DE69515613T2

DE69515613T2 - Immunogenes Hybridprotein OprF-Oprl erhältlich aus Membranproteinen von Pseudomonas aeruginosa

Info

Publication number: DE69515613T2
Application number: DE69515613T
Authority: DE
Inventors: Dr. Broeker; Horst Prof. Domdey; Dr. Hungerer; Dr. Knapp; Bernd Ulrich Prof. Von Specht
Original assignee: Chiron Behring GmbH and Co KG
Current assignee: GSK Vaccines GmbH
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-11-17
Publication date: 2000-11-30
Anticipated expiration: 2015-11-18
Also published as: AU4041995A; KR960022559A; JPH08245699A; EP0717106A1; US5955090A; US6300102B1; EP0717106B1; ATE190657T1; JP3762779B2; CA2165401C; JP3712244B2; JP2005097321A; DE69515613D1; CA2165401A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hybridprotein, umfassend das Pseudomonas aeruginosa-Außenmembranprotein I (OprI oder OMPI), das mit seinem aminoterminalen Ende an das carboxyterminale Ende eines carboxyterminalen Teils des Pseudomonas aeruginosa-Außemmembranproteins F (OprF oder OMPF) gekoppelt ist, sowie monoclonale oder polyclonale Antikörper gegen dieses Hybridprotein. Sowohl das Hybridprotein als auch die Antikörper, welche gegen das Hybridprotein gerichtet sind, stellen für Labortiere oder Menschen Schutz gegen eine Infektion durch Pseudomonas aeruginosa bereit.
Pseudomonas aeruginosa ist ein gram-negativer opportunistischer pathogener Erreger. Er stellt die Hauptursache Krankenhaus-erworbener Infektionen dar, insbesondere in Patienten mit Verbrennungen und anderen Abwehrschwächen, einschließlich transplantierte- oder Krebspatienten. Aufgrund dessen wird er als "Problem-Mikroorganismus" in der Humanmedizin angesehen.
Zahlreiche Anstrengungen sind bis zum heutigen Tag unternommen worden, um einen Impfstoff gegen Pseudomonas aeruginosa zu entwickeln. In EP-0 297 291 ist z. B. die vollständige Aminosäuresequenz des Außenmembranproteins F sowie die Nucleotidsequenz, welche OprF codiert, offenbart. In EP-0 357 024 ist die vollständige Aminosäuresequenz des Außenmembranproteins I und zusätzlich die Nucleotidsequenz, welche OprI codiert, gezeigt. Darüberhinaus ist für beide Proteine gezeigt worden, daß sie zur Bereitstellung einer Immunabwehr gegen Pseudomonas aeruginosa in einem tierischen oder menschlichen Probanden verwendet werden können. Jedoch ist die Verbesserung von Impfverfahren gegen eine tödlich verlaufende Pseudomonas aeruginosa-Infektion noch immer ein Ziel.
Überraschenderweise wurde von den Erfindern entdeckt, daß ein Hybridprotein, in welchem OprI mit seinem N-terminalen Ende an einen C-terminalen Teil von OprF gekoppelt ist, signifikant immunogener ist als Fusionsproteine, welche nur OprI oder OprF umfassen, oder als Gemische von letzteren Fusionsproteinen.
Damit betrifft die vorliegende Erfindung ein Hybridprotein, umfassend das Pseudomonas aeruginosa-Außenmembranprotein I, das mit seinem aminoterminalen Ende an das carboxyterminale Ende eines carboxyterminalen Teils des Pseudomonas aeruginosa- Außenmembranproteins F fusioniert ist, wobei der carboxyterminale Teil die Aminosäuresequenz 190-350 umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der carboxyterminale Teil die Aminosäuresequenz 190-342.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff, welcher mindestens eines der vorstehend erwähnten Hybridproteine umfaßt.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind Nucleinsäuren, die die vorstehend erwähnten Hybridproteine codieren.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten Hybridproteine, welches die Veranlassung der Expression einer Nucleinsäure in pro- oder eukrayotischen Zellen wie vorstehend erwähnt umfaßt, welche ein erfindungsgemäßes Hybridprotein codiert.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen und in den Ansprüchen in Einzelheiten weiter erklärt. Im folgenden werden die Quellen der Mikroorganismen und der DNAs sowie Verfahren, welche in den nachfolgenden Beispielen verwendet werden, und welche beispielsweise für die Durchführung der Erfindung zweckmäßig erscheinen, angegeben.

Mikroorganismen:

Pseudomonas aeruginosa International Antigenic Typing Scheme serogroup I (ATCC 33348) wurde von A. Bauernfeind, Max. von Pettenkofer-Institut, Universität München, erhalten. Die Bakterien wurden wie früher beschrieben gezüchtet und auf die erforderliche Konzentration eingestellt (Finke, M. et al. (1990) Infect. Immun., 58, S. 2241- 2244). Für die Expression der rekombinanten Proteine wurde E. coli K-12 W3110 lacIQL8 verwendet. Für die Expression von OPRs in Hefe verwendeten wir den Saccharomyces cerevisiae-Stamm HT393 (leu2, ura3, pra1, prb1, prc1, pre1, cps1).

Herkunft der DNAs:

Drei rekombinante Plasmide wurden als DNA-Quelle verwendet: pFSauI, ein von pUC19 abstammendes Plasmid, welches ein 1,0 kb Sau 3AI-Fragment des Pseudomonas aeruginosa-Außenmembranprotein F-Gens enthält, welches den C-terminalen Teil des Proteins von Aminosäureposition 57-350 codiert (Duchéne, M. et al. (1988), J. Bacteriol. 170, S. 155-162); pITaq1, ein von pUC19 abstammendes Plasmid, welches ein 626 bp- TaqI-Fragment enthält, welches das vollständige OprI-Gen überspannt (Duchéne M. et al (1989), J. Bacteriol. 171, S. 4130-4137), und den Expressionsvektor pGEX-2a, welcher von dem Vektor pGEX-2T abstammt, der durch die Einführung des Polylinkers vom Vektor pTRC modifiziert wurde. Der Vektor pGEX-2a enthält den tac-Promotor gefolgt von der codierenden Sequenz für die 26 kDa-Schistosoma japonicum-Gluthation-S-Transferase, einer Spaltstelle für Thrombin und der pTRC-spezifischen Polylinker-Region.

Charakterisierung der Antiseren, welche gegen synthetische Peptide induziert wurden:

Synthetische Peptide, welche die Aminosäureregionen 190-213 (D1), 212-240 (D2, SEE1), 239-250 (D3), 284-316 (D4) und 332-350 (D5, SEE4) von OprF repräsentieren, wurden wie beschrieben synthetisiert (Roussilhon, C. E. et al (1990) Immunol. Lett. 25, S. 149-154). Kaninchen wurden an 8 verschiedenen Stellen nahe der Lymphknoten mit 200 ug KLH-konjugierten Peptiden in komplettem Freundschen Adjuvans subkutan immunisiert und 2 Wochen später mit 400 ug des Konjugats in inkompettem Freundschen Adjuvans reimmunisiert. 6 und 9 Wochen nach der ersten Immunisierung erhielten die Tiere intravenös zwei Verstärker-Injektionen von 150 ug und 100 ug des Konjugats. Die Antikörper-Titer gegen Peptide wurden im ELISA auf Platten gemessen, welche mit 5 ng/ml Peptidlösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 (PBS) über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet worden waren. Die Platten wurden 3 x mit 0,05 M Citronensäure und 0,05 M Tris, pH 7,4 gewaschen und dann 3 Tage über Kieselgel getrocknet. Die Kaninchenseren wurden 1 : 160 verdünnt und mit E. coli-Proteinen gesättigt. Western Blot-Analysen mit rekombinanten GST-Fusionsproteinen und Immunfluoreszenznachweise gegen intakten Pseudomonas aeruginosa der Serengruppe 11 (ATCC 33358) wurden nach einem in der Literatur beschriebenen Verfahren durchgeführt (Johnson, D. A. et al. (1984) Gene Anal. Techn. 1, S. 3-8; Schnorr, J. B. et al. (1991) Vaccine 9, S. 675-681).

Expression von OprF und OprI als Gluthation-S-Transferase-Fusionsproteine:

Die Oligonucleotide p1 (5'-AAA GAG CTC GCT CCG GCT CCG GAA CCG GTT GCC GAC-3') mit einer Sac I-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende, entsprechend den Basen 568-594 des OprF-Gens, und p2 (5'-AAA AAG CTT ACT TGG CTT CGG CTT CTA CTT CGG-3') mit einer Hind III-Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende, komplementär zu den Basen 1028-1053 des OprF-Gens, und 10 ng des Plasmids pFSau I wurden unter Verwendung des Perkin Elmer Cetus Gene-Amp Kits in einer Polymerasekettenreaktion eingesetzt, wobei ein 500 bp-Fragment erhalten wurde. Das amplifizierte Fragment wurde mit Sac I und Hind III gespalten und in den Vektor pGEX-2a eingebracht, wobei das Plasmid pGEX-OprF erhalten wurde, welches den C-terminalen Teil des Porins OprF von Aminosäure 190-350 codiert. Die Oligonucleotide p3 (5'-CGT ACC ATG GTG AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT-3'), mit einer Nco I-Restriktionsschnittstelle am 5'- Ende, entsprechend den Basen 61 bis 87 der codierenden Region des OprI-Gens, und p4 (5'- AAA AAG CTT CTA TTA CTT GCG GCT GGC TTT TTC C-39, mit einer Hind III- Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende, komplementär zu den Basen 231 bis 255 der codierenden Region des OprI-Gens, und 10 ng des Plasmids DNApITaq I wurden zur Amplifikation eines 215 bp-Fragments in einer Polymerasekettenreaktion verwendet, welches dann mit den Restriktionsenzymen Nco I und Hind III gespalten wurde, um es in die entsprechenden Stellen des Expressions-Vektors pGEX-2a einzubringen, mit der Absicht, das Plasmid pGEX-OprI zu erhalten, welches die Aminosäuren 21 bis 83 von OprI codiert.

Herstellung der GST-OprI-OprF und GST-OprF-OprI Hybridgene:

Die Oligonucleotide p1 (siehe vorstehend) und p5 (5'-TTC AAC GCG ACG GTT GAT AGC GCG-3') (welches komplementär zu den Basen 1003-1026 des OprF-Gens ist) und 10 ng des Plasmids pFSau I wurden verwendet, um ein 470 bp OprF-Fragment zu amplifizieren. Eine zweite Polymerasekettenreaktion wurde mit 10 ng des Plasmids pITaq I und den Oligonucleotiden p4 (siehe vorstehend) und p6 (5'-GAA GGC CGC GCT ATC AAC CGT CGC GTT GAA AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT-3'), in welchem die Nucleotide 1 bis 30 den Basen 997 bis 1026 des OprF-Gens entsprechen und die Nucleotide 31 bis 57 den Basen 61 bis 87 der OprI-codierenden Region entsprechen, durchgeführt. Dabei wurde ein 240 bp-Fragment erhalten. 150 ng von beiden erhaltenen DNA-Fragmenten und die Oligonucleotide p1 und p4 wurden wie von Horton beschrieben (Horton, R. M. et al., (1989), Gene 77, S. 61-68) für eine dritte Polymerasekettenreaktion verwendet. Das erhaltene 660 bp-Fragment wurde mit den Restriktionsendonucleasen Sac I und Hind III geschnitten und in den Vektor pGEX-2a eingebracht, wobei das Plasmid pGEX-OprF-OprI erhalten wurde, welches die Aminosäuren 190-342 von OprF und die Aminosäuren 21 bis 83 von OprI codiert. Die Oligonucleotide p3 und p7 (5'-AAA GAG CTC CTT GCG GCT GGC TTT TT CAG CAT GCG-3') mit einer Sac I-Restriktions- Schnittstelle am 5'-Ende, komplementär zu den Basen 223 bis 249 der codierenden Region des OprI-Gens, und 10 ng des Plasmids pITaq I wurden verwendet, um ein 210 bp- Fragment zu amplifizieren, welches mit Hilfe der Restriktionsenzyme Nco I und Sac I in den Vektor pGEX2a eingebracht wurde. Das erhaltene Plasmid wurde mit den Enzymen Sac I und Hind III gespalten, um ein 490 bp-Fragment einzubringen, welches durch Spaltung des Plasmids pGEX-OprF unter Verwendung der entsprechenden Enzyme erhalten worden war. Das Plasmid pGEX-OprI-OprF codiert die Aminosäuren 21 bis 83 von OprI und die Aminosäuren 190 bis 350 von OprF, welche durch einen zwei Aminosäuren großen Linker getrennt sind, der an der Sac I-Clonierungsstelle eingebracht wurde.

Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine in E. coli:

Die 4 Plasmide pGEX-OprF, pGEX-OprI, pGEX-OprF-OprI und pGEX-OprI-OprF wurden in den E. coli K-12-Stamm W3110 lac IQL8 transformiert. Zur großtechnischen Antigenproduktion wurden 5 Liter-Bakterienkulturen, welche die Plasmide enthalten, bis zu einem OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert von 1 gezüchtet und die Expression der Pseudomonas aeruginosa- spezifischen rekombinanten Antigene durch Isopropyl-thio-galactosid induziert. Nach Aufschluß der Zellen wurde festgestellt, daß die vier verschiedenen Gluthation-S-Transferase- Fusionsproteine in wässriger Lösung löslich sind. Deshalb konnten die vier Fusionsproteine aus unbehandelten Bakterienlysaten unter nicht-denaturierenden Bedingungen durch Affinitäts-Chromatographie an immobilisiertem Gluthation zu einer Reinheit von etwa 80% gereinigt werden.

Aktive Immunisierung und Schutzexperimente:

Jede von 4 Gruppen (A-D) aus 68 weiblichen BALB/c-Mäusen (10-12 Wochen alt) erhielt 100 ug Antigen. GST (A), GST-OprF + GST-OprI (B), GST-OprF-OprI (C), GST- OprI-OprF (D), suspendiert in 100 ul "ABM2 komplett" als Adjuvans (Sebak, Aidenbach) am Tag 0. An den Tagen 14, 28 und 42 wurden Verstärkungs-Injektionen mit einer gleichen Menge Antigen, suspendiert in 100 ul Al(OH)&sub3;, verabreicht. Am Tag 49 wurde den Tieren zur Serum-Gewinnung für die Bestimmung der Antikörper-Titer in den vereinten Seren von 7-10 Mäusen aus jeder Gruppe Blut aus der Schwanzvene entnommen. 4 Tage später erhielten alle Tiere eine immunsuppressive Behandlung. Für die Immunsuppression erhielten die Mäuse an den Tagen 53, 55 und 57 3 Injektionen von 150 ug Cyclophosphamid (Serva, Heidelberg, Deutschland) pro g Körpergewicht in 0,25 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (phosphate-buffered sahne; PBS). Am Tag 58 wurde jede Antigengruppe in 4 Untergruppen, I, II, III, IV aufgeteilt, wobei jede Untergruppe 16 bis 17 Tiere enthielt. Die Mäuse der Gruppen A bis D erhielten intraperitoneal entweder 5 · 10¹ (Untergruppe I), 5 · 10² (Untergruppe II), 5 · 10³ (Untergruppe III) oder 5 · 10&sup4; (Untergruppe IV) CFU (colony forming units) Pseudomonas aeruginosa der Serumgruppe I. 15 weitere nicht immunisierte Mäuse wurden ausschließlich einer Immunsuppression ohne bakterielle Infektion unterzogen. Diese Kontrollgruppe wurde verwendet, um das Stadium der Leukopenie zu bestimmen und unspezifische Infektionen auszuschließen. Alle überlebenden Tiere wurden nach der Infektion 10 Tage lang überwacht.

Expression und Reinigung von rekombinantem OprF-OprI in Hefe:

Für die Expression des Pseudomonas aeruginosa-Außenmembranproteins in S. cerevisiae wurde der Hefe/E.coli Shuttle-Vektor pYepsec1 (Baldari, C. et al. (1987) EMBO J. 6, S. 229-234) verwendet. Dieses Plasmid exprimiert Polypeptide, die mit der Signalsequenz des Kluyveromyces lactis-Killer-Toxin fusioniert sind. Das Nco I/Hind III-DNA- Fragment aus pGEX-OprF-OprI, welches das OprF-OprI-Hybridprotein codiert, wurde isoliert und in pYepsec1 cloniert, der mit BamH I und Hind III aufgespalten worden war (wobei pYepsec1-F-I erhalten wurde). Die Nco I- und BamH I-Stellen wurden vor der Ligierung mit Klenow-Enzym in glatte Enden überführt, wobei die HindIII-Stelle nicht behandelt wurde. Das lösliche OprF-OprI-Hybridprotein, welches in Hefe exprimiert wurde, wurde durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers, welcher gegen das Epitop D1 gerichtet ist, gereinigt. Der Mab (monoclonal antibody) wurde an BrCN-alctivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) gekoppelt, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Hefe-Extrakte in PBS wurden auf die Säule geladen, unspezifisch gebundenes Material wurde mit 0,1 M Glycinpuffer pH 9,0, enthaltend 0,5 M NaCl, eluiert. Die Elutionen des OprI-OprF-Hybridproteins wurden in 0,1 M Glycinpuffer, pH 11,0 durchgeführt. Die Säule wurde durch Waschen mit 0,1 M Glycin, pH 2,5 gefolgt von Waschen mit PBS regeneriert.

Herstellung spezifischer Immunglobuline und passive Immunisierung:

Kaninchen wurden dreimal mit 100 ug gereinigtem rekombinantem OprF-OprI, isoliert aus S. cerevisiae-Zellextrakten (oder mit Zellextrakten aus S. cerevisiae alleine als Kontrollen), emulgiert ininkomplettem Freundschen Adjuvans, an den Tagen 0, 14 und 28 immunisiert. Am Tag 38 wurden Blutproben entnommen und zum Verklumpen über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Das Serum wurde entfernt, zentrifugiert und bei -20ºC aufbewahrt. In Gruppen von 30 weiblichen SCID-Mäusen (18-20 g, Bomholtgard, Dänemark) erhielt jedes Tier in der Gruppe entweder 0,5 ml Kaninchen-Anti-OprF-OprI-Serum oder 0,5 ml Kaninchen-Anti-Hefeserum. Als zusätzliche Kontrolle erhielten die Tiere in einer Gruppe 0,5 ml normale Kochsalzlösung. Denjenigen einer weiteren Gruppe wurden 0,5 ml Kaninchenserum, welches gegen Hitze-inaktivierte Zellen der Serumgruppe 1 von Pseudomonas aeruginosa gebildet wurde, injiziert. Nach 3 Stunden wurden die Tiere der Gruppen 1 bis 6 in 5 Untergruppen unterteilt (a-e) und erhielten 0,5 ml Pseudomonas aeruginosa-Serogruppe 1-Suspension (10¹, 10², 10³, 10&sup4; bzw. 10&sup5; CFU/ml, jeweils suspendiert in Mucin). Die überlebenden Tiere wurden während einer Woche beobachtet. 5 g Mucin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) wurden in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert, 10 Minuten mit einem Ultra-Turrax-Mixer behandelt, durch ein Sieb geschickt und 15 Minuten bei 120ºC autoklaviert. Kurz vor der Verwendung wurde die Lösung mit steriler 1 N NaOH auf pH 7,2 bis 7,4 eingestellt.

Beispiele:

Beispiel 1: Epitop-Kartierung von OprF.

Um Aminosäuresequenz-Bereiche von OprF, welche B-Zell-Epitope darstellen, als Grundlage für die Wahl eines auf Opr-beruhenden Pseudomonas aeruginosa-Impfstoffes zu identifizieren, stellten wir monoclonale Antikörper gegen ein rekombinantes Protein her, welches die Aminosäuren 58 bis 350 von OprF repräsentiert. Die Bindung der Mab's wurde mit einer Reihe von rekombinanten Teilfragmenten des OprF, die in E. coli exprimiert wurden, analysiert. Die Mab's unterschieden zwischen 5 verschiedenen Regionen: AS 190- 213 (D1), AS 212-240 (D2, SEE1), AS 239-250 (D3), AS 284-316 (D4) und AS 332-350 (D5, SEE4). Der C-terminale Teil von OprF zwischen AS 190 und AS 350 schien deshalb die meisten B-Zell-Epitope von OprF zu umfassen. Um die Epitope weiter zu analysieren, wurden synthetische Peptide hergestellt, die sich auf die vorstehend beschriebenen Aminosäure-Bereiche beziehen, und an KLH konjugiert. Polyclonale Antiseren gegen diese Peptide wurden in Kaninchen gebildet. Tabelle 1 zeigt, dass die Peptide D1 bis D5 von den entsprechenden polyclonalen Antiseren erkannt werden. Die Peptide D1, D2, D4 und D5 reagierten mit monoclonalen Antikörpern und die Peptide D2, D3, D4 und D5 wurden auch von polyclonalen Antikörpern erkannt, welche gegen rekombinantes OprF gebildet wurden, wobei bestätigt wurde, dass diese 5 Epitope von B-Zellen abstammen. Die gegen D3, D4 und D5 gebildeten Antiseren erkannten OprF in Western Blot-Analysen, lebende P. aeroginosa-Zellen jedoch zeigten nur nach Inkubation mit den Antiseren, die gegen D2 und D5 gebildet wurden, positive Fluoreszenz. Deshalb scheinen diese beiden Epitope Oberflächen-exponiert zu sein. Zusätzliche Mab's wurden identifiziert, die mit keinem der synthetischen Peptide reagierten, jedoch GST-OprF und weitere rekombinante Teilfragmente erkannten, was zu zwei zusätzlichen Epitopen, D6 und D7, führte, welche den Aminosäureresten 240 bis 316 bzw. 190 bis 250 entsprechen. Deshalb gingen wir davon aus, daß die Region von Aminosäure 190 bis Aminosäure 350 des OprF wichtige antigene Regionen beinhaltet und wir beschlossen zu ermitteln, ob rekombinante Proteine, welche diese Epitope tragen, in der Lage sind in Tiermodellen Schutz bereitzustellen.

Beispiel 2: Epitop-Kartierung von OprI.

Mit den Mab's 2A1, 6A4 und 5B4, welche gegen natives OprI gebildet wurden, wurden zwei verschiedene Epitope charakterisiert (Finke, M. et al. (1991), Infect. Immun. 59, S. 1251-1254). Mab-2A1, welcher schützende Wirkung gegen P. aeruginosa-Infektion gezeigt hatte, erkannte das N-terminal lokalisierte Epitop. Nachfolgende Studien zeigten, daß 2A1 nur bindet, wenn die gesamte Aminosäuresequenz von Aminosäure 21 bis Aminosäure 83 exprimiert wird. Für die Herstellung rekombinanter OprI-Antigene zur Verwendung als Untereinheiten-Impfstoff gingen wir deshalb davon aus, dass die vollständige Aminosäureregion 21-83 das angemessenste Antigen darstellt.

Beispiel 3: Expression von Opr's in E. coli:

Die Effizienz eines einzelnen Außenmembranproteins von P. aeruginosa in einem Impfstoff gegen P. aeruginosa-Infektion könnte durch Coexpression der fusionierten Epitope von zwei verschiedenen Opr's verbessert werden. Vier verschiedene Glutathion-S- Transferase-Fusionsproteine wurden in großen Mengen in E. coli exprimiert: GST-OprF (AS 190-350), GST-OprI (AS 21-83), GST-OprF (AS 190-342)-OprI (AS 21-83) und GST- OprI (AS 21-83)-OprF (AS 190-350) (Fig. 1). Die rekombinanten Proteine konnten durch Affinitäts-Chromatographie an immobilisiertem Glutathion zu etwa 80% gereinigt werden. Western Blot-Analysen der vier rekombinanten Produkte mit den Mab's 6A4 und 2A1, die für OprI spezifisch sind und verschiedenen OprF-spezifischen Mab's, welche gegen die Eptiope D1, D2, D4, D5, D6 und D7 gerichtet sind, zeigten, daß die Mab-spezifischen Epitope durch die rekombinanten Fusionsproteine exprimiert wurden.

Beispiel 4: Aktive Immunisierung mit Fusionsproteinen, welche von E. coli erhalten wurden.

Mäuse wurden viermal in Intervallen von zwei Wochen mit 100 ug rekombinantem GST-gekoppeltem Fusionsprotein oder GST alleine, suspendiert in "ABM complete"- Adjuvans, immunisiert. Die Antikörper-Titer der vereinten Seren von jeweils 8-10 Mäusen wurden durch ELISA sowie Western-Blot auf Bindungsaktivität für P. aeruginosa und durch ELISA gegen die Peptide D1 bis D5 getestet.
Fig. 2 zeigt, dass bis zu Serumverdünnungen von 1 : 15625 spezifische Antikörper- Titer gegen P. aeruginosa in allen immunisierten Gruppen erhalten wurden. Western-Blot- Analyse der Seren mit P. aeruginosa-Polypeptiden ergab eine spezifische Färbung von OprI und von OprF durch Seren von allen immunisierten Gruppen. Keine OprI- oder OprF- Färbung wurde in der GST-immunisierten Kontrollgruppe beobachtet. Weitere Analysen der Seren gegen die Peptide D1-D5 (Fig. 3) zeigten, dass in GST-OprF-OprI- sowie GST- OprI-OprF-immunisierten Tieren die Peptide D5 und D4 vorherrschten. Um zu testen, ob die induzierten Antikörper gegen Außenmembranfusionsproteine Mäuse gegen die Infektion mit P. aeruginosa schützen, erhielten die Mäuse 3 Dosen Cyclophosphamid zur Immunsuppression. Die Zahl der Leukocyten, welche in peripheren Blutproben von 15 nicht- immunisierten Kontrolltieren bestimmt wurde, fiel auf durchschnittliche Werte von unterhalb 400/ul. 1 Tag später wurden die Tiere mit entweder 5 · 10¹, 5 · 10², 5 · 10³ oder 5 · 10&sup4; CFU P. aeruginosa der Serogruppe 1 infiziert. Die Überlebensrate der Tiere wurde für eine Woche registriert. Fig. 4 und Tabelle 2 zeigen die Überlebensraten der Tiere nach vier unterschiedlichen Infektionsdosen und die LD&sub5;&sub0;-Werte wurden für jeden der Impfstoffe durch Probit-Regressionsanalyse berechnet. Für die Gruppen, welche nur mit GST- oder mit GST-OprI-OprF immunisiert wurden, wurden LD&sub5;&sub0;-Werte von nur 1,58 und 2,65 berechnet. Die gleichzeitige Impfung mit einem Gemisch aus GST-OprI und GST-OprF induzierte einen Anstieg der LD&sub5;&sub0;-Werte auf 83,3 CFU. Dieser Unterschied war jedoch statistisch nicht signifikant. Im Gegensatz dazu wurde nach Impfung mit dem Hybrid GST- OprF-OprI eine hochsignifikante Verschiebung der LD&sub5;&sub0;-Werte zu 1540 CFU berechnet (p ≤ 0,001). Verglichen mit den GST-immunisierten Kontrollen, wurde für die GST-OprF- OprI-Gruppe ein Schutzwert von 962 berechnet. Diese Ergebnisse (p ≤ 0,001) konnten in einem identisch konzipierten zweiten Experiment bestätigt werden.
Die Analyse der Werte durch das proportionale Risikomodell und die Berechnung der Verringerung der Anstiegsraten, welche durch die unterschiedlichen Impfstoff- Präparationen induziert wurden, ist in Tabelle zwei gezeigt. Die Impfung mit GST-OprF- OprI reduzierte das Risikoverhältnis im Vergleich zu den GST-immunisierten Kontrollen hoch signifikant (p ≤ 0,0001) auf einen Wert von 0,3. Sogar für eine Infektionsdosis von 5 · 10³ CFU wurde durch Rückwärts-Eliminierung für die GST-OprF-OprI geimpfte Gruppe mit Bezug auf die mit GST, GST-OprF + GST-OprI und GST-OprI-OprF immunisierten Gruppen und den Dosen 1 und 2 (5 · 10¹ und 5 · 10²) eine signifikante Erniedrigung (p ≤ 0,0019) des Risikoverhältnisses auf einen Wert von 0,69 berechnet.

Beispiel 5: Die Expression von OprF-OprI in Hefe.

Für die Expression des OprF-OprI-Hybridproteins ohne eine zusätzliche Fusionskomponente wählten wir als eine alternative Wirtszelle Saccharomyces cerevisiae und als Plasmid pYepsec1. Das in pYepsec1-F-I (Fig. 1) enthaltene OprF-OprI wurde in nur geringen Mengen in S. cerevisiae exprimiert. Da OprF und OprI in Pseudomonadaceen über den periplasmatischen Raum exportiert werden, versuchten wir den Export in S. cerevisiae nachzuahmen. Dazu wurde das Ende des OprF-OprI-Hybridproteins mit der Sekretions- Signalsequenz des Killer-Toxins (kt) der Hefe Kluyveromyces lactis fusioniert. Das dreiteilige Hybridprotein kt. OprF-OprI, welches von pYepsec1-F-I (Fig. 1) codiert wird, besteht nun aus den folgenden Polypeptidsträngen: Als erstes sind da die 16 Aminosäuren der Hefe-Sekretions-Signalsequenz gefolgt von 9 Aminosäuren, die von einem DNA-Linker codiert werden, und danach vom OprF-spezifischen Polypeptidstrang von Aminosäure 190- 342 und einem OprI-Peptid, welches die Aminosäuren 21-83 enthält. Das OprF-spezifische Polypeptid trägt die potentielle Glycosylierungsstelle Asparagin-X-Threonin (siehe Fig. 1) zweimal. Diese Glycosylierungsstellen sollten erkennbar sein, wenn das Fusionsprotein in den sekretorischen Stoffwechselweg eintritt. Nach Fusion mit der Killer-Toxin-Erkennungssequenz wurde OprF-OprI durch Western Blot-Analysen in Hefe-Zellextrakten nachgewiesen, wenn es unter induzierten Bedingungen des UASGAL/CYC1-Promotor exprimiert wurde, es wurde jedoch kein sekretiertes Antigen in der Kulturbrühe nachgewiesen.
Das OprF-OprI-Fusionsprotein, welches in Hefe exprimiert wurde, zeigte im SDS- Polyacrylamid-Gel kein Laufverhalten als scharfe Bande, sondern zeigte eine heterogene Verteilung, welche sich in einigen diffusen Banden äusserte. Dies zeigt eine posttranslationale Modifikation durch N-Glycosylierung an. Die Behandlung des rekombinanten P. aeruginosa-Antigens mit Endoglycosidase F resultierte in dem Auftreten einer scharfen Bande mit niedrigem Molekulargewicht, was bedeutet, dass OprF-OprI in den sekretorischen Stoffwechselweg eintritt, wenn es mit der Killer-Toxin-Erkennungssequenz fusioniert wird, und die Glycosylierung von mindestens einer der zwei potentiellen Glycosylierungsstellen.

Beispiel 6: Passive Immunisierung mit Antikörpern gegen OprF-OprI aus Hefe.

Das rekombinante Pseudomonas-Antigen wurde aus den Überständen von Hefezell- Extrakten durch Ammoniumsalz-Fällung und Immunaffinitäts-Chromatographie angereichert, wobei ein Anti-OprF-Maus-monoclonaler Antikörper verwendet wurde, der gegen das Epitop D1 gerichtet ist. Kaninchen wurden dann dreimal mit dem Antigen immunisiert und die Seren der Tiere wurden gesammelt. Während die Präimmunseren weder mit P. aeruginosa-OprF noch -OprI eine Reaktion zeigten, reagierten die Seren der immunisierten Kaninchen spezifisch mit den Außenmembranproteinen OprF und OprI der drei verschiedenen ATCC-Stämme von P. aeruginosa sowie mit den drei verschiedenen klinischen Isolaten von P. aeruginosa, welche getestet wurden. Die schützende Wirkung dieser Seren zur Abwehr gegen eine letale Infektion mit P. aeruginosa wurde in SCID-Mäusen getestet. Wie in Tabelle 3 gezeigt wurden Mäuse, die mit dem Kontroll-Anti-Hefeserum injiziert wurden, sogar bei einer Infektionsdosis von 5 · 10¹ (Tabelle 3, Gruppe 1) nicht gegen die Infektion geschützt. Andererseits wurden Mäuse, welche das OprF-OprI-spezifische Kaninchenserum erhielten, vollständig gegen eine 5 · 10² CFU-Infektionsdosis von P. aeruginosa geschützt (Tab. 3, Gruppe 3) und einer 40% Überlebensrate wurde beobachtet nach Infektion mit 5 · 10³ CFU. Als eine zusätzliche Kontrolle wurde die schützende Wirkung von Kaninchenserum getestet, welches gegen LPS des Infektions-Stammes P. aeruginosa der Serumgruppe 1 gerichtet war. 100% der Tiere, die mit LPS-spezifischem Serum geschützt wurden, überlebten bis zu einer Infektionsdosis von 5 · 10³ (Tab. 3, Gruppe 5). Mit einer zehnfach höheren Infektionsdosis von 5 · 10&sup4; konnten keine Überlebenden in dieser Gruppe beobachtet werden. Um die schützende Dosis von OprF-OprI- spezifischem Serum, LPS-spezifischem Serum und der Anti-Hefe-Kontrollgruppe zur Abwehr einer P. aeruginosa-Infektion zu vergleichen, wurde eine statistische Analyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine 85-fache Erhöhung im Wirkungsgrad mit OprF- OprI-Serum im Vergleich mit dem Anti-Hefeserum (p ≤ 0,002, siehe Tab. 3, Gruppe 3). Ein 325-fach höherer Wirkungsgrad als für das Anti-Hefeserum wurde für das LPS-spezifische Serum berechnet (p ≤ 0,001). Tabelle 1: Charakterisierung von B-Zell Epitopen des OprF von P. aeruginosa
*Mak's gegen ein rekombinantes Protein, welches die Aminosäuren 58-350 von OprF darstellt, wurden in Mäusen induziert, Bindung an die Peptide D1-D5 wurde durch ELISA analysiert.
**Kaninchen wurden mit Peptiden, welche an KLH gekoppelt sind, immunisiert.
***Bestimmt mit P. aeruginosa der Serogruppe 11 (ATCC33359) Tabelle 2: Statistische Analyse der Überlebensrate von Mäusen*
*Mäuse wurden mit den angegebenen GST-gekoppelten rekombinanten Opr's oder mit GST als Kontrolle geimpft.
**LD&sub5;&sub0;-Werte wurden durch Probit-Analyse berechnet (Finney, D. J. (1971) Probit Analysis, Cambrige University Press, Cambridge).
++P < 0,05 gegen die GST-Gruppe, +++P < 0,0001 gegen die GST-Gruppe.
***Die Risikoverhältnisse wurden nach dem proportionalen Hazard-Modell berechnet (Lawless, J. F. (1982), Statistical Methods for Lifetime Data, John Willey & Sons, New York), wobei auf die GST-Gruppe bezogen wurde. Tabelle 3: Schutz gegen P: aeruginosa-Infektion in SCID-Mäusen durch Kaninchen-Anti-OprF-OprI-Seren.
*Kaninchenserum von Tieren, welche mit dem angegebenen Antigen immunisiert wurden.
**Weibliche C. B-17 scid/scid-Mäuse (SCID) wurden intrapertioneal mit den angegebenen Kolonie-bildenden Einheiten (colonie forming units; CFU) von P. aeruginosa der Serogruppe 1, suspendiert mit 0,5 ml Mucin, infiziert.
***Kaninschenserum der Tiere, welche mit P. aeruginosa der Serogruppe 1 immunisiert wurden. Statistische Analyse (Probit-Analyse für das parelle Reihenmodell); Gruppe 1 gegen Gruppe 3: 85-facher Anstieg im Wirkungsgrad, Signifikanz (Chi-Quadrat), 0,002. Gruppe 1 gegen Gruppe 5; 325-facher Anstieg im Wirkungsgrad, Signifikanz 0,001.

Legende zu den Figuren:

Fig. 1

Schematische Übersicht der konstruierten rekombinanten Fusionsproteine der Außenmembranproteine von P. aeruginosa. Zur Expression in E. coli K12 wurde der Vektor pGEX-2A verwendet, der die Glutathion-S- Transferase codiert.

Fig. 2

Bestimmung der Antikörper-Titer gegen P. aeruginosa in Seren von Mäusen, welche mit den angegebenen GST-gekoppelten rekombinanten Außenmembran-Impfstoffen oder mit GST alleine immunisiert wurden. Die ELISA-Messungen wurden auf Platten durchgeführt, die mit Ultraschall-geschertem P. aeruginosa der Serogruppe 12 beschichtet waren.

Fig. 3

Antikörperbestimmung durch ELISA gegen die in Tabelle I aufgelisteten Peptide D1-D5, welche B-Zell-Epitope von OprF darstellen. Die Mäuse wurden viermal mit den angegebenen rekombinanten Fusionsproteinen oder GST alleine immunisiert.

Fig. 4

Überlebensrate der BALB/c-Mäuse nach Immunisierung mit dem angegebenen Impfstoff oder GST alleine, gefolgt von Immunsuppression und intraperitonealer Infektion mit 5,50, 500 oder 5000 Kolonie-bildenden Einheiten von P. aeruginosa der Serogruppe 1. Die Balken repräsentieren die prozentuale Überlebensrate (N = 16-17) pro Infektionsdosis.

Claims

1. Hybridprotein, umfassend das Pseudomonas aeruginosa-Außenmembranprotein I, das mit seinem aminoterminalen Ende an das carboxyterminale Ende eines carboxyterminalen Teils des Pseudomonas aeruginosa-Außenmembranproteins F fusioniert ist, wobei der carboxyterminale Teil die Aminosäuresequenz 190-350 umfasst.

2. Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei der carboxyterminale Teil die Aminosäuresequenz 190-342 ist.

3. Impfstoff, umfassend ein Hybridprotein nach Anspruch 1 oder 2.

4. Nucleinsäure, die das Hybridprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.

5. Verfahren zur Herstellung des Hybridproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Veranlassung der Expression der Nucleinsäure nach Anspruch 4 in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen.