DE69836520T2

DE69836520T2 - Clostridium perfringens Impfstoff

Info

Publication number: DE69836520T2
Application number: DE69836520T
Authority: DE
Inventors: Ruud Philip Antoon Maria Sergers; Nicolas Robin Cherry Hinton Waterfield; Peer Lyng Frandsen; Jeremy Mark Balsham Wells
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1998-06-17
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2018-06-18
Also published as: JP4234232B2; HUP9801384A3; ES2276448T3; TWI221847B; HU9801384D0; CN101914145A; HUP9801384A2; JPH11103872A; KR19990007306A; BR9802361A; CA2235445A1; CN1215729A; EP0892054A1; EP0892054B1; AU7308798A; AU743498B2; ZA985393B; ATE346931T1; DE69836520D1; DK0892054T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft entgiftete immunogene Derivate von Clostridium perfringens β-Toxin, DNS, die solche Derivate kodiert, Clostridium perfringens Bakterien, die DNS umfassen, welche solche Derivate kodiert, Gram-positive bakterielle Expressionssysteme, umfassend DNS, die solche Derivate kodieren, nicht-Clostridium perfringens-basierte Gram-positive bakterielle Expressionssysteme, die das Wildtypus β-Toxin exprimieren, Impfstoffe zum Bekämpfen von Clostridium perfringens, darauf basierend, Verfahren zur Herstellung eines nativen Clostridium perfringens β-Toxins, Verfahren zur Herstellung von entgifteten immunogenen Derivaten von Clostridium perfringens β-Toxin und Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen zum Bekämpfen von Clostridium perfringens. Clostridium perfringens (auch bekannt als C. welchii) ist eine Art der grossen Clostridium-Gattung. Alle Bakterien, die dieser Gattung zugehören, sind sporenbildende anaerobe Gram-positive Bakterien. Die Art C. perfringens kann in einige Unterarten unterteilt werden. Fünf Unterarten sind beschrieben worden. Diese Unterarten sind allgemein bekannt als "Typ" A-E. Alle Unterarten erzeugen einige Gifte, sowohl stärkere als auch schwächere Gifte. Die vier Hauptgifte sind α, β, ε und ι-Toxin. Alle C. perfringens-Typen produzieren das α-Toxin. Das β-Toxin wird von C. perfringens-Typen B und C erzeugt. Zusätzlich wird ein Bereich von geringeren Toxinen von allen C. perfringens-Typen hergestellt. Es liegt im wesentlichen an der Anwesenheit von einer oder mehreren dieser verschiedenen Toxine in den fünf C. perfringens-Typen, dass alle C. perfringens-Arten pathogen sind.
Typ A gilt als pathogen für sowohl den Menschen als auch Schweine. Typ B ist im wesentlichen pathogen für Lämmer, Schafe und Ziegen, und bewirkt die "Lammdysenterie" und die haemoragische Enteritis. Typ C ist pathogen für den Menschen, Schaf, Kalb, Lamm, Schwein und Vogel. Es ist die Ursache für "schlagartige", haemorage Enteritis, nekrotisierende Enteritis und Enterotoxämie.
Wie oben angedeutet ist es sowohl für C. perfringens-Typ B als auch für Typ C bekannt, dass sie β-Toxin herstellen. Das β-Toxin spielt eine wesentliche Rolle in der Pathogenese von nekrotisierender Enteritis in sowohl dem Menschen als auch dem Tier. Bei Menschen ist diese Krankheit "PigBel" genannt worden (Johnson et al.: Lancet ii: 496-500, (1987)). Bei Tieren ist die nekrotisierende Enteritis beschrieben worden bei Kälbern, Lämmern und Schweinen (Hauschild, A.H.W. in S. Kadis, T.C. Montie, (Herausgeber) Microbial toxins, Seiten 159-188. Academic press, Inc, New York (1971) und Willis, T.A. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice, 3. Ausgabe, Butterworths, London (1977)).
Das β-Toxin von Clostridium perfringens ist in reiner Form isoliert worden (Sakurai et al., Infect. & Immun. 18: 741-745 (1977), Sakurai et al., Toxicon 25: 1301-1310 (1987)). Aber vieles ist immer noch unbekannt zu den biophysikalischen Eigenschaften des Toxins und daher über seine Wirkungsweise. Aufgrund der Tatsache, dass es in gereinigter Form erhalten werden könnte, konnte die Giftigkeit von β-Toxin in klarer Weise in Tieren belegt werden. Die letale Giftigkeit des gereinigten β-Toxins beispielsweise für Mäuse und Meerschweinchen ist durch Sakurai et al. (Infect. & Immun. 21: 678-680 (1978), Sakurai et al., Toxicon 25: 1301-1310)1987)) gezeigt worden.
Kürzlich ist die Nukleinsäuresequenz des Clostridium perfringens β-Toxin durch Hunter et al. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) aufgezeigt worden. Die Nukleinsäuresequenz zeigte die Grösse des β-Toxin-Proteins bei ungefähr 35 kD.
Aufgrund der Tatsache, dass die Rolle von Clostridium perfringens β-Toxin zwischen Typ B und C in der Pathogenese von solch überragender Wesentlichkeit ist, ist viel Effort in die Entwicklung einer Immunität gegen dieses Toxin gesteckt worden. Die Immunität gegen das β-Toxin ist ausreichend, um gegen Clostridium perfringens Typ B und Typ C-Infektionen zu schützen. Der einzige Weg, Immunität gegen das β-Toxin zu induzieren, ist das Toxin dem zu schützenden Tier zu verabreichen. Es ist jedoch klar, dass das Toxin in entgifteter Form zu geben ist, da eine anderweitige Verabreichung zu schwerer Krankheit oder Tod des zu impfenden Tieres führen würde.
Impfstoffe, die auf dem entgifteten β-Toxin basieren, auch sogenannte β-Toxoide, sind seit ungefähr 1960 verfügbar (siehe beispielsweise das britische Patent GB 901,433 und das US Patent Nr. US 3,288,680 ).
Alle derzeit verfügbaren Impfstoffe basieren auf inaktiviertem Clostridium perfringens β-Toxin, die jedoch wesentliche Nachteile aufweisen.
Zuerst umfassen alle β-Toxin-basierten Impfstoffe chemisch entgiftete, im wesentlichen Formalin-entgiftete β-Toxine und es ist durch die Jahre hindurch aufgezeigt worden, dass es sehr schwierig ist, diese chemischen Entgiftungsprozesse zu standardisieren.
Ein Beispiel eines solchen Anti-Clostridium-Impfstoffs, basierend auf der Formalin-Entgiftung der Clostridium-Toxine ist in der britischen Anmeldung GB 2,030,451 gegeben.
Die klassischen chemischen Verfahren zur Entgiftung von Proteinen haben den Nachteil, dass sie die Gesamtstruktur des Proteins in einer ziemlich zufälligen Weise verändern. Als ein Ergebnis vermindern sich während des Verfahrens der chemischen Entgiftung die immunogenen Eigenschaften des β-Toxins in drastischer Weise. Dies kann beispielsweise aus den Graphen 1 und 2 gesehen werden. Im Graphen 2 ist gezeigt, dass mindestens 1% Formalin, eine sehr übliche benutzte Inaktivierungsverbindunq, notwendig ist, um β-Toxin unter gewissen Standardbedingungen zu entgiften. Von Graph 1 zu Graph 2 kann jedoch gesehen werden, dass die Antigenizität im Titer auch in dramatischer Weise mit einer Erhöhung von Formalin abfällt. Ein voller Titer kann sowieso nicht erhalten werden, weil die geringste Menge an Formalin, die für die Entgiftung (Graph 2) notwendig ist, bereits eine Verminderung des Titers ergibt. Dies impliziert, dass nur ein sehr geringes Band besteht, in welchem sowohl die Entgiftung als auch ein vernünftiger Titer und damit eine gewisse Imunogenizität erhalten werden kann. Wenn man sich dieses schmale Band ansieht und die Tatsache, dass mindestens drei Variablen bestehen; die Zeit der Entgiftung, die Temperatur und die präzise Formalin-Konzentration ist es klar, dass es schwierig ist in reproduzierbarer Weise entgiftetes β-Toxin herzustellen. Ein anderer Ansatz für die Entgiftung von β-Toxin ist daher stark nachgefragt. Bis jetzt ist keine akzeptable Alternative aufgefunden worden und dies aus dem folgenden Grund: Die schwierige Balance zwischen einem ausreichenden Niveau der Entgiftung und einer verbleibenden Immunogenizität impliziert eine enge Verbindung von einerseits der Struktur des Proteins und andererseits der biologischen Eigenschaften des Proteins. Es konnte daher nicht erwartet werden, die Proteinstruktur zu ändern, um das Protein zu entgiften, ohne zur gleichen Zeit in wesentlicher Weise die immunogenen Charakteristika des Proteins einzuschränken.
Es ist einer der Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung, dass sie zum ersten Mal einen Weg aufzeigt, um das oben genannte Problem zu vermeiden: unter Einsatz von gentechnische Manipulationstechniken sind spezifische und relativ grosse Aminosäurebereiche in überraschender Weise gefunden worden, die mutieren können, um die gewünschten nicht-giftigen Derivate von β-Toxin zu liefern, ohne in wesentlicher Weise die notwendigen immunogenen Eigenschaften einzuschränken.
Daher betrifft die Erfindung gemäss einer Ausführung entgiftete immunogene Derivate des Clostridium perfringens β-Toxin oder ein immunogenes Fragment davon, welches mindestens eine Mutation in seiner Aminosäuresequenz aufweist, die nicht in dem Wildtyp-β-Toxin aufgefunden werden kann, wie dies in den Ansprüchen definiert ist. Ein immunogenes Fragment davon wird als ein Fragment verstanden, dass, obwohl es nicht die volle Länge an Aminosäuresequenz des Derivats des β-Toxins umfasst, immer noch jene Bereiche des Derivats umfasst, die fähig sind, eine Schutzimmunantwort in dem Host-Tier zu induzieren, und die Mutationen umfasst, wie sie in den Ansprüchen definiert sind.
Eine Mutation wird verstanden als ein Wechsel in der Aminosäuresequenz des Derivats des β-Toxins im Vergleich zur Aminosäuresequenz des Wild-Typ-β-Toxins.
Die Mutation ist eine Substitution, eine Löschung, eine Einfügung oder eine Inversion oder eine Kombination von diesen Techniken. Eine Mutation kann beispielsweise dergestalt sein, dass eine oder mehrer Aminosäuren des β-Toxins durch andere Aminosäuren ersetzt werden, die andere Eigenschaften haben. Ein geeigneter Ersatz ist beispielsweise der Ersatz einer negativ geladenen Aminosäure durch eine positiv geladene Aminosäure, wie der Ersatz von Aspartat durch Lysin. Eine andere geeignete Ersetzung ist diejenige einer aromatischen Aminosäure durch eine aliphatische: beispielsweise Tryptophan durch Glycin. Auch ist der Ersatz einer hydrophoben Aminosäure durch eine hydrophile geeignet, wie der Ersatz von beispielsweise Isoleucin durch Aspartat.
Daher bezieht sich die Erfindung in einer bevorzugten Form auf Derivate von β-Toxin gemäss der Erfindung, wobei mindestens eine Mutation eine Ersetzungsmutation ist.
Es ist klar, dass neben der Ersetzung auch Mutationen, die die Einfügung und/oder Löschung von einer oder mehrerer Aminosäuren umfassend nicht-giftige Derivate von β-Toxin liefern, die immer noch fähig sind, immunologische Antworten zu induzieren, die dann auch Teil der Erfindung sind. Daher bezieht sich in einer ebenfalls bevorzugten Form die Erfindung auf Derivate von β-Toxin gemäss der Erfindung, bei denen mindestens eine Mutation eine Löschung oder eine Einfügung ist.
Wenn zwei oder mehr Mutationen durchgeführt werden, sind Kombinationen von Ersetzungs- und Löschungs-/Einfügungs-Mutationen ebenfalls möglich.
Ein Derivat von β-Toxin wird als nicht-giftig bezeichnet, falls sein LD50-Wert (das heisst die letale Dosis, die 50% aller Tiere in einem Experiment tötet) bei Mäusen mindestens zehnmal höher ist als die LD50 des nativen β-Toxins. Die LD50 des nativen β-Toxins ist ungefähr 0.15 μg/Maus.
Wie erwähnt, ist es einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung, dass im Gegensatz zu dem, was vom Stand der Technik angenommen worden ist, es möglich gefunden worden ist, die Aminosäuresequenz des β-Toxins dergestalt zu verändern, dass ein nicht-giftiges und immer noch immunogenes Toxoid erhalten werden kann. Nicht alle Mutationen werden jedoch zu den gewünschten nicht-giftigen und immer noch immunogenen Derivaten von β-Toxin führen. Daher ist ein Test für das schnelle Screenen und die Auswahl von Mutanten entwickelt worden, die ein nicht-giftiges Derivat von β-Toxin erzeugen, welches immer noch immunogen ist. Dieser Test gestattet das Screenen einer grossen Anzahl von Mutanten, die nicht-giftige und immer noch immunogene von β-Toxin liefern. Dieser Test wird nun im Folgenden beschrieben.
Es ist auch gefunden worden, dass diese Bereiche, die einen Übergangsbereich zwischen neutralen und hydrophilen Teilen des β-Toxins bilden, als Zielbereich für die Einführung von Mutationen geeignet sind, die zu nicht-giftigen Derivaten von β-Toxin mit den gewünschten Eigenschaften führen.
Diese Bereiche können in einfacher Weise durch das Anwenden des Hopp-Woods Algorithmus auf die Sequenz des β-Toxins verfolgt werden (Hopp und Woods; Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828 (1981)).
Daher betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführung dieses Ausführungsbeispiels Derivate von β-Toxin, die eine Mutation haben, die in einem Übergangsbereich zwischen neutralen und hydrophilen Teilen des β-Toxins angeordnet sind.
Bereiche, die als Zielbereiche für Mutationen sehr geeignet sind, liegen bei der Position 62, bei der Position 182, bei der Position 197, zwischen den Aminosäurenzahlen 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 in Bezug auf die Peptidführer-Methionin und im Bereich abwärts der einzigen Zystein-Position bei der Aminosäuren-Position 292.
In einer nochmals bevorzugten Form betrifft die Erfindung Derivate von β-Toxin, die eine Mutation aufweisen, die in mindestens einem der Bereiche an den Positionen 62, 182, 197 und zwischen den Aminosäuren Nr. 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 und/oder dem Bereich abwärts der Aminosäure-Position 292 relativ zum Peptidführer-Methionin angeordnet sind.
Es ist nochmals bevorzugt, dass die Mutationen am Ort 62, an den Positionen 80-82, an den Positionen 95-97, an den Positionen 101-103, an den Positionen 145-147, an der Position 182, an der Position 197, an den Positionen 287-291, an den Positionen 295-299 angeordnet sind.
Nicht-giftige immunogene Derivate des β-Toxins gemäss der Erfindung können durch chemischen Ersatz oder Modifikation der Aminosäuren in dem Protein hergestellt werden.
Sie können auch durch Einfügen von Mutationen in dem Gen hergestellt werden, welches das β-Toxin kodiert. Verfahren zur Einführung von Mutationen in DNS-Fragmenten sind unten beschrieben. Die mutierten DNS-Fragmente können beispielsweise in einer Nucleotidsequenz geklont werden, wie einem geeigneten Expressionsplasmid und nachfolgend exprimiert werden.
Daher betrifft die Erfindung gemäss einer anderen Ausführungsform Nucleotidsequenzen, die ein mutiertes DNS-Fragment umfassen, welches eine Charakteristik aufweist, dass es ein genetisch entgiftetes immunogenes Derivat von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon kodiert.
Wie oben erwähnt, betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Form dieses Ausführungsbeispiels Derivate von β-Toxin, welche eine Mutation aufweisen, die in einem Übergangsbereich zwischen neutralen und hydrophilen Teilen des β-Toxins angeordnet ist. Solch ein Derivat von β-Toxin kann dadurch hergestellt werden, dass ein DNS-Fragment exprimiert wird, welches ein solches Derivat von β-Toxin exprimiert.
Daher hat in einer bevorzugten Ausführungsform das mutierte DNS-Fragment, welches die Derivate von β-Toxin kodiert, eine Mutation in mindestens einem DNS-Bereich, der einen Übergangsbereich zwischen neutralen hydrophilen Teilen der Derivate von β-Toxin kodiert.
Die entgifteten immunogenen Derivate von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss der Erfindung können beispielsweise durch das Mittel der zufälligen Mutagenese des Gens erhalten werden, welches das β-Toxin kodiert. Viele Arten zur Induzierung einer zufälligen Mutagenese sind im Stand der Technik bekannt, beispielsweise die chemisch induzierte Mutagenese, welche mutagenisierende chemische Agentien einsetzen, die Mutagenese durch ultraviolette Strahlung oder Gamma-Strahlung oder die zufällige Mutagenese unter Einsatz von rekombinanter DNS-Technologie.
Mutationen auf dem DNS-Niveau können auch an bestimmten Orten hergestellt werden: ortsgerichtete Mutagenese. Dies wird mit der Hilfe von bekannten genetischen Umformungstechniken durchgeführt. So ist es beispielsweise möglich, Restriktionsenzyme einzusetzen, um DNS-Fragmente in Zielbereichen auszuschneiden oder diese Zielbereiche umfassen und diese Fragmente durch synthetische Fragmente zu ersetzen, die eine mutierte Sequenz aufweisen. Ortgerichtete Mutagenese ist auch eine sehr geeignete Technik zur Einführung von Mutationen in den Zielbereichen.
Falls die Mutation eine Ersetzungsmutation betrifft, wird der Leserahmen natürlich unverändert bleiben. Eine Kombination von Löschung und/oder Einfügungs-Mutationen und Ersetzungsmutationen ist auch möglich.
Die DNS-Mutationstechniken, die oben beschrieben sind, sind im Stand der Technik wohl bekannt und sind beispielsweise in Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989) beschrieben.
Ein geeignetes bakterielles Expressionssystem zum Exprimieren der Derivate von β-Toxin gemäss der Erfindung ist das Clostridium perfringens Bakterium selber. Das native β-Toxin-Gen kann in einfacher Weise durch das mutierte DNS-Fragment ersetzt werden, welches die Derivate von β-Toxin gemäss der Erfindung unter Einsatz von homologer Rekombination kodiert. Homologe Rekombination ist eine im Stand der Technik wohl bekannte Arbeitsweise.
Das so erhaltene rekombinante Clostridium perfringens Bakterium erzeugt dann die genetisch entgiftete immunogene Derivate von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss der Erfindung.
Bei einem nochmals weiteren Ausführungsbeispiel bezieht sich die Erfindung auf Clostridium perfringens Bakterien, die eine Nucleotidsequenz umfassen, welches ein mutiertes DNS-Fragment wie oben beschrieben aufweist.
Einige zulässige Probleme sind jedoch während der Isolierung von sowohl toxischen als auch genetisch veränderten nicht-giftigen Derivate von Clostridium perfringens β-Toxin aus Clostridium perfringens aufgetreten. Zuerst ist Clostridium ein gefährlich zu vermehrendes Bakterium, wenn man es von dem Gesundheitsaspekt für einen Arbeiter ansieht. Wachstum von Clostridium-Arten für die Herstellung von β-Toxin muss daher unter hohen Sicherheits anforderungen stattfinden, was eine hochskalierte Produktion schwierig macht.
Zweitens, wie oben beschrieben, werden mit β-Toxin einige andere hauptsächliche/nebensächliche Toxine hergestellt. Die Isolierung und Reinigung des β-Toxins unter diesen Toxinen ist beispielsweise notwendig für die Impfstoffproduktion, was schwierig und zeitaufwändig ist.
Drittens sind die Clostridium-Arten sporenausbildende Bakterien. Es ist notwendig, aber schwierig, alle Sporen aus der β-Toxin-Herstellung zu eliminieren und zur selben Zeit die Immunogencharakteristika des β-Toxins aufrecht zu erhalten, da diese Sporen in hoher Weise gegen Wärme und Chemikalien resistent sind.
Daher besteht in klarer Weise Bedarf für Verfahren, um β-Toxin frei von anderen Clostridium-Toxinen und frei von Clostridium-Sporen zu liefern.
Nicht-Clostridium-Expressionssysteme, basierend auf dem Gramnegativen Bakterium E.coli für die Expression von Clostridiumβ-Toxin sind bereits beschrieben worden. E.coli-Systeme sind durch Hunter et al. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) für die Expression von β-Toxin-Gen eingesetzt worden. Nur ein kleineres Band entsprechend dem erwarteten 34 kD-Protein ist gefunden worden, wohingegen das meiste des β-Toxin-Proteins in grossen 118 kD-multimerischen Formen aufgetreten ist.
Steinporsdottir et al. (FEMS Microbiology Letters 130: 273-278 (1995)) versuchte, das β-Toxin-Gen in E.coli als ein Fusionsprotein to exprimieren, welches an Glutathion S-Transferase angebunden ist. Diese fanden, wie Hunter auch, nur hochmolekularge wichtige nicht natürliche β-Toxine. Es ist daher in diesem Papier zusammengefasst worden, dass das in E.coli erzeugte Protein eine Konformierung hatte, die unterschiedlich ist zum nativen β-Toxin. Es scheint daher wahrscheinlich, dass andere Clostridium-kodierte Proteine eine zusätzliche Rolle in der konformatorischen Faltung und Ausscheidung des nativen β-Toxins spielen. Dies ist für viele andere ausgeschiedene bakterielle Proteine bekannt. Aus diesem Grund und da, wie oben erwähnt, es eine heikle Balance zwischen Struktur und Immunogenezität gibt, kann für β-Toxin, welches aus anderen Quellen als Clostridium perfringens erhalten worden ist und somit eine nicht-native Form aufweist, nicht erwartet werden, dass es eine effiziente Basis für einen Impfstoff bildet, unabhängig von dem eingesetzten Expressionssystem.
Flaxman, D.T. et al, (Medical Microbiology and Immunology 185: 113/33 (1996)) erwähnten, dass sie monomerisches β-Toxin in Bacillus subtilis exprimiert haben. Sie diskutierten jedoch nicht die Expressionswerkzeuge, die sie eingesetzt haben, sie erwähnten nur die konformatorische Faltung und damit die Immunogenizität des so exprimierten β-Toxins.
Es ist überraschenderweise gefunden worden, dass die Expression des nativen β-Toxin-Gens in Gram-positiven Bakterien, die nicht Clostridium perfringens sind, ein natives β-Toxin liefern, das alle biologischen und biophysikalischen Charakteristika und Wirkungsweisen des nativen β-Toxins aufweist, wie es in Clostridium perfringens erzeugt wird, aber einige hoch wünschenswerte Vorteile über das β-Toxin hat, welches in Clostridium perfringens oder E.coli erzeugt wird: a) es ist nicht mit Clostridium perfringens Sporen verseucht, b) es ist frei von kontaminierenden Lipopolysacchariden hergestellt worden, c) es ist frei von anderen hauptsächlichen/nebensächlichen Clostridium-Toxinen hergestellt worden und d) es ist in seiner nativen Konformation.
Ein so erhaltenes β-Toxin kann mit Formalin in vorteilhafterer Weise inaktiviert werden als es beim β-Toxin der Fall ist, welches aus Clostridium erhalten worden ist, da das einzige biologische Material, welches während der Inaktivierung in Betracht zu ziehen ist, das β-Toxin selber ist: Sporen, Lipopolysaccaride und andere hauptsächliche/nebensächliche Clostridium-Toxine müssen nicht betrachtet werden, da sie per se nicht vorhanden sind.
Daher betrifft die Erfindung in einem nochmals anderen Ausführungsbeispiel Gram-positive bakterielle Expressionssysteme, bei denen das Gram-positive Bakterium nicht Clostridium perfringens ist, wobei das besagte Expressionssystem das Gen enthält, welches das Wild-Typ Clostridium perfringens β-Toxin erzeugt.
Das β-Toxin-Gen kann unter der Steuerung seines nativen Promoters sein. Es kann auch unter die Steuerung eines heterologen Promoters gestellt werden. Solch ein Promoter kann beispielsweise der Lac-Promoter (Chang et al., Nature 275: 615 (1978)) oder der Trp-Promoter sein (Goeddel et al., N.A.R. 8: 4057 1980)).
Solch ein Promoter kann ein starker Promoter sein, der zu einer Über-Expression des β-Toxins führt oder es kann ein induzierender Promoter sein. Beide Arten von Promotoren sind im Stand der Technik wohl bekannt.
Einige Expressionssysteme für Gram-positive Bakterien sind beschrieben worden und vielfach einsetzbare Expressionsplasmide zum Einsatz in verschiedenen Familien von Gram-positiven sind im Stand der Technik bekannt. Als ein Beispiel können Expressionssysteme dienen, die auf einem Enterokokken breiten Gram positiven Host-Bereich Replikon von pAMβ1 basiert sind, welches von Simon und Chopin (Biochemie 70: 559-567 (1988)) beschrieben worden ist. Derivate dieses Plasmids können für die Expression von fremden Genen eingesetzt werden in beispielsweise Streptococcus, Lactobacillus und Bacillus Species.
Innerhalb der Gruppe der Nicht-Clostridium Gram-positiven Bakterien sind die Bakterien, von denen das Genom einen relativ hohen AT-Gehalt aufweist, am besten für das Klonieren und die Expression von Genen aus der Art Clostridium geeignet. Daher wird in einer bevorzugteren Form das Gram-positive Bakterium für die Herstellung des nativen β-Toxins oder des Derivats von β-Toxin gemäss der vorliegenden Erfindung eingesetzt, ausgewählt aus der Gruppe von Lactococcus, Lactobacillus, Leuconosto, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus, Sarcina, Ruminococcus oder Listeria.
Es ist natürlich nochmals vorteilhafter, ein mutiertes β-Toxin Gen gemäss der vorliegenden Erfindung in einem Gram-positiven Bakterium anders als Clostridium zu exprimieren: in einem solchen Fall kann die Entgiftungsbehandlung mit Formalin in vollständiger weise weggelassen werden. Das so erhaltene nicht-giftige Derivat von β-Toxin hat, neben der Tatsache, dass es frei von Sporen ist, frei von Lipopoysaccariden ist, frei von anderen hauptsächlichen/nebensächlichen Clostridium-Toxin ist und in seiner nativen Form vorliegt, den zusätzlichen Vorteil, dass es per se nicht-giftig ist.
Daher bezieht sich die Erfindung in ihrer bevorzugten Form auf Gram-positive bakterielle Expressionssysteme, wobei das Grampositive Bakterium nicht Clostridium perfringens ist, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Derivat β-Toxin Gen gemäss der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon kodiert.
Ein nochmals weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Impfstoffe zum Bekämpfen von Clostridium perfringens Infektionen, basierend auf genetisch entgiften Immunogen-Derivaten von Clostridium perfringens β-Toxin. Solche Impfstoffe können durch Zumischen von immunologisch ausreichenden Mengen von entgifteten Immunogen-Derivaten von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss der Erfindung und einem physiologisch verträglichen Carrier hergestellt werden. Eine immunologisch ausreichende Menge wird verstanden als die Menge von entgifteten immunogenen Clostridium perfringens β-Toxin, welches fähig ist, eine Schutzimmunantwort in einem Host-Tier zu erzeugen.
Daher bezieht sich nochmals ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung auf Impfstoffe zum Bekämpfen von Clostridium perfringens Infektionen, die ein Derivat von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss der Erfindung oder ein immunogenes Fragment davon enthalten und einen physiologisch verträglichen Träger.
Ein physiologisch verträglicher Träger ist beispielsweise Wasser oder eine physiologische Salzlösung. Häufig wird der Impfstoff auch zusätzlich mit Stabilisatoren gemischt, beispielsweise um leicht zersetzende Polypeptide vor der Zersetzung zu schützen, um die Lagerdauer des Impfstoffs zu verbessern oder seine Gefriertrockenbarkeit. Geeignete Stabilisatoren sind unter anderem SPGA (Bovarnik et al., J. Bacteriology 59: 509 (1950)), Kohlenhydrate wie beispielsweise Sorbitol, Mannitol, Trehalose, Stärke, Sucrose, Dextran oder Glucose, Proteine wie Albumin oder Kasein oder Zersetzungsprodukte davon, und Puffer, wie Alkalimetallphosphate. Es ist nicht notwendig, hier noch einmal festzustellen, dass andere Wege zur Stabilisierung des Impfstoffes durch Zuführung von Verbindungen auch bei der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Optional können eine oder mehrere Komponenten, die eine Adjuvanz-Aktivität aufweisen, zu dem Impfstoff hinzugefügt werden. Adjuvantien sind nicht spezifische Stimulatoren des Immunsystems. Sie verbessern die Immunantwort des Hostes auf die verabreichten Immunogene. Daher umfassen die Impfstoffe gemäss der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Form ein Adjuvanz.
Beispiele von im Stand der Technik bekannten Adjuvantien sind Freunds Complete und Incomplete Adjuvanz, Vitamin E nichtionische Blockpolymere, Muramyldipeptide, ISCOMs (steht für "immune stimulating complexes", immunstimulierende Komplexe, beispielsweise nach dem europäischen Patent EP 0 109 942 ), Saponine, Mineralöl, Pflanzenöl, und Carbopol (ein Homopolymer).
Adjuvantien, welche speziell für die mucosale Anwendung geeignet sind, sind beispielsweise E.coli wärmelabiles Toxin (LT) oder Choleratoxin (CT).
Andere geeignete Adjuvantien bilden beispielsweise Aluminiumhydroxid, Phosphat oder Oxid, Öl-Emulsionen (beispielsweise Bayol F^®) oder Marcol 52^®, Saponine oder Vitamin E-Solubilisate. Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung kann unter Einsatz von Verfahren gelagert werden, die zum Lagern von Lebendimpfstoffen bekannt sind. Die Lagerung kann beispielsweise bei Temperaturen unter Null stattfinden.
Gefriertrocknet ist auch ein bekanntes und geeignetes Verfahren für die Konservierung von Impfstoffen. Gefriertrocknung hat den Vorteil, dass sie den Impfstoff stabilisiert, so dass er bei Temperaturen gelagert werden kann, die sehr viel höher sind als diejenigen, bei denen nicht-gefriergetrocknete Lager zu halten sind.
Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung kann in sehr effizienter Weise gefriergetrocknet werden, insbesondere wenn er vor der Gefriertrocknung mit Stabilisatoren gemischt worden ist, wie diejenigen, die oben erwähnt worden sind.
Der Impfstoff kann allen Hosts, die für Clostridium perfringens Typ B oder C-Infektionen empfindlich sind, verabreicht werden wie Menschen, Lamm, Schaf, Ziege, Schwein, Vogel und Kalb.
Der Impfstoff kann so früh wie am Geburtstag selbst verabreicht werden, kann aber auch zu einem anderen späteren Zeitpunkt verabreicht werden.
Impfdosen liegen vorzugsweise zwischen 1 und 100 μg des Derivats je Tier, abhängig teilweise von der Grösse des Tieres. Beispielsweise ergibt sich für Schweine eine sehr geeignete Dosis zwischen zwischen 20 und 80 μg.
Obwohl im Prinzip alle gewöhnlichen Wege der Verabreichung eingesetzt werden können, wird der Impfstoff vorzugsweise intraperitoneal, intranasal, intramuskulär, subkutan, oral oder intradermal verabreicht.
Ein nochmals weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung bezieht sich auf einen anderen Weg zur Herstellung eines Impfstoffs zum Bekämpfen von Clostridium perfringens-Infektionen. Attenuierte oder nicht-pathogene Lebend-Bakterien oder Viren, die ein Clostridium perfringens Typ B oder C empfindlichen Menschen oder Tier als Host haben, können als Träger des mutierten β-Toxin Gens der Erfindung wie oben eingesetzt werden. Diese so genannten lebenden rekombinanten Träger-Impfstoffe können in sicherer Weise dem Host-Tier zusammen mit einem physiologisch verträgli chen Carrier verabreicht werden: sie verhalten sich nicht-pathogen und sie exprimieren ein nicht-giftiges Derivat des β-Toxins. Die lebend rekombinanten Träger-basierten Impfstoffe haben den Vorteil, dass sie Derivate des Clostridium perfringens β-Toxin direkt in dem Host erzeugen.
Tiere, die mit einem solchen rekombinanten Bakterium oder Virus geimpft worden sind, werden eine immunogene Antwort nicht nur gegen die Immunogene des Vectors erzeugen, sondern gegen die immunogenen Teile des Polypeptids oder der Polypeptide, für welche der genetische Kode zusätzlich in den rekombinanten Träger geklont worden sind. Dies hat den Vorteil, dass durch Verabreichung eines solchen rekombinanten Trägers Schutz gegen zwei oder mehr Krankheiten erhalten werden kann.
Viele lebende rekombinanten Träger-Viren und Bakterien sind im Stand der Technik bekannt.
Geeignete lebende rekombinante Träger-Bakterien sind beispielsweise Salmonella-Arten und E.coli-Arten. Viren, die häufig im Stand der Technik als lebende rekombinante Träger eingesetzt werden, sind Adenoviren, Retroviren, Vacciniaviren und Herpesviren. Auch geeignet als ein spezifisch oral verwendbarer Trägervirus ist der Schweine-Parvovirus. Ein anderer Virus, der benützlich ist als ein lebender rekombinanter Träger-Virus zum Tragen des Genes, welches das β-Toxoid kodiert, ist der Herpesvirus Pseudorabies-Virus (PRV) (beispielsweise beschrieben im europäischen Patent EP 0 606 437 ). Solch ein PRV, der das β-Toxoid-Gen trägt, würde Schweine gegen die Infektion von sowohl PRV als auch Clostridium perfringens Typ C schützen.
Daher bilden Impfstoffe zum Bekämpfen von Clostridium perfringens-Infektionen, die einen lebenden rekombinanten Trägerorga nismus umfassen, der das mutierte β-Toxin-Gen gemäss der Erfindung trägt, auch Teil der vorliegenden Erfindung.
Es ist klar, dass das native β-Toxin ein wesentlicher, wenn nicht der wesentlichste Virulenzfaktor in Clostridium perfringens ist.
Daher hat ein Clostridium-Stamm, bei dem das native β-Toxin-Gen durch eine mutierte β-Toxin-Gen gemäss der Erfindung ersetzt worden ist, wie oben beschrieben, einen wesentlichen Virulenzfaktor verloren. Solch ein Stamm kann als ein attenuierter Lebend-Impfstoff eingesetzt werden, da das β-Toxin nicht in seiner toxischen Form, sondern in einer entgifteten Derivatform hergestellt wird. Der Vorteil von solch einem attenuierten Lebend-Impfstoff liegt darin, dass er eine nicht-giftige aber immer noch immunogene Form des β-Toxins herstellt, womit er zusätzlich alle anderen Immunogen-Antigene des nativen Clostridium perfringens-Stammes aufweist.
Daher sind Impfstoffe, die einen attenuierten lebenden Clostridium perfringens-Stamm umfassen, bei dem das native β-Toxin-Gen ersetzt worden ist, durch ein mutiertes β-Toxin-Gen gemäss der Erfindung auch in dieser Erfindung eingeschlossen.
Auch sind in dieser Erfindung Impfstoffe eingeschlossen, die zusätzlich zu einem β-Toxin-Derivat gemäss der Erfindung Immunogene von anderen Pathogenen umfassen. Dies gestattet es, in einem einzigen Impfstoffverabreichungsschritt gegen verschiedene Krankheiten zu impfen.
Bei einer bevorzugten Form dieses Ausführungsbeispiels umfasst der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung zusätzliche Immunogene, die ausgewählt sind aus der Gruppe von Actinobacil lus pleuropneumoniae, Pseudarbiesvirus, der Schweine-Influenzavirus, der Schweine-Parvovirus, der übertragbare Gastroenteritisvirus, der Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Salmonella-Arten, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis und Helicobacter-ähnliche Bakterien.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von nativem Clostridium perfringens β-Toxin, welche Verfahren auf der Expression einer Nucleotid-Sequenz basieren, welche ein DNS-Fragment umfasst, welches das besagte β-Toxin in Grampositiven Bakterien kodiert, die nicht Clostridium perfringens sind.
Weiterhin liefert die Erfindung Verfahren für die Herstellung von nicht-giftigen Derivaten von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss der Erfindung. Diese Verfahren basieren auf der Expression von Nucleotid-Sequenzen, die ein DNS-Fragment umfassen, welches ein Derivat von β-Toxin in einem Gram-positiven Bakterium kodieren.
Auch liefert die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Bekämpfung von Clostridium perfringens-Infektionen. Solche Verfahren umfassen beispielsweise die Zumischung eines Derivats von Clostridium perfringens-β-Toxin gemäss der Erfindung und einem physiologisch verträglichen Träger.
Beispiel 1:
Herstellung von Expressionsplasmiden pKS90, pTREX1A, pTREX7 und pTREX14
Das pKS90-Plasmid ist ein eine hohe Kopierzahl aufweisendes (40- 80 je Zelle) Theta-replizierendes Gram-positives Plasmid, basierend auf dem pTREX1 Plasmid, welches selbst ein Derivat des zuvor veröffentlichten pIL253 ist. pIL253 umfasst das breite Gram-positive Host-Bereich-Replikon von pAMb1 (Simon, D., und A. Chopin, 1988 Construction of a vector plasmid family and its useful molecular cloning in Streptococcus lactis. Biochemie 70: 59-567) und ist nicht mobilisierbar durch den L-Lactis-Geschlechtsfaktor. pIL253 fehlt ebenso die tra-Funktion, die für den Transfer oder die effiziente Mobilisierung durch conjugierende Eltern-Plasmide notwendig ist, die durch pIL501 beispielhaft anzugeben sind. Das Enterokokken pAMb1-Replikon ist vorher zu verschiedenen Arten transferiert worden, umfassend Streptococcus, Lactobacillus und Bacillus-Arten sowohl als auch Clostridium acteobutylicum (Gibson, E.M., N.M. Chace, S.B. London and J. Londin, 1979, J. Bacteriol. 137: 614-619. LeBlanc, D.J., R.J. Hawley, L.N. Lee and E.J. St. Martin, 1978. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 75: 3484-3487. Oultram, J.D., and M. Young, 1985. FEMS Micro. Lett. 27: 129-134), was auf die mögliche Breite des Host-Bereichseinsatz hinweist. Während pTREX1 (und pTREX1A) einen grundlegenden konstituierenden Transkriptions-Vektor darstellen, nutzt das derivative pKS90 translationale Kopplung mit einem lactococcalen Translations-Initierungsbereich, um das Expressionsniveau anzuheben. Herstellungsdetails zu pK590 und seinem unmittelbaren Elternteil pTREX1 sind unten angegeben.
pTREX1:
Ein künstliches DNS-Fragment, welches eine mutmassliche RNS-stabilisierende Sequenz, einen die Translation initierenden Bereich (TIR), einen multiplen Klonierungsort für die Einfügung der Target-Gene und einen Transkriptions-Terminator enthält, ist durch Anlassen von zwei komplementären Oligonukleotiden und durch Erstrecken mit Tfl DNS-Polymerase erzeugt worden. Die Sense- und Antisense-Oligonukleotide enthielten die Rekogniti ons-Orte für NheI und BamHI jeweils an ihren 5' Enden, um das Klonieren zu vereinfachen. Dieses Fragment ist zwischen den Xba1 und BamHI-Orten in pUC19NT7 kloniert worden, einem Derivat von pUC19, welches die T7-Expressionskassette von pLET1 enthält (Wells, J.M., P.W. Wilson und R.W.F. Le Page, 1993 J.Appl. Bact. 74: 629-636), kloniert zwischen EcoRI und HindIII-Orten. Das sich ergebende Konstrukt ist als pUCLEX bezeichnet worden. Die vollständige Expressions-Kassette von pUCLEX ist dann entfernt worden durch Schneiden mit HindIII und Abstumpfen, gefolgt vom Schneiden mit EcoRI vor dem Klonieren in EcoRI und SacI (abgestumpften) Orten von pIL253, um den Vector pTREX zu erzeugen. Die vermeintliche RNS-stabilisierede Sequenz und TIR sind von der Escherichia coli T7 bakteriophagen Sequenz abgeleitet und an einer Nucleotid-Position modifiziert worden, um die Komplementarität des so genannten Shine-Dalgarno (SD)-Motivs an dem ribosomalen 16s RNS des Lactococcus lactis zu verbessern. Ein Lactococcus lactis MG1363 chromosomaler Promoter, der als P1 bezeichnet wird, ist zwischen EcoRI und BgIII-Orten kloniert worden, die in der Expressions-Kassette vorliegen, pTREX1 erzeugen. Dieser Promoter ist vorgängig unter Einsatz des Promoter-Proben-Vectors pSB292 isoliert worden und durch Primer-Extension und DNS-Sequenzier-Analyse charakterisiert worden (Nick. R. Waterfield, R.W.F. Le Pge, P.W. Wilson, und J.M. Wells Gene. 165, 1995 9-15). Das Promoter-Fragment ist durch PCR unter Einsatz von Vent-DNS-Polymerase verstärkt worden. Das PCR-Fragment umfasste alle der DNS-Sequenzen stromaufwärts des klonierten Promoters und bis zu 15 Basen 3' zu dem Transkriptions-Startort. Die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz, die abwärts des Transkriptions-Startortes dieses Promoters vorhanden war, ist in absichtlicher Weise aus dem PCR-verstärkten Promoter-Fragment ausgeschlossen worden, um die Translationsinitierung an Orten zu verhindern, die nicht der Start-Codon gewesen sind, welcher in der Expressions-Kassette angezeigt worden ist. Zwei ähnliche Vectoren, mit pTREX7 und pTREX14 bezeichnet, sind auch erzeugt worden unter Einsatz von schwächeren P7 und P14-Promotern, kloniert zwischen EcoRI und BgIII-Orten anstelle von P1. Die PCR-Primer, die eingesetzt worden sind, um diese Promoter-Fragmente zu erzeugen, sind in der 1d illustriert. Das pTREX1A Plasmid stellt eine Alternative zu pTREX1 dar, in welchem die XbaI-gebundende Expressions-Kassette ersetzt wird durch eine XbaI-SpeI T7-Expressions-Kassette als Fragment aus pET3A. Die SD-Sequenz ist daher nicht für Lactococcus optimiert. Die vollständige pTREX1A-Sequenz und die Schemata, die die Expressions-Kassette illustrieren, sind in 1 dargestellt.
pKS90:
Das pKS90-Plasmid ist ein Derivat von pTREX1, welches, während es den selben Transkriptions-Promoter P1 einsetzt, ein modifiziertes TIR hat, welches das SD und die ersten 20 Codone eines lactococcalen chromosomal abgeleiteten Resolvase-Gens enthält, P11, (Nick. R. Waterfield, R.W.F. Le Page, P.W. Wilson, und J.M. Wells, Gene. 165, 1995, 9-15). Dies ist erreicht worden durch Klonieren einer künstlichen DNS-Sequenz, die den neuen TIR enthält, zwischen den BgIII und BamHI-Orten von pTREX1. Die Oligonukleotid-Sequenzen, die in dieser Prozedur eingesetzt worden sind, sind in der 2 dargestellt. Durch sorgfältige Wahl der PCR-Primer-Sequenz kann ein PCR-abgeleitetes Target-Gen in translationaler Weise an dieses TIR angekoppelt werden, was gezeigt hat, dass es das Expressions-Niveau erhöht, wenn es zu demjenigen verglichen wird, welcher von dem pTREX1-Eltern-Plasmid erhalten worden ist. Die vollständige pKS90-Sequenz und eine schematische Illustrierung der Expressions-Kassette sind in der 2 dargestellt.
Konstruktion von rekombinanten Stämmen von Lactococcus lactis, welche aktives Beta-Toxin ausscheiden:
Die pJF2000 DNS (wie von J. Frey, Institute for veterinary bacteriology, University of Berne, CH-3012 Berne, Switzerland, geliefert) umfasst ein Gen, welches β-Toxin kodiert, wie es von Hunter et al. publiziert worden ist (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) ist in E.coli SURE elektroporiert worden. Plasmid DNS von sechs unabhängigen Transformanten sind isoliert worden, durch Restriktionsaufschluss geprüft und gepoolt worden. Diese Stämme sind bei –70°C in 15% Glycerol gelagert worden. Das cpb Gen mit zugehöriger Translationsinitiierungsbereich (und aufwärts RNS-stabilisierendem Stem-Loop) ist aus dieser gepoolten Präparation von Plasmid DNS durch Aufschluss mit XbaI/BamHI oder SmaI/BamHI ausgeschnitten worden. Die gereinigten cpb Genfragmente sind in multiple Klonierungsorte der Expressionsvektoren pTREX1A, pTREX14 und pTREX7 ligiert worden, welche jeweils hohe, mittlere und niedrige Niveaus der konstituierten Expression ergaben. XbaI/BamHI endende cpb Fragmente sind in XbaI/BamHI aufgeschlossenem pTREX1ANEW ligiert worden, während das SmaI/BamHI beendete cpb Fragment in BamHI/BgIII (abgestumpftes) pTREX14 und pTREX7 DNS ligiert worden ist. Diese Konstrukte sind in erfolgreicher Weise in den speziell ausgestalteten Stamm Lactococcus lactis pep5-acmA-elektroporiert worden, welcher ein chromosonal kodierte Peptidase, pep5, fehlt, welche es dem Organismus ermöglicht, Peptide einzusetzen, die von Kasein befreit sind. Zusätzlich fehlt ihm ein der Zellwand zugeordnetes Autolysin, acmA. Jeder andere Lactococcus lactis Stamm ist jedoch für diesen Zweck geeignet. Zehn korrekte Isolate von jedem Typ sind durch Restriktionsaufschlussanalyse identifiziert worden und sind bei –70°C in 15% Glycerol gelagert worden. Diese Stammtypen sind L. lactis pep5-acmA-[pTREX1Acpb], L. lactis pep5-acmA-[pTREX14cpb] und L. lactis pep5-acmA-[pTEX7cpb] bezeichnet worden. Zusätzlich ist das cpb Gen durch PCR unter Einsatz von Vent DNS-Polymerase und BamHI beendete Oligonukleo tide aus dem Plasmid pJF2000 verstärkt worden. Dieses PCR-Produkt ist in den BamHI-Ort des TIR koppelden Vektors pKS90 geklont worden.
Das Gesamtprotein, welches aus mid-log Zellen und den Supernatanten ausgezogen worden ist, ist unter Einsatz von SDS-PAGE aufgelöst worden, bevor es zu Nitrozellulosefiltern übertragen worden ist. Diese Filter sind mit sowohl monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern auf Cpb geprüft worden, unter Einsatz von MAB (MAB steht für monoklonale Antikörper) gereinigtem β-Toxin als eine Kontrolle. Ein einzelnes Proteinprodukt der richtigen Grösse (ungefähr 30 kda) ist in den Kultursupernatanten von allen vier Stämmen gefunden worden, durch Western Blot und Coomasie Blau-Färbung der SDS-Gele. Die Menge an durch jeden Stamm ausgeschiedenem β-Toxin war mit der relativen Stärke der Promoter in den eingesetzten Expressionsvektoren als konsistent gefunden worden. Kein intrazelluläres Toxin konnte erfasst werden, was daraus schliessen lässt, dass die klostridialen Exportsequenzfunktionen in Lactococcus effizient sind. Gefilterte Supernatanten aus dem pTREX1A-Exprimierer, L. lactis MG 1363 pep55-acmA-[p3-1/5], und dem pKS90-Exprimierer L. lactis MG1363 pep5-acmA-[p5-123] zeigten aktives Toxin, was eine positive Kontrolle für das recombinante β-Toxin ergab.
Die cpb mutanten Gene
Mutante cpb Gene sind in vitro durch Genkonstruktion unter Einsatz von PCR-Fragmenten erzeugt worden, welche durch Vent DNS Polymerase aus dem originalen Template cpb Gen verstärkt worden sind (kloniert von C. perfringens Typ C), welches in Plasmid pJF2000 (wie von J. Frey geliefert) vorhanden ist. Die bei dieser Konstruktion eingesetzten Primer und ein Beispiel des eingesetzten Konstruktionsverfahrens sind in der 3 angegeben. Der Einschluss von BamHI-Orten auf den 5' Enden der termi nalen epbF2 und cpbR Primern gestatteten diesen Mutanten, in den BamHI Ort der pKS90 Expressions-Plasmiden (siehe oben) kloniert zu werden. Die Wahl der PCR-Primer, die einen BamHI-Ort einschliessen, welche ausreichend von dem cpb ATG Startcodon beabstandet sind, gestatten es den mutanten cpb Genen in Translation mit dem P11 TIR in pKS90 gekoppelt zu sein. Das Verfahren ist eingesetzt worden, um eine Abfolge von mutanten Expressionsstämmen zu erzeugen. Die exakten Sequenzen dieser mutanten Gene (nach dem Klonieren in pKS90) sind durch automatische Sequenzierungen mit 3-4facher Redundanz bestimmt worden, was beide Gensequenzen bestätigte und den Ort in den Expressionsplasmiden. Das Klonieren der mutanten Gene in diesen Vektoren gestattete die Ausscheidung des Genprodukts in den Kultursupernatanten durch den nativen cpb-N-endendem Exportführer. Der Kultursupernatant ist mit Filtern sterilisiert worden und direkt in tierischen Bioassays eingesetzt worden.
Tabelle 1: mutante Genkonstrukte
Mutante Expressionsstämme:
Die pKS90-basierten Toxoid-Expressionsplasmide sind in speziell ausgeschalteten Lactococcalen Hoststämmen propagiert worden, L. lactis MG1363 pep5-acmA-, aber auch andere Lactococcus Stämme können eingesetzt werden. Dieser Stamm stellt ein Prophagen und Plasmid-behandelten Stamm dar, der in starkem Masse auxotroph ist und unfähig, in der natürlichen Milchumgebung zu überleben. Zusätzlich wächst er mit einer geringeren Rate als andere Lactococcalen Stämme.
Die nicht toxischen Expressionsstämme, die wie oben angegeben konstruiert worden sind, sind in der Tabelle 1 dargestellt. In dieser Tabelle wird gezeigt, welche Aminosäuren mutiert worden sind und wo die Mutationen angeordnet sind.
Die Toxoid-Expressionsstämme können in M17 Medium gewachsen werden (Difco Kat. Nummer 1856-17), ergänzt mit 0.5% w/v Glukose und 5 g/ml Erythromycin. Belüftung ist nicht erforderlich, es werden viel mehr anoxische Bedingungen bevorzugt, obwohl dies nicht wesentlich ist. Die optimale Wachstumstemperatur ist 30°C. Die verschiedenen, von all diesen Stämmen erzeugten Toxoid-Proteine zeigten, dass sie sich im Kulturmedium auf Niveaus von weniger als 5 g/ml akkumulierten. Die Western Blot Analyse zeigte sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, die bestätigten, dass das Proteinmonomer der korrekten Grösse in die Supernatanten durch alle benannten Expressionsstämme entsprechend obiger Liste ausgeschieden worden sind. N-terminale Sequenzierung eines Beispiels eines mutanten Proteins, M4(4-3), bestätigte, dass das Leaderpeptid in korrekter Weise während des Exports von dem lactococcalen Zytoplasma abgespalten worden ist.
Protokoll für zufällige Mutagenese des cpb Gens:
Typische PCR-Reaktionsmischung wird wie folgt aufgesetzt:

10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8.7 bei 25°C)
50 mM KCl, 5 μg/ml Rinderserumalbumin
0.5 μM von jedem der PCR Primer
(cpbf2: 5'-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3') SEQ ID Nr.: 3
(cpbR: 5'-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3') SEQ ID Nr.: 4
4 mM MgCl₂
0.5 mM MnCl₂
3.4 mM erzwingendes dNTP und 0.2 mM andere 3 dNTPs (dNTP- Konzentration kann zwischen 0.1 und 10 mM liegen)
600 pM der template-DNS (pJF2000 cpb-Klon oder anderes cpb- Derivat)
2U Taq DNS Poymerase

Thermozyklische Bedingungen waren wie folgt
(94°C für 30 Sekunden, 50°C für 60 Sekunden, 72°C für 180 Sekunden) 30 Cyclen, gefolgt von Inkubation bei 72°C für 600 Sekunden.
Diese Reaktion ist durchgeführt worden unter Einsatz von jedem der 4 dNTPs als zwingende Nucleotide und sind dann gepoolt worden. Dies ergab eine geeignete zufällige Mischung der Substitutionen. Die gepoolten PCR-Fragmente sind dann durch BamHI aufgeschlossen und in BamHI aufgeschlossenes pKS90 ligiert worden. Diese Ligierungsmischung ist in Lactococus Lactis MG 1363 transformiert worden. Transformanten sind in flüssiger Kultur gewachsen worden und die gefilterten Supernatanten sind in vitro β-Toxin assay getestet worden, wie dies in Beispiel 3 beschrieben worden ist.
Beispiel 2
Kultur von Lactococcur lactis:
L. lactis, welcher Gen-modifiziertes β-Toxin erzeugt, ist in M17 Medium gewachsen worden (bspw. Difco Kat. 1856-17), ergänzt mit 0.5% w/v Glucose und 5 μg/ml Erythromycin. Belüftung ist nicht erforderlich, anoxische Bedingungen sind bevorzugt, wenn auch nicht wesentlich. Die optimale Wachstumstemperatur ist 30°C. Die Hinzufügung von Glukose ist während des exponentiellen Wachstums notwendig.
Antigen Präparation
Die Kultursupernatanten sind von den Zellen durch das Mittel der Zentrifugierung getrennt worden. Nach steriler Filtrierung des Supernatanten sind die Derivate mit Ammoniumsulfat (0.3 g/g) ausgefällt worden. Das Ausfallprodukt ist in PBS resuspendiert worden. In einer Alternative kann der Kultursupernatant auch auf einem Filter < 10'000 Da konzentriert werden.
Letalität bei Mäusen
Derivate von β-Toxin, die in L. lactis hergestellt worden sind, sind ursprünglich durch Injektionen von sterilen gefilterten Kultursupernatanten interperitoneal in der Menge von 0.5 ml in NRMI-Mäuse, die ungefähr 20 g wiegen, getestet wurden. Derivate von pM 6-1, 6-5 und 6-7 waren letal bei einem Niveau, welches ähnlich zum nativen Toxin lag. Die Derivate pM 6-1, 6-5 und 6-7 sind in der Aminosäurenposition Cys₂₉₂ → Ala₂₉₂ modifiziert worden.
Tabelle 2: Mäuse Lethalitätstest
Bei nachfolgenden Experimenten sind die Supernatanten, die die Derivate enthalten, mit Ammoniumsulfat ausgefällt worden. Jedes derivatenthaltene Sediment ist im PBS resuspendiert worden bei einem 10fach kleineren Volumen. Jedes Derivat ist interperitoneal in Mäuse injiziert worden. Die Derivate pM 1-4, pM 1-10, pM 3-69 und pM 7-15 waren alle nicht toxisch bei Niveaus, bei denen das Wildtyp-Toxin lethal war. Sie wurden erst bei sehr hohen Konzentrationen von 20-40 μg/ml toxisch. Die Derivate pM 4-18 und pM 6-16 waren alle auch bei Niveaus nicht toxisch, bei denen das Wildtyp-Toxin letal war. Sie waren noch nicht einmal toxisch bei noch höheren Konzentrationen: 30-50 μg/ml. Die verbleibenden drei Derivate pM 2, pM 3-3 und pM 4-3 waren leicht toxisch. (die LD₅₀ Rate des Wildtyp-Toxins liegt bei 0.15 μg/Maus), siehe auch Tabelle 2.
Dermonekrose in Meerschweinchen:
Albino Meerschweinchen von eigener Züchtung, 300 g sind in einem Bereich von 4·8 cm epiliert worden. 0.2 ml des Extraktes ist intradermal an 4 Orten auf jeder Seite des Tieres injiziert worden. Die Tiere sind nach 24, 48 und 72 Stunden überprüft worden und die Läsionen an den Injektionsorten sind bewertet worden. Klar erkennbare Nekrose am Injektionsort (+++), schweres Erythem (+++), Erythem (++), Rötung (+), keine Reaktion (0).
Die Derivate pM 1-4, 1-10, 3-3, 4-3, 6-16 und 7-15 sind nicht dermonekrotisch, selbst bei sehr hoher Konzentration.
Die Derivate pM 6-1, 6-5 und 6-7 sind dermonekrotisch mit einem Niveau von 5 μg/ml. Sie sind nicht dermonekrotisch bei einem Niveau von 0.5 μg/ml. Nach der Konzentration ergab sich das Derivat pM 3-69 als dermonekrotisch bei Dosierungen von 6 μg/ml, was mindestens 60 mal weniger dermonekrotisch ist als das native Toxin. Das Derivat pM 4-18 hatte ein 15 mal weniger dermonekrotisches Potenzial als das native Toxin. Das Derivat pM 2 zeigt keine dermonekrotische Wirkung bei den getesteten Konzentrationen von 1 μg/ml und 2 μg/ml. Daher war pM 2 mindestens 20 mal weniger toxisch als das native Toxin.
Siehe auch Tabelle 3.
Impfstoffherstellung:
Die Antigenpräparationen sind mit Freund's incomplete ajuvant (50%) oder Alhydrogen (20%) jeweils mit Hilfsstoffen versehen worden.

0 keine Reaktion
+ Rötung
++ Erythem
+++ schweres Erythem
++++ klar erkennbare Nekrose am Injektionsort

CpC β Clostridium perfringens Typ C β-Toxin
Tabelle 3: Dermonekrose bei Schweinen
Immunisierung der Schweine:
Das Derivat 3-69 ist in einer Konzentration von ungefähr 40 μg/ml hergestellt worden und mit einer finalen Konzentration von 20 μg/ml mit Hilfsstoffen versehen worden. Den Schweinen sind 2 ml intermuskulär im Intervall von 2 Wochen gegeben worden. Blutproben sind vor der ersten Impfung, vor der zweiten Impfung und zwei Wochen nach der zweiten Impfung genommen worden. Schweine sind für Nebenwirkungen 24 Stunden nach der ersten Impfung beobachtet worden. Es sind keine Nebenwirkungen beobachtet worden.
Beispiel 3:
Schneller Screening Test für die Erfassung von nicht-toxischen Derivaten von β-Toxin, erhalten aus zufällig mutagenisierten β-Toxin-Genen:
Prozedur des BT-Zellen Tests:
Eine Kultur von trypsinierten BT-Zellen (BT steht für Bovine Turbinate Zellen), 1,5 × 10⁵ Zellen/ml in Eagles-Medium mit 5% Kälberserum ist in eine 96-Proben Microtiter-Platte transferiert worden, 100 μl/Probe. Die Platten sind 24 Stunden bei 37°C und 3% CO₂ inkubiert worden. Proben von β-Toxin, die zu testen waren, sind in 20°C PBS pH-Wert 7.0 in Dilutions-Platten verdünnt worden. Das Medium ist vorsichtig aus den Zellen entfernt worden und 100 μl β-Toxin Verdünnungen sind je Probe angewandt worden. Die Zellen sind dann für 30 Minuten bei 37°C und 3% CO₂ inkubiert worden. Die Proben sind vorsichtig entfernt worden und frisches Eagles-Medium mit 5% Kälberserum, bei 37°C temperiert, ist hinzugefügt worden. Die Zellen sind für 3 Tage unter denselben Bedingungen wie oben erwähnt inkubiert worden. Dann ist das Medium aus den Microtiter-Platten entfernt worden und Giemsa-Färbelösung ist mit 5 μl/Probe hinzugefügt worden. Nach 10 Minuten ist das Färbemittel entfernt worden und die Platte ist drei mal mit Wasser gewaschen worden und stand mindestens 20 Minuten zum Trocknen.
Alle Proben sind auf das Vorhandensein von Multinukleat-Zellen und Irregularitäten in der Monoschicht überprüft worden. Abwesenheit dieser Anzeichen in einer spezifischen Probe zeigte die Präsenz eines nicht-toxischen Derivats β-Toxin in dieser Probe. Solche β-Toxin Derivate, die sich als nicht toxisch herausgestellt hatten, sind für ihre Immunogenizität in dem unten beschriebenen semi-quantitativen ELISA-Test getestet worden.
Semi-quanitativer ELISA-Test:
Hochspezifische Antikörper, die gegen natives Clostridium perfringens β-Toxin in Hasen aufgezogen worden sind, sind auf einer Protein-A-Säule gereinigt worden und ELISA-Platten sind mit ungefähr 2 μg/ml der spezifischen Antikörper beschichtet worden. Die Supernatanten, die die β-Toxin Derivate enthalten haben, sind in dreifacher Verdünnung den Platten hinzugefügt worden. Nach einer Inkubation für 1 Stunde ist Meerrettich-Peroxidase konjugierte polyklonale Hasen anti-C.p.β-Toxin- Antikörper für die Erfassung eingesetzt worden.
Diejenigen β-Toxin Derivate, die in dem ELISA mit einem Titer von nicht weniger als 1'000 mal geringer als das native β-Toxin reagiert haben, sind als die gewünschten nicht-giftigen und immer noch immunogenen Derivate von β-Toxin gemäss der Erfindung betrachtet worden.
Beispiel 4:
Impfexperimente mit Schweinen.
Herstellung des Impfstoffs
Das Derivat pM 1-4 ist durch Lactococcus lactis-stamm pM 1-4 hergestellt worden. Nach der Fermentierung sind die Zellen durch Zentrifugierung entfernt worden (100'000 × g für 35 Minuten). Dann sind 0,31 g Ammoniumsulfat zu jedem Gramm des Supernatanten hinzugefügt worden. Die Mischung ist bei 4°C für 3 Stunden zur Ausfällung hingestellt worden. Nach der Zentrifugierung bei 100'000 × g für 45 Minuten ist das Ausfallprodukt in 1/30 des ursprünglichen Volumens aufgelöst und gegen PBS dialysiert worden. Der schlussendliche Gehalt des Derivats pM 1-4 ist durch SDS-PAGE relativ zu den BSA-Standards quantifiziert worden. Schliesslich ist die Derivat-Lösung mit Diluvac Forte^® bei einem Verhältnis von 1:1 gemischt worden. Die letztendliche Konzentration von pM 1-4 im Impfstoff war 18 μg/ml.
Impfung
Es sind 5 Schweine im Alter von 5 Wochen eingesetzt worden. Die Schweine sind mit 2 ml an den Tagen 0 und 21 intramuskulär geimpft worden.
Beobachtungen
Die allgemeinen Gesundheitsbedingungen der Tiere sind während der ursprünglichen 3 Stunden nach der Impfung gemäss der folgenden Skala bewertet worden:

0: = keine Symptome
1: = leicht depressiv (für weniger als 1 Stunde)
2: = deprimiert, zitternd (weniger als 1 Stunde)
3: = deprimiert, zitternd, abliegend und begrenzte Wasseraufnahme (weniger als 1 Stunde)
4: = erbrechen, stark depressiv (weniger als 1 Stunde)
5: = depressiv für mehr als 1 Stunde und frisst nicht bei der folgenden Fütterung.

Blutprobe und Bestimmung der Titer
Blutproben sind vor der ersten Impfung genommen worden (Tag 0), vor der zweiten Impfung (Tag 21) und 2 Wochen nach der zweiten Impfung (Tag 35) und sind auf Anti-β-Toxin Antikörper durch Competitive ELISA analysiert worden. Kurz beschrieben ist ein gegen natürliches β-Toxin erzeugter monoklonaler Antikörper in einer ELISA-Platte beschichtet worden. Die serielle Verdünnung der Seren ist gestattet worden, um mit einer festen Konzentration des β-Toxins auf einer getrennten Platte zu reagieren. Die Mischungen von Toxin und Antikörper enthaltenden Seren sind auf eine mit monoklonalen Antikörpern beschichtete Platte transferiert worden und verbliebene natürliche β-Toxin Gehalte sind bestimmt worden. Die Titer sind bei 50 Prozent Inhibition und nicht inhibiertem β-Toxin berechnet worden, entsprechend dem WHO Antitoxinstandard 1959.
Ergebnisse:
Beobachtungen
Die Schweine zeigten keinerlei klinische Reaktion aufgrund irgendeiner der Impfungen. Siehe Tabelle 4.
Serologie
Ein Schwein (Nr. 52) reagierte auf die erste Impfung. Nach der zweiten Impfung zeigten alle vier Schweine eine Serokonversion und der mittlere Anti-β-Toxin Titer war mit ELISA gemessen 66 i.u.. Individuelle Titer ergeben sich aus Tabelle 4.
Tabelle 4: Anti-β-Toxin Antikörper Antwort bei Schweinen
Anti-β-Toxin Antikörper Antwort bei Schweinen, gemessen mit ELISA in i.u. und Wert beim Test auf nicht spezifische Toxizität.
Schlussfolgerung
Alle Schweine reagierten auf die Impfung mit genetisch modifiziertem β-Toxin mit einer Herstellung von β-Toxin inhibierenden β-Toxin Antikörpern.
Figurenlegende
1a: Struktur des Plasmids pTREX1ANEW. Die Kodiersequenz des MLS antibiotischen Resistenzmarkers ist als schattierter Kasten dargestellt. Ori pAMB1: Ursprung der Replikation von dem Plasmid pAMB1, MLS: Makrolide, Lincosamide, Streptogramin B antibiotisches Resistenzgen. Die Struktur der Expressionskassette, die zwischen dem EcoR1 und den stumpfen Sac1-Orten des pIL253 geklont worden ist, ist unten gezeigt. Verschiedene funktionale Bereiche der Kassette sind als schraffierte Kästen dargestellt. Eindeutige Restriktionsorte sind angezeigt. SD: Shine Dalgarno Sequenz komplementär zu L. lactis 16S rRNS, ATG: Translationsinitiierungskodon, der durch SD bedient wird.
1b: die vollständige pTREX1A Sequenz, umfassend die Restriktionsenzympositionen (SEQ ID Nr.: 27).
1c: Merkmale der hoch ähnlichen pTREX1 Expressionskassette (SEQ ID Nr.: 26).
1d: Oligonukleotide, die eingesetzt worden sind, um die PCR abgeleiteten Promoter Fragmente zu erzeugen, die in pTREX7, –14 und –1A (dargestellt als 5'-3') eingesetzt worden sind (SEQ ID Nr.: 19, 20, 23, 24, 21, 22).
2a: der TIR Kopplungsvektor pKS90, schematische Darstellung der pKS90 Expressionskassette.
2b: die vollständige pKS90 Sequenz, umfassend die Restriktionsenzympositionen (SEQ ID Nr.: 25)
2c: Oligonukleotide, die eingesetzt worden sind, um die künstliche DNS Sequenz zu erzeugen, die den TIR-Bereich des pKS90 ausbildet (SEQ ID Nr.: 28,1).
3a: Primer, die bei der Konstruktion der Cpβ-Mutanten eingesetzt worden sind (SEQ ID Nr.: 7, 6, 9, 8, 11, 10, 13, 12, 14, 16, 15, 18, 17, 2, 4, 3.)
3b: Beispiel der Konstruktionsprozedur, wie sie für Cpβ M1 eingesetzt worden ist.
4: Aminosäurensequenz des Clostridium perfringens β-Toxins (SEQ ID Nr.: 5). Sequenz Listing
Übersetzung der Header der einzelnen Sequenzen:
SEQUENCE LISTING

Claims

Entgiftetes immunogenes Derivat von Clostridium perfringens β-Toxin oder ein immunogenes Fragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mutation trägt, die in einem Übergangsbereich zwischen neutralen und hydrophilen Teilen des β-Toxins angeordnet ist.
Entgiftetes immunogenes Derivat von Clostridium perfringens β-Toxin oder ein immunogenes Fragment davon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mutation an der Position 62, 182, 197 oder in einem der Bereiche zwischen der Aminosäuren Nr. 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 oder abwärts von Aminosäureposition 292 relativ zum Leader-Peptid Methionin angeordnet ist.
Derivat von Clostridium perfringens β-Toxin oder ein immunogenes Fragment davon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in einem der Bereiche zwischen Aminosäuren Nr. 80-82, 95-97, 101-103 oder 287-291 angeordnet ist.
Nukleotidsequenz umfassend ein mutiertes DNS-Fragment, wobei das besagte mutierte DNS-Fragment ein entgiftetes immunogenes Clostridium perfringens β-Toxin oder ein immunogenes Fragment davon gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert.
Clostridium perfringens Bakterium, umfassend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 4.
Exprimierungssystem, basierend auf einem Gram-positiven Bakterium, wobei das besagte Gram-positive Bakterium eine Art des Lactococcus ist, umfassend eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 4.
Impfstoff zum Bekämpfen einer Clostridium perfringens Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Derivat von Clostridium perfringens β-Toxin oder ein immunogenes Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, und einen physiologisch verträglichen Träger umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Adjuvant umfasst.
Impfstoff zum Bekämpfen einer Clostridium perfringens Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er einen lebenden rekombinanten Trägerorganismus umfasst, wobei der besagte Trägerorganismus ein DNS-Fragment nach Anspruch 4 trägt.
Impfstoff zum Bekämpfen einer Clostridium perfringens Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er einen lebenden attenuierten Clostridium perfringens-Stamm umfasst, in dem das native β-Toxin-Gen ersetzt ist durch eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 4.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich Immunogene von anderen Pathogenen umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten anderen Immunogene von anderen Pathogenen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aufweist: Actinobacillus pleuropneumoniae, Pseudorabies-Virus, Schweineinfluenza-Virus, Schweine-Parvo-Virus, übertragbarer Gastroenteritis-Virus, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Salmonella-Arten, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis und Helicobacterähnliche Bakterien.
Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Clostridium perfringens β-Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleotidsequenz, die ein DNS-Fragment umfasst, welches ein Derivat von β-Toxin nach Anspruch 4 kodiert, in einem Bakterium der Art Lactococcus exprimiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zum Bekämpfen einer Clostridium perfringens Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Verfahren das Zumischen eines Derivats von Clostridium perfringens β-Toxin gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 und eines physiologisch verträglichen Trägers umfasst.