DE69534786T2

DE69534786T2 - Diphtheria toxin impfstoffe mit mutierter r domäne

Info

Publication number: DE69534786T2
Application number: DE69534786T
Authority: DE
Inventors: R.John Wellesley Hills COLLIER; Wei Hai Boston SHEN; David Los Angeles EISENBERG; Seunghyon Solana Beach CHOE
Original assignee: Harvard College; University of California
Current assignee: Harvard College; University of California
Priority date: 1994-06-08
Filing date: 1995-05-31
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2015-06-01
Also published as: PT762892E; US5917017A; JP3755773B2; EP0762892A4; EP0762892B1; DK0762892T3; JPH10502523A; DE69534786D1; ATE317701T1; WO1995033481A1; CA2191239A1; EP0762892A1; ES2258768T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft Vakzine, die Schutz vor Diphtheria-Toxin bieten.
Wildtyp-Diphtheria-Toxin (DT) ist ein Protein-Exotoxin, das vom Bakterium Corynebacterium diphtheriae produziert wird. Das Molekül wird als einzelnes Polypeptid produziert, das proteolytisch am Aminosäurerest 190, 192 oder 193 in zwei Untereinheiten, durch eine Disulfidbindung verknüpft, aufgespalten wird: Fragment A (N-terminal, ~ 21K) und Fragment B (C-terminal, 37K) (Moskaug et al., Biol Chem 264:15709–15713, 1989; Collier et al., Biol Chem, 246:1496–1503, 1971). Die Rezeptorbindungs-Domäne des Wildtyp-DT ist im B-Fragment enthalten (Rolfe et al., J. Biol. Chem, 265:7331–7337, 1990). Fragment A ist der katalytisch aktive Teil des Wildtyp-DT. Es handelt sich um eine NAD-abhängige ADP-Ribosyltransferase, welche den Proteinsynthesefaktor Elongierungsfaktor 2 (EF-2) inaktiviert und dadurch die Proteinsynthese in den vergifteten Zellen beendet. Fragment B des Wildtyp-DT besitzt die als R-Domäne bekannte Rezeptor-Bindungsdomäne (Aminosäuren 379–535, siehe Choe et al., Nature, 357:216–222, 1992; Fu et al., in: Vaccines 93, Ginsberg et al., Hrsg., CSHSQB, S. 379–383, 1993). Die Rezeptor-Bindungsdomäne umfasst 10 β-Stränge, welche zwei β-Sheets bilden. Eine Untergruppe der β-Stränge ähnelt einer Immunoglubulin-artigen Gruppe, welche möglicherweise bei der Rezeptor-Erkennung beteiligt ist (Choe et al., Nature 357:216–222, 1992). Sobald DT über die Rezeptor-Bindungsdomäne an die Zelle gebunden ist, wird der Rezeptor/DT-Komplex internalisiert. Eine zweite funktionale Region auf Fragment B ermöglicht es dem DT, die Zellmembran zu durchwandern und somit das katalytisch aktive Fragment A in das Cytosol der Zelle freizusetzen. Ein einzelnes Molekül des Fragments A reicht aus, um die zelluläre Proteinsynthese zu inaktivieren.
Immunität gegenüber einem bakteriellen Toxin, wie Wildtyp-DT, kann auf natürlichem Weg im Verlauf der Infektion oder künstlich durch Injektion mit einer enttoxifizierten Form des Toxins (auch chemisches Toxoid genannt) erworben werden (Germanier, Hrsg., Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, FI, 1984). Chemische Toxoide wurden traditionell durch chemische Modifizierung nativer Toxine hergestellt (z.B. mit Formalin oder Formaldehyd (Lingood et al., Brit. J. Exp. Path. 44:177, 1963)), wodurch sie nicht-toxisch gemacht werden, während die das geimpfte Tier schützende Antigenität beibehalten wird. Ein Beispiel für ein chemisches Toxoid ist das von Michel und Dirkx beschriebene (Biochem. Biophys. Acta 491:286–295, 1977). Ein chemisches Toxoid kann jedoch die addierte(n) chemische(n) Gruppe(n) verlieren und zu seiner aktiven, toxischen Form zurückkehren, so dass seine Verwendung als Vakzin eine Gefahr für den Impfstoffempfänger in sich birgt.
Ein anderer Weg für die Herstellung eines Toxoids ist die Verwendung genetischer Verfahren. Es hat sich gezeigt, dass eine Corynebacterium diphtheriae-Mutante, CRM-197 (Uchida et al., J. Biol. Cchem. 248:3838–3844, 1973; Uchida et al., Nature 233:8–11, 1971) (wobei CRM für „kreuzreagierendes Material" steht) ein enzymatisch inaktives DT-Protein enthält, welches eine anti-DT-Immunantwort produziert. Collier et al. (US-Patent Nr. 4,709,017) offenbaren eine genetisch hergestellten DT-Mutante, die eine Aminosäure-Deletion bei Glu-148 trägt. Die Substitution von Asp, Gln oder Ser an dieser Stelle verringert die enzymatischen und cytotoxischen Aktivitäten um das 2- bis 3-fache, was zeigt, dass die räumliche Anordnung und die chemische Natur der Glu-148-Seitenkette diese Aktivitäten stark beeinflusst (Carroll et al., J. Biol. Chem. 262:8707, 1987; Tweten et al., J. Biol. Chem. 260:10392, 1985; Douglas et al., J. Bacteriol. 169:4967, 1987). In ähnlicher Weise offenbaren Greenfield et al. (US-Patent Nr. 4,950,740) genetisch hergestellte mutante DT-Formen, bei denen der Glu-148-Rest deletiert oder durch Asn ersetzt ist. Die DNA-Sequence und entsprechende Aminosäuresequenz von natürlich vorkommender Diphtheria-Toxin DNA ist in (SEQ ID NO:1) dargestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Polypeptide, die eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins (Toxoid) umfassen, welche als Vakzin für die toxischen Effekte von Wildtyp-DT (d. h. natürlich vorkommendes) verwendet werden kann. Die Mutante der R-Domäne besteht aus einem Aminosäure-Segment entsprechend den Aminosäuren 379–535 einschließlich, von SEQ ID NO: 1, welches wenigstens in einer Aminosäureposition mutiert ist um auf diese Weise die Targetzell-Rezeptorbindung zu verringern, aber nicht zu eliminieren. Bevorzugt ist es, die anderen funktionalen Domänen neben der R-Domäne in solchen Vakzinen beizubehalten, um die Proteinstabilität zu maximieren und die Epitopdiversität zu optimieren. Andererseits ist es weniger wahrscheinlich, dass ein Vakzin oder ein Lebendvakzinstamm, der eine einzelne Domäne wie die R-Domäne enthält, seine Toxizität wiedererlangt. Die Erfindung betrifft auch lebende, genetisch veränderte Mikroorganismen (Zellen und Viren), die ein Polypeptid exprimieren, das eine Mutante der DT-R-Domäne umfasst. Ein erfindungsgemäßes Toxoid umfasst eine Mutante der R-Domäne, welche die Targetzellen weniger effizient bindet als Wildtyp-DT. Ein erfindungsgemäßes Toxoid und die das erfindungsgemäße Toxoid kodierende DNA bergen weniger Risiken einer Reversion und sind bessere Kandidaten für die Verwendung in lebenden, genetisch veränderten Vakzinzellen oder Viren, wobei beide zur Proliferation im Vakzinempfänger in der Lage sind. Bevorzugt umfassen die Toxoide eine Mutante der R-Domäne, die immunologisch kreuzreaktiv mit natürlich vorkommendem Diphtheria-Toxin ist, d. h. sie reagiert mit Antikörpern, die für natürlich vorkommendes Diphtheria-Toxin monospezifisch sind.
Die hierin verwendeten Begriffe mutiert oder Mutante betreffen eine Sequenzveränderung (Substitution oder Deletion), welche in der Deletion einer oder mehrerer der Aminsäuren 379–535 oder in der Substitution wenigstens einer dieser Aminosäuren durch eine oder mehrere andere Aminosäuren resultiert.
Die Anmelder haben gezeigt, wie man DT-Toxoide konstruiert, die eine Mutante der R-Domäne umfassen, die einem Patienten sicher in Form eines Lebendvakzinstamms verabreicht werden können. Die Verabreichung eines Lebendvakzinstamms weist gegenüber der Immunisierung mit einem chemischen Toxoid viele Vorteile auf. Erstens proliferiert beispielsweise ein Lebendvakzinstamm im Rezipienten und kann ein DT-Toxoid exprimieren; zweitens verbleibt ein Lebendvakzinstamm länger im Vakzinempfänger, als es ein injiziertes Polypeptid vermag, und es ist in der Lage, ein genetisch verändertes DT-Toxoid zu produzieren; und drittens macht ein Lebendvakzin weniger Injektionen oder Auffrischungen für die effektive Immunisierung notwendig, es kann häufig oral verabreicht werden und es kann verwendet werden, um mehrere Antigene gleichzeitig zu verabreichen. Alternativ können die erfindungsgemäßen Toxoide mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger kombiniert werden, um eine Vakzinzusammensetzung zu bilden, die in einem Säuger inokuliert wird, und die einen immunologischen Schutz gegen Wildtyp-Diphtheria-Toxin erzeugt. Ein erfindungsgemäßes Toxoid wird durch Kultivieren einer Zelle hergestellt, die eine für ein DT-Toxoid kodierende DNA und regulatorische DNA enthält, die in der Lage ist, die Expression des DT-Toxoids zu steuern.
Allgemein betrifft die vorliegende Erfindung ein Polypeptid, bevorzugt ein im Wesentlichen reines Präparat des Polypeptids, wobei das Polypeptid eine Mutante der Diphtheria-Toxin-R-Domäne umfasst, das bevorzugt sowohl für eine Mutante der R-Domäne und wenigstens für einen Teil des B-Fragments kodiert oder für eine Mutante der R-Domäne und wenigstens einen Teil des A-Fragments kodiert, besonders bevorzugt eine Mutante der R-Domäne und ein B-Fragment und wenigstens einen Teil eines A-Fragments, ganz besonders bevorzugt eine Mutante der R-Domäne und das B-Fragment und das gesamte A-Fragment, wobei die R-Domäne eine Mutation in wenigstens einer oder mehreren der Position Lys 516, Lys 526 oder Phe 530 (SEQ ID NO: 1) umfasst, wobei bevorzugt Lys 516 oder Lys 526 durch Cys oder Phe ersetzt ist und Phe 530 entweder durch Glu, Lys oder Gln substituiert ist, und wobei dem oben genannten B-Fragment das gesamte Segment zwischen den Aminosäuren 379–535, einschließlich, des Wildtyp-DT (SEQ ID NO: 1) fehlt. Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, wie hierin verwendet, ist ein Polypeptid, das eine Mutante der R-Domäne aufweist, wie hier exemplifiziert oder beansprucht. Der Begriff „im Wesentlichen rein", wie hier verwendet, beschreibt ein DT-Protein, das von Komponenten getrennt wurde, die es natürlicherweise begleiten. Typischerweise ist ein Protein im Wesentlichen rein, wenn wenigstens 10% des Gesamtmaterials (bezogen auf das Volumen, das Nass- oder Trockengewicht, oder bezogen auf Mol-% oder auf die Molfraktion) ein DT-Protein ist. Bevorzugt macht das Protein wenigstens 50%, besonders bevorzugt 75%, noch stärker bevorzugt wenigstens 90% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 99% des Gesamtmaterials aus. Die Reinheit kann einfach mittels bekannter Verfahren, wie SDS-PAGE-Gelelektrophorese, Säulenchromatographie oder HPLC-Analyse bestimmt werden.
Gemäß einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle, die eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäure umfasst, bevorzugt eine homogene Zellpopulation, vorzugsweise ausgewählt unter B. subtilis-, Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-, Salmonella sp.-, Vibro cholerae-, Corynebacterium diphtheria-, Listeriae-, Yersiniae-, Streptococcus- oder E. coli-Zellen. Bevorzugt ist die Zelle in der Lage, ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Vakzin, umfassend ein physiologisch verträgliches Gemisch, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid beinhaltet.
Gemäß einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung einen Lebendvakzinstamm, der eine Zelle umfasst, die ein oben beschriebenes erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, welches die Bereitstellung einer Zelle, das Wachstum der Zelle in einem Medium zur Bildung einer Zellpopulation, die das Polypeptid exprimiert, und die Gewinnung des Polypeptids aus einer Zellpopulation oder dem Medium umfasst.
Gemäß einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins, welches die Kultivierung einer Zelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst, unter Bedingungen umfasst, die eine Proliferation der Zelle erlauben, wobei die Zelle für die Einführung als Lebendvakzinzelle in ein tierisches Lebewesen geeignet ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Säugers, vorzugsweise eines Menschen, gegen Wildtyp-Diphtheria-Toxin, wobei das Verfahren die Einführung einer immunisierenden Menge eines Vakzins in den Säuger umfasst. Ein, jedoch nicht das einzige, Verfahren zur Verabreichung einer für ein erfindungsgemäßes Diphtheria-Toxoid kodierenden DNA ist ein biolistischer Transfer, ein Verabreichungsverfahren, das die Beschichtung eines Mikroprojektils mit DNA, welche ein Immunogen von Interesse kodiert, und die Injektion des beschichteten Mikroprojektils direkt in die Zellen des Empfängers beinhaltet (Tang et al., Nature 356:152–154, 1992). Das erfindungsgemäße Diphtheria-Toxoid wird danach von der DNA exprimiert und stimuliert eine Immunreaktion beim Empfänger.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Fusionspolypeptid, welches ein Polypeptid umfasst, das über eine Peptidbindung mit einem zweiten Polypeptid verknüpft ist. Ein zweites Polypeptid, wie hier verwendet, verleiht der Mutante der R-Domäne oder einem erfindungsgemäßen Polypeptid Stabilität und/oder unterstützt oder verstärkt deren Immunogenität.
Ein Fusionspolypeptid besteht aus einem erfindungsgemäßen Polypeptid, das über eine Peptidbindung mit einem zweiten Polypeptid verknüpft ist. Bevorzugt ist das Fusionspolypeptid Bestandteil eines Vakzins, das zur Immunisierung eines menschlichen Patienten gegen Wildtyp-Diphtheria-Toxin verwendet werden kann. Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Trägersubstanz für ein zweites Polypeptid dienen, indem es ein Fusionspolypeptid bildet und vorzugsweise die Immunogenität des zweiten Polypeptids verstärkt. Die für das Fusionspolypeptid kodierende DNA kann direkt als Vakzin verwendet werden oder kann in eine Zelle inkorporiert werden, wobei die Zelle (beispielsweise eine Lebendvakzinzelle) in der Lage ist, das Fusionspolypeptid zu exprimieren und bevorzugt als Vakzin gegen Wildtyp-Diphtheria-Toxin verwendet wird. Der hier verwendete Begriff „Fusionspolypeptid" bezeichnet ein Proteinmolekül, das durch die Expression einer DNA hergestellt wird, wobei die DNA für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert und das Polypeptid mittels genetischer Veränderung an eine zweite DNA geknüpft ist, die für eine zweite Polypeptidsequenz kodiert. Der hier verwendete Begriff „erfindungsgemäßes Fusionspolypeptid" bezeichnet ein Fusionspolypeptid, das eine Mutante der R-Domäne umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Sequenz umfasst, die für eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins kodiert und die bevorzugt sowohl für eine Mutante der R-Domäne und wenigstens einen Teil des B-Fragments oder für eine Mutante der R-Domäne und wenigstens einen Teil des A-Fragments, besonders bevorzugt für eine Mutante der R-Domäne und ein B-Fragment und einen Teil eines A-Fragments, ganz besonders bevorzugt für eine Mutante der R-Domäne und das B-Fragment und das gesamte A-Fragment, kodiert, wobei die DNA-Sequenz, die komplementär zu dem Kodon ist, welcher wenigstens einem der Reste Lys 516, Lys 526 oder Phe 530 von natürlich vorkommendem Diphtheria-Toxin (SEQ ID NO:1) entspricht, mutiert ist und wobei bevorzugt Lys 516 oder Lys 526 durch Cys oder Phe substituiert ist und Phe 530 durch Glu, Lys oder Gln substituiert ist und das oben genannte B-Fragment die Aminosäuren 379–535, einschließlich, nicht aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Sequenz umfasst, die für eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins und wenigstens einen Teil des B-Fragments kodiert, wobei das B-Fragment eine Mutation in irgendeiner der Positionen Glu 349, Asp 352 oder Ile 364 des Wildtyp-Diphtheria-Toxins (SEQ ID NO: 1) aufweist und die Aminosäuren im Bereich von 379–535, einschließlich, nicht aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Sequenz umfasst, die für eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins, das B-Fragment und wenigstens einen Teil des A-Fragments kodiert, wobei das A-Fragment eine Mutation in einer der Positionen His 21, Gly 22, Lys 39, Gly 52, Gly 79, Gly 128 Ala 158, Glu 162, Glu 142, Val 147, Glu 148 des Wildtyp-Diphtheria-Toxins (SEQ ID NO: 1) aufweist und das oben genannte B-Fragment die Aminosäuren im Bereich von 379–535, einschließlich, nicht aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, die für das Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen polyklonalen Antikörper, der durch Injektion der R-Domäne des Diphtheria-Toxins in einen Säuger hergestellt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, die R-Domäne des Diphtheria-Toxins zu binden.
Gemäß einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein Polypeptid, enthaltend eine Mutante der R-Domäne, worin die R-Domäne wenigstens eine Mutation im Bereich der Aminosäuren 379–535, einschließlich, von SEQ ID NO: 1 beinhaltet. Das Polypeptid bindet sensitive Zellen mit geringerer Affinität als Wildtyp-Diphtheria-Toxin und ist in der Lage, einen Immunkomplex mit einem Antikörper zu bilden, der die R-Domäne des Wildtyp-Diphtheria-Toxins spezifisch erkennt. Eine sensitive Zelle, wie hier verwendet, ist irgendeine Zelle, die durch Wildtyp-Diphtheria-Toxin, gemäß den hierin beschriebenen Cytotoxizitäts-Assays, abgetötet wird.
Gemäß einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Sequenz beinhaltet, die für eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins kodiert, wobei die DNA-Sequenz mutiert ist, die komplementär zu einem Kodon ist, das wenigstens einer Aminosäure im Bereich von 379–535, einschließlich, von SEQ ID NO: 1 entspricht.
Eine „Lebendvakzinzelle" oder ein „Lebendvakzinstamm", wie hier verwendet, ist entweder ein natürlicher avirulenter lebender Mikroorganismus oder ein lebender Mikroorganismus mit geringer oder attenuierter Virulenz, welcher ein Immunogen exprimiert.
Die Erfindung betrifft auch Polypeptide, die kovalent an einen Rest, z.B. ein Polysaccharid oder ein zweites Polypeptid, gebunden sind. Der Rest kann als Trägersubstanz für ein erfindungsgemäßes Polypeptid dienen; oder alternativ kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Trägersubstanz für den Rest dienen und so bevorzugt die Immunogenität des Rests verbessern. Bevorzugte Polysaccharide umfassen Dextran, PrP (das Kapselpolysaccharid von H. influenzae b) und Pneumokokken-Polysaccharide (Typen 14, 6B oder 23F). Eine „Trägersubstanz" ist eine Substanz, die einem assoziierten Molekül Stabilität verleiht und/oder den Transport oder die Immunogenität desselben unterstützt oder verbessert.
Gemäß einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein erfindungsgemäßes Polypeptid, welches eine Trägersubstanz umfasst, die die Immunogenität eines Rests oder des Polypeptids verbessert. Beispiele für bevorzugte Trägersubstanzen sind oben angeführt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Fusionsproteine können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, bevorzugt durch Kultivieren unterschiedlicher Zellen, die eine DNA enthalten, die für ein erfindungsgemäßes Diphtheria-Toxoid kodieren, unter Bedingungen, die eine Expression der DNA erlauben.
Die Expression eines erfindungsgemäßen Diphtheria-Toxoids steht unter der Kontrolle eines heterologen Promotors und/oder die exprimierten Aminosäuren sind mit einer Signalsequenz verknüpft. Vektoren, die für die erfindungsgemäßen Toxoide kodierende DNA umfassen, können nach bekannten molekularbiologischen Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden (Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Aufl. (1989)). Unter „heterologen Promotoren" versteht man eine Promotorregion, die nicht identisch mit der Promotorregion ist, die in einem natürlich vorkommenden Diphtheria-Toxin-Gen gefunden wird. Bei der Promotorregion handelt es sich um ein DNA-Segment in 5'- Position zur Transkriptionsstart-Stelle eines Gens, woran RNA-Polymerase vor der Initiierung der Gentranskription bindet.
Unter einer „im Wesentlichen reinen" Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure versteht man eine Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält und die im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuremolekülen ist, mit welchen eine für Wildtyp-Diphtheria-Toxin kodierende Nukleinsäure natürlicherweise in Corynebacterium assoziiert ist.
Der hier verwendete Begriff Wildtyp- oder natürlich vorkommendes DT bezieht sich auf das in der Natur gefundene Diphtheria-Toxin-Protein gemäß SEQ ID NO: 1. Der hier verwendete Begriff Pseudo-Wildtyp-DT bezieht sich auf das Diphtheria-Toxin-Protein, das bei Aminosäure 148 eine Glu → Ser-Mutation aufweist. Der Fachmann weiß, dass unter Laborbedingungen die Handhabung von Pseudo-Wildtyp-DT sicherer ist als die von Wildtyp-DT. Der hierin verwen dete Begriff Mutante des DT-Proteins bezeichnet ein DT-Protein, das eine Mutante der R-Domäne wie hierin beispielhaft veranschaulicht, umfasst. Erfindungsgemäße Polypeptide für die hier der Begriff „immunologisch kreuzreaktiv" verwendet wird, haben wenigstens einen antigene Determinante gemeinsam mit natürlich vorkommendem Diphtheria-Toxin, so dass sie jeweils durch wenigstens einen Antikörper gebunden werden, der Spezifität für natürlich vorkommendes Diphtheria-Toxin aufweist.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung und aus den Patentansprüchen ersichtlich.
Detaillierte Beschreibung
Zunächst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
Zeichnungen
1 ist eine Darstellung des DNA-Vektors PWHS-105, der das DT-Gen umfasst. Die HindIII- und NdeI-Restriktionsenzym-Schnittstellen sind angegeben. 6 X His steht für 6 aufeinander folgende Histidin-Reste, die zur Reinigung des DT-Proteins verwendet werden.
Tabelle 1 zeigt eine Liste von Mutationen in der R-Domäne des Diphtheria-Toxins, die durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt wird.
Tabelle 2 zeigt die Testergebnisse für die Cytotoxizität von Wildtyp-DT, Pseudo-Wildtyp-DT und verschiedene Mutanten von DT-Proteinen.
Methoden
1. Klonierung und Expression des T-Gens
Das DT-Gen (O'Keefe et al., PNAS (USA) 86: 343–346 (1989)) wurde mittels PCR amplifiziert und dann mit NdeI und Hind III geschnitten. Das Genfragment wurde in einen PET-15b Expressionsvektor (Novagen) eingebracht, um PWHS105 zu erhalten. Durch die Verwendung dieses Vektors und die Herstelleranweisung trägt das exprimierte DT-Protein sechs aufeinander folgende Histidingruppen am N-terminalen Ende. Der modifizierte Vektor mit dem DT-Gen wurde mit PWHS105 bezeichnet (1). Mehrfache Histidingruppen binden das DT-Protein an eine Ni²⁺-Säule, die entsprechend der Herstelleranweisung (Novagen) hergestellt wurde. Nachdem ungebundene Proteine weggewaschen waren, wurde das DT-Protein durch Eluierung mit Imidazol gewonnen. Der Reinheitsgrad des DT-Proteins nach dieser Methode liegt bei über 99 %, und die Ausbeute beträgt ungefähr 1–2 mg pro 50 ml Bakterienkultur. Die Bakterientransformation wurde mittels Standardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, (1989) S. 1.74–1.105) durchgeführt.
I. Alternative DNA-Vektoren
DNA, die für DT oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, kann auch, operativ verknüpft mit Kontrollsignalen, die eine Expression in einem prokaryotischen Wirt bewirken, auf einem beliebigen anderen Vektor getragen werden. Falls gewünscht, kann die kodierende Sequenz an ihrem 5'-Ende eine Sequenz umfassen, die für jede beliebige der bekannten Signalsequenzen kodiert, die in der Lage ist, Sekretion des exprimierten Proteins in den periplasmati schen Raum der Wirtszelle zu bewirken, wodurch eine Gewinnung des Proteins erleichtert wird. Die am häufigsten eingesetzten Prokaryonten sind verschiedene E. coli-Stämme; es können aber auch andere Bakterienstämme, z.B. C. diphtheriae, eingesetzt werden. Es können auch zusätzliche Plasmidvektoren eingesetzt werden, die Replikationsursprünge, Selektionsmarker und Kontrollsequenzen, die aus einer zum mikrobiellen Wirt kompatiblen Spezies abgeleitet sind, umfassen. Beispielsweise können E. coli unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem von Bolivar et al. (1977, Gene 2:95) konstruierten Plasmid transformiert werden, wobei Fragmente abgeleitet von drei natürlich vorkommende Plasmiden, zwei aus Salmonella-Spezies isoliert und eines aus E. coli isoliert, verwendet wurden. PBR322 umfasst Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und liefert so mehrere Selektionsmarker, die durch Konstruieren des gewünschten Expressionsvektors entweder erhalten oder zerstört werden können. Üblicherweise zur prokaryotischen Expression eingesetzte Kontrollsequenzen (auch als „Regulatorische Elemente" bezeichnet) werden hier so definiert, dass sie Promotoren für die Initiation der Transkription, wahlweise mit einem Operator und mit Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen umfassen. Üblicherweise eingesetzte Promotoren zum Steuerung der Protein-Expression umfassen die Promotorsysteme für die beta-Lactamase (Penicillinase), die Lactose (lac) (Chang et al., 198 Nature 1056, 1977) und das Tryptophan (trp) Promotersystem (Goeddel et al., 8 Nucl. Acids Res. 4057, 1980), ebenso wie den lambda-PL-Promotor und die N-Gen Ribosombindungsstelle (Shimatake et al., 292 Nature 128, 1981). Beispiele für Bakterienstämme, Vektoren und assoziierte regulatorische Sequenzen werden hier zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung aufgeführt, schränken diese aber nicht ein.
Beispielsweise können von PET-15b (Novagen) verschiedene Vektoren eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide oder ein eines der erfindungsgemäßen Polypeptide umfassendes Fusionsprotein zu exprimieren. Diese Vektoren können aus (i) einem in E. coli wirksamen und aus dem Plasmid PBR322 abgeleiteten Replikationsursprung; (ii) einem ebenfalls aus PBR322 abgeleiteten, selektierbaren Tetracyclin-Resistenz-Gen; (iii) eine Transkription-Terminationsregion, z.B. die Termination des E. coli trp-Operon (das sich am Ende des Tetracyclin-Resistenz-Gens befindet, um transkriptionales Ablesen in den trp-Promotor-Bereich hinein zu vermeiden); (iv) einen Transkriptions-Promotor, z.B. den trp-Operon-Promotor, oder einen Diphtheria-Toxin-Promotor; (v) die kodierende Sequenz für das R-Bereich-Protein und (vi) einen Transkriptionsterminator, z.B die T1T2-Sequenz des ribosomaler RNA (rrnB) -Locus von E. coli. Die Sequenzen der Trägermoleküle, die in der Synthese der DNA-Sequenzen eingesetzten Verfahren, die Konstruktion von Fusionsgenen und die entsprechenden Vektoren und Expressionssysteme sind dem Fachmann bekannt. Ähnliche Expressionssysteme können für Fusions- der Nicht-Fusions-Polypeptide, d.h. für die Expression der R-Bereich-Polypeptide alleine, entwickelt werden. Diese Methoden sind weitere Beispiele für die erfindungsgemäßen Verfahren, schränken diese aber nicht ein.
II. Alternative Protein-Reinigung und -Synthese
Der Fachmann kann die erfindungsgemäßen Polypeptide reinigen, indem andere konventionelle Verfahren der Proteintrennung angewandt werden, z.B. Verfahren, die Ausfällung, Chromatographie, Immunadsorption oder Affinitätsmethoden umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Polypeptide können aus dem Ausgangsmaterial gereinigt werden, indem man Protease-behandeltes Diphtheria-Toxin einsetzt, oder indem man die Zellen oder das Zellmedium eines Vakzin-Stammes verwendet, der gentechnisch manipuliert ist, um die erfindungsgemäßen Polypeptide zu exprimieren. Die Reinigung kann auch erfolgen, indem man ein anderes Fusionsprotein aus einem Polypeptid mit einem anderen rekombinanten Protein, z.B. mit einem Fragment eines Maltose bindenden Proteins in ähnlicher Weise wie oben beschrieben, herstellt. Diese Fusionskonstrukte können beispielsweise mit dem Vektor PMAL (New England Biolabs) oder den PGEX-3X- oder -2T-Vektoren (Pharmacia), wie oben beschrieben, hergestellt werden. Fusionsproteine werden über Affinitätssäulen mit Spezifität für Maltose bindendes Protein oder Glutathion-S-Transferase-Protein gereinigt.
Erfindungsgemäße Polypeptide können in einigen Fällen auch auf nicht-biologischem Wege künstlich hergestellt werden, beispielsweise durch organisch-chemische Synthese, oder von einem größeren Protein, das erfindungsgemäße Aminosäure-Sequenzen umfasst, abgespalten werden. Beispielsweise kann eine organisch-chemische Synthese durch konventionelle Verfahren zur automatischen Peptid-Synthese, oder durch klassische organisch-chemische Methoden erreicht werden. Diphtheria-Toxin-Protein oder Fragment B kann beispielsweise durch ein Verfahren nach Carroll et al. (Meth Enzymol 165:68–76, 1988) gereinigt werden.
2. Charakterisierung der Diphtheria-Toxin-Zytotoxizität
Die Zytotoxizität des Pseudo-Wildtyp-DT und des Wildtyp-DT wurde in einer Zytotoxizitätsuntersuchung (Meth. in Enz. 165:220–221, 1988, worauf hierin in vollem Umfang Bezug genommen wird) evaluiert. Die Zahlenwerte zeigen, dass Pseudo-Wildtyp-DT einen ID50-Wert von 3,8 × 10^–11 M hat, während Wildtyp-DT einen ID50-Wert von 10^–13 M hat. Der Unterschied in der Zytotoxizität zwischen diesen beiden Proteinen ist auf die Mutation des reaktiven Zentrums des A-Fragments bei Aminosäure 148 des DT zurückzuführen. Erfindungsgemäße Polypeptide können mit diesem Test auf Zytotoxizität geprüft werden. Zusätzliche Ausführungsformen des Tests umfassen das Zugabe sowohl eines erfindungsgemäßen Polypeptids als auch eines Wildtyp-DT zu Zellen, um die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Polypeptids, die toxische Aktivität von Wildtyp-DT zu blockieren, zu prüfen. In einer anderen Ausführungsform des zytotoxischen Tests ist es möglich, Antikörper zu screenen, die den Wildtyp-DT oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid binden, indem man jedes mit einem Antikörper unter Bedingungen, die ein Binden des Antikörpers an das Polypeptid oder das Wildtyp-DT ermöglichen, kombiniert und in dem zytotoxischen Test auf Zelltoxizität überprüft. Antikörper, welche zur Bindung an Wildtyp-DT oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid befähigt sind, unterbinden Zell-Toxizität.
3. Ortsspezifische Mutagenese von DT
Um an der Rezeptorbindung beteiligte Aminosäuren in der Diphtheria-Toxin R-Domäne zu ermitteln und um Mutanten der DT-Proteine herzustellen, wurde die bekannte DNA-Primer basierende ortsspezifische Mutagenese (Kit für ortsspezifische Mutagenese (M13) von Amersham) verwendet. Spezifische, für die ortsspezifische Mutagenese verwendete DNA-Primer sind offenbart (SEQ ID Nr. 3–28). Der Kit von Amersham wurde gemäß der Herstelleranweisung eingesetzt, um spezifische Reste innerhalb der R-Domäne zu mutieren. Insgesamt wurden vierundzwanzig Mutanten des DT-Proteins hergestellt (vgl. Tabelle 1). Mutanten des DT-Proteins wurden mit einer Ni²⁺-Säule (Novagen) gemäß der Herstelleranweisung gereinigt.
4. Aminosäure-Positionen 516 und 530 sind Rezeptorbindungsstellen
Diphtheria-Toxin-sensitive Zellen besitzen Zellrezeptoren, die das Toxin binden und aufnehmen. In der Regel werden solche Zellen zerstört, wenn sie Wildtyp-Diphtheria-Toxin ausgesetzt werden. Die Fähigkeit gereinigter Mutanten des DT-Proteins, Zellen über einen Diphtheria-Toxin-Rezeptor zu binden, wurde durch eine Zytotoxizitätstest evaluiert (siehe oben). Die Ergebnisse der Zytotoxizitätsuntersuchung, bei der Pseudo-Wildtyp-DT (bezeichnet als „WT" in Tabelle 2) und ausgewählte DT-Mutanten-Proteine eingesetzt wurden, werden in Tabelle 2 dargestellt. In Tabelle 2 werden einem DT-Mutanten-Protein zwei Buchstaben und eine Zahl als geeignete Abkürzung zugeordnet. Der erste Buchstabe betrifft die normale Aminosäure, die Zahl bezeichnet den Aminosäurerest in SEQ ID NO: 1, und der letzte Buchstabe bezeichnet die substituierte Aminosäure der Mutante des Proteins. Die DT-Protein-Mutante K516A zeigt 1/20 der Toxizität von DT. Da Pseudo-Wildtyp-DT ungefähr 1/400 der Toxizität von Wildtyp-DT aufweist, besitzt K516A 1/8000 der Toxizität von Wildtyp-DT. Die Proteinmutante F530A ist um einen Faktor 9 weniger toxisch als DT und zeigt 1/3500 der Toxizität von Wildtyp-DT. Diese Werte bestätigen, dass Lys 516 und Phe 530 für die Bindung von Wildtyp-Diphtheria-Toxin an Diphtheria-Toxin-Rezeptoren auf den Zellen wichtig sind. Darüber hinaus zeigt der konservative Austausch von Lysin durch Glutaminsäure bei Aminosäure 516, dass die positive Ladung von 516K zur Bindungsaktivität von Wildtyp Diphtheria-Toxin beiträgt.
Tabelle 1 Liste der DT-Mutanten
Tabelle 2
5. Bindungs-Kompetition zwischen ¹²⁵I-markiertem Wildtyp-DT und Mutanten des DT-Proteins
Wildtyp und Mutanten des DT-Proteins wurden durch Standardverfahren (siehe Bolton-Hunter, Biochem J., 133:529, 1973) mit ¹²⁵I markiert, um zusätzlich zu zeigen, dass die Aminosäuren in den Positionen 516 und 530 an der Rezeptorbindung beteiligt sind. Bei 4°C ist die Affinität der beiden DT-Protein-Mutanten K516A und K516E 1/500 der von DT, und die Affinität der beiden DT-Protein-Mutanten F530A und F530S ist 1/100 der von DT.
6. Herstellung von Antiseren gegen die R-Domäne des Wildtyp-DT
Die gereinigte Rezeptorbindungsdomäne des Wildtyp-DT (siehe Choe et al., oben) wurde als Antigen zur Herstellung von polyklonalem Antikörper eingesetzt. Die Immunogenität des Rezeptorbindungsdomäne-Proteins wurde in zwei weiblichen weißen Neuseeland-Kaninchen getestet. 1 ml von 350 μg DTR in Tris-Puffer, pH-Wert 8,0, wurde mit 1 ml kompletten Freundschen Adjuvans für die erste Dosis und inkomplettem Freundschen Adjuvans für die folgenden Dosen vermischt. Die Immunisierungen erfolgten nach 0, 20, 40 und 60 Tagen. Serumproben wurden nach 30, 50 und 70 Tagen genommen. Antiseren konnten nicht nur die Rezeptorbindungsdomäne, sondern auch Wildtyp-DT in Standard-Western-Blot-Experimenten (siehe Harlow und Lane in Antibodies, a Laboratory Manual, 1988) erkennen.
Die spezifische Reaktivität wurde nach dem ersten Anstieg bei 12.800-facher Verdünnung beobachtet und erhöhte sich nach der zweiten und dritten Verabreichung bei ELISA-Untersuchungen (siehe Harlow und Lane, oben).
Eine 10-fache Verdünnung der Antiseren wurde auf die Fähigkeit, die toxische Wirkung von Wildtyp-DT auf Vero-Zellen zu neutralisieren, untersucht. Kurz gefasst, Wildtyp-DT (10^–12 M) wurde mit verschiedenen Konzentrationen an Antiseren eine Stunde lang bei 37°C mit Vero-Zellen inkubiert. Die Zytotoxizität wurde wie zuvor beschrieben evaluiert (Carroll und Collier, oben). Nach der dritten Verabreichung waren die Antiseren in der Lage, bis zu 72% der Toxizität von Wildtyp-DT zu neutralisieren.
Die hierin beschriebene Fähigkeit, effizient Antikörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne zu erzeugen, legt nahe, dass die Verwendung eines Polypeptids umfassend eine Mutante der R-Domäne oder einer Mutante der R-Domäne alleine ein wirkungsvolles Vakzin mit geringerer oder keiner Toxizität bereitstellen kann. Indem man gezeigt hat, dass polyklonale Antiseren gegen die Rezeptorbindungsdomäne von Wildtyp-DT leicht erhältlich sind, weiß der Fachmann, dass ein monoklonaler Antikörper unter Anwendung immunologischer Standardverfahren (siehe Harlow und Lane, oben) ebenso zugänglich ist. Die Immunogenität der Rezeptorbindungsfragmente weist darauf hin, dass ein Polypeptid umfassend eine Mutante der R-Domäne auch immunogen ist und prophylaktisch gegen eine Wildtyp-DT-Exposition wirkt. Polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne des Wildtyp-DT können verwendet werden, um zu untersuchen, ob ein erfindungsgemäßes Polypeptid antigen ist (siehe unten).
I. Western Blotting
0,5 μg Wildtyp-DT wurden auf ein aufgeteiltes 12 %iges Polyacrylamid-Minigel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Protein auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran, welche das transferierte Protein trug, wurde in Stücke geschnitten und mit verschiedenen Verdünnungen von Antiseren, jeweils getrennt, inkubiert. Die Membranschnittstücke wurden dann mit einem ersten Antikörper, nämlich Diphtheria-Antitoxin USP (Connaught Laboratories, Inc.), gefolgt von einem zweiten Antikörper, nämlich Anti-Pferde-IgG-Alkalischem Phosphatase-Konjugat (Sigma) inkubiert und mit Tris-Puffer, pH 9,6, enthaltend 0,01% Nitro-blau-Tetrazolium und 0,01% 5-Brom-4-chlor-3-indolyphosphat (Sigma) entwickelt.
7. Evaluierung der Antigenität
Es besteht die Möglichkeit, bequem zu bestimmen, ob ein erfindungsgemäßes Polypeptid antigenisch ist und wahrscheinlich als wirksames Vakzin dienen kann, welches die gewünschten antigenen Eigenschaften zeigt. Diphtheria-Antitoxin-Standards und polyklonale Antikörper gegen die gereinigte Rezeptorbindungsdomäne von Wildtyp-DT können verwendet werden, um die Antigenität von erfindungsgemäßen Polypeptiden zu bestimmen.
(i) Antigene Gesamtaktivität (Lf):
Die antigene Aktivität von jedem gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptid kann über Flockungseinheiten (Lf) mit Hilfe einer standardisierten Flockungsreaktion gegen Diphtheria-Antitoxin-Standard von dem Center for Biologics Evaluation and Research, FDA, Bethesda, MD, gemessen werden. Der Test wird mit Hilfe der Methode von Ramon Relyreld, E.M. (1969) Pro. in Immun. Stand. 3, 258–263 durchgeführt. Aktivität wird in der Einheit Lf/mg Protein ausgedrückt.
(ii) Evaluierung der Antigenität mit polyklonalen Antisera:
Polyklonale Antisera gegen die gereinigte Rezeptor-Bindungsdomäne von Wildtyp-DT können zur Bindung von erfindungsgemäßen Polypeptiden verwendet werden. Die Konservierung von antigenen Epitopen von Wildtyp-DT in erfindungsgemäßen Polypeptiden wird in zwei Systemen quantitativ evaluiert, nämlich der klassischen quantitativen Präzipitinreaktion (siehe oben) und einem kompetitiven ELISA (vgl. Harlow und Lane, s. oben).
(iii) Quantitative Präzipitinreaktion:
Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, dass es Antikörpern (beispielsweise standardisierten Diphtheria-Antitoxin oder polyklonalen Seren gegen die gereinigte DT-Rezeptorbindungsdomäne) erlaubt, Polypeptide in der Flüssigphase zu binden, wodurch potenziell störende Effekte vermieden werden, die man beobachtet, wenn Proteine an Nitrocellulose gebunden sind. Zusätzlich wird dadurch eine präzise quantitative Information über die Menge an Antikörper geliefert, die durch jedes erfindungsgemäße Polypeptid präzipitierbar ist. Die maximal präzipitierbare Antikörpermenge wird unter Verwendung des Verfahrens von Pappenheimer et al., (Immunochemistry 9, 891–906 (1922)) quantifiziert. Gereinigtes Wildtyp-Diphtheria-Toxin, formalinisiertes Diphtheria-Toxin (d.h. chemisches Toxoid) und ein erfindungsgemäßes Polypeptid werden als Kontrollen verwendet. Diese Kontrollen können verwendet werden, um auf Diphtheria-Toxin gerichtete Antikörper zu präzipitieren. Das von jedem Polypeptid präzipitierbare Gesamtantikörperprotein wird als Anteil des Antikörpers ausgedrückt, der durch die Kontrolltoxine oder -toxoide präzipitierbar ist, und wird als Maß dafür dienen, wie gut sämtliche Diphtheria-Toxin-Antigen-Epitope in den erfindungsgemäßen Polypeptiden konserviert sind.
Die Überstände der quantitativen Präzipitinreaktionen werden in Bezug auf deren verbleibende Antitoxinaktivität an ihrem Äquivalenzpunkt (dem Punkt, wo ein Maximum an Toxinprotein und Antikörper präzipitiert werden) evaluiert. Es wird erwartet, dass die Kontrolltoxin-Proteine sämtliche neutralisierende Aktivität präzipitieren. Die Vollständigkeit der Präzipitation von neutralisierender Aktivität durch erfindungsgemäße Polypeptide wird ein quantitatives Maß dafür bereitstellen, wie gut neutralisierende Epitope in den erfindungsgemäßen Polypeptidmutanten konserviert sind.
(iv) Kompetitiver ELISA:
Vorteil dieses Tests ist seine Einfachheit. Bei diesem Test wird die Bindung eines Diphtheria-Antitoxin-Standards an hochgereinigtes Wildtyp-DT, mit welchem ELISA-Platten beschichtet sind, durch Vorinkubation des Antikörpers (bei einer Verdünnung, die 80 bis 90% der maximalen OD ergibt) mit seriellen Verdünnungen von Wildtyp-Toxin oder formalinisiertem DT (Kontrollen) oder mit einer erfindungsgemäßen Polypeptidmutante inhibiert. Zwei geeignete Endpunkte sind: 1) die Konzentration von Wildtyp-Toxin oder Polypeptidmutante, die erforderlich ist, um die Bindung von 50% des Antikörpers zu inhibieren, und 2) die maximale Inhibition, die man mit erfindungsgemäßen Polypeptiden erreicht. Ersteres stellt ein Maß für die relative Antigenität eines erfindungsgemäßen Polypeptids und von Wildtyp-Toxin dar. Letzteres veranschaulicht, ob alle Epitope auf dem Polypeptid konserviert sind. Werden Antikörper an die Epi tope nicht gebunden, zeigt die ELISA-Kurve ein Plateau oberhalb des Background-Wertes, den man mit der Diphtheria-Toxin-Kontrolle erreicht.
8. Evaluierung der Immunogenität
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann auf Immunogenität durch Immunisierung von Mäusen und Meerschweinchen getestet werden. Mäuse sind einfacher und kostengünstiger in der Verwendung und Klassen- und Subklassen-Reagenzien für spezifische Antikörper-Assays liegen vor. Assays für Maus-Antikörper sind getestet und sind standardisiert (s. Harlow und Lane, oben). Ein Nachteil von Mäusen besteht darin, dass sie gegenüber Diphtheria-Toxin nicht anfällig sind, da sie keine Wildtyp-DT-bindenden Rezeptoren in ihren Zellen aufweisen. Wenn eine Toxin-Klärung durch derartige Rezeptoren für die geringe Immunogenität von Polypeptiden mit intakten Rezeptorbindungsfunktion verantwortlich ist, dann kann dieses Problem durch Immunisierung von Mäusen nicht aufgedeckt werden. In diesem Fall können immunisierte Meerschweinchen, die stark anfällig für Diphtheria-Toxin sind, verwendet werden. Darüber hinaus sind Meerschweinchen gemäß US Code of Federal Regulations die Testtiere für die Messung der Stärke von Diphtheria-Vakzinen.
(i) Screening auf Immunogenität
Ein Screening auf Immunogenität der erfindungsgemäßen Polypeptide erfolgt, indem man Mäusen und Meerschweinchen eine hohe Dosis von Antigen, das an Aluminiumphosphat adsorbiert ist, verabreicht und die Antikörper-Reaktionen nach 4 Wochen in beiden Tieren und auch nach 6 Wochen bei den Meerschweinchen misst.
(ii) Immunisierung von Mäusen
Die Immunisierungsdosis bei Mäusen beträgt 25 μg Polypeptid-Mutante/Maus, subkutan an Gruppen von jeweils 5 Mäusen verabreicht. Kontrollgruppen erhalten 1 μg an AIPO₄ adsorbiertes Formalin-Diphtheria-Toxoid, das zur Verwendung in pädiatrischen Vakzinen zugelassen ist. Diese Dosis erzeugt hohe Titer auf IgG und neutralisierende Antikörper in Mäusen. Vier Wochen nach der Immunisierung misst man IgG-Anti-DT-Antikörper mittels ELISA unter Verwendung von Wildtyp-Diphtheria-Toxin und einem erfindungsgemäßen für die Immunisierung verwendeten Polypeptid. Ein Seren-Pool aus jeder der Gruppen von 5 Mäusen wird ebenfalls bezüglich der Antitoxin-Aktivität mittels Vero-Cell-Cytotxizitäts-Assay (oben) bewertet.
(iii) Immunisierung der Meerschweinchen
Die Immunisierungsdosis bei Meerschweinchen beträgt 100 μg /Maus, subkutan an Gruppen von jeweils 5 Tieren verabreicht. Kontrollgruppen erhalten 10 Lf (25 μg) Formalin-Diphtheria-Toxoid, was der 1,5-fachen Einzeldosis an Diphtheria-Toxoid für Kinder gemäß offiziellem US-Wirksamkeitstest entspricht. Nach 4 und 6 Wochen werden die Konzentrationen von polyklonalen IgG-Antikörper in den einzelnen Tieren und die Antitoxin-Aktivität mittels Vero-Cell-Cytotoxizitäts-Assay in Seren-Pools gemessen. Werden gegenüber einem Konstrukt keine Antikörper-Reaktionen beobachtet, so kann das Konstrukt gegebenenfalls mit Formalin in Gegen wart von 0,01 M Lysin, wie von Relyveld (oben) beschrieben, behandelt und die Immunogenität erneut bewertet werden.
Konstrukte, die in einem oder mehrere dieser Assays Immunogenität zeigen, werden daraufhin nach Dosisansprechverhalten und Bindungsspezifität der induzierten Antikörper, wie nachfolgend beschrieben, bewertet.
(iv) Quantitative Evaluierung der Immunogenität von Diphtheria-Toxin-Konstrukten
Gruppen von 5 bis 10 Mäusen werden mit Dosen von erfindungsgemäßen Polypeptiden im Bereich von einem 100-fachen Dosisbereich von 0,04, 0,2, 1,0, 5.0 und 25 μg immunisiert. Typischerweise wird das Antigen adsorbiert von einer konstanten Menge Aluminiumphosphat, aber in einigen Fällen kann man auch die Reaktion auf lösliches Antigen bewerten. Eine Auffrischung erfolgt nach 4 Wochen, wenn eine Peak-Reaktion auf die primäre Dosis aufgetreten ist, und das Serum kann gemäß dem nachfolgenden Schema bewertet werden.
Kontroll-Mäuse können ähnliche Dosen von Formalin-DT-Toxoid erhalten. Die Immunogenität der erfindungsgemäßen Polypeptide in Bezug auf Wildtyp-Diphtheria-Toxoid wird sowohl für Gesamt-IgG-Antikörper und Neutralisierungsaktivität verglichen.
(v) Wirksamkeitstest für Diphtheria-Toxoid bei Meerschweinchen
Für erfindungsgemäße Polypeptide, die ausreichend immunogen sind, um als potentielle Kandidaten für die Untersuchung bei Menschen in Frage zu kommen, wird die Immunogenität bei Meerschweinchen gemäß dem offiziellen US-CFR-Wirksamkeitstest bewertet. Zur Bestimmung, ob die mindestens benötigten Titer von 2 Antitoxin-Einheiten (AU) erreicht wurden, wird das induzierte Antitoxin in vivo bewertet. Eine Antitoxin-Endpunkt-Titration erfolgt durch Vero-Cell-Cytotoxizitäts-Assay (oben).
(vi) Evaluierung der Polypeptide der Diphtheria-Mutante mit terminalen Hexahistidinen
PET-15b-DNA-Vektoren (Novagen), die für erfindungsgemäße Polypeptide kodieren, die hohe Spiegel von neutralisierendem Antikörper wirksam induzieren und einen N-terminalen Hexahistidin-Rest enthalten, werden bewertet, um zu bestimmen, ob sie einen spezifischen Antikörper am Hexahistidin-Peptid induzieren. Es hat sich gezeigt, dass Antigene mit einem längeren N-terminalen Tag von 12 Aminosäuren, einschließlich Hexahistidin, geringe Mengen Antikörper induzieren. Dies kann unter Verwendung von nicht-Diphtheria-Proteinen mit N-terminalen Hexahistidinen und mit oder ohne Spacer-Peptid an Kunststoff gekoppelte Hexahistidin-Peptide als Target im ELISA bewertet werden.
(vii) Evaluierung von Diphtheria-Toxin-Polypeptiden als Trägerproteine für Konjugate
Unter Verwendung der unten beschriebenen chemischen Koppelungsverfahren werden Polysaccharide von H. influenzae b oder von einem der gewöhnlichen Pneumokokken-Typen (Typ 14, 6B oder 23F) kovalent an ein oder mehrere Cysteine umfassende erfindungsgemäße Polypeptide gebunden.
9. Herstellung und Verwendung eines Polypeptid-Vakzins
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid-Toxoid kann in jedem bekannten Protein-Expressionssystem exprimiert und danach durch Standardverfahren gereinigt werden (siehe die oben genannten Verfahren).
Ein gereinigtes erfindungsgemäßes Polypeptid kann kombiniert werden mit einem physiologisch akzeptablen Träger (wie physiologische Kochsalzlösung), mit einem die Immunogenität verbessernden Adjuvans (wie Aluminiumsalzen, bakteriellen Endotoxinen oder abgeschwächten Bakterienstämmen (z.B. BCG oder Bordetella pertussis, abgeschwächten Viren, Liposomen, Mikrosphären oder komplettem oder inkomplettem Freundschen Adjuvans)), und/oder mit weiteren Toxoiden oder abgetöteten oder anderen Vakzinstämmen (zur Bildung eines multivalenten Vakzins). Ein derartiges Vakzin kann einem Menschen danach durch jegliche akzeptable Verfahren verabreicht werden, einschließlich oraler, parenteraler, transdermaler und transmucosaler Gabe, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die Verabreichung kann über eine Sustained-Release-Formulierung unter Verwendung eines biologisch abbaubaren biokompatiblen Polymers, wie einem Mikrokügelchen, durch örtliche Verabreichung unter Verwendung von Mizellen, Gelen oder Liposomen, oder durch transgene Verfahren erfolgen (z.B. durch biolistische Verabreichung der erfindungsgemäßen DNA direkt in die Zellen des Patienten, wie durch Tang et al, Nature 356:152–154, 1992, beschrieben, worauf hiermit Bezug genommen wird).
10. Herstellung und Verwendung von lebenden rekombinanten Vakzinen
Zu den geeigneten lebenden Trägerorganismen zählen abgeschwächte Mikroorganismen, wie BCG, Salmonella sp., E. coli, Vibrio cholerae, Streptococci, Listeriae und Yersiniae. Die erfindungsgemäße DNA kann in einen dieser Mikrobenstämme unter Verwendung von Standardverfahren stabil transfiziert werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989) und beispielsweise mittels oraler oder parenteraler Verabreichung einem Patienten eingeführt werden. Nachdem das Bakterium in den Patienten eingeführt ist, vermehrt es sich und exprimiert im Patienten eine mutante Form des Diphtheria-Toxins, was verursacht, dass der Patient einen schützenden Spiegel an Antikörper gegen die Toxin-Mutante beibehält. Analog kann auch ein abgeschwächtes Tiervirus, wie Adenovirus, Herpes-Virus, Vaccinia-Virus, Polio, Geflügelpocken, oder es können sogar abgeschwächte eukaryontische Parasiten, wie Leishmania, als Trägerorganismus eingesetzt werden. Eine erfindungsgemäße DNA, die eine Mutante der R-Domäne umfasst, kann durch gentechnische Verfahren in das Genom eines geeigneten Virus inkorporiert werden, welches danach durch Standardverfahren in einen menschlichen Impfstoffempfänger eingebracht wird. Ein erfindungsgemäßes Lebendvakzin kann beispielsweise mit 10⁴ bis 10⁸ Organismen/Dosis oder mit einer Dosis, die ausreicht, um schützende Antitoxin-Spiegel stabil zu induzieren, verabreicht werden. Die tatsächliche Dosierung eines derartigen Vakzins kann vom Durchschnittsfachmann der Vakzintechnologie leicht bestimmt werden.
11. Herstellung von Polypeptid-Polysaccharid-Konjugaten
Konjugatproteine, umfassend ein Polypeptid können folgendermaßen hergestellt werden:
Derivate von Polysacchariden kann man durch Adipinsäuredihydrazid unter Verwendung von CNBr zur Einführung der Hydrazidgruppen in die Polysaccharide erhalten. Die Hydrazidgruppen werden mit N-Iodacetyl-B-alanin-N-hydroxysuccinimid jodacetyliert. Das Protein kann mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat thioliert werden. Das aktivierte Polysaccharid kann mit dem thiolierten Protein so kombiniert werden, dass Thioether-Bindungen zwischen beiden gebildet werden. Ein detailliertes Protokoll kann bei Anderson et al., J. of Immunol. 142:2464–2468 (1989) gefunden werden. Die Konjugate können auf Immunogenität evaluiert werden, wie zuvor beschrieben.
12. Verabreichung eines Vakzins und in-vivo-Test
Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder die Rezeptorbindungsdomäne von Wildtyp-DT können einem Säuger, insbesondere einem Menschen, mittels geeigneter Verfahren verabreicht werden, wie z.B. oral, parenteral, transdermal oder transmucosal. Die Verabreichung kann über eine Sustained-Release-Formulierung unter Verwendung eines biologisch abbaubaren biokompatiblen Polymers, wie einem Mikrokügelchen, durch örtliche Verabreichung unter Verwendung von Mizellen, Gelen oder Liposomen, oder durch transgene Verfahren erfolgen. Therapeutische Dosen können, müssen aber nicht notwendigerweise, im Bereich von 0,1 bis 10,0 mg/kg Körpergewicht liegen oder aber in einem Bereich der vom Fachmann als klinisch geeignet bestimmt wird.
Meerschweinchen (oder eine andere Spezies, die von Natur aus auf die Zell-tötenden Effekte von Diphtheria-Toxin anspricht) können mit einem erfindungsgemäßen Toxoid gemäß dem folgenden Protokoll immunisiert werden: Man injiziert einem Meerschweinchen subkutan zwischen 1 und 50 μg Toxoid, suspendiert in 50–100 μl komplettem Freudschen Adjuvans am Tag 1, Tag 12 und Tag 24. Blutproben werden danach einem Assay auf Antitoxin-Antikörper durch Testen von seriellen Verdünnungen auf Reaktivität gegenüber natürlich vorkommendem Diphtheria-Toxin unterzogen (siehe obige Verfahren). Diejenigen Tiere, die ausreichend hohe Dosierungen an Toxoid erhielten, das, bestimmt durch Western Blotting oder ELISA, eine Antitoxoid-Bildung induzierte, können mit Wildtyp-Diphtheria-Toxin infiziert werden, um zu sehen, ob die Antikörper Schutz bieten. Diejenigen erfindungsgemäßen Toxoide, die eine positive Reaktion in dem oben genannten Assay induzieren, sind mögliche Kandidaten für eine Inkorporation in Lebendvakzine.
Geeignete Lebendvakzin-Mikroorganismen (Zellen oder Viren), die durch genetische Veränderung ein erfindungsgemäßes Toxoid exprimieren, können getestet werden, indem man den Vakzin-Kandidaten einem für Wildtyp-DT empfänglichen Tier, beispielsweise einem Meerschweinchen, injiziert und dieses, nach einer Inkubationszeit von 2 bis 3 Monaten, entweder a) mit einerletalen Dosis Wildtyp-DT oder b) mit mehreren, nacheinander verabreichten Dosen Wildtyp-DT infiziert und somit den Bereich der erworbenen Immunität zu kalibrieren.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die Rezeptor-Bindungs-Domäne von Wildtyp-DT, die gegen Wildtyp-DT schützt, können einem menschlichen Patienten direkt als Immunogen in einem Vakzin gegen Diphtheria-Toxin verabreicht werden. Alternativ können ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder die Rezeptor-Bindungs-Domäne des Wildtyp-DT in einem Lebendvakzinstamm verabreicht werden. Ein verabreichter Lebendvakzinstamm kann prolifierieren, das geklonte schützende Proteinantigen exprimieren und Schutz vor dem abgeschwächten Organismus selbst, Wildtyp-DT oder vor dem geklonten Antigen, wie z.B. einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder der Rezeptor-Bindungs-Domäne von Wildtyp-DT verleihen. Zu Beispielen für Lebendvakzinstämme zählen BCG, Salmonella sp. und Vibro cholerae, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Transformation eines dieser Stämme mit der für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierenden DNA kann mit Hilfe dem Fachmann bekannter Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Calciumphosphat-Präzipitation oder Elektroporation.
Ein Vakzin kann auch von einem abgeschwächten Virus, wie Adenovirus, Herpes-Virus oder Vaccinia-Virus, getragen werden. Alternativ kann das Vakzin durch biolistischen Transfer verabreicht werden, wodurch die für eine exprimierbare Form eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder für eine Rezeptor-Bindungs-Domäne von Wildtyp-DT kodierende DNA direkt in die Zellen des Impfstoffempfängers inkorporiert wird.
Andere Ausführungsformen
Polypeptide, die eine Mutante der R-Domäne umfassen, können auch eine andere Mutation aufweisen, bevorzugt in der katalytischen Diphtheria-Toxin-Region, um so die Katalyse zu behindern und die besagten Polypeptide in der Verwendung sicherer zu machen. Beispielsweise kann eine mutierte Form des Diphtheria-Toxin-Fragments A erzeugt werden, bei der Glu 142, Val 147 und Glu 148 fehlen, oder bei der alle Reste im Bereich von Glu 142 bis Glu 148 fehlen. Ein derartiges mutiertes Fragment A kann mit einer erfindungsgemäßen Mutante der R-Domäne unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten molekularbiologischen Verfahren kombiniert werden. Zu anderen Aminosäureresten, die sich für die biologische Aktivität von Diphtheria-Toxin als bedeutsam erwiesen haben, zählen die Reste His 21, Glu 22, Lys 39, Gly 52, Gly 79, Gly 128, Ala 158 und Gly 162 aus der Fragment A-Teil des Diphtheria-Toxins und die Reste Glu 349, Asp 352 und Ile 364 aus der Fragment B-Teil. Mutationen von einem oder mehreren dieser Reste und darüber hinaus Mutationen von Val 147 und Glu 148 können unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten molekularbiologischen Verfahren mit den erfindungsgemäßen Mutanten der R-Domäne-Polypeptiden kombiniert werden. Derartige mutierte Diphtheria-Toxin-Polypeptide umfassen eine Mutante der R-Domäne und wenigstens eine der oben beschriebenen zusätzlichen Aminosäure-Veränderungen im A- oder B-Fragment und können mögliche Kandidaten für ein Vakzin sein, das geringe oder keine Toxizität aufweist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, umfassend eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins, wobei die R-Domäne eine Mutation an wenigstens einem oder mehreren der Reste Lys 516, Lys 526 oder Phe 530 des Wildtyp-Diphtheria-Toxins aufweist, wobei das Wildtyp-Diphtheria-Toxin durch SEQ ID NO:1 gekennzeichnet ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer oder mehrere der Reste Lys 516 oder Lys 526 durch Cys oder Phe substituiert ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei Phe 530 durch Glu, Lys oder Gln substituiert ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei wenigstens einer oder mehrere der Reste Lys 516, Lys 526 oder Phe 530 durch Ala substituiert ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei Lys 516 durch Glu und/oder Phe 530 durch Ser substituiert ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid einen weiteren Teil des Diphtheria-Toxin-Fragments B umfasst, wobei dem Teil von Fragment B das Segment zwischen den Aminosäuren 379 bis 535, einschließlich, des Wildtyp-Diphtheria-Toxins (SEQ ID NO:1) fehlt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid wenigstens einen Teil des Diphtheria-Toxin-Fragments A umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Polypeptid das gesamte Diphtheria-Toxin-Fragment A umfasst.
Präparat eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polypeptid von Komponenten, die es natürlicherweise begleiten, abgetrennt ist.
Zelle, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Zelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle ausgewählt ist unter einer B. subtilis-, BCG-, Salmonella sp.-, Vibrio cholerae-, Listeriae-, Yersiniae-, Streptococci-, Corynebacterium diphtheriae- oder E. coli-Zelle.
Vakzin, umfassend eine physiologisch verträgliche Mischung, enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Lebendvakzinstamm, umfassend eine Zelle nach Anspruch 10 oder Anspruch 11.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei man eine Zelle nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 bereitstellt, diese Zelle in einem Medium vermehrt, um eine Zellpopulation zu bilden, welche das Polypeptid exprimiert, und das Polypeptid aus der Zellpopulation oder dem Medium erhält.
Verfahren zur Herstellung eines Vakzins, umfassend die Kultivierung einer Zelle nach Anspruch 10 oder Anspruch 11 unter Bedingungen, welche die Proliferation der Zelle gestatten, wobei die Zelle zur Einbringung in ein Lebewesen als Lebendvakzinzelle geeignet ist.
Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder der Zelle nach Anspruch 10 oder 11 zur Herstellung einer Vakzinzusammensetzung zur Immunisierung eines Säugers gegen Wildtyp-Diphtheria-Toxin.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Fusionspolypeptid umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, verknüpft über eine Peptidbindung mit einem zweiten Polypeptid.
DNA-Molekül umfassend eine Sequenz, welche für eine Mutante der R-Domäne des Diphtheria-Toxins kodiert, wobei die DNA-Sequenz, korrespondierend zu wenigstens einem der Reste Lys 516, Lys 526 oder Phe 530 von natürlichem Diphtheria-Toxin mutiert ist, wobei das Wildtyp-Diphtheria-Toxin durch SEQ ID NO:1 gekennzeichnet ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 19, wobei die mutierte DNA-Sequenz, die wenigstens einem der Reste Lys 516 oder Lys 526entspricht, für Cys oder Phe kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 19, wobei die mutierte DNA-Sequenz, die Phe 530 entspricht, für Glu, Lys oder Gln kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 19, wobei die mutierte DNA-Sequenz, die wenigstens einem der Reste Lys 516, Lys 526 oder Phe 530 entspricht, für Ala kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 19, wobei die mutierte DNA-Sequenz, die Lys 516 entspricht, für Glu kodiert und/oder die Phe 530 entspricht, für Ser kodiert.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei das DNA-Molekül eine Sequenz umfasst, die für einen weiteren Teil des Diphtheria-Toxin-Fragments B kodiert, wobei dem Teil von Fragment B das Segment zwischen den Aminosäuren 379 bis 535, einschließlich, fehlt.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei das DNA-Molekül eine Sequenz umfasst, die für einen Teil des Diphtheria-Toxin-Fragments A kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 25, wobei das Molekül für das gesamte Fragment A kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 24, wobei der Teil eine Mutation an einem der Reste Glu 349, Asp 352 oder Ile 364 von Fragment B des Wildtyp-Diphtheria-Toxins umfasst, wobei das Wildtyp-Diphtheria-Toxin durch SEQ ID NO:1 gekennzeichnet ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, wobei Fragment A eine Mutation bei His 21, Gly 22, Lys 39, Gly 52, Gly 79, Gly 128, Ala 158, Glu 162, Glu 142, Val 147, Glu 148 des Wildtyp-Diphtheria-Toxins umfasst, wobei das Wildtyp-Diphtheria-Toxin durch SEQ ID NO:1 gekennzeichnet ist.
DNA-Sequenz, kodierend das Polypeptid gemäß SEQ ID NO:2.