inhalt des rekombinanten E. coli-Plasmids wurde dann mit Standardverfahren analysiert (17), und das Plasmid, das das erwartete Fragment enthielt, wurde als pClone5 bezeichnet.
Nach der Reinigung durch Chromatographie über eine Nucleobond AX-Säule (Macherey – Nagel) nach den Anweisungen des Herstellers wurde ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit etwa 150 bp durch das Didesoxyribonucleotid-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von [alpha-³⁵S]dCTP (1.000 Ci/mMol; Amersham) und des T7-DNA-Sequenzier-Kits (Pharmacia) nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die erhaltene Sequenz ist in 7 dargestellt, in der die Sequenz der beiden für die PCR verwendeten Oligonucleotide unterstrichen ist. Es stellte sich heraus, dass die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz den für die Peptide S1441 und S1443 bestimmten Aminosäuresequenzen entsprach. Dies weist darauf hin, dass das amplifizierte PCR-Fragment einem internen Teil des BCG-Gens entspricht, das HBHA codiert.
Um das gesamte HBHA codierende Gen zu clonieren, wurde das 150bp-Fragment aus pClone5 durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII ausgeschnitten. Das Fragment wurde anschließend durch Elektrophorese in einem 7%-igen Polyacryamidgel gereinigt und aus dem Gel durch Elektroelution ausgeschnitten. Das gereinigte Fragment wurde mit Digoxygenin unter Verwendung des DNA-Nachweis- und Markierungskits durch DIG (Boehringer) markiert, wie vom Hersteller empfohlen. Das markierte Fragment wurde dann in Southern-Blot-Experimenten verwendet, um die chromosomale DNA von BCG zu testen, die mit BamHI (8, Spur 1), EcoRI (8, Spur 2), PstI (8, Spur 3), SmaI (8, Spur 4), AccI (8, Spur 5), NcoI (8, Spur 6), NotI (8, Spur 7), SacI (8, Spur 8) oder SphI (8, Spur 9) gespalten wurde, einer Agaraose-Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylonmembran transferiert. Die Membran wurde dann mit dem BamHI/HindII-Fragment von etwa 150 bp aus Clone5 getestet. Die Größenmarker sind am rechten Rand gezeigt. Southern-Blot-Analysen wurden unter Verwendung von Standardvorschriften (17) durchgeführt. Wie 8 zeigt, ergab die Spaltung der chromosomalen DNA von BCG mit SphI ein einziges Fragment mit etwa 2,5 kb, das mit der Sonde hybridisierte.
Die SphI-Restriktionsfragmente der chromosomalen DNA von BCG von 2,3 bis 2,7 kb wurden dann durch präparative Elektrophorese und Elektroelution gereinigt und in die SphI-Schnittstelle von pUC18 eingebaut. Die rekombinanten Plasmide wurden verwendet, um E. coli XL1-Blue zu transformieren. Weiße Kolonien, die auf Gelose LB (17) gezüchtet wurden, der Ampicillin (150 μg/ml), Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG, 40 μg/ml) und X-Gal (40 μg/ml) zugegeben wurde, wurden durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung der mit Digoxygenin markierten Sonde analysiert. Von etwa 300 analysierten Kolonien hybridisierte eine mit der Sonde. Die Restriktionsanalyse des isolierten Plasmids dieser Clone hat gezeigt, das es ein SphI-Fragment von 2,5 kb enthielt, das mit der Sonde in der Southern-Blot-Analyse hybridisierte.
Analyse der Sequenz des HBHA codierenden BCG-Gens.

Das HBHA codierende Gen, das in dem SphI-Fragment von 2,5 kb enthalten ist, wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Didesoxyribonucleotid-Kettenabbruchverfahrens sequenziert. Die Sequenzen der synthetischen Oligonucleotide, die für die Sequenzierung verwendet wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt, und die Sequenzierstrategie ist in 9 dargestellt. Das clonierte SphI-Fragment von 2,5 kb wird durch die schwarze Linie dargestellt. Die gestrichelten Linien stellen Vektor-DNA dar. Die dicken Pfeile stellen den offenen Leserahmen von HBHA dar. Die dünnen Pfeile geben die Richtung und die Länge des DNA-Fragments an, das für jedes über seinem entsprechenden Pfeil angegebene Oligonucleotid sequenziert wurde. TABELLE I: Für die Sequenzierung des HBHA codierenden Gens verwendete Oligonucleotide

Bezeichnung des Oligonucleotids	Sequenz
HBHA Seq1	5'AGC CGG TAC AAC GAG CTG GTC 3'
HBHA Seq1Inv	5'GAC CAG CTC GTT GTA CCG GCT 3'
HBHA Seq2	5' CAT CCA ACA CGT CGA CTC C 3'
HBHA Seq3	5' TTG ATG TCA TCA ATG TTC G 3'
HBHA Seq4	5' CGT GGA CCA GGC GGT GGA G 3'
HBHA Seq5	5' GAC GAT CAG GAG GTT TCC CCG 3'
Rückwärtsprimer	5' AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3'

Das ganze HBHA codierende Gen liegt im Inneren des SphI-Fragments von 2,5 kb am einen Ende des Fragments, und es wurde ausgehend von beiden Strängen vollständig sequenziert.
Die Nucleotidsequenz sowie die abgeleitete Proteinsequenz sind in 10 dargestellt. Der offene Leserahmen wurde zwischen den Nucleotiden 331 und 927 nachgewiesen. Die ersten 16 Codons nach dem etwaigen Startcodon ATG 331/333 werden in eine Aminosäuresequenz übersetzt, die mit derjenigen identisch ist, die nach der N-terminalen Sequenzierung des gereinigten HBHA-Proteins bestimmt wurde. Stromaufwärts des etwaigen Startcodons, an den Resten 331-333, fand man ein Stopp-Codon TAG in Phase an den Positionen 310-312. Dies legt stark nahe, dass der offene Leserahmen von HBHA keine Sequenzen enthält, die das klassische Signalpeptid codieren, und 331/333 stellt daher wahrscheinlich das Startcodon dar. Dies wird durch die Gegenwart einer vermeintlichen Ribosomen-Bindungsstelle AGGAA gestützt, die man 10 bis 6 Nucleotide stromaufwärts des Startcodons findet.
Die abgeleitete Proteinsequenz weist ein berechnetes Molekulargewicht von 21390 auf, was unter dem apparenten Molekulargewicht liegt, das durch SDS-PAGE geschätzt wurde. Das vorhergesagte Protein besteht aus 198 Aminosäuren und enthält kein Cystein, Methionin, Histidin oder Tryptophan. Die fünf bestimmten Peptidsequenzen wurden in der vorhergesagten Proteinsequenz von HBHA wiedergefunden (unterstrichen in 10). Homologierecherchen in den Proteindatenbanken haben bestätigt, dass HBHA ein mycobakterielles Protein ist, das bisher nicht identifiziert wurde.
Die Erfinder haben eine Region des Proteins identifiziert, die geeignet erscheint, an den Interaktionen mit den sulfathaltigen Glycokonjugaten beteiligt zu sein. Diese Region ist in der folgenden Sequenz enthalten:
KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK
Die Peptide, die besonders geeignet erscheinen, an den Interaktionen beteiligt zu sein, sind die Folgenden:
KKAAPA
KKAAAKK
Die Wiederholungen am C-terminalen Ende des Proteins, die reich an Prolinen, Alaninen und Lysinen sind, könnten den Unterschied zwischen dem apparenten und dem berechneten Molekulargewicht des Proteins erklären, das posttranslationalen Modifikationen wie der Glycosylierung unterliegt.
Die Erfindung betrifft daher genauer gesagt den C-terminalen Teil der Sequenz von 10 und genauer gesagt die Sequenz, die etwa die 50 letzten Aminosäuren zwischen den Aminosäuren 150 und 199 der Sequenz von 10 umfasst. Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung das C-terminale Ende des Proteins von 10, und genauer gesagt das C-terminale Ende, das die Wiederholungen enthält, die reich an Prolin, Alanin und Lysin sind, d.h. die 50 letzten Aminosäuren der Sequenz von 10.
Man kann auch alle Varianten der vorstehend beschriebenen Sequenzen in Betracht ziehen, die durch Addition, Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren erhalten werden, ohne im Wesentlichen die Eigenschaften der Region von Interesse zu ändern. Unter den in Betracht gezogenen Modifizierungen sind insbesondere die stillen Mutationen auf der Ebene der Nucleotidsequenzen anzumerken, die die Peptidsequenz des Proteins oder des Fragments von Interesse nicht modifizieren, sowie konservative Mutationen, die darauf beruhen, eine oder mehrere Aminosäuren zu substituieren, die dieselben funktionalen Eigenschaften zeigen wie die Aminosäure der nativen Sequenz. Additionen oder Deletionen von Aminosäuren, ohne dass die Eigenschaften der Regionen von Interesse im Wesentlichen verändert werden, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Bestimmte Reste können entfernt oder modifiziert werden, indem ein modifiziertes Gen in E. coli so exprimiert wird, wie für das vollständige Gen beschrieben. Falls dieses Protein Heparin mit derselben Affinität bindet wie das ganze HBHA, zeigt dies, dass die Wiederholungssequenzen nicht an dieser Bindung beteiligt sind. Falls dagegen das modifizierte Protein die Kapazität verliert, mit Heparin zu interagieren, spielt die modifizierte Region des Proteins in dieser Interaktion eine Rolle.
Expression des HBHA-Gens von BCG in Escherichia coli.
Die Erfindung betrifft auch eine rekombinante Wirtszelle, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie in ihrem Genom eine der vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen umfasst. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Transformation von Wirtszellen wie E. coli mit einer der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen, um das mycobakterielle Antigen HBHA zu produzieren, das die Anheftung von Mycobakterien an sulfathaltige Kohlenhydrate von epithelialen Zellen zulässt. Der zu transformierende Bakterienstamm kann die Nucleotidsequenz umfassen, die den C-terminalen Teil des HBHA-Polypeptids von 10 codiert, die die 50 letzten Aminosäuren des HBHA-Polypeptids codiert, oder die die letzten 30 bis 50 Aminosäuren des HBHA-Polypeptids codiert.
Um HBHA von BCG in Escherichia coli zu produzieren, wurde das von pUC18 stammende Plasmid, das das SphI-Fragment von 2,5 kb enthält, das das vollständige HBHA-Gen von BCG enthält, gleichzeitig mit NcoI und KpnI gespalten. Das aus dieser Doppelrestriktion hervorgegangene Fragment von 705 Basenpaaren wurde nach der Wanderung in einem 1 %-igen Agarosegel durch Elektroelution mittels Standardverfahren (17) gereinigt und schließlich in den Expressionsvektor pKK388-1 (Clontech, Palo Alto, Ca., USA) cloniert, der vorher mit NcoI und KpnI gespalten wurde. Das rekombinante Plasmid wurde dann mittels klassischer Transformationsverfahren (17) in E. coli-XL1-Blue eingeführt.
Die phänotypische Analyse des Stammes, der dieses Expressionsplasmid trägt, wurde durchgeführt, indem dieser in flüssigem LB-Medium gezüchtet wurde und die Produktion des rekombinanten HBHAs durch Zugabe von Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG) nach Standardverfahren (17) stimuliert wurde. Es wurden jeweils zwei Kulturen in 500 ml-Erienmeyerkolben, die jeweils 100 ml flüssiges LB-Medium mit 150 μg/ml Ampicillin enthielten, mit 4 ml einer Vorkultur von E. coli-XL1-Blue, enthaltend das HBHA-Expressionsplasmid, oder enthaltend das Plasmid pKK388-1, das die Kontrollkultur darstellt, angeimpft. Das Wachstum der beiden Kulturen wurde durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt. Sobald diese 0,6 betrug, wurde den Kulturen IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und die Kulturen wurden 4 Stunden weitergezüchtet. Vor der Zugabe von IPTG und nach 4 Stunden Kultur in Gegenwart des Induktors wurden Proben entnommen, um durch Polyacryamidgelelektrophorese und Immuno-Blot-Analyse die Produktion von rekombinantem HBHA zu analysieren.
Die Ergebnisse dieser verschiedenen Analysen sind in 11 aufgegriffen.
Die Spuren A und B stellen Gesamtlysate vor der Induktion von E. coli-XL1-Blue dar, der jeweils mit pKK388-1 und dem Derivat von pKK388-1, enthaltend das HBHA codierende Gen, transformiert wurde. Die Spuren C und D stellen Gesamtlysate nach der IPTG-Induktion von E. coli- XL1-Blue dar, der jeweils mit pKK388-1 und dem Derivat von pKK388-1, enthaltend das HBHA codierende Gen, transformiert wurde. Die Spuren E enthalten 1 μg des ausgehend von Zellwänden von BCG gereinigten HBHA. Von links nach rechts stellen die verschiedenen Felder jeweils die Färbung mit Coomassie-Blau R-250 des Polyacryamidgels und die Immuno-Blots dar, die mit einem Kontroll-Maus-Serum, einem gegen HBHA von BCG gerichteten Maus-Serum, dem monoclonalen Maus-Antikörper 3921E4 und dem monoclonalen Maus-Antikörper 4057D2 getestet wurden. Die Referenzmolekulargewichte sind links von dem Feld eingetragen, das die Färbung mit Coomassie-Blau R-250 des Polyacryamidgels darstellt.
Die Analyse des mit Coomassie-Blau gefärbten Polyacryamidgels zeigt die Synthese eines Polypeptids mit ungefähr 27 kDa bei E. coli-XL1-Blue, der den HBHA-Expressionsvektor trägt und durch IPTG dereprimiert wurde. Dieses Polypeptid, das in der Immuno-Blot-Analyse von einem Maus-Antiserum erkannt wurde, das gegen das HBHA-Protein gerichtet ist, das aus dem Kulturüberstand von BCG gereinigt wurde, wurde nicht von E. coli- XL1-Blue produziert, der den Vektor pKK388-1 ohne Insertion trägt, was zeigt, dass seine Synthese von der DNA-Sequenz des BCG-Clons im Expressionsvektor abhängt. Da dies die ganze Sequenz ist, die HBHA von BCG codiert, war es überraschend zu beobachten, dass das rekombinante Polypeptid ein apparentes Molekulargewicht aufweist, das geringer ist als das von HBHA, das aus BCG gereinigt wurde, und das in dem betrachteten Gelsystem 28 kDa besitzt.
Die Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante Peptidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen zulässt. Genauer gesagt betrifft die Erfindung eine Peptidsequenz, die ein Polypeptid mit etwa 27 kDa umfasst, dass vom monoclonalen Antikörper 3921E4 (14) erkannt und vom monoclonalen Antikörper 4057D2 (14) nicht erkannt wird. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße rekombinante Peptidsequenz das Expressionspodukt eines E. coli-Stammes, der mit einer der Nucleotidsequenzen transformiert wurde, die vorstehend beschrieben wurden und eine Peptidsequenz codieren, die das Anheften von Mycobakterien an Wirtszellen zulässt, genauer gesagt eine Nucleotidsequenz, die ausgehend von M. bovis BCG oder M. tuberculosis erhalten wird.
Da das ausgehend von seiner Gensequenz abgeleitete Molekulargewicht von HBHA bedeutend niedriger gegenüber seinem apparenten Molekulargewicht ist, das nach der elektrophoretischen Wanderung beobachtet wurde, und dieser Unterschied das Ergebnis posttranslationaler Modifizierungen von HBHA ist, werden diese Modifizierungen nicht in E. coli durchgeführt. Diese Schlussfolgerung wird durch die Tatsache untermauert, dass wir eine unterschiedliche Immunreaktivität des rekombinanten HBHA mit den beiden monoclonalen Antikörpern 3921E4 und 4057D2 beobachten. Auch wenn diese beiden monoclonalen Antikörper auf gleiche Weise bei der Immuno-Blot-Analyse das gereinigte HBHA von BCG erkennen, so ist doch nur 3921E4 mit dem in E. coli produzierten rekombinanten HBHA immunreaktiv. Diese Beobachtung zeigt zu allererst, dass die Epitope dieser beiden monoclonalen Antikörper sich unterscheiden und dass das von 4057D2 erkannte Epitop auf HBHA nicht mehr vorhanden ist, wenn dieses in E. coli produziert wird, dass es auf einem molekularen Element lokalisiert ist, welches auf eine posttranslationale Modifizierung zurückzuführen ist, die nicht von E. coli durchgeführt wird.
Diese posttranslationale Modifizierung ist insoweit eine Glycosylierung als bereits gezeigt wurde, dass der Saccharid-Anteil eines Glycoproteins immunogen sein kann. Das Saccharid-Motiv ist insofern sehr immunogen als die Immuno-Blot-Analyse unter Verwendung von Maus-anti-HBHA-Serum ein schwächeres Signal mit dem rekombinanten HBHA im Vergleich zu demjenigen hervorruft, das mit dem gereinigten BCG von HBHA erfolgt. Diese Beobachtung ist umso mehr bemerkenswert, als die Menge an rekombinantem HBHA, die in dieser Analyse eingesetzt wurde, bei weitem größer ist als diejenige des natürlichen HBHA, wie die Färbung des Polyacryalamidgels mit Coomassie-Blau bezeugt. Da zudem die Immunreaktivität von 3921E4 derjenigen nahekommt, die mit dem Maus-Serum beobachtet wurde, ist das von diesem monoclonalen Antikörper erkannte Epitop daher teilweise von der mutmaßlichen posttranslationalen Modifizierung abhängig.
Es wurden mehrere Versuchsansätze in Betracht gezogen, um die genaue Natur dieser posttranslationalen Modifizierung aufzuklären. Zuerst wurde das ausgehend von BCG gereinigte HBHA der Wirkung verschiedener Endoglycosidasen und Exoglycosidasen unterzogen, um zu sehen, ob das apparente Molekulargewicht dieses Proteins nach der Wirkung dieser Enzyme abnimmt. Eine schnellere elektrophoretische Wanderung, die nach der Spaltung mit einem oder mehreren dieser Enzyme beobachtet wurde, weist direkt auf die chemische Natur der mutmaßlichen Saccharid-Modifizierung hin. Gleichzeitig stellen BCG-Kulturen, die in Gegenwart von Inhibitoren der Glycosylierung gezüchtet wurden (z.B. Tunicamycin, das die N-Glycosylierung bei den grampositiven Bakterien hemmt) einen interessanten Ansatz zur Aufklärung der Natur der posttranslationalen Modifizierungen von HBHA dar.
Identifizierung der Heparin-Bindungsstelle („Heparin-bindende Stelle") von HBHA.
Da gezeigt wurde, dass HBHA eine direkte Rolle bei der Interaktion zwischen BCG und den epithelialen Zellen spielt, eine Interaktion, die durch Heparin hemmbar ist, ist es wichtig die Region zu identifizieren, die an der Interaktion von BCG mit den epithelialen Zellen über die sulfathaltigen Polysaccharide beteiligt ist.
Das in rekombinanter Form von E. coli produzierte HBHA ist der Gegenstand einer Proteolyse, die dessen C-terminales Ende betrifft und eine Herabsetzung der Affinität für Heparin mit sich bringt.
Das in E. coli WL1-Blue produzierte HBHA häuft sich im Cytoplasma an, bleibt aber löslich, da sich nach einer Ultraschallbehandlung der Colibakterien, der sich eine Zentrifugation zur Klärung (15 Minuten bei 10.000 g) anschließt, das gesamte in einer Immuno-Blot-Analyse nachweisbare HBHA in der löslichen Fraktion des Lysats befindet. Wenn das Letztere bei Raumtemperatur inkubiert wird, durchläuft das rekombinante HBHA bis zum Ende einer 2-stündigen Inkubation einen schnellen Abbau, wobei dessen apparentes Molekulargewicht von 27 kDa auf 19 kDA übergeht. Die Form mit 19 kDA, die von dem monoclonalen Antikörper 3921E4 nicht mehr erkannt wird, zeigt jedoch eine gute Resistenz gegenüber einem weiteren Abbau, da diese Form bis zum Ende einer 18-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur stabil bleibt. Da der Abbau des rekombinanten HBHA durch Zugabe von 1 mM AEBSF, das ein Inhibitor von Serinproteasen ist, gestoppt werden konnte, ist es wahrscheinlich, dass dieser Abbau das Ergebnis einer Proteolyse ist. Es ist anzumerken, dass das native HBHA, das in einem E. coli XL1-Blue-Lysat inkubiert wird, keinen derartigen Abbau erfährt, was daher nahelegt, dass die posttranslationale Modifikation, die das native HBHA trägt, ihm eine Resistenz gegenüber der mit dem rekombinanten HBHA beobachteten Proteolyse verleiht.
Die chromatographische Analyse über Heparin-Sepharose eines geklärten Sonikats von E. coli XL1-Blue, der rekombinantes HBHA produziert, das mit 1 mM AEBSF supplementiert wurde, hat gezeigt, dass das rekombinante HBHA Heparin mit derselben Affinität bindet wie das native HBHA, da es bei 350 mM NaCl in PBS eluiert. Dagegen bindet das HBHA, das in ein Polypeptid mit 19 kDa abgebaut wurde, kein Heparin mehr, was zeigt, dass der abgespaltene Anteil für die Erkennung der sulfathaltigen Polysaccharide notwendig ist. Das über Heparin-Sepharose gereinigte, rekombinante HBHA hat sich zudem als außerstande erwiesen, die Erythrocyten des Kaninchens zu agglutinieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die posttranslationale Modifizierung von HBHA nicht an dessen Bindungsaktivität an Heparin beteiligt ist, aber für seine Hämagglutinationsaktivität wichtig ist.
Die Analyse des rekombinanten HBHA durch Chromatographie auf immobilisierter Heparin-Matrix erwies sich auch als interessant für die Kartierung der Proteindomäne, die an der Erkennung des Heparins (Heparin-bindende Stelle) beteiligt ist. Tatsächlich werden drei Formen des rekombinanten HBHA mit Molekulargewichten von 27, 26 und 25 kDA durch einen linearen NaCl-Gradienten eluiert, der von 0 bis 500 mM variierte und bei dem ein Säulen-Waschpuffer (PBS) verwendet wurde. Die Formen mit 26 und 25 kDa, Abbauprodukte des rekombinanten vollständigen Proteins mit 27 kDa, eluierten bei ca. 310 und 280 mM NaCl. Da diese beiden eine verringerte Affinität für Heparin im Vergleich zum vollständigen rekombinanten Protein zeigen, war es wichtig, die Region zu kennen, an der die Verkürzungen erfolgten. Dazu wurden die aminoterminalen Enden der 3 über Heparin-Sepharose gereinigten Formen mikrosequenziert. Die Analyse der ersten 10 Aminosäuren zeigte, dass die 3 Molekülarten dieselbe Sequenz aufwiesen, die mit der aminoterminalen Sequenz des ausgehend von BCG-Zellwand gereinigtem HBHA identisch ist. Diese Beobachtung zeigt daher, dass der Abbau von rekombinantem HBHA durch aufeinanderfolgende carboxyterminale Spaltungen erfolgt. Diese Spaltungen, die einhergehen mit einer verringerten Affinität für Heparin, zeigen, dass die carboxyterminalen Aminosäuren von HBHA direkt an der Erkennung der sulfathaltigen Polysaccharide beteiligt sind. Der hohe Lysin-Gehalt in den carboxyterminalen Wiederholungsbereichen von HBHA spricht außerdem für eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen den positiven Ladungen der Lysine und den negativen Ladungen, die von den Sulfatresten des Heparins getragen werden.
Die Rolle der Lysine bei den Protein-sulfathaltigen Zucker-Wechselwirkungen ist zudem dokumentiert (18).
Die nach der Proteolyse des rekombinanten HBHA beobachtete Form mit 19 kDa könnte daher einem HBHA entsprechen, das seine carboxyterminalen Wiederholungssequenzen verloren hat und einem Verlust von 39 Aminosäuren entspricht. In dieser Hypothese verlöre die Polypeptidkette von HBHA eine Masse von etwa 3,8 kDa und ginge daher von 21,3 auf 17,5 kDa über. Das apparente Molekulargewicht des rekombinanten HBHA nach der Proteolyse in einem E. coli-XL1-Blue-Lysat stimmt tatsächlich mit dieser Hypothese überein. Es ist auch interessant anzumerken, dass die abnorme elektrophoretische Wanderung von HBHA seinen carboxyterminalen Wiederholungssequenzen zuzuschreiben ist, die nicht mehr bei der abgebauten Form mit 19 kDa zu beobachten ist, die kein Heparin mehr bindet. Diese letztere Beobachtung verstärkt daher die Hypothese, nach der das rekombinante HBHA mit 19 kDa einem HBHA entspricht, das seine carboxyterminalen Wiederholungssequenzen verloren hat. Da der monoclonale Antikörper 3921E4 das rekombinante HBHA mit 19 kDa nicht mehr erkennt, legt dies nahe, dass sich sein Epitop in den carboxyterminalen Wiederholungssequenzen befindet.
Immunreaktivität gegenüber HBHA durch Antiseren von Tuberkulosekranken
Um herauszufinden, ob HBHA in der Lage ist, eine Immunreaktion beim Menschen zu induzieren, wurden Immuno-Blot-Analysen durchgeführt unter Verwendung von gereinigtem HBHA und menschlichen Antiseren von Tuberkulosekranken. 5 μg des Proteins wurden einer Elektrophorese unter Verwendung eines 15%-igen Polyacryamid-SDS-Gels unterzogen, anschließend auf Nitrocellulosemembranen transferiert, die daraufhin mit 100-fach verdünnten Seren getestet wurden, die von 7 verschiedenen Patienten stammten, die an sich entwickelnder Tuberkulose litten (vgl. 6, Spuren 3A bis 493) (Spur 1, gereinigtes HBHA, Spur 2, nicht relevantes Protein), sowie mit Serum eines gesunden Probanden (Kontrollspur). Die linken Spuren, die gereinigte Proteine (Spuren 1 und 2) und die Molekulargewichtsmarker (vgl. PM) enthalten, wurden nach der SDS-PAGE mit Coomassie-Blau gefärbt.
Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass alle Seren von Tuberkulosekranken anti-HBHA-Antikörper enthalten, während das Serum des gesunden Individuums derartige Antikörper nicht enthielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass an der Oberfläche exponiertes HBHA während der Entwicklung der menschlichen Tuberkulose immunogen ist und das Vorliegen von anti-HBHA-Antikörpern den Nachweis des Vorliegens einer mycobakteriellen Infektion erlaubt.
Die posttranslationale Modifikation, die von dem nativen HBHA getragen wird, ist eine antigene Hauptdeterminante bei Tuberkulose-Patienten:
Das von E.coli produzierte rekombinante HBHA wurde durch Immuno-Blot-Analyse unter Verwendung von Seren von Tuberkulose-Patienten analysiert. Im Vergleich zu den mit nativem HBHA erhaltenen Nachweissignalen erkannten diese Immunreagenzien das rekombinante Protein sehr schwach, was daher anzeigt, dass die posttranslationale Modifikation von HBHA ein oder mehrere Hauptepitope trägt. Diese Seren erwiesen sich als nicht in der Lage, das rekombinante HBHA mit 19 kDa nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft daher die Verwendung einer Peptidsequenz oder eines Proteins gemäß der Erfindung und insbesondere einer oder mehrerer immunogener Regionen dieser Sequenz oder dieses Proteins, zur Diagnose von mycobakteriellen Infektionen, insbesondere zum Nachweis des Vorliegens von anti-HBHA-Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten. Im Allgemeinen ist eine Peptidsequenz oder das Protein oder ein rekombinantes Polypeptid, vorzugsweise gemäß der Erfindung modifiziert, an einen Träger gebunden und wird mit biologischen Flüssigkeiten inkubiert, die geeignet sind, anti-HBHA-Antikörper zu enthalten. Die anti-HBHA-Antikörper, die an das erfindungsgemäße Polypetid gebunden sind, werden dann entweder beispielsweise mit markierten Antikörpern nachgewiesen, die gegen die anti-HBHA-Antikörper gerichtet sind, oder mit nicht-markierten Antikörpern, die gegen die anti-HBHA-Antikörper gerichtet sind, und mit z.B. einem Enzym vom Typ der alkalischen Phosphatase oder Peroxidase, oder Biotin, markierten Antikörpern, die gegen die nicht-markierten Antikörper gerichtet sind.
Das gesamte Protein oder ein rekombinantes Polypeptid gemäß der Erfindung kann verwendet werden, aber man kann auch eine oder mehrere immunogene Regionen dieses Proteins verwenden, die durch Verfahren, die als „Epitop-Kartierung" bezeichnet werden und die dem Fachmann gut bekannt sind, bestimmt werden. Beispielsweise macht man im Hinblick auf das Kartieren der Epitope B und T, die auf dem vollständigen HBHA-Molekül vorliegen, von dem Verfahren des Hydrophobizitätsprofils Gebrauch (19). Die computergestützte Vorhersage von antigenen Determinanten für die B-Zellen wird ebenfalls verwendet (20).
Das ausgewählte Polypeptid wird auf einem Träger vom Typ Mikrotiterplatte, Kanüle, Mikrokügelchen oder anderen adsorbiert. Die Bindung des Polypeptids erfolgt unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise ist der verwendete Träger eine Mikrotiterplatte. Das Polypeptid wird dann in einem basischen Carbonatpuffer verdünnt und in den Vertiefungen verteilt. Nach einer Inkubation von einigen Stunden bei Raumtemperatur erfolgen mehrere Waschschritte unter Verwendung von physiologischem Puffer.
Das an den Träger gebundene Polypeptid wird dann mit einer Probe einer biologischen Flüssigkeit inkubiert. Mehrere Arten biologischer Flüssigkeiten können verwendet werden und von Tieren oder Menschen erhalten werden. Genauer gesagt kann die biologische Flüssigkeit aus Serum, Lymphe, Speichel oder Urin erhalten werden, oder außerdem von Geweben wie Lungenzellen isoliert werden. Die Inkubation erfolgt nach den üblichen Verfahren. Hier werden die Seren des Patienten verdünnt und mit der auf der Platte gebundenen Peptidsequenz in Kontakt gebracht. Auf die ungefähr einstündige Inkubation folgen mehrere Waschschritte mit einem physiologischen Puffer. Die an das erfindungsgemäße Polypeptid gebundenen anti-HBHA-Antikörper werden dann entweder mit markierten Antikörpern nachgewiesen, die gegen die anti-HBHA-Antikörper gerichtet sind, oder mit nicht-markierten Antikörpern, die gegen anti-HBHA-Antikörper gerichtet sind, und dann mit markierten Antikörpern, die gegen die nicht-markierten Antikörper gerichtet sind.
Die Markierung der Antikörper kann radioaktiv sein, aber es wird im Allgemeinen eine andere Art der herkömmlichen Markierung bevorzugt. Die Fluoreszenzstoffe, wie Fluoreszin-Isothiocyanat oder die Enzyme wie alkalische Phosphatase, Peroxidase oder Biotin/Strepavidin sind die für gewöhnlich verwendeten Marker. Die Wahl der markierten oder nicht-markierten Antikörper hängt vom Tier ab, von dem die biologischen Flüssigkeiten stammen. Falls es sich um eine menschliche biologische Flüssigkeit handelt, sind die verwendeten Antikörper gegen menschliche Immunglobuline gerichtet.
Die Bindung zwischen dem anti-HBHA-Antikörper und den markierten oder nicht-markierten Antikörpern erfolgt nach den herkömmlichen Verfahren. Beispielsweise findet die Bindungsreaktion innerhalb einer Stunde bei Raumtemperatur statt und nach mehreren Waschgängen wird ein Marker-Substrat zugegeben.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, mit dem das Vorliegen von anti-HBHA-Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeitsprobe nachgewiesen werden kann. Der Kit umfasst ein Polypeptid oder eine oder mehrere immunogene Regionen von HBHA, die fakultativ auf einem Träger adsorbiert sind, einen markierten Antikörper (und falls erforderlich einen nicht-markierten Antikörper) sowie übliche Puffer und ein Marker-Substrat.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Mycobakterielles Proteinantigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem C-terminalen Teil des Polypeptids HBHA der 10, b) der Peptidsequenz der 50 letzten Aminosäuren des Polypeptids HBHA der 10 und c) einer Peptidsequenz der 30 bis 50 letzten Aminosäuren des Polypeptids HBHA der 10, wobei das Antigen die Anlagerung der Mycobakterien an sulfathaltige Kohlenhydrate von Epithelzellen erlaubt.
Antigen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, das die Anlagerung ermöglicht, in der folgenden Sequenz umfasst ist: KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK oder jeder Teil dieser Sequenz, der die Anlagerung der Mycobakterien an die Wirtszellen erlaubt.
Antigen gemäß Anspruch 1, das ausgehend von einem Mycobakterium erhalten werden kann, und insbesondere aus M. bovis BCG.
Antigen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es von den monoclonalen Antikörpern 3921 E4 und 4057 D2 erkannt wird.
Rekombinantes Polypeptid, das erhalten werden kann durch Expression eines Polynucleotids, das den C-terminalen Teil des Polypeptids HBHA der 10 codiert oder die 50 letzten Aminosäuren des Polypeptids HBHA der 10 oder die 30 bis 50 letzten Aminosäuren des Polypeptids HBHA der 10, in einer Wirtzelle und das ein mycobakterielles Antigen HBHA darstellt, das die Anlagerung der Mycobakterien an sulfathaltige Kohlenhydrate von Epithelzellen erlaubt.
Rekombinantes Polypeptid gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotidsequenz ausgehend von M. bovis BCG oder M. tuberculosis erhalten wird.
Rekombinantes Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es von dem monoclonalen Antikörper 3921 E4 erkannt wird und von dem monoclonalen Antikörper 4057 D2 nicht erkannt wird.
Rekombinantes Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, enthalten in den 50 letzten Aminosäuren des C-terminalen Endes des Polypeptids HBHA der 10.
Rekombinantes Polypeptid gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle E. coli. ist.
Immunogene Zusammensetzung gegen mycobakterielle Infektionen, die als Wirkstoff ein Proteinantigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält oder ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8.
Reagens zum Nachweis von Anti-HBHA-Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) dem C-terminalen Teil des Polypeptids HBHA der 10 b) der Peptidsequenz der 50 letzten Aminosäuren des Polypeptids HBHA der 10 und c) einer Peptidsequenz der 30 bis 50 letzten Aminosäuren des Polypeptids HBHA der 10, d) einem Antigen gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4 und e) einem rekombinanten Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9.
Kit zur serologischen Diagnose von mycobakteriellen Infektionen, mindestens umfassend: a) ein Reagens gemäß Anspruch 11, wobei das Reagens an einen Träger gekoppelt oder adsorbiert ist; b) einen gegen Antikörper gerichteten Antikörper, der in einer solchen Weise modifiziert ist, dass ein Nachweissignal an ihn gekoppelt werden kann.
Kit gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der gegen Antikörper gerichtete Antikörper für menschliche Immunglobuline spezifisch ist.
Kit gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei der gegen Antikörper gerichtete Antikörper direkt oder indirekt markiert ist, entweder durch eine Markersubstanz oder durch ein Enzym, das durch Umsetzung seines Substrates ein Markersignal erzeugen wird.
Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz ein Antigen gemäß Anspruch 1 codiert.
Polynucleotid gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz in einer Sequenz enthalten ist, die für folgendes Polypeptid codiert: KKAAPAKKAAPAKKAAPAKKAAAKKAPAKKAAAKKVTQK oder jeder Teil dieser Peptidsequenz, der die Anlagerung der Mycobakterien an Wirtszellen erlaubt.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nucleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 17 enthält.
Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt ein Mycobakterium ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 18 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle M. bovis BCG ist.
Wirt gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz durch den Wirt überexprimiert wird.