DE69532109T2

DE69532109T2 - Expression heterologer proteine in abgeschwächten bakterien mittels des htra-promotors

Info

Publication number: DE69532109T2
Application number: DE69532109T
Authority: DE
Inventors: Mohammed Anjam Khan; Steven Neville Research Unit CHATFIELD; Jingli Li
Original assignee: Acambis Research Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Holding Ltd
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2015-02-01
Also published as: FI963016A; KR970700770A; ES2210283T3; CA2182315C; ATE254178T1; PT742829E; NZ278930A; CZ218296A3; PL315670A1; JP3731004B2; KR100392916B1; DK0742829T3; FI963016A0; DE69532109D1; HU222982B1; CA2182315A1; CZ285867B6; AU701384B2; JPH09508276A; BR9506666A

Description

Diese Erfindung betrifft Impfstoffzusammensetzungen, die attenuierte Bakterien umfassen, welche DNA Konstrukte enthalten, die einen induzierbaren Promotor umfassen, der funktionell mit einer DNA Sequenz verknüpft ist, die für ein oder mehrere heterologe Proteine kodiert.
In den vergangenen Jahren ist eine neue Generation von oralen Salmonella Lebendimpfstoffen aufgetaucht, die auf Salmonella Stämmen basieren, welche durch die Einführung einer nicht revertierenden Mutation in ein Gen des aromatischen Biosynthesewegs des Bakteriums attenuiert wurden. Solche Stämme sind beispielsweise in EP-A-0322237 offenbart. Die obengenannten oralen Salmonella Lebendimpfstoffe sind vielversprechende Impfstoffe gegen Salmonellose bei Mensch und Tier und sie können ebenso wirksam als Trägerstoffe zur Überbringung heterologer Antigene zum Immunsystem verwendet werden. Kombinierte Salmonellaimpfstoffe wurden verwendet, um Antigene von Viren, Bakterien und Parasiten zu überbringen, wobei sekretorische, humorale und zellvermittelte Immunantworten gegenüber der rekombinanten Antigene ausgelöst werden. Kombinierte Salmonellaimpfstoffe weisen ein großes Potential als orale Einmaldosis-Multiimpfstoff-Übertragungssysteme auf [C. Hormaeche et al, FEMS Symposium No. 63, Plenum, New York; pp 71–83, 1992].
In der Entwicklung von kombinierten Salmonellaimpfstoffen müssen Probleme überwunden werden. Ein Hauptfaktor ist es ein hohes Expressionsniveau des rekombinanten Antigens im Salmonellaimpfstoff zu erhalten, so daß dieses ausreicht, um eine Immunantwort auszulösen. Jedoch kann ein unreguliert hohes Expressionsniveau fremder Antigene toxisch sein und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen [1. Charles und G. Dougan, TIBTECH 8, pp 117–21, 1990], was den Impfstoff ineffektiv macht oder den Verlust der rekombinanten DNA verursacht. Es wurden einige mögliche Lösungen dieses Problems beschrieben, wie etwa die Expression ausgehend von Plasmiden, die essentielle Gene tragen, „an-aus" Promotoren oder der Einbau der Fremdgene in das Salmonellachromosom.
Ein alternativer Ansatz zur Überwindung des obengenannten Problems wäre es, einen Promotor zu verwenden, der in vivo induzierbar ist, und ein solcher Promotor ist der E.coli Nitritreduktasepromotor nirB, der unter Anaerobiose induziert wird. Impfstoffzusammensetzungen, die Bakterien enthalten, welche mit Konstrukten transformiert wurden, die den nirB Promotor umfassen, werden in unserer früheren Internationalen Patentanmeldung PCT/GB93/01617 beschrieben. Die Verwendung des nirB Promotors in Impfstoffstämmen von Bakterien wird auch im Artikel von Chatfield et al Bio/Technology, Bd. 10, 888-892 (1992) offenbart.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von DNA Konstrukten, die einen anderen induzierbaren Promotor enthalten, nämlich den Promotor des htrA Gens, das für ein durch Streß induziertes Protein kodiert.
Das htrA Gen wird beschrieben und es wird darauf Bezug genommen in den Artikeln von K. Johnson et al in Mol. Microbiol 1991; 5: 401–7 und Res. Microbiol. 1990, 141, 823–825 und den darin zitierten Quellenangaben, und es ist ein Beispiel für ein Gen, das für ein Hitzeschockprotein kodiert, welches auf eine Temperaturerhöhung über 42°C hin gebildet wird. Ein weiteres Hitzeschockprotein wird in Stover et al Nature, Band 351, 456–460 (1991) diskutiert, worin die Verwendung der regulatorischen Sequenzen von BCG hsp60 und hsp70 Genen zur Steuerung der Expression von Genen fremder Antigene in BCG beschrieben wird. Jedoch weisen die regulatorischen Sequenzen nur einen geringen Grad an Homologie mit dem htrA Promotor auf.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die ein attenuiertes Bakterium umfaßt, welches ein DNA Konstrukt enthält, das die htrA Promotorsequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer DNA Sequenz umfaßt, die für ein oder mehrere heterologe Proteine kodiert; sowie einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine wie oben definierte Impfstoffzusammensetzung bereit, wobei die htrA Promotorsequenz funktionell mit einer DNA Sequenz verbunden ist, die für ein Fusionsprotein zweier oder mehrerer heterologer Proteine kodiert.
Die Proteine, aus welchen sich die Fusion zusammensetzt, können mittels einer flexiblen Scharnierregion verbunden sein.
In einer besonderen Ausführungsform kann das die htrA Promotorsequenz umfassende DNA Konstrukt funktionell mit einer DNA Sequenz verknüpft sein, die für ein erstes und zweites heterologes Protein kodiert, wobei das erste heterologe Protein eine antigene Sequenz darstellt, die Tetanustoxinfragment C oder ein oder mehrere Epitope davon umfaßt.
Das erste und zweite Protein sind vorzugsweise heterologe Proteine und können insbesondere polypeptidische Immunogene sein; zum Beispiel können sie antigene Sequenzen eines Virus, Bakteriums, Pilzes, einer Hefe oder eines Parasiten sein. Es wird insbesondere bevorzugt, daß das erste Protein eine antigene Sequenz darstellt, die Tetanustoxinfragment C oder Epitope davon umfaßt.
Das zweite Protein ist vorzugsweise eine antigene Determinante eines pathogenen Organismus. Beispielsweise kann die antigene Determinante eine antigene Sequenz eines Virus, Bakteriums, Pilzes, einer Hefe oder eines Parasiten sein.
Beispiele viraler antigener Sequenzen für das erste und/oder zweite heterologe Protein sind Sequenzen, die einem Typ des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV), wie etwa HIV-1 oder HIV-2, die CD4 Rezeptorbindungsstelle von HIV beispielsweise von HIV-1 oder -2, Hepatitis Virus A, B oder C, menschlichem Rhinovirus wie etwa Typ 2 oder Typ 14, Herpes Simplex Virus, Poliovirus Typ 2 oder 3, Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV), Rabiesvirus, Rotavirus, Influenzavirus, Coxsackievirus, menschlichem Papillomavirus (HPV) beispielsweise dem Typ 16 Papillomavirus, dessen E7 Protein und Fragmente, die das E7 Protein oder dessen Epitope enthalten, sowie Affenimmundefizienzvirus (SIV) entstammen.
Beispiele von Antigenen, die von Bakterien stammen sind solche von Bordetella Pertussis (z. B. P69 Protein und filamentöse Hämagglutininantigene (FHA)), Vibrio cholerae, Bacillus anthracis und E.coli Antigene wie etwa die B Untereinheit des hitzelabilen Toxins (LT-B) von E.coli, E.coli K88 Antigene und enterotoxigenische E.coli Antigene. Weitere Beispiele von Antigenen schließen ein das Zelloberflächenantigen CD4, Schistosoma mansoni P28 Glutathion S-transferase Antigene (P28 Antigene) und Antigene von Leberegeln, Mycoplasma, Rundwürmern, Bandwürmern, Chlamydia trachomatis und Malariaparasiten, z. B. Parasiten der Gattung Plasmodium oder Babesia, zum Beispiel Plasmodium falciparum, sowie Peptide, die für immunogene Epitope der genannten Antigene kodieren.
Besondere Antigene schließen ein das P28 von Schistosoma mansoni in voller Länge und Oligomere (z. B. 2, 4 und 8mere) des immunogenen P28 Aminosäuren 115–131 Peptids (welches sowohl ein B- als auch ein T-Zell Epitop enthält) und menschliches Papillomavirus Protein E7, Herpes simplex Antigene, Maul- und Klauenseuchevirus Antigene, Affenimmundefizienzvirus Antigene sowie die Diphtherietoxin Antigene, z. B. die Diphtherietoxin Gangliosidbindende Region.
Wie hierin verwendet beziehen sich Referenzen bezüglich des htrA Promotors auf den Promotor selbst oder einen Teil oder ein Derivat davon, das zur Steuerung der Expression einer kodierenden Sequenz in der Lage ist. Die bevorzugte und den htrA Promotor enthaltende Sequenz ist:
In den Konstrukten der vorliegenden Erfindung kann die DNA Sequenz für ein Fusionsprotein aus zwei oder mehreren Proteinen kodieren, bei dem angrenzende Proteine durch eine Scharnierregion getrennt sind. Die Scharnierregion ist eine Region, die zur Förderung der unabhängigen Faltung sowohl des ersten als auch zweiten Proteins vorgesehen ist, indem eine sowohl räumliche als auch zeitliche Trennung zwischen den Domänen bereitgestellt wird.
Die Scharnierregion ist typischerweise eine Sequenz, die für einen hohen Anteil an Prolin und/oder Glycin Aminosäuren kodiert. Die Scharnierregion kann sich gänzlich aus Prolin und/oder Glycin Aminosäuren zusammensetzen. Die Scharnierregion kann eine oder mehrere Glycin-Prolin Dipeptideinheiten umfassen.
Die Scharnierregion kann beispielsweise bis zu etwa fünfzehn Aminosäuren enthalten, zum Beispiel wenigstens 4 und vorzugsweise 6–14 Aminosäuren, wobei die Anzahl der Aminosäuren so gewählt ist, daß eine Flexibilität zwischen dem ersten und zweiten Protein vermittelt wird.
In einer Ausführungsform kann die Scharnierregion im wesentlichen der Scharnierdomäne eines Antikörperimmunglobulins entsprechen. Die Scharnierregionen von IgG Antikörpern sind insbesondere reich an Prolinen [T. E. Michaelson et al. J. Biol. Chem. 252, 883–9 1977], von denen angenommen wird, daß sie eine flexible Verbindung zwischen den Antigen bindenden und Schwanzdomänen bereitstellen.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird von den Prolinen zugeschrieben, daß sie den starren Teil des Scharniers bilden, da das Merkmal der Ringstruktur dieser Aminosäure die Rotation um die Peptidbindung, die den Prolinrest mit einer angrenzenden Aminosäure verbindet, behindert. Dieser Eigenschaft wird zugeschrieben Prolin und angrenzende Reste davon abzuhalten, die geordnete Struktur einer alpha-Helix oder eines beta-Faltblatts anzunehmen. Es wird angenommen, daß die Flexibilität von Glycin vermittelt wird, der einfachsten Aminosäure mit sehr eingeschränkten sterischen Anforderungen. Es wird angenommen, daß Glycin als ein flexibler Ellbogen im Scharnier fungiert. Weitere Aminosäuren können Glycin ersetzen, insbesondere solche ohne sperrige Seitenketten wie etwa Alanin, Serin, Asparagin und Threonin.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Scharnierregion eine Kette von vier oder mehr Aminosäuren, welche die Sequenz -[X]_p-Pro-[Y]_q-Pro-[Z]_r- definieren, wobei Pro für Prolin steht; X und Y jeweils Glycin oder eine Aminosäure, die eine nicht-sperrige Seitenkette aufweist, darstellen; Z eine beliebige Aminosäure ist; p eine positive ganze Zahl ist; q eine positive ganze Zahl von eins bis zehn darstellt; und r Null oder eine positive ganze Zahl größer Null ist.
Die Scharnierregion kann eine eigenständige Region darstellen, die sowohl zu dem ersten als auch zweiten Protein heterolog ist oder kann als ein carboxyterminaler Anteil des ersten Proteins oder ein aminoterminaler Anteil des zweiten Proteins definiert sein.
In einem höchstbevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und ein attenuiertes Bakterium umfaßt, das ein DNA Molekül enthält, welches den htrA Promotor in funktioneller Verknüpfung zu einer DNA Sequenz umfaßt, die für ein erstes und zweites polypeptidisches Immunogen verbunden durch eine Scharnierregion kodiert, wobei das erste polypeptidische Immunogen Tetanustoxinfragment C oder Epitope dessen umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das DNA Konstrukt den htrA Promotor in funktioneller Verknüpfung zu einer DNA, die für ein erstes Protein kodiert und an dessen fortgesetztem 3' Ende eine DNA Sequenz, die für die Scharnierregion kodiert, sowie stromabwärts davon ein oder mehrere Restriktionsendonucleasestellen.
Das Protein ist vorzugsweise ein antigenes Protein wie vorstehend definiert und ist insbesondere das TetC Fragment oder dessen Epitope.
Eine stabile Expression des ersten und zweiten heterologen Proteins verbunden über die Scharnierregion kann in vivo erhalten werden. Die heterologen Proteine können in einem attenuierten Bakterium exprimiert werden, das somit als Impfstoff verwendet werden kann.
Das attenuierte Bakterium kann ausgewählt sein aus den Gattungen Salmonella, Bordetella, Vibrio, Haemophilus, Neisseria und Yersinia. Alternativ kann das attenuierte Bakterium ein attenuierten Stamm von enterotoxigenen Escherichia coli sein. Insbesondere können die folgenden Arten erwähnt werden: S.typhi- die Ursache von menschlichem Typhus; S.typhimurium- die Ursache von Salmonellose bei einigen Tierarten; S.enteritidis- eine Ursache von Lebensmittelvergiftung bei Menschen; S.choleraesuis- eine Ursache von Salmonellose bei Schweinen; Bordetella pertussis- die Ursache von Keuchhusten; Haemophilus influenzae- eine Ursache der Gehirnhautentzündung; Neisseria gonorrhoeae- die Ursache der Gonorrhoe und Yersinia- eine Ursache von Lebensmittelvergiftung.
Die Attenuierung eines Bakteriums kann auf eine nicht-revertierende Mutation eines Gens des Biosynthesewegs aromatischer Aminosäuren des Bakteriums zurückzuführen sein. Wenigstens zehn Gene sind an der Synthese von Chorismat, der Verbindung am Verzweigungspunkt des Biosynthesewegs aromatischer Aminosäuren beteiligt. Einige von diesen liegen auf weit voneinander entfernten Orten auf dem bakteriellen Chromosom, zum Beispiel aroA (5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat-synthase), aroC (Chorismatsynthase), aroD (3-Dihydrochinatdehydratase) und aroE (Shikimatdehydrogenase). Eine Mutation kann somit im aroA, aroB, aroD oder aroE Gen vorkommen.
Vorzugsweise jedoch beherbergt ein attenuiertes Bakterium eine nicht-revertierende Mutation in jedem zweier eigenständiger Gene seines Biosynthesewegs aromatischer Aminosäuren oder beherbergt eine nicht-revertierende Mutation in seinem Biosyntheseweg aromatischer Aminosäuren und eine nichtrevertierende Mutation in einem regulatorischen Gen wie etwa htrA, OmpR oder OsmC. Beispiele geeigneter attenuierter Bakterien werden beispielsweise in EP-A-0322237 und EP-A-0400958 offenbart.
Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung können ein oder mehrere geeignete Zusatzstoffe umfassen.
Der Impfstoff wird vorzugsweise in lyophilisierter Form präsentiert, zum Beispiel in Kapselform zur oralen Verabreichung an einen Patienten. Solche Kapseln können mit einer enterischen Hüllschicht zur Verfügung gestellt werden, beispielsweise Eudragit „S", Eudragit „L", Celluloseacetat, Celluloseacetatphthalat oder Hydroxypropylmethylcellulose. Diese Kapseln können als solche verwendet werden oder alternativ kann das lyophilisierte Material vor der Verabreichung angerührt werden, z. B. als Suspension. Das Anrühren wird vorteilhafterweise in einem Puffer bei einem geeigneten pH durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Organismen zu gewährleisten. Zum Schutz der attenuierten Bakterien und des Impfstoffes vor Magensäure, wird vor jeder Verabreichung des Impfstoffs vorteilhaftennreise ein Natriumbicarbonatpräparat verabreicht. Alternativ kann der Impfstoff zur parenteralen Verabreichung, intranasalen Verabreichung oder intramammären Verabreichung angefertigt werden.
Vorzugsweise ist die Impfstoffzusammensetzung für eine mucosale Aufnahme angepaßt, z. B. durch orale Verabreichung, durch intranasale Verabreichung oder durch intrabronchiale Verabreichung.
Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung können zur Vorbeugung oder Behandlung bei einem Wirtsorganismus, insbesondere einem menschlichen Wirtsorganismus aber möglicherweise auch einem tierischen Wirtsorganismus verwendet werden. Eine durch einen Mikroorganismus, besonders ein Pathogen verursachte Infektion kann somit durch Verabreichung einer wirksamen Dosis einer Impfstoffzusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes attenuiertes Bakterium enthält, vermieden werden. Das Bakterium exprimiert dann ein heterologes Protein oder heterologe Proteine, die in der Lage sind, die Bildung eines Antikörpers gegen den Mikroorganismus hervorzurufen. Die eingesetzte Dosierung ist von einigen Faktoren abhängig, welche die Größe und das Gewicht des Wirtsorganismus, den Typ des formulierten Impfstoffes und die Art des heterologen Proteins einschließen.
Ein zur Verwendung in den Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützliches attenuiertes Bakterium kann durch Transformation eines attenuierten Bakteriums mit einem DNA Konstrukt wie vorstehend beschrieben hergestellt werden. Jede geeignete Transformationstechnik kann zum Einsatz kommen, wie etwa Elektroporation. Auf diese Weise kann ein attenuiertes Bakterium erhalten werden, das in der Lage ist, ein Protein oder Proteine, die gegenüber dem Bakterium heterolog sind, zu exprimieren. Eine Kultur des attenuierten Bakteriums kann unter aeroben Bedingungen angezogen werden. Eine genügende Menge des Bakteriums wird folglich zur Formulierung als Impfstoff angefertigt, wobei eine minimale Expression des heterologen Proteins auftritt.
Der Expressionsvektor wird mit angemessenen Transkriptions- und Translationskontrollelementen versehen, die, neben dem htrA Promotor, eine transkriptionelle Terminationsstelle und Start- und Stopcodons der Translation einschließen, und eine angemessene Ribosomenbindungsstelle wird zur Verfügung gestellt. Der Vektor umfaßt typischerweise einen Replikationsursprung und, wenn gewünscht, einen Selektionsmarker wie etwa ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum. Der Vektor kann beispielsweise ein Plasmid sein.
Die Erfindung wird nunmehr durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und die begleitenden Abbildungen veranschaulicht, jedoch nicht eingeschränkt, in denen:
1 eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids pHTRA1 ist, das den htrA Promotor gemäß einem Aspekt der Erfindung enthält;
2 eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids pHTRA2 ist, das den htrA Promotor und eine für das mit einer Scharnierregion verbundene Tetanustoxinfragment C kodierende DNA enthält;
3 die Struktur des Plasmids pTECH2 darstellt;
4 die Struktur des Zwischenplasmids pBD907 darstellt;
5 die Struktur des gemäß des in 1 gezeigten Schemas angefertigten Plasmids pHTRA1 veranschaulicht;
6 die Struktur des gemäß des in 2 gezeigten Schemas angefertigten Produktplasmids pHTRA2 veranschaulicht;
7A und 7B den Einfluß von Temperaturverschiebungen auf die Promotoren nirB, groE und htrA darstellen; und
8 die Expression von lacZ durch htrA, nirB und groE in Makrophagen zeigt.
BEISPIEL 1
Herstellung des htrA-TetC-Scharnier Konstrukts
Wie aus 1 ersichtlich war das Startmaterial zur Herstellung eines Vektors, der den htrA Promotor und für das Tetanustoxinfragment C kodierende Gene enthält das Plasmid pTETnir15, dessen Struktur und Herstellung in unserer früheren Anmeldung PCT/GB93/01617 (Publikations Nr. WO94/03615) und darin zitierten Quellenangaben, z. B. WO-A-92159689, offenbart sind.
Das pTETnir15 Plasmid enthält den nirB Promotor verbunden mit dem Gen, welches für das C-Fragment des Tetanustoxins (TetC) kodiert. Wie in 1 gezeigt, wurde pTETnir15 mit SaclI und BamHI verdaut und die daraus resul tierenden 2,9 kb und 813 by Fragmente wurden in einem Gel gereinigt. Das 2,9 kb Fragment wurde mit einem 1,74 kb Fragment, welches dem B. Pertussis filamentösen Hämagglutiningen (FHA) entstammt, ligiert, wobei das Fragment die in SEQ.ID.NO.7 gezeigte Sequenz aufweist. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pBD907 bezeichnet und dessen Restriktionskarte wird in 5 gezeigt. Die Absicht bei der Herstellung des Zwischenplasmids pBD907 war die Enfernung der im TetC Fragment befindlichen EcoRI Stelle, damit die nirB Promotorsequenz durch die htrA Promotorsequenz ersetzt werden könnte. Dies wurde durch Verdau von Plasmid pBD907 mit EcoRI und BglII erreicht. Das erhaltene 4535 by Fragment wurde im Gel gereinigt und mit den folgenden 55 by Oligonukleotiden, die den htrA Promotor enthalten, ligiert:
Oligo-1
Oligo-2
Die Anwesenheit des Promotors im resultierenden Zwischenplasmid pINT wurde durch DNA Sequenzierung bestätigt. Das Plasmid pINT wurde dann mit SaclI und BamHlI verdaut und an das 813 by Fragment aus pTETnir15 ligiert, wodurch das Plasmid pHTRA1 gebildet wurde. Die DNA Sequenz von pHTRA1 ist in SEQ.ID.NO.4 gezeigt; die durch die ersten 55 by definierte htrA Region weist die Sequenz
In Bezug auf SEQ. iD. NO.4 ist GAACTT die –35 Box und TCTGA die –10 Box. Bei den Basenpaaren 513 und 2235 liegen Sacli beziehungsweise AIwNI Restriktionsstellen.
Plasmid pHTRA1 wurde zur Transformation des Salmonella typhimurium Stamms BRD509 (hinterlegt unter der Zugangsnummer NCTC 12716 am 12. Oktober 1992) verwendet, und der resultierende Stamm, als BRD935 bezeichnet, wurde mit Hilfe von Standardverfahren auf Expression des TetC Fragments überprüft. Stamm BRD935 wurde bei der National Collection of Type Cultures, Colindale, Vereinigtes Königreich, am 27. Januar 1995 unter der Zugangsnummer 12883 hinterlegt.
Wie in 2 gezeigt wurde Plasmid pHTRA1 verwendet, um ein modifiziertes Konstrukt herzustellen, in dem sich eine „Scharnier"region am C-terminalen Ende des TetC Fragments befindet. Die die „Scharnier"region darstellende Nukleotidsequenz wurde aus dem Plasmid pTECH2 erhalten, welches die in SEQ.ID.No.5 dargestellte DNA Sequenz aufweist und Sacli und AIwNI Restriktionsstellen an den Positionen 533 beziehungsweise 2304 besitzt. Die Herstellung dieses Plasmids wird in unserer früheren Anmeldung PCT/GB93/01617 offenbart.
Das Plasmid pTECH2 umfaßt die nirB Promotorregion verbunden mit dem Tetanustoxinfragment C, das an seinem 3' Ende über eine BamHl Restriktionsstelle mit einer durch ein Gly-Pro-Gly-Pro Wiederholungsmotiv kodierten Scharnierregion sowie einer Anzahl von Restriktionsstellen, welche die Insertion von Genen erlauben, die für weitere Polypeptide kodieren, verbunden ist. Ein 1,7 kb Fragment, das für die Scharnierregion und einen Teil der Region des Tetanustoxinfragment C kodiert, wurde durch Verdau mit Sacli und AIwNI aus pTECH2 entfernt und gereinigt. Die DNA des entstandenen Fragments ist in SEQ.ID.No.6 gezeigt.
Plasmid pHTRA1, das für den htrA Promotor und das Tetanustoxinfragment C kodiert, aber kein Scharnier enthält, wurde mit SaclI und AIwNI verdaut, und das entstandene Fragment wurde im Gel gereinigt.
Das 1,7 kb Fragment (SEQ.ID.N0.6) aus pTECH2 und das 2 kb Fragment aus pHTRA1 wurden zur Bildung des Plasmids pHTRA2 ligiert, das einen htrA Promotor in funktioneller Verknüpfung mit dem Gen für das Tetanustoxinfragment C vereint, wobei es an dessen 3' Ende die Scharnierregion aufweist.
Ein attenuierter Stamm von Salmonella typhimurium wurde mit dem Vektor pHTRA2 transformiert, und nach Selektion gemäß Standardverfahren wurde der Salmonellastamm BRD1062 isoliert, der das Plasmid pHTRA2 beherbergt.
Plasmid pHTRA2 dient als Zwischenprodukt zur Herstellung von Konstrukten, die für ein durch eine Scharnierregion verbundenes Fusionsprotein kodieren. Folglich können gemäß der in unserer früheren Anmeldung Nr. PCT/GB93/01617 beschriebenen Methoden weitere Proteine in die Restriktionsendonukleasestellen der Scharnierregion kloniert werden.
MATERIALIEN UND METHODEN BAKTERIENSTÄMME
E.coli HB101 und BRD509 (ein attenuierter S. typhimurium aroA aroD Stamm (hinterlegt unter Zugangsnummer NCTC 12716 am 12. Oktober 1992) wurden in allen Experimenten verwendet. Die Bakterien wurden in Luria Broth (LB) oder mit 1,6% w/v Agar verfestigtem LB unter Zusatz geeigneter Antibiotika angezogen.
DNA Manipulationen
Plasmid DNA wurde durch die Methode der alkalischen Lyse (R. Maniatis, et al., 1982 Molecular Cloning- A Laboraton Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) isoliert. Geschnittene DNA Fragmente wurden aus Agargelen nach der Methode von Tautz und Rentz (1983, „An optimized freezesqueeze method for the recovery of DNA fragments from agarose gels". Analytical Biochem., 132, 14–19) gereinigt. Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim, Deutschland und New England Biolabs, USA geliefert und nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.
DNA SEQUENZIERUNG
DNA zur doppelsträngigen Sequenzierung wurde nach der Methode von Stephen et al. (1990, A Rapid Method for Isolating High Quality Plasmid DNA Suitable for DNA Sequencing, Nucleic Acid Research, 18, Nr. 24, S. 7463) isoliert. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Sequenase Version 2 Kit (USB) durchgeführt, welcher nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde.
OLIGONUKLEOTIDE
Sie wurden mit einem SAM1 Oligonukleotidsynthetisiergerät (Biolabs, UK) hergestellt.
BEISPIEL 2
Herstellung des htrA-lacZ Konstrukts
Die Eigenschaften des htrA Promotors wurden mit zwei anderen induzierbaren Promotoren „verglichen", nämlich den nirB und groE Promotoren.
Subklonierung von lacZ stromabwärts der nirB, htrA und groE Promotoren
Ein DNA Fragment, das für ein promotorloses lacz Gen kodiert, wurde aus dem Plasmid pMAC1871 (Pharmacia) mittels der Technik der Agarose niedrigen Schmelzpunktes aufgereinigt, nachdem das Plasmid mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI verdaut wurde [14]. Die Plasmide pTETnir-15 [S. N. Chatfield et al, Bio/Technology 10, 888-892] und pTEThtrA-1, die den nirB beziehungsweise htrA Promotor beherbergen, wurden mit SalI und BamHl Endonukleasen verdaut, und das gereinigte für IacZ kodierende Fragment wurde im Leseraster stromabwärts der Promotoren kloniert. Plasmid pRZ-PES wurde verwendet, um die Expression von 6-Galaktosidase (6-Gal) durch den groE Promotor zu messen. pRZ-PES enthält den E.coli groE-Operon Promotor stromaufwärts der Gene groES und IacZ. Es wurde durch Subklonierung eines 2,1 kb EcoRI-HindlII Fragments, welches das Operon des Plasmids pOF39 [O. Fayet et al J. Bacteriol. 171, 1379–1385 (1989)] trägt, in pUC19 konstruiert. Es wurde anschließend eine neue BglII Stelle zwischen die Gene groES und groEL durch ortsgerichtete Mutagenese eingeführt. Das EcoRI-BglII Fragment, welches den groE Promotor und das roES Gen trägt, wurde in das mit EcoRI-BamHI geschnittene Promotor-Probeplasmid pRF5255 [P. F. Lambert of al J. Bacteriol. 162, 441–444 (1985)] kloniert, um Plasmid pRZ-PES zu erhalten. Plasmide, die in S. typhimurium LB5010 (r^–m⁺) [L. R. Bullas et al J. Bacteriol. 256, 471–474 (1983)] hergestellt wurden, wurden in den S. typhimurium Stamm BRD915 (S. typhimurium SL1344 htrA) [S. N. Catfield et al Microbial. Pathog. 12, 145–151 (1992)] durch Elektroporation eingeführt. Lac positive Rekombinanten wurden auf Ampicillin und X-Gal enthaltenden L Agarplatten durchforstet.
Auswirkungen von Veränderungen der Umgebungsbedingungen auf die IacZ Expression
Bakterielle Stämme, die die rekombinanten Plasmide beherbergen, wurden über Nacht in L-Broth unter Schütteln bei 30°C angezogen. Die Kulturen wurden 1 : 50 verdünnt und für weitere 3 Stunden bei 30°C wachsen gelassen, bis eine OD₆₀₀ von 2,8–3,4 erreicht wurde. 0,2 ml jeder Kultur wurden bei 4°C aufbewahrt und zur Bestimmung der Grundlinie der 6-Gal Aktivität verwendet. Die übrigen Anteile der Kulturen wurden dann, wie unten ausgeführt, unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt, und Proben wurden, wenn nicht anders angegeben, bei 0, 2, 4, 6 und 24 Stunden entnommen. Zu jedem Zeitpunkt wurde die OD₆₀₀ bestimmt, und die Bakterien wurden vor Durchführung einer 6-Gal Analyse bei 4°C aufbewahrt.
Bestimmung der Expression in infizierten HEp-2, Caco-2 und THP 1 Makrophagenzelllinien
Zellen wurden zu annähernd 10⁵ Zellen pro Mulde in Vierundzwanzig-Mulden-Platten angeimpft und über Nacht in Dulbecco's Modified Eagles Medium ohne Phenolrot (ICN Flow), ergänzt mit 10% (vol/vol) fötalem Kalbsserum und 2 mM Glutamin bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ angezogen. 10⁸ CFU Bakterien der verdünnten Übernachtkultur wurden den Gewebekulturzellen zugegeben und bei 30°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben des Gewebekulturmediums entnommen, um die 6-Gal Aktivität in den extrazellulären Bakterien zu messen. Die Anzahl der Bakterien in jeder Probe wurde anhand der Zahl lebender Organismen bestimmt und die entsprechende ODsoo wurde unter Verwendung einer Standardkurve gemessen. Infizierte Zellen wurden mit Phosphatpuffersaline (PBS) gewaschen und eine weitere Stunde in Gegenwart von 200 mg/ml Gentamycin inkubiert, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Danach wurden die Zellen unter Verwendung von sterilem destilliertem Wasser und kräftigem Pipettieren lysiert. Die 6-Gal Aktivität wurde für jedes Zelllysat bestimmt. Die Anzahl der Bakterien in jedem Lysat wurde anhand der Zahl lebender Organismen bestimmt und die entsprechenden ODsoo Werte wurden unter Verwendung einer Standardkurve gemessen.
ERGEBNISSE
Die Expression durch jeden der für diese Studie ausgewählten Promotoren ist gegenüber Veränderungen der Umgebungsbedingungen empfindlich. Für nirB wurde bereits früher gezeigt, daß er auf Veränderungen der Anaerobizität reagiert. Die anfänglichen Experimente wurden durchgeführt, um das Ausmaß der Expression von IacZ durch jeden der Promotoren, die auf ähnlichen Multikopie-Plasmiden liegen, welche in dem Salmonella Impfstoffstamm BRD915 beherbergt sind, einzuschätzen. Der Einfluß von Temperaturverschiebungen auf die verschiedenen Promotoren ist in 7 gezeigt. Temperaturverschiebungen von 30°C auf 37°C (7A) resultierten in einer Steigerung von 6-Gal Enzymeinheiten, wenn IacZ durch den nirB und htrA Promotor exprimiert wurde. Kein signifikanter Anstieg an 6-Gal Einheiten konnte beim groE Promotor festgestellt werden. Eine Temperaturverschiebung von 30°C auf 42°C resultierte in einer Steigerung der Anzahl von 6-Gal Einheiten bei allen drei Promotoren. Die Steigerungsrate im Gehalt an 6-Gal war schneller bei htrA und nirB im Vergleich zu groE (7B). Temperaturverschiebungen von 37°C auf 42°C resultierten in der Induktion beider Promotoren nirB und htrA, mit einer gemäßigteren Erhöhung von 6-Gal Einheiten beim groE Promotor (7C).
Die Expression von 6-Gal durch die verschiedenen Promotoren wurde auch durch Selektion von Bakterien, die in eukaryotische Zellen eingedrungen waren, untersucht. HEp-2, Caco-2 und THP-1 Makrophagenzelllinien wurden mit 10⁸ Bakterien infiziert und bei 30°C inkubiert. Die Anzahl von 6-Gal Einheiten, bestimmt drei Stunden nach der Infektion von HEp-2, zeigte, daß die IacZ Expression durch sowohl den htrA als auch den nirB Promotor signifikant gesteigert wurde (2). Jedoch gab es keinen nachweisbaren Anstieg der IacZ Expression durch den groE Promotor. Ähnliche Ergebnisse wurden bei infizierten Caco-2 Zellen erzielt (nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu wurden in der intrazellulären Umgebung der Makrophagen alle drei Promotoren induziert (8). Der nirB Promotor wurde am stärksten, der groE Promotor am wenigsten beeinträchtigt (8). Wenn die Anzahl an 6-Gal Einheiten im extrazellulären Medium der jeweiligen Zellinie bestimmt wurde, konnte keine Steigerung der Enzymaktivität beobachtet werden (nicht gezeigt).
Da herausgefunden wurde, daß das Wachstum innerhalb von Makrophagen die Expression aller drei Promotoren beeinflußt, wurde deren Sensitivität gegenüber Wasserstoffperoxid, welches allgemein im Phagosom von Makrophagen vorhanden ist, beobachtet. Eine Inkubation der Bakterien bei 30°C in 100 OM Wasserstoffperoxid ergab keine signifikante Auswirkung auf den groE und den nirB Promotor. Im Gegensatz dazu wurde der Gehalt an 6-Gal beim htrA Promotor erhöht, wobei 10 U über dem Grundgehalt nach 4 Stunden erreicht wurden. Darauf folgte ein rasches Absinken auf den Grundgehalt nach 6 Stunden (nicht gezeigt). Die konstitutive Expression von IacZ durch das Plasmid pLK [M. Szabo et al J. Bacteriol. 174, 7245–7252] wurde nicht in signifikanter Weise durch eine der Umgebungsbedingungen beeinflußt (nicht gezeigt).
In dieser Studie wurden drei durch Umgebungsbedingungen regulierte Promotoren verwendet, um IacZ unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu exprimieren. Die Promotoren repräsentieren drei Klassen von induzierbaren bakteriellen Promotoren: der anaerobisch induzierbare E.coli nirB, der σ^E abhängige htrA und der σ³² abhängige groE. Die Expression durch den nirB Promotor ist abhängig von dem Transkriptionsfaktor FNR, der zwischen Position –52 und –30 stromaufwärts vom Transkriptionsstart bindet. In manchen Fällen wird die FNR abhängige Transkription zusammen mit einem zweiten Transkriptionsfaktor NarL moduliert. Jedoch enthält das hier verwendete Plasmid pTETnir-15 nur die FNR abhängige Bindungsstelle.
Bakterien reagieren auf umgebungsbedingte Streßsituationen durch eine schnelle Veränderung der Syntheserate vieler Proteine. In vielen Fällen gleicht die Transitinduktion den Proteingehalt einem neuen Gleichgewichtszustand an. In dieser Studie untersuchten wir den Einfluß von Umgebungsbedingungen auf den Gehalt an 6-Gal. Wir fanden heraus, daß eine Temperaturverschiebung eine größere Auswirkung auf htrA Promotoren im Vergleich zu groE aufwies. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der Tatsache, daß in vivo der htrA Promotor vor groE (welcher σ³² abhängig ist) und zusammen mit σ³² induziert wird durch σ^E enthaltende RNA Polymerase. Überraschenderweise wurde der nirB Promotor ebenso durch erhöhte Temperaturen gesteigert. Obschon es möglich ist, daß bei hoher Temperatur die Sauerstoffkonzentration im Wachstumsmedium reduziert ist, kann die Tatsache, daß die Temperaturverschiebung von 30°C auf 37°C eine rasche Erhöhung der durch den nirB Promotor exprimierten 6-Gal Einheiten bewirkt, nahelegen, daß FNR, wie andere Streßproteinmodulatoren, auf eine Anzahl von Umgebungsstimuli reagiert. Ebenso wurde htrA auch unter anaeroben Wachstumsbedingungen induziert und es scheint daher, daß dieser Promotor entweder durch andere Faktoren als σ^E reguliert wird oder daß σ^E auch bei niedrigem Sauerstoffdruck aktiviert wird.
Für S. typhimurium gilt, daß, um seine Virulenz zu behalten, das Bakterium die Fähigkeit besitzen muß, in Makrophagen zu überleben. Dieses Überleben ist abhängig von der Fähigkeit der Bakterien eine Reihe von toxischen Tötungsmechanismen zu tolerieren, einschließlich der Produktion von Wasserstoffperoxid. Ungleich E.coli htrA Mutanten wurde für S. typhimurium htrA Mutanten früher gezeigt, daß sie nicht durch erhöhte Temperaturen abgetötet werden, sondern eher eine beeinträchtigte Fähigkeit aufweisen, bei signifikantem Gehalt an Wasserstoffperoxid zu überleben. Interessanterweise war der htrA Promotor der einzige der Testpromotoren dessen Expression in Gegenwart von Wasserstoffperoxid erhöht war.
Um den Einfluß der intrazellulären Umgebung zu bestimmen, wurde der Expressionsgrad durch die drei Promotoren beobachtet nachdem Salmonella, welches die Testplasmide beherbergt, in eine Anzahl von verschiedenen kultivierten eukaryotischen Zelllinien eingedrungen war. Die Bakterien wurden in vitro angezogen und zur Infektion von eukaryotischen Zellen bei 30 °C verwendet, da eine Temperaturverschiebung von 30 °C auf 37 °C sowohl den htrA als auch den nirB Promotor in drastischer Weise induzierte. Wir konnten zeigen, daß während der Grad der 6-Gal Expression durch sowohl den nirB als auch den htrA Promotor in allen untersuchten Zelllinien erhöht wurde, der groE Promotor nur in infizierten Makrophagen induziert wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Impfstoftzusammensetzung, die ein attenuiertes Bakterium umfasst, welches ein DNA Konstrukt enthält, das die htrA Promotorsequenz in funktioneller Verknüpfung zu einer DNA Sequenz, die für ein oder mehrere heterologe Proteine kodiert umfasst, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die htrA Promotorsequenz funktionell mit einer DNA Sequenz verknüpft ist, die für ein Fusionsprotein zweier oder mehrerer Proteine kodiert.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die die Fusion bildenden Proteine über eine flexible Scharnierregion verbunden sind.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Scharnierregion eine Kette von vier oder mehr Aminosäuren darstellt, welche die Sequenz -[X]_p-Pro-[Y]_q-Pro-[Z]_r- definiert, wobei Pro Prolin ist, X und Y jeweils Glycin oder eine Aminosäure darstellen, die eine nicht-sperrige Seitenkette aufweist, Z eine beliebige Aminosäure ist, p eine positive ganze Zahl ist, q eine positive ganze Zahl von eins bis zehn und r null oder eine positive ganze Zahl größer als null darstellen.
Impfstoftzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2, 3 und 4, wobei der htrA Promotor funktionell mit einer DNA Sequenz verknüpft ist, die für ein erstes und zweites heterologes Protein kodiert, wobei das erste heterologe Protein eine antigene Sequenz darstellt, die das Tetanustoxinfragment C oder eines oder mehrerer Epitope davon umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die zur oralen oder intranasalen Verabreichung angepasst ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das attenuierte Bakterium aufgrund einer nicht revertierenden Mutation in einem Gen des Biosynthesewegs aromatischer Aminosäuren des Bakteriums attenuiert ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das attenuierte Bakterium zusätzlich eine nicht revertierende Mutation des htrA Gens aufweist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das attenuierte Bakterium eine nicht revertierende Mutation in jedem zweier eigenständiger Gene des Biosynthesewegs aromatischer Aminosäuren beherbergt.
Impfstoftzusammensetzung nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei das Gen oder jedes der Gene des Biosynthesewegs aromatischer Aminosäuren ausgewählt ist aus aroA, aroC, aroD und aroE.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die beiden eigenständigen Gene aroA und aroD sind.