JPH06501382A - ライム病の予防および診断に用いる組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ライム病の予防および診断に用いる 組成物および方法 本発明は米国保健福祉省によって与えられた認可番号Ａｌ２６８１５号に基づい た米国政府の援助でなされた発明である。米国政府はこの発明の所定の権利を有 する。

１且旦改ｎ公互 本発明は、ヒトおよび他の動物のライム病の予防、治療および診断に有用な組成 物および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、治療された患者に、ライム 病を治療もしくはライム病に対して防御するために有効な免疫応答を生成させる ことができる０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドに関する。さらに、本発明 は、上記の免疫応答を引き出すことができる本発明の０８ＩＩＩＡおよび０ｓｐ Ｂのポリペプチドを選択するスクリーニング方法に関する。また本発明の範囲内 には、０ｓｐＡおよび０５ｐＢのポリペプチドに対して特異的な抗体；および前 記抗体もしくは前記ポリペプチドを有する診断キットが含まれる。

及五皮宵１ ライムボレリア症は、米国における最も普通のベクター保持感染症である（Ｓ、 　Ｗ、　Ｂａｒｔｈｏｌｄら、−Ａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｏｄｅｌ　Ｆｏｒ　Ｌ ｙｔｙｒｅ　Ａｒｔｈｒｔｔｉｓ”、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、、５３９巻、２６４〜２３７頁、１９８８年）。この感染症は南極大陸以外 のあらゆる大陸で報告されている。ライム病の臨床上の特徴は、遁走性舌紅斑と して知られている皮膚の病変が早期に広がり、数週間から数ケガ後に神経学的異 常、心臓の異常および関節の異常が起こる。

ライム病の原因となる因子は、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒ■ｏｒｆｅユとして知 られるスピロヘータであることが最近判明し、これは、Ｉχｏｄｅｓ　ｒｉｃｉ ｎｕｓ複合群の一部であるマダニ属のマダニによって主として媒介される。さら に、し堕」吏ｍ包皿は、他の種のマダニおよび蚊とメクラアブとによって運ばれ ることは分かっている。しかし、［、ｒｉｃｉｎｕｓ複合群のマダニだけがヒト に該疾患を媒介することは明らかである。

ライム病は一般に３段階の病斯で起こる。第１期では局所の皮膚の病巣（Ｊ走性 舌紅斑）が生じ、そこからスピロヘータが感染中の池のいずれの時点よりも容易 に増殖する（Ｂ、　Ｗ。

Ｂｅｒｇｅｒら、”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ ｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　ＬｙｍｅＤｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅ　Ｆｒ ｏｍ　Ｔｈｅ　５ｋｉｎ　Ｏｆ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　Ｅｒｙｔｈｅｍ ａ　Ｃｈｒｏｎｉｅｕｍ　Ｍｉｇｒａｎｓ−、Ｊ、　Ａｍ、　Ａｃａｄ、　Ｄｅ ｒｍａｔｏＬ、、３巻、４４４〜４４９頁、１９８５年）。この時点ではインフ ルエンザ様もしくは髄膜炎様の症状が普通である。第２期は数日間もしくは数週 間以内に起こり、スピロヘータが患者の血液もしくはリンパを通じて、脳と関節 とを含む身体の多くの様々な部位に広がる。この散在性感染の多様な症状が、皮 膚、神経系および筋骨格系に生じるが一般に間欠的である。第３期すなわち後期 感染は永続的な感染と定義され、重篤な疾患を生じることがある。この病期には 、慢性関節炎、および中枢神経系と末梢神経系との症候群が、進行中の感染およ び恐らくはその結果もたらされる自己免疫疾患の結果として現れる（Ｒ，Ｍａｒ ｔ　ｉｎら、−Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ−Ｓｐｅｃｔｆｔｃ 　Ａｎｄ　Ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　Ｆｒｏｌｌ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　Ｆｌｕｉｄ　Ｉｎ　Ｌｙｍｅ　Ｒａｄｉｅｕｌｏ ｍｙｅｌｉｔｉｓ−、Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ、、　２４巻、５０９〜５１５頁、 １９８８年）。

Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉは、ヒトよりもマダニによる方がはるかに増殖する ので、現在ライム病は主として血清学で診断されている。酵素結合免疫吸着測定 法（Ｅｌ、ｌ５Ａ）が検出法のひとつであり、抗原として超音波処理を行った全 スピロヘータを用いている（Ｊ、Ｅ、Ｃｒａｆｔら、−Ｔｈｅ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｙ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｉｒ＋　Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｖａｌｕａｔｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｔｅ５ｔｓ−、Ｊ、　１ｎｆｅｃｔ、Ｄ’ ｓ、、１４９巻、７８９−７９５頁、１９８４年）。しかし血清学的試験法はま だ規格化されていないので、試験結果は試験室および市販のキット間で変動する ことがあり、偽陰性およびより一般的には偽陽性の結果を起こす。その上に、こ の疾患は、マダニが小さいので見逃し易いから、気付かないままの場合が多く、 また特徴的な発疹は症例の６０〜８０％にしか起こらないので起こったときに誤 解されることがある。

現在、ライム病の全病期について抗生物質で治療されている。初期の疾患の治療 は通常有効であるが、後期には付随する心臓、関節および神経系の疾患は、治療 に対して反応しないことが多い。（Ａ、Ｃ，５ｔｅｅｒｅ、　−Ｌｙｍｅ　Ｄｉ ｓｅａｓｅ”、　狛ｌ−カ狐」、　Ｍｅｄ、　、　３２１＠、５８６−５９６頁 、１９８９年）。

２つの系統の徴候が、Ｌム」重工Ｕ且の特異抗原に対する宿主の免疫応答が、ラ イム病の病原性に部分的に関与していることを示唆している。第１に、コルチコ ステロイド類（免疫系を抑制する）で治療された患者はその症状が改善される（ Ａ、　Ｃ，５ｔｅｅｒｅら、−Ｌｙｍｅ　Ｃａｒｄｉｔｉｓ：　Ｃａｒｄｉａｃ 　Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ　Ｏｆ　ＬｙＩｌｅ　Ｄｆｓｅａｓｅ−、Ａｎｎ 、Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、、９３巻、８〜１６頁、１９８０年）。第２に抗生 物質に対して応答しない何人かの患者には、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの感染 によって始まった自己免疫疾患が現れるようである。

梅毒を起こす江鉦旦聾ｊｌｊ、且旦」および感染性黄痘を起こすレブトスピレ属 の微生物と同様に、ボレリア属の微生物は、真性細菌間のスピロヘータに属して いる（Ａ、Ｇ、　Ｂａｒｂｏｕｒおよび’Ｓ、Ｆ、　Ｈａｙｅｓ、　”Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　Ｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｆａ　５ｐｅｅｉｅｓ”、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｒｅｖ、　、　５０巻、３８１〜４００頁、１９８５年）。Ｂｏｒｒｅｌｉａ　 ｂｕｒ　ｄｏｒ　ｅｒｉ　は、原形質シリンダー（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍｉｃ　 ｃｙｌｉｎｄｅｒ）をもっており、これは、まず細胞膜で囲まれ、次に鞭毛、次 いで外膜で囲まれている。この外膜内に次の２つの主要タンパク質が埋没されて いる。すなわち３１ｋｄの外表面プロティンＡ（ＯｓｐＡ）　［Ａ、Ｇ、　Ｂａ ｒｂｏｕｒら、−Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｊｒｏｃｂｅｔｅｓ　Ａｎｄ 　Ｉｘｏｄｉｄ　Ｔｉｃｋ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　５ｂａｒｅ　Ａ　Ｃｏｍ ｌｌ１ｏｎ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｅ　ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔＤ ｅｆｔｎｅｄ　Ｂｙ　Ａ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｔｂｏｄｙ”、Ｉｎｆ ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、４１巻、７９５〜８０４頁、１９８３年；　Ｊ、Ｌ、　 Ｂｅｎａｃｈら、”Ａ　Ｍｕｒｉｎｅ　ＩｇＭ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｙ　Ｂｉｎｄｓ　Ａｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｄｅｔｅｒｉｉｎａｎｔ 　Ｉｎ　０ｕｔｅｒＳｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ、　Ａｎ　ＩｌｍＬｌ ｒｌＯｄＯＩｉｎａｎｔ　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒｏｔｅｔｎ　（ＨＴｈｅ　Ｌｙ＋＋ ＋ｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｆｒｏｃｈｅｔｅ”、　Ｊ、Ｉｎｍｕｎｏｌ、、　 １４０巻、２６５〜２７２頁、１９８８年コ、および３４ｋｄの外膜プロティン Ｂ（ＯｓｐＢ）　［Ａ。

Ｇ、Ｂａｒｂｏｕｒら、＋ｖａｒｉａｔｉｏｎ　Ｉｎ　Ａ　Ｍａｊｏｒ　５ｕｒ ｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　０ｆＬｙ＋ａｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈ ｅｔｅｓ”、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｌｌｍｕｎ、、　４５巻、９４〜１００頁、　１ ９８４年］である。この２１のタンパク質は、異なる分離株によって変動し、ま たは分子量およびモノクローナル抗体との反応性で測定して同じ分離株の異なる 継代によって変動することが分かっている。その上に０ｓｐＢは培養では全く産 生されない（Ｔ、Ｇ、　Ｓｃｈｗａｎら、−Ｃｈａｎｇｅｓ　Ｉｎ　Ｉｎｆｅｃ ｔｉｖｉｔｙ　ＡｎｄＰｌａｓ＋ｍｉｄ　Ｐｒｏｆｉｌｅ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｌｙ ｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅ、　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒ　 ｄｏｒ　ｅｒ’、　Ａｓ　Ａ　Ｒｅ５ｕｌｔ　Ｏｆ　Ｉｎ　’／１ｔｒｏ　Ｃｕ １ｔｉｖａｔｉｏｎ”　１ｎｆｅｅｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　５６巻、１８３１〜 １１１３６頁、１９８８年）。

ヒトに感染した初期には、抗体は主として４１ｋｄの鞭毛関連抗原に対して生成 する。後期には、０ｓｐＡと０ｓｐＢの両者に対して高い力価の抗体が現れる（ Ｊ、Ｅ、　Ｃｒａｆｔら、”Ａｎｔｉｇｅｎｓ　Ｏｆ　Ｂ。

ｒｒｅｌ’ａ　Ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　Ｄｕｒｉｎｇ 　Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ：　Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ　Ｏｆ　Ａ　Ｎｅｗ　Ｉ ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｍ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ａｎｄ　Ｅｘｐａｎｓｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　 Ｌａｔｅ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　ｌ１ｌｎｅｓｓ−、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、 、　７８巻、９３４−９３９頁、１９８６年）。しかし、この体液性免疫応答は 一般に、試験的に感染させた実験用ラットでは、感染因子の系を除去するのに十 分ではない（Ｋ、　Ｄ。

Ｍｏｏｄｙら、−Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｌｙｍｅ　Ｂｏ ｒｒｅｌｆｏｓｉｓ　Ｉｎ　Ｌｅｖｉｓ　Ｒａｔｓ−、Ａ１．−ムーＴｒｏ　、 　Ｍｅｄ、　Ｈ、印刷中、１９９０年）。その上、ヒトは数ケ月間または数年間 にわる潜伏期の長い感染をすることがわかっている。従って、該スピロヘータは 、細胞内のある部位に隠れることができ、その部位では循環する抗体分子は効力 がないことを示唆している。

ライム病に対する実験モデルの開発は困難であることが分かっている。いくつか のグループが、ウサギ、ベロマイスククス・マウス（隙胆旺匹皿１ｌｉｃｅ）お よびシリアハムスターに旦、　ｂｕｒ叉ｄｏｒ工釘１を接種した後、スピロヘー タをこれらの動物中に見いだしたが、ライム病の他の症状の発現は全く認められ なかった（Ｗ、　Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、　−Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ 　Ｗｈｉｔｅ　Ｒａｂｂｉｔ：Ａｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｏ５ｔ　Ｆ ｏｒ　Ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ　Ｔｉｃｋｓ　Ｗｉｔｈ　Ｌｙｍｅ　Ｄｔｓｅａｓｅ 　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ”、　Ｙａｌｅ　Ｊ、　Ｂｆｏｌ、　Ｍｅｄ、、５７ 巻、６０９〜６１２頁、１９８４年；　Ａ、Ｎ、Ｋｏｒｎｂｌａｔｔら、−Ｅｘ ｐｅｒｔｍｅｎｔａｌ　Ｌｙｉｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　１ｎ　Ｒａｂｂｉｔｓ：　 ５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　Ｆｏｕｎｄ　Ｉｎ　Ｅｒｙｔｈｅｍａ　Ｍｉｇｒａｎ ｓ　Ａｎｄ　Ｂｌｏａｄ−、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋ａｍｕｎ、、　４６巻、２２０ 〜２２３頁、１９８４年：Ａ、Ｎ。

Ｋｏｒｎｂｌａｔｔら、−Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｉｎ　Ｒａｂｂｉｔｓ　Ｗｉｔ ｈ　Ｔｈｅ　Ｌｙｒｎｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔａ”、　Ｙａｌ ｅ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｖｅｄ、、５７巻、６１３〜６１４頁、１９８４年；　 Ｊ、Ｌ、Ｂｅｎａｃｈら、−Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉ ｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃ６ｅｔｅ　Ｔｏ 　Ｒａｂｂｉｔｓ−、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｔｓ。

、１５０巻、７８６〜７８７頁、１９８４年；　Ｊ、Ｇ、　Ｄｏｎａｈｕｅら、 −ＲｅｓｅｒｖｏｉｒＣｏｍｐｅｔｅｎｃｅ　Ｏｆ　Ｔｈ１ｔｅ−Ｆｏｏｔｅｄ 　Ｍｉｃｅ　Ｆｏｒ　Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｅｈａｔｅｓ−、 ｖａ、　Ｊ、ｒｏ、　Ｍｅｄ、　Ｈ、，３６巻、９２〜９６頁、１９８７年Ｅ、 Ｃ，Ｂｕｒｇｅｓｓら、−Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ 　Ｏｆ　シ圧λｖ１四ｃ、　ｓｐｐ、　Ｗｉｔｈ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒ　 ｄｏｒｆｅｒｉ：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　Ｏｆ　ＣｏｎｔａｃｔＴｒａｎｓｍｉｓ ｓｉｏｎ−、Ａｍ、Ｊ、　Ｔｒｏ　、　Ｍｅｄ、　Ｉ’！　、、３５巻、３５５ 〜３５９頁、１９８６年；　Ｐ、Ｈ，ＤｕｒａｙとＲ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎ、° Ｔｈｅ　Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｊｍｅｎｔａｌｌｙ 　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　Ｈａｍｓｔｅｒｓ　Ｗｉｔｈ　Ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　Ｄｆｓ ｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ ＋、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、ＥＸ　。

Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、、１８１巻、２６３〜２６９頁、１９８６年；　Ｒ，Ｃ， Ｊｏｈｎｓｏｎら、”Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　５ｙｒｉａｎ　Ｉｌａｍｓｔ ｅｒｓ　Ｗｉｔｈ　Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ−、Ｊ 、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、２０巻、１０９９〜１１０１頁、１９ ８４年）。

いくつかの動物モデルが開発されたが、それらのモデルはＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆ ｅｒｉ感染症に対して免疫することが可能であることを示唆している。ハムスタ ーによる初期の研究では、受動免疫法、すなわち、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ を接種されたウサギの血清を転移させる方法が、同じ菌株によるその後の感染に 対して防御することを示したが（Ｒ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎら、−Ｐａｓｓｉｖｅ 　Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈａｍｓｔｅｒｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｘ ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｗｉｔｈ　Ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　Ｄ ｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅ−、Ｉｎｆ、Ｉｍｍ、、５３巻、７１３〜 ７１４頁、１９８６年）。この免疫性は他の地域からの菌株にまでは広がらなか った（Ｒ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎら、−Ｅｘｐｅｒｆｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｆｅｃｔ ｉｏｎ　Ｏｆ　ＴｈｅＨａｍｓｔｅｒ　Ｗｉｔｈ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒｇ ｄｏｒｆｅｒｉ−、Ａ　ｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ＋、　、　５３Ｎ！ 、２５８〜２６３頁、１９８８年）。さらに、全不活性化Ｌｌ扛■ｏｒｆｅｒｉ によるハムスターの能動免疫法も免疫性を与えるが、やはりいくぶん菌株特異的 であるようである（Ｒ，Ｃ，Ｊｏｈｎｓｏｎら、”Ａｃｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｉ ｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈａｍｓｔａｒｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ ｔａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｗｉｔｈ　Ｂｏ　ｒｅｌｉａ　Ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ ｒｉ−、Ｉｎｆ、１ｍｍ、、５４巻、　８９７〜８９８頁、１９８６年）。ハム スターは、ライム病に付随する臨床症状を発現しないようであるから、最適なモ デル系ではない。

実験ラットを利用する動物モデルによって、ラットは永続的に感染し、関節炎と 心臓炎を起こしたが、これらの症状は、ラット３適齢以上で感染した場合一貫性 がないことが実証された（Ｓ、Ｗ、　Ｂａｒｔｈｏｌｄらの前記文献）。

重症複合型免疫不全（銭」）マウスを用いる他の動物モデル系も開発されている 。Ｌ］旦郵Ａｙゴｅｒｉに感染した皿マウスは、ヒトのライム病と同様の、関節 炎と心臓炎を伴う慢性の感染症にかかる（Ｕ、Ｅ、　５ｅｈａｉｂｌｅ、”Ｔｈ ｅ　５ｅｖｅｒｅ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｉ＋＋＋＋５ｕｎｏｄｅｆｔｃｉｅｎｃ ｙ　Ｍｏｕｓｅ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｏｄｅｌ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　 Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｏｆ　Ｌｙｍｅ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ａｎｄ　Ｃａｒｄｉ ｔｉｓ”ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、１７０巻。

１４２７〜１４３２頁、１９８９年）。この系を用いると、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏ　 ｆｅｒ１特異的免疫マウスの血清は、０ｓｐＡに対するモノクローナル抗体と同 様に、感染時に受動的に転移させた場合、皿マウスのライム病を防止するかまた は発現を遅らせることができることが分かっている（Ｕ、Ｅ、　５ｃｈａｔｂｌ ｅら、−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｆ ｏｒ　Ｔｈｅ　０ｕｔｅｒ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　（ＯｓｐＡ ＞Ｏｆ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ　Ｐｒｅｖｅｎｔ　Ｌｙ＋ ＊ｅ　Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ　Ｉｎ　５ｓｖｅｒｅ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｉｍ ｍｕｎｏｄｅｆｊｃｉｅｎｃｙ　（ＳＣＩＤ）　Ｍｉｃｅ−、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８７巻、３７６８〜３７７２頁、１９ ９０年）。しかし免疫無防備状態の動物は、可能性のあるワクチンの研究に充分 に適しているわけではない。他の研究者は、実験マウスに免疫応答性菌株を感染 させようと試みたが失敗した（Ｓ、Ｗ、　Ｂａｒｔｈｏｌｄらの前記文献参照） 。したがって別の動物系とワクチンの開発が必要である。

マダニの外寄生の防止法は不完全であり、かつライム病は発生したとき見逃した り誤診することがあるので、Ｌ匝組臼ｒｆｅｒｔの抗原と、防御的免疫応答を引 き出すことができる関連タンパク質を決定することが緊急に必要である。さらに 、ライム病を予防し診断する薬剤および方法を開発するために、ヒトの疾患に似 ていて、上記のような抗原を研究して選択し、免疫応答を調査するために協議で きる適切な動物系が必要である。

産朋ヱと匪丞 本発明は、１つの好ましい実施態様において、ライム病の治療もしくは予防に有 用な０ｓｐＡポリペプチド類、これらのポリペプチドを有する、薬学的に有効な 組成物および方法を提供することによって上記の問題を解決するものである。こ の実施態様の好ましい組成物と方法は、治療された患者にＬｈ■土工α己の感染 によって起こるライム病に対して治療もしくは防御を行うのに有効な免疫応答を 起こさせる０ｓｐＡポリペプチドを特徴とするものである。

他の好ましい実施態様において、本発明は、ライム病の治療もしくは予防に有用 な０ｓｐＢポリペプチド類、およびこれらのポリペプチド類からなる薬学的に有 効な組成物および方法を提供するものである。この実施態様の好ましい組成物お よび方法は、治療された患者にし堕」土工匡丘の感染によって起こるライム病に 対して治療もしくは防御を行うのに有効な免疫応答を起こさせる０ｓｐＢポリペ プチドを特徴とするものである。

さらに他の実施態様において、本発明は、本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢの ポリペプチド類に特異的な抗体類、およびこのような抗体類からなる薬学的に有 効な組成物と方法を提供するものである。この実施態様の抗体は本発明の０ｓｐ Ａもしくは０ｓｐＢのポリペプチド類と免疫学的に反応性でかつＬ匝■並パ仏の 感染で起こるライム病に対して治療もしくは防御を行うのに有効な抗体である。

本発明はさらに、ライム病に対して防御するのに有効な、本発明の好ましい０ｓ ｐＡと０ｓｐＢのポリペプチド類と抗体類を選択するための、特異的なヒト以外 の哺乳類のモデルを使用する新規なスクリーニング方法を提供するものである。

本発明の上記スクリーニング方法は、以下の工程を含有する＝１）本発明の０ｓ ｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドまたは抗体でＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを免疫し ； ２）上記の免疫された動物にＬ血」吏ｍ匡且を接種し；次いで ３）ライム病に対して動物を防御するのに有効な０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポ リペプチド類または抗体類を選択する；工程。

他の実施態様において、本発明は、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチド類 に特異的な抗体類を特徴とする診断手段と診断方法を提供するものである。これ らの手段と方法は、ライム病およびＬ鳳」土工匡且の感染を検出するためのに有 用である。

またこれらの手段と方法は、上記の感染に対する治療の方法を追跡するのに有用 である。

最後に、本発明は、本発明の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子、これらＤＮ Ａの配列および分子で形質転換された単細胞の宿主、およびこれらの配列、分子 および宿主を使用して本発明の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドを生成す る方法を提供するものである。

区ｉ旦皿工呈鳳里 図１は、し蝕」薗ｍ包且菌株Ｎ４０の０ｓｐＡポリペプチドのＤＮＡ配列とアミ ノ酸配列、およびその遺伝子を増幅するために用いるオリゴヌクレオチドブライ マーの配列を示す。

ｌ豆旦２亙ユ且コ 本発明は、０ｓｐＡポリペプチドと０ｓｐＢポリペプチド、抗０ｓｐＡポリペプ チド抗体と抗０ｓｐＢポリペプチド抗体、上記ペプチドと抗体とを含有する組成 物ならびにライム病を、検出、治療および予防する方法に関する。さらに詳しく は、１つの実施態様において本発明は、治療されたヒトを含む動物に、Ｂ、　ｂ ＋↓肛堕Ｌ１已に感染した結果起こるライム病関連の疾患に対して、ある期間そ の動物を防御するのに十分な免疫応答を起こさせる０ｓｐＡポリペプチド類を含 有する組成物および方法に関する。

他の実施態様において、本発明は、治療されたヒトを含む動物に、Ｂ、　ｂｕｒ 　ｄｏｒｆｅｒｉに感染した結果起こるライム病関連の疾患に対して、ある期間 その動物を防御するのに十分な免疫応答を起こさせる０ｓｐＢポリペプチド類か らなる組成物と方法に関する。

他の実施態様において、本発明は、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ己の感染によって起 こるライム病関連疾患に対して、治療された動物をある期間防御するのに有効な 、抗０ｓｐＡポリペプチド抗体または抗０ｓｐＢポリペプチド抗体からなる組成 物と方法に関する。

さらに他の実施態様において、本発明は、ライム病を検出する診断手段と診断方 法に関する。

さらに本発明を定義するために、以下に用語と定義を提示する。

本願に用いられる「ライム病に対して防御する０ｓｐＡポリペプチド類」という 用語は、Ｂ、ｂｕ　ｄｏ　ｆｅｒｉの感染によって起こる、遁走性舌紅斑、関節 炎、心臓炎、神経学的疾患および他のライム病関連疾患を含む疾患のいずれか１ つの重症度を、ある期間予防するか少なくする０ｓｐＡポリペプチド類を意味す る。

本願に用いられるｒｏｓｐＡポリペプチド」という用語は、菌株ＺＳ７と８３１ とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４（ＤＯｓｐＡタフｉ４り質とその血清型変異 体；　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４の０ｓｐＡタン／（り質とその血清型変異体のア ミノ酸配列から、プロ・ツタとして採取した少なくとも１０のアミノ酸を含有す るフラグメント；および上記のもののいずれかの誘導体を意味し、前記誘導体は 、前記のＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４の０ｓｐＡタンパク質、その血清型変異体およ びそのフラグメントと、アミノ酸配列が少なくとも８０％同一である。あるいは ｒｏｓｐＡポリペプチド」という用語は、哺乳類の宿主がＢ、　ｂｕｕ重二匡已 に感染して生成する抗体と免疫学的に反応性のポリペプチド類であって、その抗 体が、ＺＳ７と８３１とを除いた５ＥＱＩＤ　Ｎｏ：４の０ｓｐＡタンパク質と その血清型変異体（すなわち、菌株ＺＳ７および／またはＢ３１の菌株の０ｓｐ Ａタンパク質とのみ免疫学的に反応性の抗体と免疫学的に反応性のポリペプチド 類を除く）であるポリペプチド類；　Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ　ｊおよびＺＳ７ とＢ３１とを除いたＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の０ｓｐＡポチペプチドとその血清 型変異体と免疫学的に反応性の抗体を生成することができるポリペプチド類（す なわち菌株ＺＳ７および／またはＢ３１の０ｓｐＡポリペプチドとのみ免疫学的 に反応性の抗体を生成するポリペプチド類を除り）；ならびにＢ、ｂｕｒ　ｄｏ ｒｆｅ　ｉの感染によって起こるライム病に対して防御するのに有効な免疫応答 を、治療した哺乳類の宿主に起こさせ、かつＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の０ｓｐＡ ポリペプチドおよびその血清型変異体と免疫学的に反応性の抗体を生成すること ができるポリペプチド類ド類；からなる群から選択されるポリペプチド類を意味 する。

本願で用いる、０ｓｐＡポリペプチドの「血清型変異体」という用語はｒ　０ｓ ｐＡ変異体」とも呼ぶが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４の０ｓｐＡポリペプチドをコ ードするＤＮＡ配列の部分と、Ｔｍより低い２０〜２７℃でハイブリダイズする ＤＮＡ配列で、全体もしくは一部がコードされ得ているポリペプチドである。あ るいは、０ｓｐＡポリペプチドの「血清型変異体」は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ の０ｓｐＡタンパク質もしくはフラグメントの誘導体をコードするＤＮＡ配列の 部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列によって、全体もしくは一部がコードされ 得る任意のポリペプチドであって、前記の誘導体がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４の０ ｓｐＡタンパク質もしくはそのフラグメントとアミノ酸配列が少なくとも８０％ 同一のポリペプチドである。

当業者であれば、０ｓｐＡポリペプチドの血清型変異体には、ポリメラーゼ連鎖 反応と、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の０ｓｐＡタンノｆり質をコードするＤＮＡ配 列の部分由来のオリゴヌクレオチドブライマーとを用いて、任意の部分が増幅さ れるＤＮＡ配列でコードされるポリペプチドが含まれていることは分かるであろ う。さらに、０ｓｐＡポリペプチドの血清型変異体には、ポリメラーゼ連鎖反応 と、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の０ｓｐＡタンパク質もしくはそのフラグメントの 誘導体をコードするＤＮＡ配列の部分由来のオリゴヌクレオチドブライマーとを 泪いて、任意の部分が増幅されるＤＮＡ配列でコードされるポリペプチドであっ て、前記誘導体がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の０ｓｐＡタンパク質もしくはそのフ ラグメントの配列とアミノ酸配列が少なくとも８０％同一であるポリペプチドが 含まれている。

本発明の１つの実施態様によってＬ迎」±ｍ１０菌株Ｎ４０由来の０ｓｐＡポリ ペプチドの血清型変異体が提供される。この異変体（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１０ ）菌株２５０１５由来は、３９位のアミノ酸配列が菌株Ｎ４０の０ｓｐＡポリペ プチドと異なっている。上記の定義によれば、ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１０のタン パク質、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のアミノ酸配列からプロ、りとしてとった少 なくとも１０のアミノ酸のフラグメント、またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１０もし くはそのフラグメントとアミノ酸配列が少なくとも８０％同一の誘導体はすべて ０３ｐＡポリペプチド類とみなされる。その上、哺乳類宿主がｌ■堕り罰Ｈに感 染したことによって生成した抗体と免疫学的に反応性のポリペプチドであって、 前記抗体がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１０のタンパク質もしくはそのフラグメントと 免疫学的に反応性であるポリペプチド、ならびにＢ、ｂｕｒ　ｄｏ　ｆｅｒｏお よびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

＝１０のタンパク質と免疫学的に反応性の抗体を生成できるポリペプチドも０ｓ ｐＡポリペプチド類とみなされる。

当業者ならば、２５０１５０ｓｐＡ変異体（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）をフード するＤＮＡ由来の、特に菌株Ｎ４０　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）の０ｓｐＡポ リペプチドと同等のアミノ酸部分をコードする領域由来のプローブとオリゴヌク レオチドブライマーを使って、他のＬ匝■血が旺１株および恐らくは同様に他の スピロヘータ由来の表面タンパク質の別の変異体（本発明の方法と組成物に有用 である）を単離しクローン化することができることが分かるであろう。

本願に用いられる「ライム病に対して防御する０ｓｐＢポリペプチド類」という 用語は、遁走性舌紅斑、関節炎、心臓炎、神経学的疾患および他のライム病関連 疾患を含む、Ｌ匡」並記の感染によって起こる疾患のいずれか１つの重症度をあ る期間、予防もしくは軽減する０ｓｐＢポリペプチド類を意味する。

本願で泪いられるｒ　０ｓｐＢポリペプチド」という用語は、ＬｕＢ±ｍ匡■菌 株Ｂ３１の０ｓｐＢタンパク質およびその血清型変異体；Ｌ堕」■江匡亘菌株Ｂ ３１の０ｓｐＢタンパク質およびその血清型変異体のアミノ酸配列からブロック としてとった少なくとも１０のアミノ酸を含有するフラグメント；ならびにＬ巨 ■０ビニＩ菌株Ｂ３１の０ｓｐＢタンパク質、その血清型変異体およびそのフラ グメントとアミノ酸配列が少なくとも８０％同一である、上記のもののいずれか の誘導体を意味する。あるいは、「０５ｐＢポリペプチド」という用語は、哺乳 類宿主がＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｌに感染したことによって生成する抗体と免 疫学的に反応性のポリペプチドであって、前記抗体がＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒ ｉ菌株Ｂ３１の０ｓｐＢタンパク質およびその血清型変異体と免疫学的に反応性 であるポリペプチド；Ｌ崩」士ｍ匡已及びし堕］吏ｍη已菌株Ｂ３１の０ｓｐＢ タンパク質とその血清型変異体に対して免疫学的に反応性であるポリペプチド； ならびに１３．　ｌ）Ｂ　ｄｏｒｆｅｒｉの感染によって起こるライム病に対し て防御するのに有効な免疫応答を治療を受けた哺乳類の宿主に生成させ、かつＬ 匝江鼓ｄ肛１ｍ株Ｂ３１の０ｓｐＢタンパク質とその血清型変異体に対して免疫 学的に反応性の抗体を生成することができるポリペプチドを意味する。

本願で用いられる０ｓｐＢポリペプチドの「血清型変異体」という用語は、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ＋１１の０ｓｐＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の任意の 部分と、Ｔｔａより低い２０〜２７℃で７Ｘイブリダイズを行うＤＮＡ配列によ って全体もしくは一部をコードされているポリペプチドを意味する。あるいは、 ０ｓｐＢポリペプチドの「血清型変異体」は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の０ｓ ｐＢタンノｆり質もしくはそのフラグメントの誘導体をコードするＤＮＡ配列の 部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列によって全体もしくは一部がコードされて いるポリペプチドであって、前記誘導体がＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１１の０ｓｐＢ タンパク質もしくはそのフラグメントとアミノ酸配列が少なくとも８０％同一で あるポリペプチドである。

０ｓｐＡポリペプチドの血清型変異体と同様に、当業者は、０８ｐＢポリペプチ ド類の血清学的変異体に、ポリメラーゼ連鎖反応と、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１１ の０ｓｐＢタンノくり質をコードするＤＮＡ配列の部分由来のオリゴヌクレオチ ドブライマーとを用０て部分力ｆ増幅されるＤＮＡ配列によってコードされるポ リペプチドカｆ含まれることは容易に分かるであろう。さらに、０ｓｐＢポリペ プチド類の血清型変異体には、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の０ｓｐＢタンノくり 質もしくはそのフラグメントの誘導体をコードするＤＮＡ配列の部分由来のオリ ゴヌクレオチドブライマーを用いて部分が増幅されるＤＮＡ配列でコードされた ポリペプチドであって、前記誘導体がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の０ｓｐＢタン ノ（り質もしくはそのフラグメントの配列とアミノ酸配列が少な（とも８０％同 一であるポリペプチドが含まれる。

また本発明の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢポリペプチドは各々より大きなタンパク質 の一部であり得ると解すべきである。例えＩｆ。

本発明の０ｓｐＡポリペプチドは、他の０ｓｐＡポリペプチドまた！±非０ｓｐ Ａポリペプチドまたはその組み合わせに、そのＮ末端もしくはＣ末端で融合させ ることができる。この目的のため１こ有用な０ｓｐＡポリペプチドには、ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：４およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０由来のポリペプチドならびに これらペプチドのいずれかの血清型変異体が含まれる。この目的に有用な非０ｓ ｐＡポリペプチドニハ、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１由来ポリペプチドとその血清 型変異体；Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ鞭毛関連タン／ｓ＋　９質とそのフラグ メント；他のＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉタンパク質とそのフラグメント；およ び非い肛対虹ム旦タンパク質とそのフラグメントが含まれて℃）る。

本発明の１つの実施態様において、０ｓｐＡおよび／またｌ；！０ｓｐＢポリペ プチドの複合血清型変異体を含有する融合タンノ＜脂質が、本発明の方法と組成 物に用いるため１こ構築される。このようなタンパク質は、広範囲のＢ、ｂｕｒ 　ｄｏｒｆｅｒｉ分離株で起こるライム病の予防、治療および診断に有効である 。

また０ｓｐＡと０ｓｐＢポリペプチドは、より大きな多量体タンノｆり質の一部 であってもよい。これらの融合タンｚ（り質もしくは多量体タンパク質は、組換 え法で生成されるかまた１ま化学的に合成される。またこれらのタンノくり質に は、脂質と炭水化物を含むアミノ酸以外の部分に融合もしくはカップリングされ た０ｓｐＡと０ｓｐＢポリペプチドが含まれる。

本願で用いられる「防御抗体」という用語は、実験１こ使用されたことがない動 物を受動的に免疫するのため１こ使ったときに、Ｌ蝕」土ｍ匡旦の感染で起こる ライム病に対して防御する抗体を意味する。

本願で用いる「防御エピトープ」と（弓用語１ま、（１）防御抗体が２ｍするエ ピトープおよび／または（２）動物を免疫するのに使用したとき、Ｌ蝕」圭ｍ匡 ムの感染で起こる疾患の０ずれかが１つの重症度を、ある期間予防するかもしく 　１１軽減するのに充分な免疫応答を起こさせるエピトープを意味する。防御エ ピトープは、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープまた（ｉその組み合わせを含 む。

本願で用いられる「Ｔ細胞エピトープ」は、抗原提示細胞によってＴ細胞に提示 されたとき、リンホカインなどの免疫ｉｌｌｌｌ好性分子ローン膨張もしくはク ローン発現のようなＴ細胞応答をもたらすエピトープを意味する。またＴ細胞エ ピトープ（よ、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの細胞内感染に影響する細胞毒Ｔ細 胞１こよって認識されるエピトープである。強いＴ細胞エピトープ（ま強１．ｓ ７細胞応答を起こさせるＴ細胞エピトープである。

本願で用いる「Ｂ細胞エピトープ」と′１．）う用語ｉ！、特異抗体と反応する 抗原の最も簡単な空間構造を意味する。

本願で用いるｒ　０ｓｐＡポリペプチドの治療するの（こ有効な量」という用語 は、Ｌ堕」土工匡且の感染で起こる疾患の−）ずれ力）１つの重症度を、ある期 間、予防もしくは軽減するのをこ必要な量を意味する。

本願で用いるｒ　０ｓｐＢポリペプチドの治療するの（こ有効な量」という用語 は、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの感染で起こる疾患のｔｌずれ力）１つの重症 度を、ある期間、予防もしくは軽減するのに必要な量を意味する。

本願で用いる「抗０ｓｐＡポリペプチド抗体」と−１う用語（マ、本発明の０ｓ ｐＡポリペプチドと免疫学的に反応性の、免疫グロブリン分子もしくはその部分 を意味する。

本願で用いる「抗０ｓｐＢポリペプチド抗体」という用語は、本発明の０ｓｐＢ ポリペプチドと免疫学的に反応性の、免疫グロブリン分子もしくはその部分を意 味する。

抗０ｓｐＡポリペプチド抗体もしくは抗０ｓｐＢポリペプチド抗体は、本来の完 全な免疫グロブリン分子、または、Ｆ（Ｖ）、Ｆａｂ。

Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２として当該技術分野で公知の部分を含む本来の完 全な抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の部分であってもよい。また抗 ０ｓｐＡポリペプチド抗体または抗０５ｐＢポリペプチド抗体も防御抗体である と解すべきである。

本願で用いる「抗０ｓｐＡポリペプチド抗体の治療するのに有効な量」という用 語は、Ｌ蝕」土ｍ薊且の感染によって起こる疾患のいずれか１つの重症度を、あ る期間、予防もしくは軽減するのに必要な量を意味する。

本願で用いられる「抗０ｓｐＢポリペプチド抗体の治療するのに有効な量」とい う用語は、Ｌ回」垂こ匡且の感染によって起こる疾患のいずれか１つの重症度を 、ある期間、予備もしくは軽減するのに必要な量を意味する。

本発明の０ｓｐＡポリペプチド類には、未変性のポリペプチドに相当するポリペ プチド（例えば、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４とその血清型変異体）に加えて、これ らのポリペプチド類とフラグメントのフラグメントと誘導体が含まれる。このよ うな、未変性のポリペプチドのフラグメントは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の０ｓ ｐＡポリペプチドとその血清型変異体の配列からブロックとしてとった少なくと も１０のアミノ酸を含有している。本発明の誘導体は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ の０５Ｉ）Ａタンパク質、その血清型変異体およびそのフラグメントとアミノ酸 配列が少なくとも８０％同一である。

同様に、本発明の０ｓｐＢポリペプチド類には、未変性のポリペプチドに相当す るポリペプチド（り１えばＢ３１０ｓｐＢとその血清型変異体）に加えて、これ らのポリペプチドおよびフラグメントの誘導体が含まれる。このような未変性ポ リペプチドのフラグメントは、Ｂ３１０ｓｐＢとその血清型変異体の配列からブ ロックとしてとった少なくとも１ｏのアミノ酸を含有している。本発明の誘導体 は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１の。ｓｐＢタンパク質、その血清型変異体および そのフラグメントとアミノ酸配列が少なくとも８０％同一である。

本発明によれば、未変性の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドもしくはフ ラグメントが、目的とする受容個体内でその免疫原性を増大するように改変もし くは処理されるときに好ましい誘導体が得られる。例えば種々のアミノ酸の置換 、改変もしくは欠失をポリペプチドの生成中もしくは生成後に行うことができる 。未変性の０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドのこのような誘導体には、例えば 、そのポリペプチド中に存在するアミノ酸残基の遊離のアミ八　カルボキシルも しくはヒドロキシルの側鎖基を反応させることによって生成することができる誘 導体が含まれる。またこの誘導体には、異なる天然のアミノ酸、アミノ酸誘導体 もしくは非天然のアミノ酸で、１つ以上のアミノ酸を置換することによって得ら れるポリペプチドが含まれるが、保存性の置換が好ましい。例えば、次の置換を 行うことができる。すなわち、ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに置換するこ とができ；プロリンを４〜ヒドロキシプロリンに置換することができ；す７ンを ５−ヒドロキシリンンに置換することができる、などである。

また本発明の０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドは、例えば、ジニトロフェノー ル基もしくはアルサニル酸（ａｒｓａｎｉｌｉｃ　ａｃｉｄ）にカップリングす るか、または熱および／またはＳＤＳで変性することによって、その免疫原性を 増大するように改変することがテキる。特に、０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチ ドが化学的に合成された小さなポリペプチドの場合、免疫原性担体をカップリン グすることが望ましい。このカップリングは、もちろん、ポリペプチドまたは担 体の性能が適正に機能するのを阻害してはならない。力、ブリング方法について のいくつかの一般的な考察結果を再検討するには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｒａｔｏｒｙ、　Ｅ、　Ｈａｒｌｏｔおよびり、　Ｌａｎｅ！１１集、１ ９８８年を参照のこと。有用な免疫原性担体は当該技術分野ではよく知られてい る。このような担体の例としては、キーホールリンベットヘモシアニン（にＬｌ ｌ）　；ウシ血清アルブミン類（ＢＳＡ）　；　ＰＰＤ　（ツベルクリンの精製 タンパク質誘導体）；赤血球；破傷風トキンイド；コレラド牛ンイド；アガロー スビーズ；活性炭；またはベントナイトがある。

本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドはいずれも、薬学的に受容可 能な塩の形態で使用することができる。本発明のポリペプチド類と塩を形成でき る適切な酸と塩基は当業者にとって公知であり、無機および有機の酸および塩基 が含まれる。

本発明の１つの実施態様によって、本発明の発明者らは、本発明の０ｓｐＡポリ ペプチド、または本発明の０ｓｐＡポリペプチドを含有する融合タンパク質もし くは多量体タンパク質の治療上の有効量によって、薬学的に受容可能な様式で患 者を治療する工程を含む、Ｌ加コ土ｍ圧ムの感染によって起こる疾患のいずれか １つの重症度を、ある期間、予防もしくは軽減するのに十分な様式でライム病に 対して防御する方法を述べる。

上記の方法と組成物に用いることが好ましい０ｓｐＡポリペプチド類は、防御エ ピトープを含有する０ｓｐＡポリペプチド類である。このような防御エピトープ としては、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、またはその組み合わせがある 。

本発明の他の実施態様によって、本発明の発明者らは、本発明の０ｓｐＢポリペ プチド、または本発明の０ｓｐＢポリペプチドを含有する融合タンパク質もしく は多量体タンパク質の治療上の有効量によって、薬学的に受容可能な様式で患者 を治療する工程を含む、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの感染によって起こる疾患 のいずれか１つの重症度を、ある期間、防止もしくは軽減するのに十分な様式で ライム病に対して防御する方法を提示する。

上記の方法と組成物に用いるのに好ましい０ｓｐＢポリペプチド類も防御エピト ープを含有する０ｓｐＢポリペプチド類であり、そのエピトープとしてはＢ細胞 エピトープ、Ｔ細胞エピトープまたはその組み合わせである。

これらの組成物と方法に用いるのに最も好ましい、本発明の○ｓｐＡと０ｓｐＢ のポリペプチドは、強力なＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方を含 有するポリペプチドである。理論に縛られることなく、本発明の発明者らは、Ｌ 匝■鼓旺虹１の感染を中和するのに有効な高力価の抗体を刺激するのに、上記の 方法が最高の方法と考えるものである。上記の好ましい０ｓｐＡおよび０ｓｐＢ ポリペプチドは、Ｂ細胞のエピトープを認識する表面免疫グロブリンを発現する Ｂ細胞によって取り込まれる。次ぎにＢ細胞は該抗原をプロセッシングし、それ をＴ細胞に提示する。Ｔ細胞はＴ細胞エピトープを認識し、リンホカイン類を増 殖産生して応答し、次いでそのリンホカイン類はＢ細胞を抗体産生形質細胞に分 化させる。従ってこの系には、自己触媒閉鎖回路が存在し、この回路はＢ細胞と Ｔ細胞との両方の応答を増幅し、結局、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチ ドに対する高力価の抗体を含む強力な免疫応答を起こさせる。

１つの実施態様において、上記の好ましい０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチ ドを生成するために、本発明の０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドのオーバーラ ツプフラグメントが使用される。Ｂ細胞エピトープを含有するポリペプチドは、 その以下の性能によって同定される。すなわち（１）防御性の抗Ｂ、ｂｕｒ　ｄ ｏｒｆｅｒｉ抗体もしくは抗０ｓｐＡ抗体もしくは抗０ｓｐＢ抗体によって認識 され、（２）ポリクローナルウサギ抗Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ血漬から防御 抗体を除去するか、または（３）Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの感染で起こるラ イム病に対して防御する免疫応答を起こす性能で認識される。

ＴｍＨ８エピトープの読本はＭＨＣで制限されるので、Ｔ細胞エピトープを含有 する０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドは、増殖および／またはサイトカイ ンの産生を刺激する性能について、各種の）ＩＬＡ型のヒト、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウ スのリンパ節または家畜から生成したＴｍｍツクローン渭いて試験することによ ってインビトロにおいて同定される。異なるクラス■の抗原を有する個体によっ て認識される複数のＴ細胞エピトープを含有する組成物は、広範囲の患者のライ ム病の予防と治療に有用である。

本発明のこの好ましい実施態様において、Ｂ細胞エピトープを含有する０ｓｐＡ もしくは０ｓｐＢのポリペプチドは、強力なＴ細胞エピトープを含有する１つ以 上の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドと融合される。強いＴ細胞エピト ープとＢ細胞エピトープとを有する０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドを 有する融合タンパク質は、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの感染を中和するのに有 効な高力価の抗体の応答を起こすことができる。

強いＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、他のウィルスの成分にもみら れる。例えば、強いＴ細胞エピトープはＢ型肝炎ウィルスのコア抗原（ＨＢｃＡ ｇ）中に見いだされている。さらに、これらのセグメントの１つがＢ型肝炎ウィ ルスの表面抗原のセグメントに連結すると、これらのセグメントはＴ細胞によっ て不十分にしか認識されないが、抗ＨＢＶ表面抗原応答を太き（増幅することが 判明している（Ｄ、Ｒ，ＭｆＬｉｃｈら、”Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ　Ｔｏ　Ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ　Ａｎｄ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ 　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｉｍｅｄ　Ｂｙ　 Ａ　Ｓｉｎｇｌｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｉｔｅ−、Ｎａｔｕ ｒｅ、３２９巻、５４７〜５４９頁、１９８７年）。それ故に、ざらに別の好ま しい実施態様において、Ｂ細胞エピトープを含有する０ｓｐＡおよび○ｓｐＢの ポリペプチドを、ＨＢｃＡＧのセグメント、または強いＴ細胞エピトープを含有 する他の抗原に融合させて、高力価の抗体応答を起こすことができる０ｓｐＡも しくは０ｓｐＢのポリペプチドを含有する融合タンパク質が生成される。例えば Ｂ細胞エピトープを含有する０ｓｐＡポリペプチドは、Ｌあ１旺ｏｒｆｅｒｉの ０ｓｐＢタンパク質または鞭毛関連タンパク質の強いＴ細胞エピトープに融合さ せることができる。同様に、Ｂ細胞エピトープを含有する０ｓｐＢポリペプチド は、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの０ｓｐＡタンパク質または鞭毛関連タンパク 質の強い丁細胞エピトープに融合させることができる。あるいは、Ｔ細胞エピト ープを含有する０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープ を含有する他のＬ］且３Ａ部ゴｅｒｉタンパク質もしくはそのフラグメントに融 合させてもよい。同様に、非Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ　Ｂ細胞エピトープを 、本発明の強いＯｓｐＡもしくは０ｓｐＢのＴｍ抱エピトープなどに融合させて もよい。

本発明の好ましい実施態様では、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの複数の血清型変 異体由来のＢ細胞および／またはＴ細胞のエピトープを含有する０ｓｐＡおよび ／または０ｓｐＢのポリペプチドからなる融合タンパク質が構築されるが、上記 の各変異体はその０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチド内のエピトープの位 置もしくは配列が互いに異なっている。このような融合タンパク質は、本発明の 方法および組成物に用いると、広範囲のＬ厘ユ包コニ１菌株によって起こるライ ム病の予防、治療および診断に特に有効である。

０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドを含有する多量体タンパク質も本発明 の一部である。このタンパク質は、同じ分子内に、ランダムにまたは間にスペー サー（アミノ酸もしくはその外のもの）を置いて繰り返されている多数のＴ細胞 もしくはＢ細胞のエピトープまたはその組み合わせで構成されているものが好ま しい。多量体タンパク質の調製法は当該技術分野では公知である。

本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドおよびこれらを含有する融合 タンパク質と多量体タンパク質は、組換え法、化学的方法またはその組み合わせ によって調製することができる。

例えば、０ｓｐＡポリペプチドは、Ｌ蝕コ吏ｍ匡ム菌株Ｎ４０　（ＳＥＱＩＤ　 ＮＯ：３）の０ｓｐＡ遺伝子またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９のＤＮＡまたは上記 いずれかの誘導体を用いて組換え法で生成することができる。

ＯｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドとの血清型変異体およびその誘導体とを コードするＤＮＡは、さらに、例えばＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｊ菌株！ｉ４０ または同２５０１５の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列古来のオリゴヌクレオチドとＰＣＲを利用してクローン化することができ る。このようなりＮＡを発現させて、本発明の方法と組成物とに有用な他の０ｓ ｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドが製造される。オリゴヌクレオチドプライマ ー、および０ｓｐＡと０ｓｐＢの遺伝子内の保存され分岐したＤＮＡ配列は、本 発明の０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドに相同のＤＮＡ配列の領域を含有して いるＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉおよび関連するスピロヘータ由来の他の関連表 面タンパク質を単離しクローン化するのに使用できる。

本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドは、組換え法で生成された場 合、単細胞宿主内で発現することができる。当業者にとって公知のことであるが 、宿主内で異種のＤＮＡ配列の高い発現レベルを得るためには、選択された発現 宿主内で機能する転写および翻訳の発現制御配列に、機能し得るように連結され ねばならない。発現制御配列と主要遺伝子は、さらに細菌の選択マーカーと複製 起点を有する発現ベクターに含まれていることが好ましい。発現宿主が真核細胞 の場合、発現ベクターはさらに発現宿主に有用な発現マーカーをもっていなけれ ばならない。

本発明の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、シ グナル配列をコードしてもよいかまたはコードしなくてもよい。発現宿主が真核 性である場合、一般にタンパク質が真核宿主から分泌されて成熟するようにシグ ナル配列がコードされる方が好ましい。

アミノ末端のメチオニンは、本発明の発現された０ｓｐＡおよび０ｓｐＢおよび ポリペプチド上に存在していても存在していなくてもよい。末端のメチオニンは 、発現宿主によって切断されない場合、所望により、ａｉｓ的な方法によって化 学的に除去することができる。

広範囲の発現宿主／ベクターの組合わせを、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに 利用することができる。真核宿主に用いる有用な発現ベクターには、例えば、Ｓ Ｖ４０．ウシ乳頭腫ウィルス、アデノウィルス、サイトメガロウィルスおよびレ トロウィルス類由来の発現制御配列を含有するベクターがある。細菌宿主に用い るのに有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ　Ｅｌ、 ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体を含むＥ、　ｃｏｔ　ｉ由 来のプラスミド；広い宿主域のプラスミド例えばＲＰ４；ファージＤＮＡ類、例 えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９　；および他のＤＮＡファー ジ類が含まれる。

酵母細胞に用いるのに有用な発現ベクターとしては、２μプラスミドおよびその 誘導体がある。昆虫の細胞に用いるのに有用なベクターとしてはｐＶＬ９４１が ある。

さらに、多種類の発現制御配列、すなわちＤＮＡ配列に機能し得るように連結さ れたときにそのＤＮＡ配列の発現を制御する配列は、本発明のＤＮＡ配列を発現 させるために上記のベクター内で使用することができる。このように有用な発現 制御配列には、前記の発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現制御配列が含ま れる。有用な発現制御配列の例としては、例えば、ＳＶ４０もしくはアデノウィ ルスの初期プロモーターおよび後期プロモーター、ｌａｃ系、ｍ系、ＴＡＣ系も しくはＴＲＣ系、ファージλの主なオペレーターおよびプロモーターの領域、ｆ ｄコツータンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解 糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター例えばＰｂｏ２、酵 母α−交配系のプロモーター、および真核あるいは原核細胞もしくはウィルスの 遺伝子とその種々の組合わせの発現を制御する公知の他の配列がある。

好ましい実施態様において、０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドは、発現ベクタ ーｐＤｃ１９７−１２に挿入され、λｐｔプロモーターから転写される。この系 の転写は、熱に不安定なリプレッサーＣｌ８５７によって制御される。

他の好ましい実施態様では、本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチド をコードするＤＮＡは、融合タンパク質としてポリペプチドを高レベルで発現さ せる発現ベクター中にフレームで合うように挿入される。したがって、このよう な融合タンパク質は、ベクターの配列でコードされるアミノ酸と０ｓｐＡもしく は０ｓｐＢのポリペプチドのアミノ酸を含有している。０ｓｐＡおよび０ｓｐＢ のポリペプチドを融合タンパク質として発現させると安定性が増大しおよび／ま たは精製が容易になる。

多種類の単細胞宿主細胞が本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。これ らの宿主には、公知の真核宿主と原核宿主、例えばＥ、ｃｏｌｉＳＰｓｅｄｏｍ ｏｎａｓ、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ、　５ｔｒｅ　ｔｏ＋ｌ１ｃｅｓ、真菌、酵母な どの菌株、鋒剋並旦ｎ住■江肛ム（ＳＦ９）のような昆虫細胞、ＣＩ（Ｏ細胞と マウス細胞のような動物細胞、Ｃｏ５ｔ、ＣＯ３７、Ｂ５Ｃｌ、Ｂ５Ｃ４０およ びＢＭＴＩＯのようなアフリカグリーンモンキー細胞、ヒト細胞および組織培養 の植物細胞が含まれる。これらのなかでＥ、　ｃｏｔ　ｉのＡｇ３もしくはＪＭ １０９が好ましい。

すべてのベクターと発現制御配列が等しく充分に機能して本発明のＤＮＡ配列を 発現するわけではないということは勿論理解すべきである。またすべての宿主が 同じ発現系で等しく充分に機能するわけでもない。しかし、当業者は、不適切な 試験を行わずにかつ本発明の適用範囲を逸脱することなく、これらのベクター、 発現制御配列および宿主のなかから選択することができる。例えば、ベクターを 選択する場合には、ベクターは宿主内で複製しなけらばならないので宿主につい ては熟慮しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を制御する性能、 およびベクターがコードする池のタンパク質の発現、例えば抗生物質のマーカー も考慮しなければならない。

発現制御配列を選択する際には、各種の因子も考慮しなければならない。これら のなかには、例えばその配列の相対強度、配列の制御性、および特に潜在的な二 次構造について、その配列の本発明のＤＮＡ配列との適合性が含まれる。次のこ とを考慮して単細胞の宿主を選択しなければならない。すなわち、選択されるベ クターに対する宿主の適合性、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる生成物 の毒性、宿主の分泌特性、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドを正しく折 りたたむ宿主の性能、宿主の醗酵もしくは培養の必要条件、および本発明のＤＮ Ａ配列がコードする生成物の宿主からの精製の容易さを考慮しなければならない 。

これらのパラメータの範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を、醗酵または 例えばＣＨＯ細胞もしくはＣ０Ｓ７細胞による大規模な動物培養で発現する、種 々のベクター／発現制御配列宿主の組合わせを選択することができる。

本発明のＤＮＡ配列によってコードされる○ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチ ドを含有する分子は、醗酵物もしくは細胞培養物から単離し、次いで下記のよう な各種の通常の方法で複製することができる。すなわち、ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣな どを用いる順相もしくは逆相の液体クロマトグラフィー；アフィニティークロマ トグラフィー（例えば無機のリガンドもしくはモノクローナル抗体を用いる）； サイズ排除クロマトグラフィー；固定化金属キレートクロマトグラフィー；ゲル 電気泳動法などの精製法がある。当業者であれば、本発明の適用範囲を逸脱する ことなく最も適切な単離法と精製法を選択することができる。

その上に、本発明の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチドは、いくつかの化学 的方法で生成させることができる。例えばＲｌＢ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが最 初に発表した固相合成法”５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔ ｈｅｓｆｓ、　１．　Ｔｈｅ　Ｓｙｒ＋ｔｈｅｓｉｓ　Ｏｆ　Ａ　Ｔｅｔｒａｐ ｅｐｔｔｄｅ−、ＪＡｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、８３巻、２１４９〜２１５４ 頁、１９６３年を用いて製造できるし、または溶解状態で合成することができる 。ペプチド合成法の要約は、Ｅ、　ＧｒｏｓｓおよびＨ，Ｊ、　Ｍｅｉｎｈｏｆ ｅｒ、　４Ｔｈｅ　Ｐｅ’９目ｄｅｓ：　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　５ｙｎｔｈｅｓ ｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｏｆ　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　Ａｎｄ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｊｏｈｎ　Ｖ ｉｌｅｙおよび５ｏｎｓ、　１９８１年、ならびにＭ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、 　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓＯｆ’　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｓｐ ｒｊｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　１９８４年に記載されている。

一般に、これらの合成法は、１つ以上のアミノ酸残基を、成長中のペプチド連鎖 に逐次付加することからなる方法である。この反応を容易にするためにペプチド カップリング剤を用いることが多い。本願に記載した用途に用いるのに適したペ プチドカップリング剤の詳細については、Ｍ、　Ｂｏｄａｎｓｋｙの前記文献を 参照のこと。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基もしくはカルボキシル基は、 適切な選択的に除去できる保護基で保護される。リジンのような反応性の側鎖基 を宵するアミノ酸には異なる保護基が用いられる。ペプチド合成の分野で知られ 、通常の略語で知られている各種の保護基は、Ｔ、　Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｐｒｏｔ ｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８１年に記載されている。

本発明の他の実施態様によって、抗０ｓｐＡポリペプチド抗体および抗０ｓｐＢ ポリペプチド抗体を生成することができる。このような抗体類は、本発明の０ｓ ｐＡもしくはＯｓｐＢのポリペプチドと免疫学的に反応性の免疫グロブリン分子 またはその部分である。抗０ｓｐＡおよび抗０ｓｐＢのポリペプチドの抗体には 、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドを含有する融合タンパク質および多 量体タンパク質と免疫学的に反応性の抗体が含まれると解されるべきである。

本発明の抗０ｓｐＡポリペプチド抗体と抗０ｓｐＢポリペプチド抗体は、哺乳類 宿主にＢ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉを感染させるか、または哺乳類宿主を本発明 の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドで免疫することによって生成させる ことができる。これらの抗体はポリクロナールもしくはモノクロナールのいずれ でもよいが、モノクロナール抗体の方が好ましい。ポリクロナール抗体およびモ ノクロナール抗体の製法は当業者によってよく知られている。このような方法を 再検討するには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、上記文献、およびり、Ｅ、　Ｙｅｌｔｏｎら、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｚ、、　５０巻、６５７〜６８０頁、１９８１年 を参照のこと。

本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドとの免疫反応性の測定は、イ ムノプロ、トアッセイとＥＬｒＳＡｉ’５！−を含めて当業者にとって公知のい くつかの方法のいずれかによって実施することができる。

抗０ｓｐＡポリペプチド抗体および抗０ｓｐＢポリペプチド抗体は、Ｂ、ｂｕｒ 　ｄｏｒｆｅｒｉの感染によって起こるライム病の予防と治療に用いる組成物お よび方法に使用できる。さらに、これらの抗０ｓｐＡおよび抗０ｓｐＢポリペプ チド抗体は、防御エピトープを含有する０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチド を固定するのに利用できる。

本発明はさらに、本発明の各種の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリペプチド、およ び抗０ｓｐＡポリペプチド抗体と抗０ｓｐＢポリペプチド抗体とを、ライム病に 対して防御する性能についてスクリーニングする動物モデルを提供するものであ る。

以下に述べる本発明のスクリーニング法にしたがって、当業者は、特定の０ｓｐ Ａもしくは０ｓｐＢのポリペプチドまたは抗体がライム病の予防に有用であるか どうかを、不当な試験を行わずに決定できると解されるべきである。このスクリ ーニング法は下記の工程を包含する： （１）動物を０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのボリベチドまたは抗０ｓｐＡポリペプ チド抗体または抗０ｓｐＢポリリペプチド抗体で免疫し； （２）その免疫された動物に、Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉを接種し；次いで、 Ｈ）　Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉを接種した後、ライム病に対して防御する０ ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドまたは抗０ｓｐＡポリペプチド抗体また は抗０ｓｐＢポリペプチド抗体を選択する；工程。

Ｂ、ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉに感染し易い動物はこのスクリーニング法に有用に 利用できるが、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスが好ましい。なぜならば、このマウスは、感 染しやすいだけでなく、ヒトに発生するライム病に感染しやすいからである。従 って、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスにおいて感染と疾患の両者に対する応答の効力を試験 することができる。

動物を、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのボリペチドまたは抗０ｓｐＡポリペプチド もしくは抗０ｓｐＢポリペプチド抗体で免疫で免疫することは標準的な方法で実 施できる。この方法の詳細な考察については組圧−比仏工％　Ｌａｊ工工Ｕカニ …、前記文献を参照のこと。ポリペプチドを用いる場合は、薬学的に受容可能な アジュバント、例えば、完全もしくは不完全のフロインドアジュバント、ＲＩＢ Ｉ　（ムラミルジペプチド類）またはｌＳＣ０Ｍ　（免疫刺激性複合体）ととも に投与することが好ましい。このようなアジュバントは、ポリペプチドを局部に 析出させて隔離することによって急速に分散しないように防御するか、または宿 主を刺激してマクロファージとその免疫系の他の成分に対して走化性の因子を分 泌させる物質を含有し得る。免疫の計画には、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのボリ ベチドを数週間にわたって間隔をあけて２回以上投与するほうが好ましい。

本発明の０ｓｐＡおよびは０ｓｐＢのボリベチドまたは抗０ｓｐＡポリペプチド もしくは抗０ｓｐＢポリペプチドの抗体が本発明のスクリーニング法で有効であ ることが決定されたならば、ヒトおよび他の動物に巨体に発生するライム病を治 療もしくは予防するために、医薬組成物ならびに方法に治療上の有効量で使用す ることができる。

本発明の医薬組成物は、各種の通常のデポ−剤形態であってもよい。これらには 、例えば、錠剤、ビル、散剤、液体の水剤もしくは懸濁剤、リポソーム剤、カプ セル剤、坐剤、注射用および注入用の水剤のような、固体、半固体および液体の 投与形態が含まれる。好ましい使用形態は、利用する投与モードと予防法とによ って決まる。

このような投与形態に゛は、当業者に知られている薬学的に受容可能な担体とア ジュバントとを含有させてもよい。これらの担体およびアジュバントには、例え ば、ＲＩＢＩ、ｌＳＣ０Ｍ、イオ７交［ｔｌｌ’ｌ、アルミナ、ステアリン酸ア ルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩 のような緩衝剤、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物飽和脂肪酸 の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、塩化 ナトリウム、亜鉛塩のような塩類もしくは電解質類、コロイドシリカ、三ケイ酸 マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質およびポリエチレング リコールが含まれる。局所用もしくはゲルをベースにした形態に用いるアジュバ ントは、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート類、ポリオ キシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー類、ポリエチレングリ コールおよいヒトッパエニシダ（ｗｏｏｄ　ｗａｘ）のアルコール類からなる群 から選択することができる。

本発明のワクチンおよび組成物は、その免疫原性を増大するか、または患者内で のその耐性を改善するために、他の成分を含有させるかまたは調製中に他の処理 を行ってもよい。

一般的に、本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリベチドは、他の医薬として 重要なポリペプチド類（例えば、肝炎に対するワクチン）について採用している のと類似の方法および組成物を用いて患者に対して処方し投与することができる 。

抗０ｓｐＡポリペプチド抗体または抗０ｓｐＢボリベチド抗体からなる組成物は 、他の受動免疫療法に用いられ、当業者に周知のと類似の各種の投与形態および 処方で投与することができる。その上に、上記の抗体を、ジフテリア、シュード モナス外毒素、リンノ（ｒｉｃｉｎ）　Ａ鎖、ゲロニンなどのような毒素、また はペニシリン類、テトラサイクリン類およびクロラムフェイコールのような抗生 物質とカップリングさせるもが有利である。

薬学的に受容可能な投与経路としては、非経口、静脈、筋肉、病巣内もしくは皮 下の注射があるが、本発明の０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのボリペチドまたは抗０ ｓｐＡポリペプチド抗体もしくは抗０ｓｐＢのボリベチド抗体の組成物を投与す るのに利用できる。例えば、本発明のポリペプチドあるいは抗体は、患者に静脈 を通じて単回投与できる投与形態を含む薬学的に受容可能な投与形態で、または を椎傍および関節周囲を含めて筋肉内、皮下、皮肉、関節内、滑液口内、鞘内、 病巣内、骨膜内（ｐｅｒｉｏｓｔａｌｌｙ）に数時間、数日間、数週間もしくは 数ケ月間もの期間にわたって連続的に輸液することによって、または経口もしく は局所経路によって投与することができる。本発明の組成物は、単位投与形態で 通常患者に筋肉内投与することが好ましい。

０ｓｐＡおよび０ｓｐＢのポリベチドまたは抗０ｓｐＡポリペプチド抗体もしく は抗０ｓｐＢボリベチド抗体は、患者に対して、−回でまたは一連の治療にわた って投与してもよい。投与の最も有効なモードと投与計画は、免疫原性のレベル 、治療に用いる特定の組成物および／またはアジュバント、予想される感染症の 重症度と経過、以前の治療、患者の健康状態と免疫に対する応答、および治療医 師の判断によって決まる。例えば、ポリペプチドの免疫原性が高ければ高いほど 、投与量と免疫の必要回数が少なくなる。同様に、ポリペプチドがアジュバント とともに投与されると投与量と必要な治療回数が少なくなる。一般的に投与量は 、１０μ〜１００ｍｇの精製０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペチドからなり、 １００〜１０００μｇの投与量が好ましい。

抗０ｓｐＡポリペプチド抗体もしくは抗０ｓｐＢポリペチド抗体の投与量は一般 に０．５ｍｇ〜３．０ｇである。

本発明の好ましい実施態様では、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのボリベチドは、そ の免疫原性を増大させるためにアジュバントとともに投与される。有用なアジュ バントとしては、ＲＩＢＩとＩｓＣＯＭ、水酸化アルミニウムのような単純な金 属塩、および完全および不完全のフロイントアジ二バンドのようなオイルベース のアジュバントが挙げられる。オイルベースの７ジニバントを用いる場合、０ｓ ｐＡポリペプチドは通常、アジュバントとともに乳剤で投与される。

他の好ましい実施態様では、０ｓｐＡおよび／または０ｓｐＢのポリペプチドを 含有するタンパク質を発現するＥ、ｃｏｌｉが、Ｌ」肛対虹ム」が起こす感染症 と疾患に対して防御するためヒト以外の動物に経口投与される。例えば、本発明 の０ｓｐＡおよび／または０ｓｐＢのポリペプチドを発現する細菌の、口に合う 処方物が、野生のマウスもしくはシカ、または家畜が摂取しつくすように動物飼 料とともに投与される。このような細菌が消化されると、体液性と細胞性の両方 の免疫応答が誘発されるＯＪ、Ｃ，５ａｄｏｆｆら、−０ｒａｌ　Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ　Ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｃ ｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｏｔｅｃｔｓ　Ａｇａ ｉｎｓｔＭａｌａｒｉａ”、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、３３６−３３８頁、 １９８８年、およびＫ。

Ｓ、Ｋｉｍら、−１ｍ＋＊ｕｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｒ　Ｃｈｉｃｋｅｎｓ　Ｗｉ ｔｈ　Ｌｉｖｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＥｘｐｒｅｓＳｉｎｇ　 ｉｍｅｒｉａ　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ　Ｍｅｒｏｚａｉｔｅ　Ｒｅｃｏｙａｂｉ ｎａｎｔ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｉｎｄｕｃｅｓ　Ｐａｒｔｉａｌ　Ｐｒｏｔｅｃｔ ｉｏｎ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｃｏｃｃｆｄｉｓｆｓ”、Ｉｎｆ、ｌｌＩｗｍｕｎ、 、　５７巻、２４３４−２４４０頁、１９８９年参照のこと。

さらに他の実施態様によれば、本発明の抗０ｓｐＡポリペプチド抗体と抗０ｓｐ Ｂポリペプチド抗体、および０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドは、Ｂ、　ｂｕ ｒ■ｏｒｆｅｒｉの感染を検出する診断薬として有用である。その理由は、これ らのポリペプチドはＬ」肛肘ｏｒｆｅ旦が感染したヒトを含む動物内に産生され る抗体分子に結合可能で、およびその抗体は、　ｂｕｒ　ｄｏ　ｆｅｒｉまたは その抗原に結合できるからである。

このような診断薬はキットに入れることができるが、このキットには使用説明書 と他の適切な試薬をいれてもよい。本発明のポリペプチドまたは抗体には、検出 手段の標識をつけることができ、この標識によって、０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢ のポリペプチドは抗体に結合したときに検出することができ、または抗０ｓｐＡ もしくは抗０ｓｐＢのポリペプチド抗体はＢ、　ｂｕ■ｄｏｒｆｅ１に結合した 時に検出できる。

上記の検出手段は、フルオレセンインシアナアート（ＦｒＣ）、フルオレセンイ ンチオシアナアート（ＦＩＴＣ）などのような蛍光ａｔ識剤、西洋ワサビペルオ キシダーゼ（ＪＩＩＩＰ）　、グルコースオキシダーゼのうな酵素、γ線を発生 する１２５■もしくは５１　Ｃｒのような放射性元素、または試験溶液中に存在 する電子と遭遇するγ線を発生する陽電子を放出する放射性元素、例えばＩＩＣ ，ＩＳＯまたは１３Ｎであってもよい。

上記検出手段の連絡方法は当該技術分野ではよく知られている。例えばハイブリ ドーマによって産生されるモノクローナルの抗０ｓｐＡもしくは抗０ｓｐＢのポ リペプチド抗体の分子は、放射性同位元素を含有するアミノ酸を培養培地に混合 することによって、代謝により標識をつけることが可能であり、またはポリペプ チド類は、活性化された官能基を介して検出手段に接合もしくはカップリングす ることができる。

本発明の診断キットは、血清、血漿もしくは尿のような体液試料中の、ある量の Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉまたは抗Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ口抗体の存在 を検出するのに利用できる。従って、好ましい実施態様において、本発明の０ｓ ｐＡもしくはＯｓｐＢのポリペプチドまたは抗０ｓｐＡもしくは抗０ｓｐＢのポ リペプチド抗体の組成物は、一般に、水性媒体から吸着させることによって固体 支持体に結合させる。有用な固形マトリックスは、当該技術分野では公知であり 、架橋デキストラン；アガロース；ポリスチレン；ポリ塩化ビニル；架橋ポリア クリルアミド；ニトロセルローもしくはナイロンベースの材料；チツーブ；プレ ート；またはマイクロタイタープレートのウェルが挙げられる。

本発明のポリペプチドもしくは抗体は、溶液の形態または実質的に乾燥した粉末 、例えば、凍結乾燥された形態で診断薬として使用できる。

本発明の０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドおよび抗０ｓｐＡと抗０ｓｐＢのポ リペプチド抗体は、診断に現在利用できるものよりもはるかに一層特異的な試薬 を提供するので、偽陽性および偽陰性の試験結果のような落し穴を減らすことが できる。鞭毛関連タンパク質を含む池のＢ、　ｂｕｒ　ｏｒｆｅｒｉタンパク質 由来のエヒトープを含有する０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチド、およびこのよ うなポリペプチドに対する抗体を利用することは、上記の試薬を製造するのには 有利であることは、当業者にとって明らかなことである。

本発明の０ｓｐＡと０ｓｐＢのポリペプチドおよび抗０ｓｐＡと抗０ｓｐＢのポ リペプチド抗体、ならびにこれらのものからなる組成物および方法は、本発明の ０ｓｐＡもしくは０ｓｐＢのポリペプチドとアミノ酸配列もしくはコンホメーシ ョンが類似した表面タンパク質をもっているスピロヘータによって起こる他の感 染症の検出、予防および治療にも有用である。これらの他のスピロヘータには、 Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｈｅｒｍｓｉｉおよびＢｏｒｒｅｌｉａ　Ｒｅｃｕｒｉｅｎ ｔｉｓならびにＬｅｐｔｏｓｐｉｒａおよびＴｒｅｐｏｎｅｍａのスピロヘータ が含まれる。

本発明を一層十分に理解できるように、以下に実施例を示す。これらの実施例は 、例を示すことのみを目的とし本発明の適応範囲を限定するものではない。

（以下＃′白） 実施例Ｉ−ライム　のための　モデルのＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｌ＠染およ び／またはライム病に対する治療または防御に有効な免疫応答を示し得る能力を 調べるために、多種類の近文系マウスを試験することにより、本発明の０ｓｐＡ および０ｓｐＢポリペプチドおよび抗０ｓｐＡおよび抗０ｓｐＢポリペプチド抗 体をスクリーニングする動物モデルを開発した。マウスを選んだのは、操作のた めに有用な免疫学的、生物学的、および遺伝学的パラメータが豊富であるためで ある。

様々な系統のマウスについて、毒性の高いし」肛旦虹ムムの菌株？Ｊ４（ｌをい くつかの異なる経路により接種して、その感染の度合いを検査した。［Ｓ、　Ｗ 、　Ｂａｒｔｈｏｌｄら、Ｊ、　Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、、　１６２、　Ｉ）ｌＤ、１ ３３−１３８　（１９９０）コ。遺伝的に最大格差を有し、異なる■−２ハブロ タイブを表すマウスを選択した。これらの研究のために使用したマウスは、Ｊａ ｅｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＭＥ）より購入したＢａ１ｂ／ｃＢｙＪ、　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、　Ｃ５７ＢＬ／６ ＪＳＳＪＩ、／Ｊ、および！ＪＲ／Ｊ７ウス、ならびにＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖ ｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｒａｌｅｉｇｈ、　ＮＣ）より購入したＣ ＲＬ／：５ＫＨ（ｈｒ／ｈｒ）Ｂｒ　（無毛）であった。全てのマウスをＭｉｃ ｒｏ−１ｓｏｌａｔｏｒケージ（Ｌａｂ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｍａｙｗｏｏｉ ｊ、　ＮＪ）に入れ、自由にＢ　（Ａｇｗａｙ、　５ｙｒａｃｕｓｅ、　ＮＹ） および水を与えた。

先ず、改変されたＢａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ　（ＢＳＫ− １１）培地［Ａ、Ｇ、Ｂａｒｂｏｕｒら、Ｙａｌｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　Ｂ ｉｏｌ、Ｍｅｄ、、５７．　ｐｐ、５２１−２５　（１９８６）コにＬ」基１戯 Ｌ１０のＮ４０分離株を３４°Ｃで、計数によるおよび暗視野顕微鏡を使用して 血球計算盤上による測定により、生ｍ（らせん状の）をｍｌあたり約１ｘｌＯｇ 個の濃度まで増殖させた。

様々な系統のマウスに生後３日または３週間で１ｘｌＯ’から１ｘ１０８の範囲 の投与量のスピロヘータを、腹腔内、皮肉、胃内、および鼻腔内接種により接種 した。３０日後、マウスを二酸化炭素ガスにより層殺し、心臓穿刺により放血さ せた。

各マウスから様々な器官を取り出して培養してＬ」肛組虹ｆｅｒｉに感染させた 。１ｍｌのＢＳＫ　１１培地で組織をホモジナイズし、次に０．５ｍｌのホモジ ネートを７ｉ１のＢＳＫ　１１培地に入れ２週間培養した。

感染したマウスの脳、肺、肝臓、心臓、肺臓、腎臓、および四肢すべての関節（ 青、肘、毛根、中手、股、膝、足板、中足、および指節）を、これらの組織を中 性緩衝ホルマリン液（ｐＨ７，２）に浸漬固定することにより組織病理学的に検 査した。さらに、関節を脱塩して処理し、通常の組織学上の技術により組繊をヘ マトキシリン−エオシンで染色した。

また、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により感染マウスの血清を検査し て、抗３．　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ抗体を調べた。このアツセイにおいて、抗 原としてスピロヘータを以下のように調製して使用した。６５０ｍ１のし］肛且 匹ハム菌株！１４０をＢＳＫ　［１培地にて３３°Ｃで２週間培養して最大密度 に増殖させた。次に、スピロヘータを１５℃で２０分間、１２．　ＯＯＯｒｐｍ でＢｅｃｌｖａｎ　Ｊ４遠心機にかけてベレット化した。このペレットをリン酸 緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、最後に１０ｍ１のＰＢＳに懸濁した。

次にスピロヘータを１５秒間隔で３分間水中で超音波処理した。

次に、上述のように遠心機にかけ、上澄み液を０．４５ミクロンのフィルターで 濾過した。分光測定により濾液のタンパク質濃度を測定した。

ＥＬＩＳＡは、上述のように１０μｇ／ｍｌの濃度の抗原０．１ｍｌでツー）　 Ｌ７’：Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、のマイクロタイタブレートを使用する標準 方法により行われた。第２の抗体を標識してペルオキシダーゼヤギ抗マウスＩｇ Ｇ　（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）とした。

これらの研究の結果、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを、ｌＸｌ０’から１ｘｌＯ８の範囲 の全ての投与量においてＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４０に皮内感染す ると、ヒトのライム病に著しく類似した疾患の臨床的兆候を示すことが分かった 。生後３週間で皮肉接種したマウスでは、２週間以内にスピロヘータ血症および 重度の関節炎が見られた。ＥＬＩＳＡの結果、Ｃ３Ｈ／Ｂｅマウスは高レベルの 抗Ｂ、　ｂｕ■ｄｏｒｆａ旦抗体を有し、そしてスピロヘータは接種後３日から ５日で肺臓から培養し得ることが分かった。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスは、接種後少く とも１２ケ月間は感染が維持され、陽性スピロヘータ肺臓培養物、血清変換、お よび疾患との間には１００％の相関性があった。さらにこの結果により、関節炎 および心臓炎は同じ感染投与量レベルで生じ、血清変換は能動感染したマウスに おいてのみ生じることが分かった。従って、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスをヒトのライム 病の動物モデルとして選択した。この理由は、このマウスが、１）少量の微生物 を皮内投与することでＬｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉに感染しやすい、２）多糸にわ たるおよび永続的な感染を発現し、そして３）多関節炎および心臓炎を１００％ の確率で発現させる十分な免疫担当成体宿主であるためである。

これらの特徴はＣ３Ｈ／）Ｉｅマウスに特異的であり他の周知の動物モデルでは 可能ではない。

実施例１ｌ−Ｃ３ＨＨｅマウスの ニューシーラント白色ウサギに、０．１４．２１、および４９日目に静脈注射に よってｌＸｌ０’個の生菌Ｌユ旺肢扛ｎ且を接種することにより、ポリクローナ ルウサギ抗Ｂ、　ｂｕ工Ｃ１ＣＩＬヨＮ４０抗血清を産生じた。１週間後にこの 動物を出血死させて血清を取り出した。次に６週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを、こ のポリクローナルウサギ血清の１＝５の希釈液０．１ｍｌで受動免疫した。次に １７時間後に、受動免疫したマウスおよび正常ウサギ血清で免疫した対照マウス を、上述のように皮肉接種により１ｘｌＯ’個のＬ敗」重工匡ムＳチャレンジし た。２週間後にマウスを層殺して、上述のように血液、肺臓、および関節を分析 した。

対照マウスは尾根関節にスピロヘータ血症および重度の関節炎を発現していたが 、全ての受動免疫マウスでは関節炎は防御され、またスピロヘータは血液または 膵臓から培養され得なかった。これらの研究により、Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ 亘酸株Ｎ４０に感染したウサギは我々のインビボの感染アッセイにおいてＬｂｕ ｒｄｏｒｆｅｒｉ感染を中和するのに有効な抗体を含有する抗血清を産生ずるこ とが分かった。

次に、Ｃ３■／Ｈｅマウスが感染Ｃ３Ｈ／＋ｌｅマウスのポリクローナル抗Ｂ、 　ｂ肛Ｈ虹ハ皿血清の移入によりライム病に対して受動免疫され得るかどうかを 決定した。３週齢の健全なＣ３Ｈ／）Ｉｅマウスまたはニューシーラント白色ウ サギからなる群に、完全フロインドアジュバント中の１ｘ１０７個の非生１！Ｉ Ｂ、ユ肛ロ虹ム旦菌株Ｎ４０を皮下接種し、１０日後に不完全フロインドアジュ バント中のｌＸ１０７個の非生菌し］肛底虹包且菌株Ｎ４０で追加免疫した。

次に、免疫したマウスまたはウサギから血清を採取し、これをリン酸緩衝生理食 塩水（ＰＢＳ）で１＝５に希釈した。

５匹の非感染Ｃ３Ｅ［／ｌｌｅマウスからなる群にＯ，１ｍｌの血清を皮肉注射 した。対照群のマウスは正常なマウスまたはウサギの血清で免疫した。免疫の１ 日後にマウスの体の反対側に１ｘｌＯ’個のし」肛鳳虹ムム菌株Ｎ４０または菌 株Ｂ３１を皮肉接種した。５または１４日後、マウスを二酸化炭素で安楽死させ た。次に、各マウスから膵臓の約９５％を取り出し、ホモジナイズし、このホモ ジネートの約５０％を７ｍｌのＢＳＫＩ！培地に置いた。また、心臓全採血によ り血液を取り出し、血液のＯ，１ｍｌを７ｍｌのＢＳＫ　Ｉ＋培地で培養した。

次に肺臓および血液培養物を共に上述のように３３°Ｃで２週間インキュベート した。暗視野顕微鏡により培養物を検査してスピロヘータの有無を調べた。２０ 倍の高倍率で視野を入念に調べた。また、感染後１４日目の心臓および関節を組 織病理学的に検査した。

表１に示すように、受動免疫マウスのいずれもスピロヘータ培養物に陽性を示さ なかったが、正常なマウスまたはウサギ血清で免疫した対照マウスの全てに少く とも１から１００個のスビロヘータが検出された。さらに、ウサギ血清の防御効 果は１：５００の希釈液においても維持された。

受動免疫はまた、感染の防御に寄与するだけでなく、疾患の防御にも寄与する。

これらの研究により、このマウスモデルでは受動免疫は防御効果があるだけでな く、この防御は系統を超えて有効であることが分かった。これらの研究によりま た。　、　ｂｕ　ｄｏｒｆｅ且で免疫したＣ３Ｈ／Ｂｅマウスにおいては、免疫 されていないＣ３■／Ｈｅマウスのライム病を防御し得る免疫応答を生じること が可能であることも分かった。

（以下余白） 表ｒ ″　常巳　１上　゛°峠 彦表巧・ ｎ＋ｏｔ’：テでシーツ′／ ｑ、−ｔフ久　ＬＩＬＬＩ　ＬＬ　！ｉＪＬ　ｕＢ　１４”−狼体滑傳東夾） ５３１１”テｆレソブＬβてフ入 ＆葎１嶋駁次） 参陽性培養物の数量／培養物の全数量として表す。

傘本全ての対照動物において血液および肺臓培養物のいずれも陽性であった。

実施例１１１−Ｎ４００ｓＡ゛　のクローニングＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒ’ 菌株Ｎ４０の０ｓｐＡ遺伝子をポリメラーゼ鎖反応によりクローニングした［Ｈ ，Ｅｒ１ｉｃｈら編、−Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ −、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、２５−２９ 　（１９８９）］。スピロヘータを１０ｍ１のＢＳＫ　ＩＩ培地で３４℃で７日 間増殖し、次にＢｅｃｋｍａｎ　Ｊ４遠心分離機で３０分間１６にで遠心分離す ることにより採取した。ゲノムＤｌｆＡを、Ｆ、　ＨｙｄｅおよびＲ，Ｊｏｈｎ ｓｏｎ、　−Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｈｉｐ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｌｙ ｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ　Ｔ。

Ｂｏｒｒｅｌｉａ、■」ｙ徂ｕ、　Ａｎｄ　ホ肚坦■ｎ−，ｓｐｐ、　Ｊ、　Ｃ １１ｎ、　Ｍｉ旺ｏ、、　２０．　ｐｐ、１５１−５４　（１９８４）に記載の ように、ＳＤＳ細胞溶解およびフェノール−クロロホルム抽出により精製した。

エール大学のオリゴヌクレオチドおよびタンパク質合成センターから、増幅にお けるプライマーとして使用するための、一対のオリゴヌクレオチドを得た。オリ ゴヌクレオチド配列は、Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株Ｂ３１か菌株側３１ ０ｓｐＡ遺伝子配列に基づいた［　Ｓ、　Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ　ｂ、Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｏｆ　ＬｉｎｅａｒＰｌａｓｍｉｄ−Ｅｎｃｏｄ ｅｄ　Ｍａｊｏｒ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　０ｓｐＡ　Ａｎｄ　 ０ｓｐＢ、Ｏｆ　丁ｈｅ　Ｌｙｒｉｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈａｅｔ ｅ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ”、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏ、 、　３．　ｐｐ、４７９−８６　（１９８９）］　ｏ　この対の第１のメンバー はＢ３１０ｓｐＡ遺伝子のコード配列の最初の１７個のヌクレオチドに対応し、 またＥｃｏＲ１部位およびリポソーム結合部位を５゛末端に含みクローニングを 促進させた（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１）。

この対の第２のメンバーはＢ３１０ｓｐＡ遺伝子の最後の９個のアミノ酸に相補 的なもので、ＢａｍＨ１部位を含み、同様にクローニングを促進させた（ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ：　２）。これらオリゴヌクレオチドの配列を図１に示す。オリゴ ヌクレオチドは本質的には以下のように５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム上で 脱塩することにより精製した。オリゴヌクレオチドを０．４ｉ１のｄＨ２０に溶 解し、次に０．２１をＨ２Ｏで平衡化させた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム にかけた。２００μｍ毎の画分を２．５ｍｌのＨ２Ｏを添加することによりカラ ムから溶出し、分光測定法によりアッセイを行いＤＮＡを測定した。オリゴヌク レオチドの大部分は第２の画分て溶出した。

次に各オリゴヌクレオチドのプライマー２０μＭ、上述のように調製された１ｎ ｇ／μｌのＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｊ鋳型ＤＮＡ　１０μｍ、　ＴａｑＤＮ Ａポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）　０．５μｍ、１． ２５ｍ１ｌｌｄＮＴＰｓを１６μｌ、１０ｘ緩衝液（５００１ＭのＭＣＩ、１０ ０　ｍＭのトリス−ＥＣ１ｐＨ８，３，１５ｍＭのＭｇＣｈ）を１０μｌ、およ びｄＨ２０を１００μｌまで含有する１００μｍの反応液においてＰＣＲを行っ た。最初は鋳型ＤＮＡヲ９４°Ｃで変性させ、次に４０℃のアニーリング温度お ヨヒ７２°Ｃのエクステンンヨン温度でＰＣＲを３０サイクル行った。

ＰＣＲ増幅された０ｓｐＡ遺伝子を１％ゲル上で７ガロースゲル電気泳動により ゲノムＤＮＡから単離し、電気溶出によりＤＥＡＥ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　 ＆　５ｃｈｕｅ１１．　Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）上に精製した。５００１のＬＭ　 ＮａＣＬ中で、膜を５５℃で１時間インキュベートすることにより、精製された ＤＮＡを膜から溶出した。溶出されたＤＮＡを次にエタノール沈澱させた。次に ＤＮＡをＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨｌにより一部消化させ（予想される内部Ｅｃ ｏＲ１部位での開裂を避けるため）、上述のようにアガロースゲル電気泳動およ び電気溶出により全長を増幅した遺伝子を再精製した。次にＥｃｏＲｌ−Ｂａｍ Ｈ１フラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉｉ、Ｄａｎｂｕｒｙ、　ＣＴ）を使用して１５℃で一夜、ＥｃｏＲｌ、Ｂ ａｍＦ１１開裂発現ベクターｐＤｃ１９７−１２　（Ｗ、　Ｆｉｅｒｓ、　Ｕｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｈｅｎｔの御好意により入手）に結合させた。この 結合混合物をフェノール／りロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、５０ μｍのＮ２０で再懸濁した。

ｐＤＣ１９７−１２を発現ベクターとして選択した理由は、これがバクテリオフ ァージλＰＬプロモーターおよび易熱性ファージλｃ１８５７リプレツサーを含 有しているためであり、後者はえＰＬプロモーターからの転写を完全に抑制し得 る。ｃ１８５７リブレツサーは３０℃で活性であり、４２℃で不活性であるため 、ＰＬプロモーターにより制御される遺伝子の誘導発現が可能となる。

ｐＤＣ１９７−１２を含有する細菌を３０℃で増殖させることにより、大量のプ ラスミド含有細菌が潜在的に有毒なまたは増殖を阻害するタンパク質を産生ずる という懸念なしに得られ得る。

ｐｏｃ　１９７−１２はまた、テトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、これによ りテトラサイクリンを含有するアガロースプレート上に、陽性の形質転換体が選 択され得る。

結合混合物を、以下に述べるようにエレクトロポレーションを使用して応答能の あるＥ、　ｃｏｌｉｃ株Ａ８９　（Ｆ、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｈａｒｖａｒｄ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの御好意により入手）に形質転換した。先ず１リツトル のＬ−ブロスで０Ｄ６ｉ１ｉ１が０．６となるまで培養することにより応答能の あるＡ８９細菌を調製した。次に細胞を１５分間、４０００　ｒｐｍでペレット 化し、０．５リツトルの冷たいｄＨ２０で再懸濁した。再び、ペレット化し、そ して０．５リツトルの冷たいｄＨ２０で再懸濁した。ペレット化し、そして１０ ＋ａｌの２０％グリセロールで再＠濁し、最終的にペレット化し、そして２ｍｌ の１０％グリセロールで再懸濁した。次に４０μｌの応答能のある細胞を、エレ クトロポレーシヲンキュベット中で５μｌの結合ＤＮＡと混合した。静電容量が ２５マイクロＦおよび抵抗２００オームで設定されたＢｉｏＲａｄ　（Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、　ＣＡ）のエレクトロボレーターにより２゜５に’／で細菌をエレク トロポレーションを行った。次に懸濁液を１　ｍｌのＳＯＣブロス［１リツトル あたり２グラムのバクトドリブトン、５グラムのバクトイ−スト、０．５グラム のＮａＣ１，および２０ｍＭのグルコース］に移し、３７℃で１時間攪拌してイ ンキュベートし、１５μｇ／ａ　１のテトラサイクリンを含有するし一プロスプ レートにプレートした。

実施例ＩＶ　−ｍか′　゛れたＯｓ　Ａ’　（Ｄ１９７−ＯｓｐＡ−Ｎ４０プラ スミドを含有するコロニーを以下のように同定した。コロニーを取り出しテトラ サイクリンを含む２會１のＬ−ブロスに置き、３０℃で一夜攪拌してインキュベ ートした。

次に細胞をペレット化して２００μｌのＧＴＥ緩衝液（５０ｍＭのグルコース、 ２５＋ａＭのトリス、１０■ＭのＥＤＴＡ）で再懸濁し、室温で１０分間インキ ュベートした。次に０．２ＮのＮａＯＨおよび１．９％のＳＤＳを含有する溶［ ４００μｍを添加して再び１０分間インキュベートした。

次に３００μｍの７．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加して氷上で１０分間インキュ ベートした。１２．　ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を取り 出し、５００μｍのインプロパツールを添加することにより上澄み液からＤＮＡ を沈澱させた。次にＤＮＡをＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨｌにより完全に消化させ 、アガロースゲル上で電気泳動した。０ｓｐＡ遺伝子の配列は配列キット（Ｕ、 Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ。

Ｃ１ａｖｅｌａｎｄ、　Ｏ）りおよびエール大学で合成されたオリゴヌクレオチ ドブライマーを使用して決定した。

図１に示すように、０ｓｐＡ遺伝子は長さが８１９個のヌクレオチドであること が分かった。Ｎ４００ｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３） を菌株Ｂ３１の０ｓｐＡ遺伝子の配列と比較することにより、Ｎ４００ｓｐＡが 、ヌクレオチド１１７および４４６に対応する２つの部位でＢ３１０ｓｐＡと異 なることが分かった。これらの相違の結果として、Ｎ４０からのＯｓｐＡタンパ ク質（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４）は、アミノ酸３９ではりシンではなくアスパ ラギンを、そしてアミノ酸１４９ではグリシンではなくグルタミン酸を有する。

またＮ４００ｓｐＡ遺伝子の配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　３）をＺＳ７菌株か らのＯｓｐＡ遺伝子の配列と比較した［Ｂ、　Ｗａｌｌｉｃｈら、”Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　Ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｉ ｒｉｇ　Ｔｈｅ　０ｕｔｅｒ　５ｕｒｆａｃｅ　ＰｒｏｔｅｉｎＡ　（ＯｓｐＡ ）　Ｏｆ　Ａ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｏｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｆ 　ｌ５ｏｌａｔｅ、”Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１７．　ｐ、８８６４ 　（１９８９）コｏ　Ｎ４００ｓｐＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３）はヌク レオチド４９０でＺＳ７と異なり、これによりアミノ酸１６４ではセリンではな くグリシンが生じる。これらの比較により、０ｓｐＡは異なるＢ、　ｂｕｒ　ｄ ｏｒｆｅｒｉ分離株の間で十分保存されることが示唆される。

実施例Ｉ１１で述べたように、オリゴヌクレオチドブライマーおよびＰＣＲを使 用してＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４０カラ０ｓｐＢオヨヒ鞭毛関連タ ンパク質に対する遺伝子をクローニングした。０ｓｐＢ遺伝子を増幅するために 使用されたオリゴヌクレオチドブライマーは（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　５）　５ ’　ＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡ 　３°および（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６）　３’　ＧＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡ ＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＣＣＴＡＧＧＴＣＴ　５°であった。これら のオリゴヌクレオチドの配列はＢ、　ｂｕｒ■ｏｒｆｅｒｆ菌株Ｂ３１からの周 知のＯｓｐＢ遺伝子配列に基づ（［Ｓ、　Ｂｅｒｇｓｔｒ−ら、前出］、４１ｋ ｄの鞭毛関連タンパク質を増幅するために使用されたオリゴヌクレオチドブライ マーはぐＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　７）　５°ＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴ ＴＴＡＴＧＡＴＴＡＴＣＡＡＴＣＡＴＡＡ　３’および（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： 　ａ＞　３’　ＡＣＡＡＡＡＣＡＧＴＡＡＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡ ＧＡ　５°であった。これらのオリゴヌクレオチドの配列はＢ、　ｂｕｒ■ｏｒ ｆｅｒｉ菌株Ｂ３１からの周知のフラゲリン配列に基づ＜　［Ｇ、Ｓ、　Ｇａｓ ｓｍａｎら、−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｏｆ　Ａ　Ｇｅｎｅ 　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｂｏｒｒｅｌｔａ　Ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ　ｆ ｌａｇｅｌｌｔｎ−、Ｎｕｃ、−Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ、、　１７．　Ｉ）Ｉ）、　 ３５９０　（１９８９）］　ｏ次に増幅されたＮ４００ｓｐｓおよび４１　ｋｄ 鞭毛関連タンパク質遺伝子を単離し、上述のようにｐＤＣ１９７−１２へとクロ ーニングした。

実施例Ｖ＋−のＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ　ンパク　のクローニングλＺＡ Ｐ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）の発現ライブラ リーを構築することによりＢ、　ｂｕｒ■ｏｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４０からの追加の 遺伝子をクローニングする。ライブラリーを構築するには注射器に繰り返し通過 させることにより無作為に剪断され、ＥｃｏＲ１メチラーゼでメチル化された。

　１０マイクログラムのし」ユ」ｄｏｒ４ｅｒｉケノムＤＮＡを使用する。次に ＥｃｏＲ１リンカ−をゲノムＤＮＡフラグメントの末端に結合させ、これらをλ ＺＡＰベクターに挿入する。このベクターはＥｅｏＲ１部位でＤＮＡ挿入物をｌ ａｃ融合融合タンパ色質て発現する。製造業者の指示書に従って、ＩＰＴＧに浸 漬したニトロセルロースフィルター上でプラークをインキュベートすることによ り、ライブラリーの組換えファージを誘導して１ａｃ−Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆ ｅｒ’融合タンパク質を発現させる。

融合タンパク質をフィルターに結合し、次にこれらを上述のようにＢ、　ｂｕｒ 　ｄｏｒｆｅｒｉに感染したＣ３Ｈ／Ｈｅマウスのポリクローナル抗Ｂ、　ｂｕ ｒ■ｏｒｆｅｒｉ抗血清と一緒にインキュベーションすることによりスクリーニ ングする。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス第２抗体が引き続いて結合 することにより第１抗体の結合を検出する。第１抗体の結合部位で採取されるア ルカリホスファターゼは、当該分野で周知の技術を用いてＢＣＩＰおよびＮＢＴ にさらすことにより検出される。

１ａｃ−Ｂ、　ｂｕ　ｄｏｒ４ｅｒｉ融合タンパク融合タンパ石質ラークを同定 した後、製造業者の指示書に従ってヘルーパーファージに感染させることにより 、λＺＡＰファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）粒子からｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ プラスミドを切除する。この結果、タンパク質またはそのフラグメントをコード する別のいくつかのし」肛肢虹ム坦遺伝子が得られ、これらはポリクローナル抗 し」肛肢虹ム坦抗血清により認識される。

実施例Ｖｌｌ　−Ｏ５Ａ　のポリペプチドＮ４Ｏ−Ｏ５Ａの０ｓｐＡ−１９７− Ｎ４０プラスミドを育する組換えＡ８９＠菌を誘導して、組換えＮ４００ｓｐＡ タンパク質（Ｎ４Ｏ−ＯｓｐＡ）を３０℃で一夜３　ｍｌのＢＳＫＩ＋培地にて 培養し、次に４２℃で２時間誘導することにより発現させた。次に細胞を濃縮し て０Ｄ６ｉｌｉ１を４．０とし、濃縮細胞１００−５００μｍを５分間沸騰させ た。次に沸騰された細胞５０μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動 し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。誘導された培養物の抽出物のレ ーン中に１本の特異なバンドが存在し、これは全細菌タンパク質の約５％を占め た。この特異的なバンドは３１　ｋｄで移動し、組換え０ｓｐＡタンパク質に想 定されるサイズであった。

ゲル上のこの新しいバンドがＮ４Ｏ−ＯｓｐＡであるかどうかを決定するために 、以下の細菌タンパク質の免疫プロットを行った。先ず細菌を誘導してＮ４０〜 ０ｓｐＡを発現させ、上述のように沸騰させた試料を電気泳動させた。次にＢｉ ｏＲａｄの電気的転移装置を使用して６０ボルトで２．５時間電気転移を行うこ とにより、タンパク質をニトロセルロースストリップ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　 ＆　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ、　Ｎ、Ｈ，）に移した。次にストリップを 、上述のように調製された抗Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒ’免疫マウス血清の１ ：１００の希釈液により、または後述の全ての生！ＪＦＢ、　ｂｕｒ■旺ハ…で 免疫したマウスの肺臓細胞融合により調製された抗し］肛且虹皿モノクローナル 抗体ＶＩＩＩＣ３，７８と反応させた。ストリップを室温で１時間インキュベー トし、ＰＢＳで室温で１時間洗浄し、アルカリホスファターゼ標識のヤギ抗マウ スＩｇＧ　（ＴＡＧＯ）の１＋　５２００希釈液と一緒にインキュベートした。

そして、ニトロブルーテトラゾリウム５−ブロモ４−クロロ−インドリルホスフ ェートで発現させた。免疫プロ、トの結果、Ｌ」五■で発現した特異な３１　ｋ ｄのバンドは、マウスの血清およびモノクローナル抗体で染色され、これが８４ ０−ＯｓｐＡであると明確に同定された。

Ｅ、　ｅｏｌｉの浸透圧ショック抽出物による実験Ｅ　Ｈ，Ｃ，Ｎ８ＬＩおよび り、Ａ、　Ｈｅｐｐｅｌ、　”Ｔｈｅ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　Ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ 　Ｆｒｏｍ　ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｔ　Ｂｙ　Ｏｓｍｏｔｉｃ　５ｈｏ ｃｋ　Ｄｕｒｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｏｆ　５ｐｈｅｒｏｐｌａ ｓｔｓ”、　Ｌ一旦鋤工−匹ｌＪ１．２４０．　ｐｐ、３６８５−３６９２　（ １９８５）］　を行うことにより、組換えＮ４Ｏ−ＯｓｐＡタンパク質が少くと も一部は周縁細胞質腔に局在していることを決定し得た０また組換えタンパク質 をＩｍｍｏｂＨｏｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｂｕａｌｌ、　Ｋｅｅ ｎｅ、　ＮＨ）への転移により単離し、このアミノ末端の配列分析をエール大学 のタンパク質化学部に委託した。このタンパク質の最初の１５個のアミノ酸の配 列は、Ｎ４００ｓｐＡ遺伝子のＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３）から予 測される配列に対応し、これによりＮ４Ｏ−ＯｓｐＡが組換え細菌で発現してい る証拠がさらに提供された。

実施例１／ＩＩＩ　−Ｎ４Ｏ−Ｏｓ　を　ル、　ｃｏ　ｔ＋：Ｊ：　？”＋スノ 腹監免左 次にＮ４Ｏ−ＯｓｐＡがライム病を防御する免疫応答を示し得るかどうかを決定 した。上述のように３ｍｌの細菌培養物においてタンパク質の発現を誘導した。

次に細胞をベレット化し、これらを３ｍｌのＰＢＳにて再懸濁し、再びベレット 化し、そして１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。次にＯＤ６［１１１で分光測定によ り細胞数を測定し、細胞をＰＢＳにて５ｘｌＯ７／ｍｌに希釈した。

次に５匹のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスからなる群にＮ４Ｏ−ＯｓｐＡを発現する５ｘｌ Ｏ６個の生菌Ｅ、　ｅｏｌｉを１ｍｌ、１週間に一回３週間にわたって腹腔内注 射した。対照として、ベクターｐＤｃ１９７−１２により形質転換された［：、 　ｃｏｌｔを５匹のマウスに注入した。４週間目にマウスを出血死させ、上述の ように免疫プロットを調製して、マウスがＮ４Ｏ−ＯｓｐＡに対する抗体を合成 しているかどうかを決定した。このプロットでは、全ての熱死させたＢ、　ｂｕ ｒ　ｄｏｒｆｅ口菌株Ｎ４０のタンパク質抽出物を使用し、タンパク質をニトロ セルロースストリップに移し、そしてストリップを上述のように能動免疫したマ ウスの血清の１　＋　１００希釈液と一緒にインキュベートした。最初の注入の ４週間後までには、能動免疫した動物のすべてにＮ４Ｏ−ＯｓｐＡに対する強い 免疫応答が現れた。

抗体応答は１：１０００の希釈液に対する免疫プロットにより検出され得た。

第５週開目にマウスをＬ］肛■虹ムユ菌株Ｎ４０でチャレンジして、能動免疫が Ｌ］肛対虹ム皿の様々な菌株に対して防御免疫応答を示すかどうかを決定した。

マウスを、上述のように！！２したＩｘｌｌ）’（ＩＮのＢ、　ｂｕｒ’　ｄｏ ｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４０．　Ｂ３１、またはＣＤ１６で皮肉感染させた。次にマウ スを５または１４日後に層殺し、上述のように感染および疾患を調べた。

表ＩＩに示すように、血液および膵臓の培養物から測定した限りでは、Ｎ４Ｏ− ＯｓｐＡを発現するＥ、　ｃｏｌｉで能動免疫したマウスは、試験されたし」肛 対ｏｒｆｅユのすべての菌株による感染から完全に防御された。これに反して、 ０ｓｐＡ遺伝子を有しない親プラスミドを有するし」立■で免疫した対照マウス は直ちに感染を発現した。繰り返し行われた実験でも同じ結果を示した。さらに 、免疫した動物の大部分は１４日で臨床的疾患から防御された。（カイニ乗ｐ≦ ０．０５）表！冨 本陽性培養物の数量／培養物の全数量として示す。

実施例１ｘ−シたマウスの　゛による 二１工些叉ｌ免左 次にＮ４Ｏ−ＯｓｐＡを発現する）：、　ｃｏｌｔで能動免疫したマウスの血清 でマウスを受動免疫することがＢ、　ｂｕｒ■虹葺ユによる感染を防御し得るか どうかを決定した。上述のように、能動免疫したマウスの希釈しないまたは１． ５に希釈した血清０．１ｍｌでマウスを受動免疫した。対照として、正常なウサ ギ血清を１：５に希釈して使用した。翌日、マウスにＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ ｒｉ菌株Ｎ４０を接種して、上述のように感染５日後に血液培養物を調べた。

表ＩＩ＋に示すように、能動免疫したマウスは５日で感染から完全に防御された 。これは０ｓｐＡで能動免疫したマウスの血清が、後のＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒ　 ｅｒ’による感染からの防御も十分に提供し得ることを示唆する。

五■ ■力　えｌ）　−９ミ〕μシｉ（ｒリ　置傘陽性培養物の数量／培養物の全数量 として示す。

実施例Ｘ　−Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉモノクローナル　による二１エユｉ ！主座 当該分野で周知の方法により、Ｌユ旺対０ｒｆｅｒｔ菌株Ｎ４０に感染したマウ スの膵臓細胞をマウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８　ミエローマ細胞へ融合させることによ り抗Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ　ｒモノクローナル抗体を調製した。次にモノク ローナルのアイソタイプを決定し、受動免疫のために次の４つのタイプを選択し た。すなわち、ｖｕ＋ｃ３．７ｇ　（補体結合１ｇＧ３）　、ｌＧ１２．５７　 （非補体結合１ｇＧ４）、１１１［１２，３３（補体結合１ｇＧ２ａ）　、およ びＶＩＡＩ２．７１　（補体結合１ｇＧ２ａ）である。

Ｇ３）！／Ｈｅマウスを、希釈されていないモノクローナル抗体産生細胞の上澄 み液０．１＋ａｌで免疫し、翌日、上述のようにこれらの動物にし］■剋鉦ムユ 菌株Ｎ４０を接種した。５ヨ後、血液試料を検査して感染を調べた。表＋Ｖに示 すように、補体結合１８Ｇ３モノクローナル抗体ＶＩＩＩＣ３，７８による免疫 は、完全な感染からの防御を示したが、非補体結合１ｇＧ１モノクローナル抗体 による免疫は防御を示さなかった。２個のＩｇＧ２ａモノクローナル抗体は中間 的な防御、すなわちいく種類かの動物には防御を示した。これらの研究により、 Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉｇ染に対する免疫はモノクローナル抗体による受 動免疫により得られ得ることが示される。ＶＩＩＩＣ３，７８をブダペスト条約 の規則の下で１ｎ　Ｖｉｔｒａ　Ｉｎｔｒｅｎａｔｉｏｎａｌ、　Ｉｎｃ、、　 Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託した。この寄託物は受託番号Ｉ ＶＩ　１０２５６として受け入れられた。

長ＸＶ 七ノフロー丁１し□宅な、１手　０ａ、三（ξ、権〕ｉ二、稗嗜Ｌ ＩＧＩＣ３−ＶＨＩ＋ｌ！、７？ｌ　０１５ＩＧＩＣＩ　−Ｅ？２．５７　５７ ５ ＩｇＧ２ｍ　−１１１１１２，ゴ３１１５ＩｇＣ２ａ　−ＶＩＡ＋２．７１　２ ／４参陽性培養物の数量／培養物の全数量として示す。

ル夫千ヤヨ゛倉 実施例Ｘｌ−０５Ａ　Ａ　ンバク　のへ或Ｎ４Ｏ−ＯｓｐＡフラグメントを発現 する組換え遺伝子を構築して、どのフラグメントが防御エピトープを含有するか を決定する。

先ず、上述のように制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含有するＰＣＲおよびオ リゴヌクレオチドブライマーを使用して、制限酵素消化、または１９７−Ｏｓｐ Ａ−Ｎ４０の特異配列の増幅のいずれかにより、Ｎ４００ｓｐＡ遺伝子の全ヌク レオチド配列を包含するオーバーラツプ２００−３００　ｂｐフラグメントを産 生する。次にこれらのフラグメントを、ＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨｌにより開裂 させたｐＧＥＭＥＸ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＳ）に配回的に クローニングする。

ｐＧＥＭＥＸはＴ７遺伝子１０融合タンパク質として組換えタンパク質の発現を 高レベルで行う。Ｔ７−ＯｓｐＡ融合タンパク質の転写は、バクテリオファージ エフプロモーターにより行われる。ＰＣＩ’ｌ用に使用されるオリゴヌクレオチ ドブライマーは、結果的にフラグメントが増幅されるように構築され、このフラ グメントはｐＧＥＭＥＸにクローニングされ融合タンパク質として発現すると、 ０ｓｐＡタンパク質の正しい読み取り枠を維持する。小さなタンパク質フラグメ ントは一般には）：、　ｃｏｌｉでは安定して発現されないため、０ｓｐＡフラ グメントを融合タンパク質として発現させる。

上述のように、エレクトロポレーションによりＥ、　ｃａｌｆ　ＪＭ１０９を組 換えｐＧＥＭＥＸプラスミドにより形質転換する。Ｅ、　ｃｏｔｉ　ＪＭ　１０ ９を宿主として用いるのは、これがＩＰＴＧ誘導１ａｃ　ｕｖ５プロモーターの 下でＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ用の遺伝子を含有するためである。ＩＰＴＧによ り形質転換された細菌を誘導すると、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼが産生され、こ れは５０％までの細胞タンパク質を組換えＴ７−ＯｓｐＡ融合タ融合タンパ単質 導く。

この方法で産生されたＴ７−ＯｓｐＡ融合タ融合タンパ単質であり、不溶性ベレ ット画分の回収により容易に精製され得、この後、組換えタンパク質は変性剤で 可溶化される。ｐＧＥＭＥＸからの融合タンパク質を可溶化して精製するために は尿素を選択して使用する。

融合タンパク質を合成する他の方法としては、挿入された遺伝子をグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として発現させるベクターｐＧＥＸ−２ ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　Ｎ、Ｊ、）を利用する方 法がある。ＥｅｏＲｌおよびＢａｍＨ１制限部位を含有するオリゴヌクレオチド ブライマーを使用して、上述のようにＬユ肛■ｏｒｆｅｒｉの菌株Ｎ４０からの ０ｓｐＡ遺伝子を増幅した。次に当該分野では周知の方法を用いて、ＰＣＲ増幅 された０ｓｐＡ遺伝子を精製し、これをグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ遺 伝子を有する枠内でｐＧＥＸ−２７にクローニングした。次にエレクトロポレー シヨンを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉｍ株ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン含有 プレート上にプレートするとにより組換え体を選択した。

形質転換された細菌の培養物５００ｍ１を増殖させ、製造業者の指示書に従って 、ＩＩＩＭのｒＰＴＧにより、０ｓｐＡ　１−８１９と命名される組換え融合タ ンパク質の産生を誘導した。次にＰＢＳにて細胞を洗浄し、１％のトリトンを有 する５ｍｌのＰＢＳで再懸濁させ、超音波処理で細胞を溶解した。次に溶解物を １３Ｋ　ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄み液をグルタチオンセファロース ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）上にのせた。製造業者の指示書に従って、 ５ｍＭのグルタチオンにより０ｓｐＡ　１−８１９を溶出した。

実施例Ｘｌｌ　−０５Ａ１−８９によるマウスの１週間に一回３週間にわたって 、２０マイクログラムの精製０ｓｐＡ　１−８１９を皮下注射により注入してマ ウスを免疫した。対照として、マウスに実施例ＸＩに示したように調製した精製 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを注入した。４週巨にマウスを出血死させ て、実施例Ｖｌ＋に示したように免疫プロットを調製して、マウスがＮ４Ｏ−Ｏ ｓｐＡに対する抗体を合成しているかどうかを決定した。免疫プロットにより、 １：６４，０００の希釈液に対する抗体応答は検出され得たため、０ｓｐＡ　１ −８１９で免疫したマウスはＮ４Ｏ−ＯｓｐＡに対して非常に強い免疫応答を生 じることが分かった。

次に、上述のように、マウスを１ｘｌＯ’個のＬユ肛■虹ハ且菌株Ｎ４０でチャ レンジして、５または１４日目に感染および疾患について検査した。表Ｖに示す ように、関節および心臓の組織病理学検査では、０ｓｐＡ　１−８１９で免疫し た動物に疾患の形跡は見られず、また血液および膵臓培養物では感染の形跡は見 られなかった。これに対して、対照動物は直ちに感染、ならびに関節炎および心 臓炎を発現した。これらの研究により、精製された０ｓｐＡ　１−８１９による 免疫により生成される免疫応答は、後に続く感染および疾患の臨床的発現を完全 に防御するのに十分であることが分かった。

表Ｖ 地投化なｊ　区組　胡、田Ｌ　坦 ｏｓ’　１−８１９　０／１５　ｏｚ＋ｓ　Ｏ１５０／９　０ハ０中陽性培養物 の数量／培養物の全数量として示す。

実施例Ｘ　Ｉ　Ｉ　１−　の　を六　〇ＳＡフラグメントの６−Ｂ　エピトープ 防御Ｂ細胞エピトープを含有するＯ　ｓｐＡタンノくり質の領域を同定する１つ の方法は、０ｓｐＡタンパク質のどの領域がＬユ扛雇旺包ム感染に対する防御を 示すモノクローナル抗体により認識されるかどうかを決定することである。

これはＯｓｐ＾タンパク質のフラグメントを産生することから始めた。先ず、上 述のようにＥｃｏＲｌおよびＢａ＋ｓＨ１部位を含有するオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて０ｓｐＡ遺伝子の一部をＰＣＨにより増幅した。ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎｏ：　３のヌクレオチド２００−８１９および４００−８１９からなるフラ グメントを合成した。次にこれらのフラグメントをグルタチオンＳ−トランスフ エラーゼタンノくり賀を有する枠内でｐＧＥＸ−２７にクローニングした０次に Ｅ、　ｃ。

貝を組換えプラスミドにより形質転換し、グルタチオンＳ−＋−ランスフェラー ゼ融合タンパク質として０ｓｐＡフラグメントの発現を誘導した。これらの融合 タンパク質を０ｓｐＡ　２００−８１９および０ｓｐＡ　４００−１１１９と命 名する。

次に、０ｓｐＡフラグメントグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク 質（ＯｓｐＡ　２００−８１９および０ｓｐＡ　４００−８１９）　、または全 長の０ｓｐＡ−グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（０ｓｐＡ 　１−８１９）のいずれかを発現するＥ、　ｃｏｌｔからの全細胞抽出物により 免疫プロットを調製した。次にこの免疫プロットを、前にＬ」■皿より≦５染に 対する防御を示すとして示した（実施例Ｘ参照）モノクローナル抗体ＶＩ　Ｉ　 ＩＣ３，７８と一緒にインキュベートした。

これらの結果により、防御抗体ＶＩＩＩＣ３，７８により認識されるエピトープ は、０ｓｐＡ遺伝子（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３）の領域内のヌクレオチド４０ ０−８１９の間にコードされることが示唆される。この実施例は、ＶＩＩＩＣ３ ，７８により認識されるエピトープが０ｓｐＡタンパク質の唯一の防御エピトー プであるということを必ずしも意味しない。また、ＶＩＩＩＣ３，７８により認 識されるＢ細胞エピトープをコードする領域がＴ細胞エピトープを含有しないと いうことも意味しない。しかし、これは０ｓｐＡタンパク質の防御エピトープを 同定するために使用され得る１つの方法を示す。

Ｂ細胞エピトープを含有する０ｓｐＡの領域を同定する別の方法としては、防御 ポリクローナル血清の抗体を吸収するために０ｓｐＡ融合タンパク質を使用する 方法がある。通常の方法を用いて、様々なＴ７−ＯｓｐＡまたは０ｓｐＡ−グル タチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をＣｎＢｒ活性化セファロース に結合してカラムを調製する。

実施例１１におけるように、ポリクローナルウサギ抗Ｂ、　ｂｕｒ■虹ムム抗血 清を調製する。

次にウサギ血清を０ｓｐＡ融合タンパク質カラムに通して、融合タンパク質を認 識する抗体を吸収する。次に上述のように、残留血清を使用してＣ３１１／Ｈｅ マウスを受動免疫する。

２日後、上述のように免疫したマウスをＢ、　ｂｕ　ｄｏｒ　ｅｒｉ菌株Ｎ４Ｑ でチャレンジし、次に２週間後に層殺する。関節の炎症を調べるために関節を臨 床的および組織病理学的に検査し、そしてスピロヘータを調べるために肺臓およ び血液を培養する。２週間後、上述のように暗視野顕微鏡により培養物を検査し てスピロヘータの有無を調べる。融合タンパク質を認識する抗体を含有する（Ｂ 細胞エピトープを含有する）ポリクローナルウサギ血清では受動免疫マウスに対 する防御を示す能力が個渇する。このため、どの融合タンパク質が防御抗体を示 し得るかを決定することが可能である。

様々なエピトープを融合タンパク質の領域へ位置づけた後は、５−３５アミノ酸 の短い合成ペプチドを使用してさらに分析を行う。合成ペプチドを使用すること により、各エピトープをさらに特定化し、一方融合タンパク質の非０ｓｐＡ部位 によりもたらされる変数を除去し得る。

（［゛奸牟町 実施例ＸＩＶ　−Ｏｓ　Ａ　４００−１１９によるＣ３ＨＨｅマウスの完全フロ イントアジ−パント中の１０μｇの０ｓｐＡ　４００−８１９または０ｓｐＡ　 １−８１９のいずれかでマウスを免疫し、さらに不完全フロイントアジ−パント 中の１０μｇを１０日間隔で２回、追加免疫した。１４日後、マウスを１ｘｌＯ ’個のし］肛剋肛りム菌株Ｎ４０チャレンジし、１４日目に感染を調べた。表Ｖ ｌに示すように、０ｓｐＡ　４００−８１９で免疫した５匹のマウスのうち１匹 だけが感染の形跡を示し、一方、対照マウスのすべてにおいてスピロヘータ培養 物は陽性であった。これらの結果により、ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ：３の４００−８ １９７ラグメントは、防御エピトープを含有する０ｓｐＡポリペプチドをコード する証拠がさらに示さ′れる。

＆＋Ｖ［ Ｎ４Ｏ−Ｏａｐｌ　１−ａｔＰ”　１１４０　０１５　０１５　０１５−ωか６ １９　−−　１１５　０１５　ｔ１５奉陽性培養物の数量／培養物の全数量とし て示す。

傘＊この群のマウスは前に０ｓｐＡ　１−１１１９で免疫されていた。最後に追 加免疫したのはこの実験を開始する約３ケ月前であった。

中＊参陽性血液および／または肺臓培養物を有するマウスの数／マウスの全数と して表す。

実施例ＸＶ　−０５ＡＡ　ンパク　によるＣ３ＨＨｅマウスの疫 防御モノクローナル抗体と反応することが知られている、または防御抗体のポリ クローナルウサギ血清を個渇する０ｓｐＡ融合タンパク質を、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウ スを能動免疫するために使用する。等量のフロインドアジュバントで乳化される 、１０および１００マイクログラムの間の０ｓｐＡ融合タンパク質を使用し、２ および４週開目に２回、追加免疫する。３週間後に動物を出血死させてウェスタ ンプロットにより間接蛍光抗体の力価を測定する。

また、実施例Ｖｌ１１に示すように、組換え０ｓｐＡ融合タンパク質を発現する Ｅ、　ｃｏｌｉでマウスを免疫する。両方の免疫方法により示される抗体応答の 最適生成を比較する。次に免疫後１４．３０、および９４日目に、免疫したマウ スを感染させ、５．１４、または６０日後に層殺する。マウスの関節の炎症を調 べ、そして肺臓および血液を培養してスピロヘータの有無を調べる。次に精製さ れた抗原および抗原を発現するＥ、　ｃｏｌｔの防御効果を比較する。

実施例ＸＶＩ　−１を六　〇ＳＡエピトープの６能動免疫マウスおいて誘起され る１、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの様々な菌株の間で共通のエピトープに対して 特異的である抗体は、Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅムのこれらの様々な菌株による 感染に対する防御を示す。Ｎ４Ｏ−ＯｓｐＡのどのエピトープがこのような抗体 を誘起し得るかを決定するために、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスを様々な０ｓｐＡ融合タ ンパク質で免疫して、上述のようにマウスをＬユ旺島且匠の様々な菌株でチャレ ンジする。Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄから得た２００以上のＢ、　ｂｕｒ■ｏｒｆ ｅｒｉの検体を単離した。これら様々な検体をＣ３Ｈ／Ｉ（ｅマウスに注入して 、感染性および／または関節炎誘発性であるかどうかを決定し、次に、様々な感 染性の菌株を０ｓｐＡ融合タンパク質で能動免疫したマウスに接種する。Ｌｂｕ 　ｄｏｒｆｅｒｉの多くの異なる菌株による感染に対する防御を示すとされるエ ピトープに近いワクチンを設計する。

表’／ＩＩおよびＶｌｌ＋は、組換え０ｓｐＡによる免疫がし」工１泣ご仏の他 の菌株による感染からマウスを防御するかどうかを決定するために行った実験の 結果を示す。上述のように、マウスを１０μｇの０ｓｐＡ　１−８１９で、また はＮ４Ｏ−ＯｓｐＡを発現する生菌旦−姐Ｈの腹腔内注射により免疫した。同量 の抗原で１０日間隔で２回、マウスを追加免疫した。２回目の追加免疫の１４日 後に、マウスに１ｘｌＯ’個のし」■庭匹負ム菌株２９７（ヒトを椎液から単離 ）を接種した。次に、上述のように１４日目にマウスの感染を調べた。５匹のマ ウスは疾患についても調べた。表Ｈ１に示すように、し」弘匡■ｒｆｅｒｉ菌株 Ｎ４０からの０ｓｐＡによる免疫は、感染に対してはほぼ完全な防御を示し、ま た疾患に対しては完全な防御を示した。

（以下余白） ？＜、　Ｖｌｌ 中隔性血液および／または肺臓培養物を有するマウスの数／検査したマウスの全 数として表す。

Ｌ」肛底肛ムム菌株Ｂ３１に対しても同様の実験を行った。しかしながら、これ らの実験では防御期間も決定しようとした。

上述のように、マウスを１０μｇの０ｓｐＡ　１−８１９で免疫し、２回追加免 疫した。次にマウスをＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ　ｉ菌株Ｂ３１に感染させ、チ ャレンジから６ケ月目に感染および疾患を調べた。表Ｖｌｌ＋に示すように、し 」狸匡■ｊ上ｌ菌株Ｎ４０からの０ｓｐＡ　１−８１９による免疫は、Ｌ」肛対 虹ムユ菌株Ｂ３１が原因の感染および疾患から完全なおよび長期間にわたる防御 を示した。

−良Ｖｌｌ＋ ０ｓｐＡ＋−８＋９　ａｓｌ、　１）ｈｒＡ　ｏｉｂ　ｏｔｂ参陽中隔液および ／または肺臓培養物を有するマウスの数／検査したマウスの全数として表す。

参＊６ケ月目の疾患は慢性廉直、および消散慢性感染を示す血漿細胞浸潤巣によ る。

（以下余白） 実施例ＸＶＩＩ−Ｔ　エピトープを　るＯ８Ａ　ム　ンパク　の５ 動物体内で高力価の中和抗体を含有する体液性免疫応答の刺激は、Ｔ細胞エピト ープおよびＢ細胞エピトープの両方を含有する抗原により促進される。Ｔ細胞エ ピトープを含有する０ｓｐＡ融合タンパク質を同定するために、上述のように完 全フロイントアジ−パント中でＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを、ｂｕｄｏｒｅｉ菌株Ｎ４ ０に感染させる。初回免疫から１０日後に、リンパ節を採取して、インビトロで Ｔ細胞系を産生させる。次にこれらのＴ細胞系を限界希釈技術および軟寒天技術 を用いてクローニングする。これらのＴ細胞クローンを用いて、どの０ｓｐＡ融 合タンパク質がＴＮ胞エピトープを含有するかを決定する。Ｔ細胞クローンを、 ０ｓｐＡ融合タンパク質および同系の抗原が存在する細胞で刺激する。Ｔ細胞ク ローンをＴ細胞エピトープを含有する融合タンパク質にさらすとＴ細胞が増殖す るが、それを３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定する。また標準方法で刺激さ れたＴ細胞クローンによりリンホカイン産物を測定する。

ヒトＴ細胞で認識された０８１）ＡポリペプチドのＴ細胞エピトープを測定する ために、Ｌ」旺剋旺ムユ感染患者から複数のＨＬＡ型を有するＴ細胞クローンを 単離する。種々の０ｓｐＡ融合タンパク質でクローンを刺激し、’Ｈ−チミジン の取り込みを測定することにより、Ｔ細胞エピトープを同定する。次に種々のＴ 細胞エピトープとＤＲ，ＤＰ、およびＤＱのようなりラスＩＩ　ＨＬＡ抗原との 関係を明らかにする。その方法は種々の）ＩＬＡ遺伝子を発現するＢリンパ芽球 細胞系を利用することにより行われる。

所定のＴ細胞クローンを適切なり　ＩＪリンパ芽球細胞系よび０ｓｐＡポリペプ チドと混合することにより、Ｂ細胞はＴ細胞に０ｓｐＡポリペプチドを付与し得 る。次に増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定する。

次にこれらの複数のＴ細胞エピトープを基にして組み合わせワクチンを合成する 。そのようなワクチンは、広範囲の所定の患者数において、ライム病の治療また は防御に有用である。

また、０ｓｐＢのような他のＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｊタンパク質および鞭 毛関連タンパク質のＴ細胞を刺激するエピトープを同定し、モして０ｓｐＡポリ ペプチドからのＢ細胞エピトープに関連してこれらのエピトープを基にした組み 合わせワクチンを設計する。

実施例ＸＶＩＩＩ−Ｔ　エピトープおよびＢ　エピトープをるＯ５Ａ　Ａ　ンバ ク　の Ｔ細胞で認識されるＮ４Ｏ−ＯｓｐＡのエピトープを同定した後、これらのエピ トープ、および例えば実施例Ｘで用いた中和抗体により認識されるＢ細胞エピト ープを含有する組換えタンパク質を構築する。これらの融合タンパク質はＴ細胞 エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方を含有するため、表面免疫グロブリン を発現するＢ細胞によりＴ細胞に抗原を付与し得る。次に、これらのＴ細胞は表 面免疫グロブリンを発現するＢ細胞を刺激して、高力価の中和抗体を産生ずる。

またＢ細胞エピトープを含有することが知られているＮ４Ｏ−ＯｓｐＡの領域を 、他の抗原の強力なＴ細胞エピトープと連結させることにより０ｓｐＡ融合タン パク質を構築する。Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原の１２０から１４０のアミノ酸と 相同であるオリゴヌクレオチドを合成する。コア抗原のこの領域には強力なＴ細 胞エピトープが含有されていることが示された（Ｄ、　Ｒ，ＭＥｌｌｉｃｈら、 前出）。次に実施例Ｘのように、そのオリゴヌクレオチドを、中和抗体で認識さ れるＢ細胞エピトープをコードするＤＮＡセグメントの５“および３°末端に連 結させる。次いでその組換えＤＮＡ分子を、０ｓｐＡからのＢ細胞エピトープ、 およびコア抗原からのＴ細胞エピトープを含有する融合タンパク質を発現させる ために用いて、それによりＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉに対する強力な体液性 免疫応答を生じさせる。

また、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのフラゲリンタンパク質に組み込まれたＮ４Ｏ−Ｏ ｓｐＡのＢ細胞エピトープを含有するプラスミドを構築する。細菌性フラゲリン は細胞性および体液性応答の強力な刺激因子であり、防御抗原のベクターとして 用いられ得る（Ｓ。

Ｍ、　Ｃ，Ｎｅｗｔｏｎ、　Ｃ，ＪａｃｏｂＳＢ、　５ｔｏｃｋｅｒ、　”Ｉｍ ｍｕｎｅ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅＴｏ　Ｃｈｏｌｅｒａ　Ｔｏｘｉｎ　Ｅｐｉｔｏｐ ｅ　Ｉｎ５ｅｒｔｅｄ　Ｉｎ　江り坦虹ムＦｌａｇｅｌＩｔｎ−１Ｓｃｆｅｎｃ ｅ、　２４４、ｐｐ、　７０−７２　（１，９８９））　ａ　Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｔａ　ｍｕｅｎｃｈｅｎｓのクローニングされた）ｌ　１−ｄフラゲリン遺伝子 を、超可変部の特有のＥｃｏ　ＲＶ部位で切断する。次いで防御Ｂ細胞エピトー プをコードする０ｓｐＡ遺伝子の平滑末端フラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡリガー ゼを用いて挿入する。次にその組換えプラスミドを用いて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａの無鞭毛菌株をワクチンとして用いるために形質転換する。マウスを生きてい る菌およびホルマリンで殺した細菌で免疫し、防御抗原に対する抗体の産生をア ッセイする。さらに、肺臓細胞を問題のペプチドに対する増殖性の細胞性応答に 関して試験する。量後にこの試薬で免疫したマウスを上述のようにＢ、　ｂｕｒ 　ｄｏｒ　ｅｒｉでチャレンシスる。

また、０ｓｐＡからのＢ細胞エピトープおよび０ｓｐＢからのＴ細胞エピトープ を含有する０ｓｐＡ融合タンパク質、４１　ｋｄ鞭毛関連タンパク質、またはＢ 、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ　ｉのＤＮＡから構築された発現ライブラリーから単離 された他のタンパク質を構築する。また０ｓｐＡからのＴ細胞エピトープおよび ０ｓｐＢからのＢ細胞エピトープを含有する０ｓｐＡ融合タンパク質、および／ または鞭毛関連タンパク質、または他のし」肛旦虹ムムタンパク質を構築する。

これら融合タンパク質の構築は、当業者に公知の組換えＤＮＡ技術により得られ る。融合タンパク質およびそれらに対する抗体は、Ｂ、　ｂｕ工対ユ戸１も、の 感染によって起こるライム病を発見し、治療し、そして防御するための方法およ び組成物に用いられる。

実施例ＸｌＸ−０ｓ　Ａ’　（Ｄ　Ｉパ（Ｄ’Ｚ　ａ−ニンク且圭互１舅旦所 Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株２５０１５はＪｏｈｎ　Ａｎｄｅｒｓｏｎの 好意により提供された。実施例ＩＩ＋に記載のように、オリゴヌクレオチドのプ ライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）およびＰＣ Ｒ増幅を用いて、０ｓｐＡポリペプチドの血清型変異体をコードする、ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ・９を単離した。次いで実施例＋Ｖに記載のように配列キ、）を用い てこの遺伝子を配列させた。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９に示すように、菌株２５０１５から血清型変異体をコー ドする遺伝子は、全長８１９のヌクレオチドであることが判明した。菌株Ｎ４０ からの０ｓｐＡ遺伝子と同様に、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９は２７３アミノ酸のタ ンパク質（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）をコードする。しかし、２５０１５０ｓ ｐＡ変異体は３１ｋｄよりはむしろ３２．５ｋｄにおいて５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り移動する。ＳＥＱ　ＪＤ　ＮＯ：１０をＮ４００ｓｐＡタンパク質の配列（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４）と比較すると、２５０１５０ｓｐＡ変異体はＮ４Ｏ−Ｏ ｓｐＡと比べて３９個のアミノ酸蓋換基を含有することが決定された。これらの 置換は３９．４７．５３．５５．９０．９５．９６．１０２．１１４．１３３． １３７．１３８．１４１．１４４．１４９．１６１．１６４．１７６．１９０． １９８．１９９．２０７．２０ｇ、２１４．２１５．２１７．２１８．２２９． ２３４．２４０．２４１．２４５．２４７．２５１．２５４．２５８．２６３． ２６４、および２７３の位置で生ずる。他の公知の０ｓｐＡポリペプチドとかな り異なる０ｓｐＡ変異体の発見は、驚くべきものであったと同時に望ましいもの であった。菌株２５０１５により発現された０ｓｐＡ変異体は新規のクラスの表 面タンパク質および／または新規のクラス実施例ＸＸ−Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｒ ｅＢ　２５０１５で　したヱクノ」と４及 最初に、Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４１１１で免疫したウサギの血清 でＣ３Ｈ／Ｈｅマウスを受動免疫すると、その後のＢ、ｂ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株 ２５０１５による感染の防御が可能である否かを決定した。ポリクローナルウサ ギ抗Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏ　ｆｅｒｉ　Ｎ４０抗血清を産生させるために、二二− ジランド産臼色ウサギに、完全フロイントアジ１バント中で殺されたＢ、　ｂｕ ｒ　ｄｏｒｆｅ　ｉ　（約１×１０７のスピロヘータ）の３０ｇｇの抽出物を接 種し、次いで２週間後に不完全フロイントアジコバント中でさらに３０ｔｔｇの 抽出物を用いて追加免疫した。実施例■■に記載したように、５匹のＣ３Ｈ／Ｈ ｅマウスを受動免疫するために、ウサギ血清の１：５希釈液をＯ，１ｍｌ用いた 。対照マウスを正常ウサギ血清を用いて免疫した。１７時間後にマウスをｌＸｌ ０’のＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆ　ｒ’園株２５０１５でチャレンジした。２週間 後、スピロヘータおよび疾患に関してマウスを評定した。免疫したマウスの全て は、感染および疾患に対して陽性であり、ウサギ抗Ｂ、　ｂｕｒ　ｄｏ　ｆｅｒ ｉ菌株２５０１５血清による受動免疫は菌株２５０１５による感染を防御しない ことが示された。

実施例ＸＸｌ−２５０１５グル　チオンｓ−トランスフェラーゼ　ム　ンパク　 のム ２５０１５０ｓｐＡ変異体をコードするＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋９を実施例ＸＩに 記載のようにＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ１リンカ−を用いてベクターｐＧＥＸ− ２７に挿入した。次にグルタチオンｓ−ｈランスフェラーゼ融合タンパク質とし て、この変異体を発現させ、前述のようにグルタチオンのセファロース４Ｂカラ ム上で組換え融合タンノｆり質を精製した。

実施例ＸＸＩ＋−５０１５ム　ンバク　によるヱ１工旦ヱｌ免亘 上述のように、１群が５匹のマウスを１０μｇの０ｓｐＡ　１−８１９または１ （ｌμｇの２５０１５変異体融合タンパク質を用いて免疫し、１０日間隔で２回 追加免疫した。対照マウスをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼを用いて免疫 した。次いで免疫したマウスを１４日後にｌＸｌ０’のＬ−坦匡現泣ゴヱｒｉ１ １株２５０１５でチャレンジし、２０日後、感染および疾患に関して評定した。

表ＩＸに示すように、予備結果では２５０１５変異体による免疫は、Ｌ」ｙｌ泣 ■虹１菌株２５０１５による感染を全面的に防御およびその後の疾患を防御する ことを示している。

（以下余白） 表ＩＸ 免疫剤　Ｂｏｒｒｅｌｉａ血液　肺臓　関節炎　心臓炎菌株　培養物°培養物゛ Ｎ４００ｓｐＡ１−１１１９　２５０１５　０／４　１／４　０／４　０／４２ ５０１５変異体 融合タンパク質　２５０１５　０／３　０／３　０／３　１／３グルタチオン Ｓ−）ランスフェラーゼ゛　２５０１５　２１５　２／Ｓ　Ｌ１５　１１５゛陽 性培養物数／全体培養物数で表した。

上述の実施例では、し」肛剋虹ムム菌株１１１４０からの０ｓｐＡ　１−８１９ による免疫もまたＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉ菌株２５０１５ｉ、：よって起 こる感染および疾患を防御するようだ。しかし他の実施例の結果は、Ｂ、　ｂｕ ｒ　ｄｏｒｆｅｒｉＩＩ株Ｎ４０からのＯｓｐＡはＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒ ｉ菌株２５０１５によって起こる感染または疾患を効果的に防御し得ないことを 示している。

例えば、組換え融合タンパク質の注入、またはＮ４Ｏ−ＯｓｐＡを発現する生！ ＩＬ」立ｕの腹腔内への接種のいずれかによりＬｈ］吏ｍ匡ム１１株Ｎ４０から の０ｓｐＡで２０匹のマウスを免疫した。

マウスを追加免疫して、前述のように１４日後に１×１０′のし」肛対虹ハユ菌 株２５０１５でチャレンジした。対照マウスをグルタチオンＳ−）ランスフェラ ーゼ、または挿入フラグメントなしにｐｏｃ　１９７（２ベクターで形質転換さ せたＥ、　ｃｏｌｔのいずれかで免疫した。表Ｘに示すようにＬ］旺組虹ハ己菌 株Ｎ４０からの０ｓｐＡで免疫したマウスはＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒ’菌株 ２５０１５による感染から効果的に防御されなかった。

表Ｘ 免疫剤　チャレンジ　血液および／　関節炎および／または肺臓　または心臓炎 培養物゛ ０ｓｐＡ　１−８１９ またはＮ４Ｏ−ＯｓｐＡを　２５０１５　１１／１９　５／９発現する）：、　 ｃｏｌｔ グルタチオン Ｓ−）ランスフェラーゼ゛　または　２５０１５　１８／２０　７／１ＯＮ４０ −ＯｓｐＡを発現しない Ｅ、　ｃｏｌｉ °陽性血液および／または肺臓培養物を有するマウス数／評定マウス全体数で表 した。

同様に、上述のように１０μｇの２５０１５変異体融合タンパク質を用いて５匹 のマウスを免疫し、Ｌ］肛■ｏｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４０でチャレンジした。免疫し た５匹のマウスのうち３匹が感染後１４ヨの時点で陽性スビａヘータ培＃物を有 していた。これらの結果は、Ｎ４Ｏ−ＯｓｐＡが２５０１５変異体と共通しない エピトープを含有し、同様に２５０１５変異体がＮ４００ｓｐＡと共通しないエ ピトープを含有することを示している。

２５０１５変異体の中でのＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの同定、お よびこれらのエピトープ並びに他の０ｓｐＡポリペプチドおよび／または変異体 からのエピトープを含有する融合タンパク質の構築により、広範囲のし」肛■ｄ 旦分離株による感染を防御し得るワクチンの合成が可能となる。

実施例ＸＸ１１１−Ｎ４０−Ｏ８Ａおよび２５０５　カ”　ノＯｓ　ポ軍ペプチ ドの タンパク質のオーバーラツプフラグメントを産生させ、Ｔ細胞エピトープおよび Ｂ細胞エピトープ各々の存在、および／または動物モデル系においてライム病を 防御し得る能力を試験することにより、２５０１５−ＯｓｐＡ内の防御エピトー プを同定する。次いでＮ４Ｏ−ＯｓｐＡと比較して防御エピトープおよびアミノ 酸置換基の両方をコードするフラグメントを選択し、これらのフラグメントを用 いて菌株Ｎ４０および２５０１５からの防御エピトープを含有する０ｓｐＡ融合 タンパク質を構築する。そのような融合タンパク質は広範囲のＬ−垣匡舷旦コｌ ｕ５分離株を防御するＯ 実施例ＸＸ　ＩＶ−Ｎ４０　か゛ノＯ８Ｂ°　の　１実施例Ｉｖに記載のように 配列キットを用いて、ｂｕｏＦｒＪＩ株Ｎ４０からの０ｓｐＢ遺伝子を配列させ た。その遺伝子は全長８８８のヌクレオチドであることが判明した。次にＮ４０ ０ｓｐＢ遺伝子配列を菌株Ｂ３１　（Ｓ、　Ｂｅｒｇｓｔｒｏ重ら、前出）から の０ｓｐＢ遺伝子の配列と比較し、Ｎ４００ｓｐＢが、ヌクレオチドに相当する ９つの位置２５８．３７６．３８２．５２６．５７７．５９３．７２９、および ７５８（ヌクレオチド１−３がアミノ酸１に相当）でＢ３１０ｓｐＢと異なるこ とが判定した。菌株Ｎ４０からの０ｓｐＢにおいてこれらの位置で見つかったヌ クレオチドは各々Ｃ％Ａ、　Ａ、　Ａ、　Ａ、　Ｔ％Ｇ、　Ｃ，およびＣである 。５７７の位置にヌクレオチド置換基が存在する結果、菌株Ｎ４０からの０ｓｐ Ｂ　ｍＲＮＡは、Ｂ５１−０ｓｐＢで見つかったＧｌｕ　（ＧＡＡ）の代わりに アミノ酸１７６に相当する位置に停止コードン（ＵＡＡ）を有する。Ｅ、　ｃｏ ｌｔにおけるＮ４００ｓｐＢ遺伝子の発現の結果、２４　ｋｄで移動するタンパ ク質が産生される。このことは、そのタンパク質がその系で発現する時、実際に 、１０４　Ｃ０ＯＨ末端アミノ酸が切り取られたことを示している。Ｂ、　ｂｕ ｒ　ｄｏｒｆｅ　ｉ１株Ｎ４０は停止コードンを介して読み取り可能であると思 われる。

しかし、Ｅ、　ｃｏＨは先端が切り取られたＮ４Ｏ−ＯｓｐＢタンパク質を産生 ずるので、　、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ且菌株Ｂ３１からの０ｓｐＢ遺伝子を用い た研究を続けることにする。次に動物モデル系を用いて０３ｐＢに対する免疫応 答を調べ、Ｂ５１−０ｓｐＢグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ融合タンパク 質を精製した。

実施例ＸＸＶ−Ｂ３１−Ｏ８Ｂグル　チオンＳ−トランスフニラ−ゼム　ンパク 　の４ Ａ、Ｇ、　Ｂａｒｂｏｕｒの好意により提供されたプラスミドｐＴＲＨ４６の０ ｓｐＢ挿入をＰＣ１ｉ増幅することによりＢ３１０ｓｐＢ遺伝子をクローニング した。次いで増幅された０ｓｐＢ遺伝子をベクターｐＧＥＸ−２７に挿入して、 グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として０ｓｐＢタンパク質 を発現させ、実施例ＸＩに記載のように、グルタチオンのセファロース４Ｂカラ ム上で組換えタンパク質を精製した。

実施例ＸＸＶＩ−虹岨ムヱ久１１ヱ辷Σ１Ｚムニ王ユニヱム　ンパク　によるマ ウスの 完全フロイントアジ−パント中の精製されたＢ５１−０ｓｐＢグルタチオンＳ− トランスフェラーゼ融合タンパク質１０μｇを用いてマウスを免疫し、不完全フ ロインドアジュバント中の１０μｇの０ｓｐＢ融合タンパク質を用いて１０日間 隔で３回追加免疫した。

対照マウスを精製されたグルタチオンｓ−トランスフェラーゼで免疫した。１： １５．ＯＯＯの希釈度で、免疫プロットにより検出可能なり３ｌ−ＯｓｐＢに対 する０ｓｐＢ融合タンパク質で合成された抗体を用いてマウスを免疫した。種々 の投与量のＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅ且菌株Ｎ４０またはＢ３１で免疫後１４４ 回目マウスをチャレンジし、１４４回目感染および疾患を評定した。

表ｘＩに示すように、全ての対照マウスは容易にスピロヘータ血症に感染した。

対照的に０ｓｐＢを用いて免疫したマウスの大半は感染から防御された。１×１ ０２または１×１０３のスピロヘータを接種された動物もまた、軽度の心臓炎に 感染した１匹のマウスを除くと全て疾患から防御された。対照的に同量のスピロ ヘータを接種された対照マウスはかなりの数で疾患に冒された。

表ＸＩ 免疫剤　Ｂｏｒｒｅｌｉａｉ１株　培養物′　関節炎および／（投与量）　また は心臓炎 Ｂ５１−０ｓｐＢ　り′ルタチオン　Ｂ５１（１０’）　５／１４　７／１４Ｓ −）ランスフェラーセ゛　Ｂ５１（１０３）　Ｏ１５０１５Ｂ３１（１０２）　 Ｏ／８　１／１０ り゛ルタチオン　Ｂ５１（１０’）　１２／１３　１２／１３Ｓ−トランスフェ ラー七゛　Ｂ５１（１０’＞　２１５　４１５Ｂ３１（１０２）　３／８　３／ ８ Ｂ３１−ＯｓｐＢ　り゛ルタチオン　Ｎ４０（１０’＞　２／！ｌ　５１５Ｓ− ）ランスフニラ−七’　Ｎ４０（１０２）　Ｏ１５り゛ルタチオン　Ｎ４０（１ ０’＞　５１５　５１５Ｓ−）ランスフエラーセ゛　Ｎ４０（１０２）　１１５ “陽性血液および／または肺臓培養物を有するマウス数／全体マウス数で表した 。

これらの初期の研究により、Ｂ５１−０ｓｐＢグルタチオンＳ−トランスフェラ ーゼ融合タンパク質がＬ」肛皿ｏｒｆｅｒｉによる感染を部分的に防御、および より低い投与量のスピロヘータでは感染および疾患を完全に防御し得ることが示 された。よって０ｓｐＢは、０ｓｐＡのように防御エピトープを含有する。本発 明の教示によれば当業者は容易に０ｓｐＢタンパク質の中に防御エピトープを同 定し得、またＬユ肛剋虹ｎムによる感染によって起こるライム病を完全に防御し 得る０ｓｐＢポリペプチド（融合タンパク質および多重結合タンパク質を含有す る）を合成し得る。

実施例ＸＸＶＩＩ　−Ｏ５Ａによるマウスの　口実施例Ｖ１１に記載のように３ ０℃でｐ１９７−ＯｓｐＡ−Ｎ４０プラスミドを有するＥ、　ｃｏｌｔを培養し た。温度を４２℃にまで２時間上昇させることによりＮ４Ｏ−ＯｓｐＡの発現を 誘導した。次いで、遠心分離により細菌を採取し、ＬＸ　１０’細菌／ｍｌの濃 度でＰＢＳ中に再懸濁した。

この懸濁液０．１ｍｌを、Ｃ３１１１／Ｈｅマウスに経口的に接種するために用 いた。接種は先端が丸い金属注射針を用いて強制的に行った。１０．２０．３０ 、および４００回目同量の細菌を用いてマウスを追加免疫した。対照マウスを同 様の方法でｐ１９７−ＯｓｐＡ−Ｎ４０プラスミドがない細菌で接種した。２回 目および４回目の追加免疫から７回目にマウスを採血し、実施例Ｖ１１に記載の ようにＢ、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉの抽出物上で免疫プロットを行った。２回 目の追加免疫後に得られた血清を１：１００に希釈した。４回目（最後）の追加 免疫後に得うレタ血清を１：１００．１：５００、Ｌ：１，０００．１：５，０ ００、および１：１０，０００に希釈した。

両時点で得られた血清では共に免疫プロットにより抗体の検出が可能であった。

２回目の追加免疫後に得られた抗体の力価は、１×１０８のＥ、　ｃａｌｆを発 現するＮ４Ｏ−ＯｓｐＡを腹腔内に注入する同様の方法で免疫した動物から得ら れたものより幾分偶力１った。しかし４回目の追加免疫後に得られた血清は１： ５０００の希釈度で検出可能な抗体を含有しており、マウスがその時点までにＮ ４Ｏ−ＯｓｐＡに対する強力な体液性免疫応答を獲得したことを示している。

最後の追加免疫から１４ＦＥ目に、マウスをＩＸＩ（１’のシ」肛ｇｏＪＪＭｉ ｔＭ株＋１４０で皮内接種することによりチャレンジして、実施例Ｉ＋に記載の ように５回目または１４４回目感染および疾患を評定した。表Ｘｌ＋に示すよう に、Ｎ４Ｏ−ＯｓｐＡを発現するＬ」且亘で経口ワクチンされたマウスは感染お よび疾患から防御された。さらに、マウスは菌血症の兆候を示さなかった。

表Ｘｌ＋ 経口免疫　屠殺　血液および／　関節炎　心臓炎または膵臓培養物。

０ｓｐＡ　Ｓ日間　０１５ 対照　５日間　４１５ ０ｓｐＡ　１４日間　０／Ｓ　Ｏ１５０１５対照　１４日間　３／４　５１５　 ５１５°陽性血液および／または膵臓培養物を有するマウス数／全体マウス数で 表した。

これらの結果は０ｓｐＡポリペプチドを用いた経口ワクチンにより、マウスがＢ 、　ｂｕｒ　ｄｏｒｆｅｒｉによって起こる感染および疾患から十分に防御され ることを示している。

（Ｊ−砕敏白） 配列表 および方法 （目ｉ）配列数：１１ （Ｂ）番地：　８７５　啼−ｉ　７へ゛二１−（Ｅ）国二　アメリを合衆国 （ｖｌ）現在の出願データ。

（Ａ）出願番号・ ＣＢ＞出願日： （Ａ）出願番号：　ＵＳ　５３８，９６９（Ｂ）出願日：　１９９０年６月１５ 日（Ｖ目）優先出願データ・ （Ａ）出願番号：　ＩＪＳ　６０２．５５１（Ｂ）出願日：　１９９１年１０月 ２６日（ν１目）代理人２／事務所情報： （Ａｌｆｆｉ　名：　八−シイ　）゛に７　、　ノ゛エイＡス　エフ。

（Ｂ）登録番号：　２フ、７９４ （Ｃ）照会、′記録番号：　ＹＵ−１００ＣＩＰ　２（］ス）を話回線情報： （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報：（Ｆ）頁：　４７９−４８６ （Ｇ）Ｆ３付：　１９８６年 （已千敦９） （ｘ［）配列・ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋２Ｎ詰α−コＩゴτ：λυＧ＝πτ＝フリ ご＝でに℃υｉＧ　３６（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋３の情報：（１）配列の特 色： （Ａ）長さ二８１９塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−木調 （Ｄ）トボロノー：　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇａｎｏｍｉｃ）（■］）ハイボセテイカル配列 二Ｎ０ （１ｖ）アンチセ／ス：Ｎｏ （ｚ）出版情報： （Ａ）著者：　ＦＩＫＲＩＧ、ＥＲＯＬＢＡＲＴＨＯＬＤ、５ＴＥＰＩＩＥＮ　 ＷＫＡＮＴＯＲ，ＦＲＥＤ　Ｓ。

（Ｃ）雑誌名：　５ｅｉｅｎｅａ （Ｇ）日付：　１９９０年１０月２６日く目）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋３ ＝Ｗ−ユαｎコζ：ＷＯコ品Ｗｘ艶にに＝７；■χ蟻Ｗ麩７２０）ＪＯｔ−品： ユａＣユク眞スにχコＭフスＮα−りＣ１Ｍご）りα＝：ロリクｒ　７１１０（ ２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の情報：（ｉ）配列の特色・ （＾）長さ＝２７３アミノ酸 （Ｂ）型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・　−木調 （Ｄ）トボロノー：　直鎖状 （１１）配列の種類：　タンパク質 （ｉｉｉ）ハイポセテイカル配列：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘ）出版情報： （Ａ）著者二　ＦＩＫＲＩＧ、εＲＯＬＢＡＲＴＩＩＯＬＤ、５ＴＥＰＨＥＩＩ 　ＷにＡＩＩＴＯＲ，ＦＲＥＤ　Ｓ。

ＦＬＡＶＥＬＬ、ＲＩＣＨＡＲＤ　Ａ （Ｂ）！ｉ名：　ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ　ＯＦ菖ＩＣＥ　ＡＧＡＩＮＳＴ　ＴＨ Ｅ　ＬＹＭＥ　ＤＩＳＥＡＳＥ　ＡＧＥ！ＩＴ　ＢＹ　ＩＭＭＩＩＮＩＺＩＮＧ 　ＷＩＴＨＲＥＣＯＩＩＢＩＮＡＮＴ　０ｓｐＡ（Ｃ）雑誌名：　５ｃｉｅｎｃ ｅ （Ｇ）日付：　１９９０年ｌＯ月２６日（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋ ４Ｍａｔ　Ｌ％　ＩりＴ！／Ｔ　−Ｈ尻（：ｌＹ　Ｘｌ＊　Ｇｌ’ｆ−１Ｈａ− ユ紅ｉ展工１ａ　ｊｕ＆１　５　工Ｏ本 Ｃｙｓ　”ｐ　Ｇｉｎ　Ａｇｎ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　’Ｌｍ　）ａｐ　Ｇ ｌｌ砂Ａｓｎ　５ａｒ　ＶａＬ　Ｓａｒ　ｖａ１２ｏ　２５　コ０ Ａｓｐ−ユｆ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｕ　？妃ぬＶ社−ハＵ嬬−はＵ−ぬ孕コ５　 ４０　４５ 御財ＴＪ！ｓか１卯−１珈蟲計Ｖ社御−一バ―−１−ＧＩＹ誼対Ａｓｐ−Ａｓ！ ’＋　１’Ｊ？　ａｌｙ　ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ−１Ｃｕ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　 ＬＹＳＡｌａ瑯ン１ｓａｒ−■目砂−ユ誼コＩＣ縞角卯−ｘ　Ｇｌｙ　Ｇ止Ｂ５ 　９０　９５ Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　ＴＹｒ　Ｔｈｒ　にｌｕ　エユａ　ＬｙＳ　Ｓａｒ　入ｓｐ　 Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＬＦ　Ｇｉｕ１４５　Ｌ５０　Ｌ５ ５　ユ６０ Ｖａｌシ＝ｍ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　）ζＶａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｐ　Ｌｙｓ　Ｔａｘ１６５　Ｌ７０　Ｌ７５ Ｌｙｓ　５ａｒ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　にｍｕ　−υ５Ａ ｓｐ　ＴｈＬ−１Ｃ５ａｒ　Ｎａ（Ｂ）豐・　核酸 （Ｃ）［の数・　−木調 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （１１）配列のｆ！　Ｈ：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｅ）（ｉｉｉ）ハイボセテ ィカル配列、Ｎ０（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘ）出版情報。

（Ａ）著者：　Ｅｅｒｇｓｔｒｏｍ、５（Ｂ）８名＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａ ｎａｌｙｓｉｓ　Ｏｆ　Ｌｉｎｅａｒ　Ｐｒｘｓｍｌｄ−Ｅｒｌｃｏｄｅｄ　Ｍ ａｊｏｒ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　０ｓｐＡ　Ａｎｄ　０ｓｐＢ 、　Ｏｒ　Ｔｈｅ　Ｌｙｍｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｐｉｒｏｃｈａｅｔａ　Ｂｏ ｒｒｅｌｉａ　Ｂｕｒｇ＋ｊｏｒｆｅｒｉ（Ｃ）雑誌名：　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ（Ｄ）巻：　３ （Ｆ）頁：　４フ９−４８６ （Ｇ）日付　１ｇ８６年 （ｘｉ）配列：　ＳＥｏ　ＩＤＮ０＋５旭屹品：ロバｎ−状ゴーπににフごＬ味 ス　翼（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報：（１）配列の特色 （＾）長さ・　３７塩基対 （Ｂ）型：　核酸 （Ｘ）出版情報・ （Ｃ）雑誌名：　Ｍｏ１．　１ｌｉｅｒｏｂｉｏｌ（Ｄ）＠＋　３ （Ｆ）頁：　４７９−４８６ （Ｇ）日付：　１９８６年 （Ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６−一心＝＝へにｆＷ＝＝Ｗ；σ界に　 〕７（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報：（Ｂ）題名：　ＮＵＣＬＥＯＴＩＤ Ｅ　ＳεＱＵＥＮＣＥ　ＯＦ　Ａ　ＧＥＮＥ　ＥＮＣＯＤＩＮＧＴＨＥ　ＢＯＲ ＲＥＬＩＡ　ＢＵＲＧＤＯＲＦＥＲＩ　ＦＬＡＧＥＬＬＩＮ（Ｃ）１１誌名：　 Ｎｕｅｌｅｆｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

（Ｄ）巻ｚ　ｌ７ （Ｆ）頁：　３５９０−３５９０ （Ｇ）日付：　１９８９年 （ｘｉ）配列＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア八へ八へ入＾ＴＴＣ＾ＧＣ，＾ｍｃ； ＾１１λＩｃ入＾Ｔ　ｃＡ工＾＾　コ５（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＢＣＱ情報 ：（Ｉ）配列の特色。

（＾）長さ：３１塩基対 （Ｂ）璽：核酸 （Ｃ）ｔｌｉの数二　−末鎖 （Ｄ）　）ポクジー　１棲状 Ｈｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｘ）出版ｌ′ｌｌ報： （Ｃ）雑誌名：　Ｎｕｅｌｅｊｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（Ｄ）巻：１７ （Ｆ）ｌ　３５９０−３５９０ （（ｉ）Ｅ＋付・　１ｇ８ｇ年 （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８ＡＧ＾ｅ＾τ口；ｒ：λゴロ＝入＾Ｇ ；入Ａゴα＾Ｃλ＾Ａ＾Ｃλ　コｌ＋２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋９ｆｌＤｆｉｌ ｌｉ：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：８１９塩基対 （Ｂ）皇、核酸 （Ｃｏｉｌの数：　二本鎖 （Ｄントボクノー・　ｒＩＬ鎖状 （］Ｘ）配列の特徴。

（Ａ＞特徴を表すＩ８号ＣＤ５ ＣＢ）存在位置　１．．８１９ （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋９Ｍａｔ　Ｌｙｓ　’Ｉｐ　？、τ］、 ａｕ　Ｌｓｕ　ｍｙ　ｎｏ　Ｃ１ｙ　Ｌｓｕ工１ｅシ胆に１シにｔ　Ａｌａユ５ ユ０工５ Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　１ｘ＋　Ｖａｎ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　ｊコＡｓｐ　Ｃ１ ｕ　卒Ａｇｎ　５ａｒ　Ｖａｌ　５ａｒ　Ｖａｎ２０　２５　コロ Ａｓｐシｌ≧フのｙ■、ｕｈ比−７社−コＶ社シ「−のＵ功１にや隨１コ５　４ ０　４５ にやＣ１ｙ　ＴＪｉｓ？シ「−λｈ呪に１冨ｖ社にや功１シ県こｕＩａユ恥弓（ ：ｉｙ　”：ｋ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　ｒＪ／５）ｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｃ１ｙ　Ｖａｌ　エ１飄ユＧｌｕ　Ｇｌｙ　〜’、ａＬＬ凾■ 、ｕａＡｓｐ工Ｆｋ＄シａニーＬａｕＴｈｒ〜（ａ１５ａｒ講ｆＡｌｐ論に計＋ １５９０９５ ＬＦＡｒｇ−’！ｈｒＳａｒＬｙｓＡｓｐＬｙｓＳａｒＳａｒＴｈｒＧｌｕＧｌ ｕＬｙｓＦｈｅＡｓｎＧユＵ１１５　Ｌ２０　１２５ ＬＦ　ＧユｙＧユｕ　Ｌａｕｖａユ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　エユ＊　Ｆ’ｔｔ　Ａｌ ａ　ＡｒｑＡユａ入！Ｅｎ　Ｇｌｙ　？！℃＝工１Ｑ１コ０１コ５１４゜ Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ｃｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｍ苧にｌ ｙ　Ｓａｒ　にｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　に１ｕ１４５　じＯ１５５１６ ０ 誼シｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　）ζＶａｌ　Ｌａ５ｘ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｎｒ　Ｌ ａｕ　Ｔｈｒ　ｊｕａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａユ６５　１７０　１７５ τｈｒＬｅｕＶａ１ＶａｌＬｙｓＧユｕＧｌｙ？ｈｒＶａｌＴｈｒＩａｕ５ａｒ Ｌｙ寞）Ｌ、工１ａｓａｒ１８０　１８５　ツ０ Ｌｙｓ　Ｓｅｘ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　誼にＪ　ＧｌｕシＵ　ｋｍ　Ａｓｐ 　計Ａｓｐ　Ｓａｒ　’１ｌｈｒ　Ｇ１ｎにＬａ　Ｔｘ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｄ、 ｘ　Ｇｌｙ−フッ〜やに、ａ　Ｇｌｙ　計シ；フ２シ艮フτ工ｌ＊　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ａｓｎ　）ｓｒｒ　Ｌｙｓ　Ｘｐ　Ｄｒ　Ｌｙｓ　ＡＬａ　Ｌｍ　Ｖａｌ 　Ｆｈａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｒ＋２２５　２コロ　２コ５　２４゜ ＡｖｐＴｈｒ工Ｘｓ　Ｔｈｒ　５ａｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｙ：　Ａｓｐ　Ｓａ ｒにＪ　Ｇｌｙ　誼ｈｗ＋−ｕ　Ｃ１ｕＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｃ１ ｕ　ｎａ　Ｌｙｓ　ｋシ＊　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ｎｅ　隨１）ｓｒｒに１シ県（２ ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１ノ清報：（１）配列の特色・ （Ａ）長さ：２９６アミノ酸 （Ｂ）！＋２．　ア　ミ　ノ　酸 （Ｃ）鎖の数、−末鎖 （Ｄ）トボロノー・　直鎖状 （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌｌｍｑｒ、ｓｕ−二ａ　に１ｙ　Ｐｈ ｅ　Ａｌａ−９−一」ムＬｍ　ｎｔａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓｌ　５　１０　ＬＩ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｉｊ／５Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　５ｅｒ　ｎａ　’Ｇｌｙ　 Ｓａｒ　Ｇｌｒ＋　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　）ａｘｔ　Ａｓｐ　Ｌ≠■ ２ｏ　２５　コＯ ＬａｕＰｒａにＪ　Ｖａｌ　？ｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ｓａｒ　Ｖａｌ　シ「１ Ｆｈｍ　ＡＳＥｎ　ＧＩＹ　Ａｓｎ　ＬｙｓにやＳａｒ計シ「計−ユフ；工ｌａ シ「に１にやに一隨嘔計易５にや一ハｒａｌ　Ｆｈｅ論ユ１１斗のｙフｃｎａ計 Ｖ社Ｇ止−）τぬ計に１のｙ計シ；−１Ｇｌｕのｙシ；に五シτＧ工ｕ　ｎａ− Ａｓｎ−ユ謔＝口に；０足二〇乏菰ロ乏：呂ご笛えご：８足：８に；８乏：（（ へＵ＞　”＜−−＜−−Ｌ）ＬＪ−ＨｔｆＩ”ＬＪ＜−ＵＣｊ−Ｌｌ）−Ｕｔ３ 己母■口會Ｌ５　目３コ；ヨ３Ｈ耘ミ ロ納　ＱＱ　（−１Ｑ為　（−υａ　（−←−ロコ　く−（＞　←Φ　ト勺　Ｑ −υぷ　（Ｉｌｌ　ＬＩＪ：　Ｕ−１トΦ　ＱＱ（−＜Ｔ、ＣＤ＞　ＬＪロ　く ←　ロく　（←　ロ（←−←ψ＄′！＞　乏：　ご竺　２：　８竺　２遡　≦！ 　２遡　ご芝　仁；←ＣＪ　Ｌ５Ｃ５（＆−（ｊｕｌ　（＋　（Ｊ　（１−１（ Ｊ　（ｆ−＜５＞く１　←≧　く勺　←コ　（Ｃ：　Ｑ−（Φ　（シ　（−（コ Ｊ−（ｊ＋１　υ−←Φ　＜−ＵΦ　←−Ｃｊ＋＋　（Ｊ二　く−ａ＜　ａａ　 ａ＜　ｕ−（Ｊロ　←Ｗ　（Ｍ　ＵＣｊ　（＋　ｕｕくΦ　−０←の　（−１！ −１飄　←−（哨　１−ｔｉｉ　（＃１　（ｊ為！−−Ｌｌｌ−＋　Ｅ−−１← ｆｆｉ　＋５−ＬＩＪ：　＜＞　ＣＪＩ　（＞　ｔａ−く−　υ−（−ロ〉　＠ ロ　（←　（−トの　に−ＱＯ（：ｌ　Ｏ：＋　（り　（論　（り　＜−（コ　 （シ　くコ　←−如！　号！　し！　８Ｇ　じ３　ｂ；　ざ已　８Ｇ　５己　と 屑くω　ＬＩＣ（ψ　←α　くコ　（−（コ　〈−＜コ　〇−←−く切　（＞＜ ψ　←Φ　ＱＪ：　＜−Ｑ二　＜−ａΦ＜−（（（−ロ（←−く←　ロＣ（←　 Ｕロ　くの＜蔦　くψ　ＬＩＣ←−（哨　くψ　←ＣＯ−←り　くコＬ）−＋　 （＞　（ｉｌｌ　（Ｊａｌ　（＞　＜＞　（ａｌ　＜＞　Ｉ−ａ）［−ΦＵＵ　 （Ｊ　（（←の　（Ｊ　（−＜＜　←←　Ｑ−トーＵコ　ロク　くψ　←−（− ｉ　（Ｊ＞　Ｌｌａ＋　（コ　←−←−←Φ　＜−（＞　ＱＪ：　←−Ｑ−←＝ 　く−　←で　０；←−Ｌｊｃ、＋　（−（？　ｕ＞　ｕＵ　←−ロＣＣｊ＞　 （←くり　υα　〈コ　〈＞（切　←α　くψ　←コ　←−トー←Φ　＜ψ　く −ロー　く論　くψ　く≧　←Φ　＜＞　ｉ＋勺←−（ｊ（ＣｊＣｊ　ロロ　＜ −Ｕ＜　（Ｊ　ＱＪ　Ｈ←　Ｃ〉畦Ｌ３　芥ヨ３Ｉヨ言ヨ５コ５１辱 （′！＞　８〒　８笛　号呂　２遡　２菰　乏！　８竺　２菰　巴ご＜−＜の　 ＜ＣＩ′＋１ＪＪ　（Ｊ　４：Ｊ　Ｕじ　く←　＜Ｗ　ａａくψ　（Ｊｉｉ　（ −１Ｃｊコ　ｕＱ、（Ｊａｌ　＜Ｑ　（メ　くコ　くコ（＞　ｆｊａＩ　←勺　 ＜−＜ψ　ｌ−二　〇＝　０−　←ω　く−＜−＜ψ　ｕ＞　ｑロ　Ｏく　←− くト　じロ　←−Ｑ○国際調査報告 −、−ａ、−＋ｌＬ　ＦＣｒ／ｕ！！９１７０４１）５６フロントページの続き Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ フロントページの続き （３１）優先権主張番号　６８２，３５５（３２）優先臼　１９９１年４月８日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　Ｃ Ａ、ＪＰ （７２）発明者　パートホールド、ステイーブン　ダブリュアメリカ合衆国　コ ネチカット　０６４４３マディソン、リトル　ハロー　ロード　１８（７２）発 明者　フィクリグ、二ロールアメリカ合衆国　コネチカット　０６４０５ブラン フオード、ショア　アベニュー

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．下記のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 を含む、組換え、合成、または単離ＤＮＡ分子：菌株ＺＳ７とＢ３１とを除く、 ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプチドおよびその血清型変異体；ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドおよびその血清型変異体； 上記ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列からのブロックとして取り出した少 なくとも１０のアミノ酸を含有するフラグメント；および上記ポリペプチド、変 異体、およびフラグメントの誘導体であって、該誘導体がアミノ酸配列において 上記ポリペプチド、変異体、またはフラグメントにおけるアミノ酸配列と少なく とも８０％同一である誘導体。
2. ２．下記のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 を含む、組換え、合成、または単離ＤＮＡ分子：哺乳類宿主がＢ．ｂｕｒｇｄｏ ｒｆｅｒｉに感染することにより生じる抗体と免疫学的に反応するポリペプチド であり、抗体が菌株ＺＳ７とＢ３１とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐ Ａポリペプチドと免疫学的に反応するポリペプチドおよびその血清型変異体；哺 乳類宿主がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染することにより生じる抗体と免疫 学的に反応するポリペプチドであり、抗体がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐ Ａ変異体ポリペプチドと免疫学的に反応するポリペプチド、およびその血清型変 異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｅｆｅｒｉおよび菌株ＺＳ７とＢ３１とを除く、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を誘起し 得るポリペプチドおよびその血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉおよび ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドと免疫学的に反応する 抗体を誘起し得るポリペプチドおよびその血清型変異体；およびＢ．ｂｕｒｇｄ ｏｒｆｅｒｉの感染によって起こるライム病を効果的に防御する免疫応答を治療 されている哺乳類宿主中に誘起するポリペプチド。
3. ３．前記ポリペプチドが下記のものからなる群から選択される、請求項１に記載 のＤＮＡ分子：Ｂ．ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉが哺乳類宿主に感染することによって 生じる抗体と免疫学的に反応するポリペプチドであり、その抗体が菌株ＺＳ７と Ｂ３１とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプチドと免疫学的に 反応するポリペプチドおよびその血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉが 哺乳類宿主に感染することによって生じる抗体と免疫学的に反応するポリペプチ ドであり、その抗体がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチド と免疫学的に反応するポリペプチドおよびその血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏ ｒｆｅｒｉ、および菌株ＺＳ７とＢ３１とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯ ｓｐＡポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を誘起し得るポリペプチドおよび その血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉおよびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０ のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を誘起し得るポリペプ チドおよびその血清型変異体；およびＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの感染によっ て起こるライム病を効果的に防御する免疫応答を治療されている哺乳類宿主中に 誘起するポリペプチド。
4. ４．前記ＤＮＡ配列が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３のヌクレオチド４００−８１９ またはそのフラグメントを含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ分子。
5. ５．前記ＤＮＡ配列が防御エピトープをコードする、請求項１、２、または４の いずれかに記載のＤＮＡ分子。
6. ６．前記ＤＮＡ配列がＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープからなる群の少 なくとも１つをコードする、請求項１または２に記載のＤＮＡ分子。
7. ７．融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、組換え、合成、または単離 ＤＮＡ分子であって、該融合タンパク質がＯｓｐＡポリペプチドおよび付加的ポ リペプチドを含む、ＤＮＡ分子。
8. ８．融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、組換え、合成、または単離 ＤＮＡ分子であって、該融合タンパク質がＯｓｐＡ変異体ポリペプチドおよび付 加的ポリペプチドを含む、ＤＮＡ分子。
9. ９．前記付加的ポリペプチドが下記のものからなる群から選択される、請求項７ または８に記載のＤＮＡ分子：ＯｓｐＡポリペプチドまたはそのフラグメント； ＯｓｐＡ変異体ポリペプチドまたはそのフラグメント；ＯｓｐＢポリペプチドま たはそのフラグメント：Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ鞭毛関連タンパク質または そのフラグメント；Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原のエピトープ；Ｔ細胞エピトープ ；Ｂ細胞エピトープ；Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープ；およびそれら の組み合わせ。
10. １０．前記ＤＮＡ配列がさらに多量体タンパク質をコードする、請求項１、２、 ７、または８のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
11. １１．前記ＤＮＡ配列が１つ以上の発現制御配列に機能し得るように連結されて いる、請求項１、２、７、または８のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
12. １２．請求項１１に記載のＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主。
13. １３．前記宿主が以下のものからなる群から選択される、請求項１２に記載の単 細胞宿主：Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；酵母；真菌菌株；組織培養の動物細胞；植物細胞；昆虫細 胞；およびヒト細胞。
14. １４．請求項１から１０のいずれかに記載のＤＮＡ分子によりコードされる、ポ リペプチド。
15. １５．請求項１４に記載のポリペプチドを産生する方法であって、請求項１２ま たは１３に記載の単細胞宿主を培養する工程を包含する、方法。
16. １６．下記のものからなる群から選択されるポリペプチド菌株ＺＳ７とＢ３１と を除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプチドおよびその血清型変異 体；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドおよびその血清型 変異体；上記ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列からのブロックとして取り 出した少なくとも１０のアミノ酸を含有するフラグメント；および上記ポリペプ チド、変異体およびフラグメントの誘導体であって、該誘導体がアミノ酸配列に おいて、上記ポリペプチド、変異体、またはフラグメントにおけるアミノ酸配列 と少なくとも８０％同一である誘導体。
17. １７．下記のものからなる群から選択されるポリペプチド：哺乳類宿主がＢ．ｂ ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染することにより生じる抗体と免疫学的に反応するポ リペプチドであり、その抗体が菌株ＺＳ７とＢ３１とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：４のＯｓｐＡポリペプチドと免疫学的に反応するポリペプチドおよびその血 清型変異体；哺乳類宿主がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染することにより生 じる抗体と免疫学的に反応するポリペプチドであり、その抗体がＳＥＱ　ＩＤＮ Ｏ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドと免疫学的に反応するポリペプチドおよ びその血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、および菌株ＺＳ７とＢ３１ とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプチドと免疫学的に反応す る抗体を誘起し得るポリペプチドおよびその血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒ ｆｅｒｉ、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドと免 疫学的に反応する抗体を誘起し得るポリペプチドおよびその血清型変異体；およ びＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの感染によって起こるライム病を効果的に防御す る免疫応答を治療されている哺乳類宿主中に誘起するポリペプチド。
18. １８．下記のものからなる群から選択される、請求項１６に記載のポリペプチド ：哺乳類宿主がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに感染することにより生じる抗体と 免疫学的に反応するポリペプチドであり、その抗体が菌株ＺＳ７とＢ３１とを除 く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプチドと免疫学的に反応するポリ ペプチドおよびその血清型変異体；哺乳類宿主がＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに 感染することにより生じる抗体と免疫学的に反応するポリペプチドであり、その 抗体がＳＥＱ　ＩＤ ＮＯ：１０のＯｓｐＡ変異体ポリペプチドと免疫学的に反 応するポリペプチドおよびその血清型変異体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、お よび菌株ＺＳ７とＢ３１とを除く、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４のＯｓｐＡポリペプ チドと免疫学的に反応する抗体を誘起し得るポリペプチドおよびその血清型変異 体；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｒｆｅｒｉおよびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０のＯｓｐＡ 変異体ポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を誘起し得るポリペプチドおよび その血清型変異体；およびＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの感染によって起こるラ イム病を効果的に防御する免疫応答を治療されている哺乳類宿主中に誘起するポ リペプチド。
19. １９．前記ポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３のヌクレオチド４００−８１ ９またはそのフラグメントによりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１４ 、１６、または１７のいずれかに記載のポリペプチド。
20. ２０．前記ポリペプチドが防御エピトープを含む、請求項１４、１６、または１ ７のいずれかに記載のポリペプチド。
21. ２１．第１のポリペプチドおよび付加的ポリペプチドを含む融合タンパク質であ って、該第１のポリペプチドが請求項１４、および１６から２０のいずれかに記 載のポリペプチドからなる群から選択される、融合タンパク質。
22. ２２．前記付加的ポリペプチドが請求項１４、および１６から２０のいずれかに 記載のポリペプチドであり、前記第１のポリペプチドとは異なるＢ．ｂｕｒｇｄ ｏｒｆｅｒｉの菌株由来である、融合タンパク質。
23. ２３．前記第１のポリペプチドがＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ菌株Ｎ４０由来で あり、前記付加的ポリペプチドＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ菌株２５０１５由来 である、請求項２２に記載の融合タンパク質。
24. ２４．請求項１４、および１６から２０のいずれかに記載のポリペプチドを含む 、多量体タンパク質。
25. ２５．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの感染によって起こるライム病を効果的に防 御する免疫応答の形成を哺乳類宿主中に誘起するポリペプチドを選択する工程で あって、 （ａ）該ポリペプチドを用いてＣ３Ｈ／Ｈｅ系マウスを免疫し；（ｂ）該免疫し た動物にＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを接種し；次いで（ｃ）該免疫した動物を 感染およびライム病から防御するポリペプチドを選択する、工程； を包含する、工程。
26. ２６．薬学的に受容可能な担体および下記のものからなる群から選択される成分 の治療上の有効量を含む医薬組成物：請求項１４および１６から２０のいずれか に記載のポリペプチド；請求項２１から２３のいずれかに記載の融合タンパク質 ；請求項２４に記載の多量体タンパク質；およびＯｓｐＢポリペプチド。
27. ２７．前記成分が免疫原性担体と架橋される、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. ２８．さらにアジュバントを含む、請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
29. ２９．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染およびライム病を治療または予防する方 法であって、請求項２６から２８のいずれかに記載の医薬組成物の治療上の有効 量を患者に投与する工程を包含する、方法。
30. ３０．請求項１４および１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド、並びに ＯｓｐＢポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドと結合する抗体。
31. ３１．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３０に記載の抗体。
32. ３２．前記抗体がモノクローナル抗体ＶＩＩＩＣ３．７８である、請求項３１に 記載の抗体。
33. ３３．前記モノクローナル抗体ＶＩＩＩＣ３．７８を産生するハイプリドーマ。
34. ３４．前記抗体が防御抗体である、請求項３０に記載の抗体。
35. ３５．防御抗体を選択する工程であって、（ａ）Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系マウスを抗体を 用いて免疫し；（ｂ）該免疫した動物にＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉを接種し； 次いで、（ｃ）該免疫した動物を感染およびライム病から防御する抗体を選択す る、工程； を包含する、工程。
36. ３６．請求項３０から３２および３４のいずれかに記載の抗体並びに薬学的に受 容可能な担体を含む医薬組成物。
37. ３７．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染およびライム病を治療または予防する方 法であって、請求項３６に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与する工程を包 含する、方法。
38. ３８．請求項３０から３２および３４のいずれかに記載の抗体並びに使用説明書 を含む、診断キット。
39. ３９．使用説明書、並びに請求項１４および１６から２０のいずれかに記載のポ リペプチド、およびＯｓｐＢポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチ ドを含む、診断キット。
40. ４０．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染を検出する方法であって、請求項３０に 記載の抗体を用いて感染が疑われる哺乳類宿主の体液をアッセイする工程を包含 する、方法。
41. ４１．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ感染を検出する方法であって、請求項１４お よび１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド、およびＯｓｐＢポリペプチ ドからなる群から選択されるポリペプチドを用いて感染が疑われる哺乳類宿主の 体液をアッセイする工程を包含する、方法。