CZ456090A3 - Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky - Google Patents
Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ456090A3 CZ456090A3 CS904560A CS456090A CZ456090A3 CZ 456090 A3 CZ456090 A3 CZ 456090A3 CS 904560 A CS904560 A CS 904560A CS 456090 A CS456090 A CS 456090A CZ 456090 A3 CZ456090 A3 CZ 456090A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- burgdorferi
- antigen
- vaccine
- ospa
- monoclonal antibodies
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 48
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 36
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 claims 3
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 abstract description 7
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010062746 Carditis Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 abstract description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N butyl 2-methylprop-2-enoate;methyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound COC(=O)C(C)=C.CCCCOC(=O)C(C)=C WHLPIOPUASGRQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000021646 inflammation of heart layer Diseases 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101150040471 19 gene Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010036030 Polyarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003541 chymotrypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- XULSCZPZVQIMFM-IPZQJPLYSA-N odevixibat Chemical compound C12=CC(SC)=C(OCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC)C(O)=O)C=3C=CC(O)=CC=3)C=C2S(=O)(=O)NC(CCCC)(CCCC)CN1C1=CC=CC=C1 XULSCZPZVQIMFM-IPZQJPLYSA-N 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 208000030428 polyarticular arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká očkovací látky proti boreliose, obsahující monoklonální protilátky, specifické proti antigenůn Borrelia burgdorferi, způsobu její výroby a příslušných monoklonálních protilátek.
Dosavadní stav techniky ·>
Boreiiosa,onemocnění Lyme nebo lymská horečka je v současné době nejčastějším infekčním onemocněním, které se přenáší klíšťaty. Toto onemocnění je vyvoláváno spirochetou Borrelía burgdorferi, onemocnění přenášejí na člověka především kiíšťaza kmene Ixodes. Jde o chronickou progresivní infekci, napadající řadu orgánů, jako jsou pokožka, centrální a periferní nervový systém, srdce, játra, ledviny a svalový a kostní systém. Vzhledem k tomu, že dostatečná léčby antibiotiky je obtížná, je v současné době prováděna řada výzkumů s cílem změnit a zvýšit odpověď imunitního systému na infekci uvedeným mikroorganismem. U lidí s uvedeným onemocněním byl zjištěn vysoký titr protilátek proti B. burgdorferi, tato skutečnost však nebyla ukazatelem ochrany proti infekci. Původce infekce pravděpodobně velmi rychle přechází z krevního oběhu do tkání, kde již není pro imunitní systém bezprostředně dosažitelný. To znamená, že ochrana pomocí protilátky je možná pouze bezprostředně po začátku infekce, kdy se mikroorganismus ještě nachází v krevním oběhu.
Skutečnost, že přirozená infekce B. burgdorferi byla nalezena u řady živočišných druhů vedla k pokusům vytvořit laboratorní modely pro toto onemocnění, až dosud s omezeným úspěchem. Při pokusech se specifickou odpovědí u myši bylo prokázáno, že infekce u inbredních myších kmenů, pěstovaných již delší dobu s izolátem B. burgdorferi vedla k mírným, avšak významným pathomorfologickým směnám různých orgánů, jako je mozek, srdce, plíce a ledviny, přičemž tyto změny byly srovnatelná se změnami ά lidí s tímtéž onemocněním, jak bylo uvedeno v publikaci Schaible a další, (1988),
Infect. Immun. 1, 41. Skutečnost, že se vytvořily pouze mírné změny, byla způsobena patrně poklesem schopnosti vyvolat protilátky a sníženou virulencí mikroorganismu, již dlouho pěstovaného in vitro nebo schopnostmi myší vyvinout dostatečnou imunologickou odpověc, jak bylo popsáno v publikacích Johnson a další, (1984), J. Clin. líicrobiol. 20, 747; Schwan a další (1958), Infect. and.Immun. 5c, 1837.
Vynález si klade za úkol připravit účinnou očkovací látku proti uvedenému onemocnění. X tomuto účelu je zapotřebí nejprve získat vhodný laboratorní model. Bylo nyní navrženo užít kmen myší bez funkčních T- a B-buněk, tzv. kmen Scid-myší. popsaný v publikaci Bosma a další, (1983) Nátuře 10, 52, protože tyto myši vyvinou po infekci B. burgdorferi ve formě izolátu vícesystémové onemocnění a převážně polyarthritis a karditis,
Na tomto modelu je poprvé možné zkoušet účinnost očkovacích látek proti uvedenému onemocnění.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří očkovací látka proti boreliose, onemocnění Lyme, tato očkovací látka obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen
31kD, OspA nebo 34 kD, OspB, Borrelia burgdorferi.
Očkovací látka podle vynálezu může obsahovat jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31 kD (OspA) B. burgdorferi nebo jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 34 kD (OspB) B. burgdorferi.
Ze specifických protilátek je zepména možno použít protilátku, specifickou pro antigen%. kD B. burgdorferi z kmenů ZS7 (DSM 5527) nebo/a B31 (ATCC 35210), nebo protilátku, specifickou pro antigen 34 kD B. burgdorferi z kmenů ZS7 (DSM 5527) nebo/a B31 (ATCC 35210).
Výhodné jsou zejména očkovací látky, které obsahují protilátku proti vynálezu ze třídy IgG, zejména podtřídy IgG2b nebo IgGl.
Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby očkovací látky proti boreliose, který spočívá v tom, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy B. burgdorferi nebo jejich částmi vytvoří fúzí buněk hybrid, produkující monoklonální protilátku LA2 nebo monoklonální protilátky LA 25.1, LA 26.1 nebo LA 27.1. K imunizaci je možno použít kompletní organisn my B. burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
Součást podstaty vynálezu tvoří také příslušné monoklonální protilátky, a to LA-2 proti OspA, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 89091302 nebo LA-26.1 proti OspA, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 90050406. Mimoto může jít ještě o protilátky proti OspB, a to LA-25.1, vylučovanou buněčnou linií hybridomu ECACC 90050405 a LA-27.1, vylučovanou buněčnou linií hybridomu ECACC 90050407 až 7
Použití protilátek podle vynálezu působí neočekávaně na rozdíl od použití jiných protilátek, například proti povrchovému antigenu 41 kD B. burgdorferi (Flagelin) u imunodeficientních pokusných zvířat, s výhodou Scid-myší, infikovaných životaschopnou pathogenní B. burgdorferi, zvláště kmene ZS7 zbrzdění zánětu kloubů, srdečního svalu a jater, a to úplně nebo ve značné míře.
Pathogenní organismy B. burgdorferi je možno získávat tak, že se z imunodeficientních pokusných zvířat, s výhodou myší, předem infikovaných tímto mikroorganismem mikroorganismy získají zpět, přičemž jejich pathogenita zůstává zachována.
Protilátka podle vynálezu může být zpracována na lékovou formu při použití běžných nosičů, plniv a pomocných látek.
Vynález bude dále osvětlen příklady provedení v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna DNA a řetězec aminokyselin antigenu 31 kD, OspA, B. burgdorferi.
Na obr. 2 je uvedena imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2.
Příklady provedení vynálezu /
Příklad 1
Indukce arthritis, karditis a hepatitis u Scid-myší infekcí kmenem 3. burgdorferi ZS7
Infekce myší Bv burgdorferi
Dospělé myši kmene C.3-17 Scid (homozygot pro Scid-mutaci) a C.B-17 se infikují podkožní injekcí 1 χ 105, 5 x 105, 1 x 10 6 nebo 1 χ 108 životaschopných nebo usmrcených (UV-světlo) B. burgdorferi do kořene ocasu.
- 9 Izolace B. burgdorferi z klíštat a myší
Výzkumy byly prováděny s již dlouho pěstovaným kmenem B. burgdorferi B31, ATCC 35210 a s čerstvým izolátem ZS7, DSM 5527, který byl izolován z klíštěcí samice kmene Ixodes rizinus. VSechny kmeny B. burgdorferi byly pěstovány v modifikovaném Kellyho prostředí z publikace Barbour a další, (1983) Switzerland. Curr. Microbiol.
ho
8, 123. Organismy, izolované ze středný'střeva klíštat, sterilizovaných ethanolem nebo z krve infikovaných myší byly zpočátku pěstovány v Kellyho prostředí s přidáním 8/Ug/ml kanamycinu a 230/Ug/ml fluoruracilu podle publikace Johnson a další, (1984) J. Clin. Microbil. 1, 81.
Serologické testy &. Zjištění specifických prótilátek proti B. burgdorferi se provádí běžným testem ELISA podle publikace Justus a další, (1988) V/ehrmed. Mschr. 32, 263. Standardní křivka pro obsah imunoglobulinu (lg) byla získána převrstvením vyhloubení lg proti myším (ředění 1 : 500 roztoku sera, Paesel, Frankfurt, SNR) a titrací obsahu celkového množství IgG nebo IgM proti myši (Calbiochera, LaJolla, USA). Obdobným způsobem byl měřen celkový obsah IgM a IgG v seru. Koncentrace těchto specifických protilátek se udává v /ug/ml sera, vztaženo na lg.
Imunofluorescence a barvení podle Gimmsy.
/til krve se napipetuje do zkumavek hematokritu (Becton a Dickinson, Heidelberg, NSR) a pak se odstředí při 5 000 g v odstředivce pro hematokrit (ECCO, NSR) Zkumavky se rozříznou ve fázi mezi šerem a erythrocyty a 5/Ul sera se nanese na nosič (Superior, Bad Mergentheim,
NSR). Nosič se vzorkem sera se suší ne vzduchu a pak se fixuje 100% ethanolem 1 minutu při -20 °C. Po inkubaci 1 hodinu s králičím hyperimunním šerem proti B. burgdorferi v ředění 1 : 100 při teplotě místnosti se nosič' pětkrát promyje PBS a pak se 1 hodinu barví při použití kozího antisera proti králíkům, konjugovaného s FITC (ředění 1 : 20, Jackson Lab., West Grove, USA). Psk se nosič promyje, uloží do směsi glycerolu a želatiny (Merck, Darmstadt, NSR) a okamžitě se sleduje ve fluorescenčním mikroskopu. Neošetřené kapky krve se usuší na vzduchu, fixují v methanolu, barví se podle Giemsy (0,1 %, Merck, Darmstadt, NSR), odbarví v PBS a uloží do prostředku Entellan (Merck, Darmstadt, NSR))
Histologické preparáty a postupy při barvení
Různé vnitřní orgány, jako mozek, srdce, plíce, játra, ledviny, slezina a klouby myší, infikovaných B. burgdorferi se v různé době po infekci odstraní a uchovávají bučí v kapalném dusíku pro přípravu zmrazených řezů nebo v 5% formaldehydu v PBS pro uložení do parafinu nebo methakrylátu. Pak se vytvářejí řezy o tloušíce 4 až 7/um, které se barví Hematoxylinem-Eosin a pak se ukládají do prostředku Entellan (Merck AG, Darmstadt, NSR). Imunohistologické sledování se provádí při použití systému s obsahem streptavidinu, biotinu a peroxidézy podle publikace Kramer a další, (1989) Eur. J. Immunol. 19, 151.
Následující tabulka 1 ukazuje, že organismy B. burgdorferi, izoláty ZS7 a B31 bylo možno zjistit v krvi Scid-myší, naočkovaných životaschopnými mikroorganismy, po celou dobu pokusu. Jinak bylo možno rekultivovat pouze spirochety kmene ZS7, avšak nikoliv kmene B31 in vitro. Při srovnání rekultivovaných organismů s primárním izolátem ZS7 nbbylo možno prokázat žádné změny v obsahu bílkovin nebo v profilu ]3asmidu. Po celou dobu pozorování bylo možno u Scid-myší, Infikovaných B. burgdorferi prokázat jen velmi malý nebo žádný titr irelevantních protilátek. Nebylo možno prokázat žádné protilátky typu IgMnebo IgG, specifické proti uvedenému mikroorganismu. Naprotitomu docházelo u kontrolních myší C.B-17, rovněž infikovaných, k expresi velkého množství celkových protilátek Ig a současně bylo možno prokázat vysoký titr specifických ) i
protilátek IgMca IgG proti B. burgdorferi. liezi 7 a 22 dnem po infekci izolátem ZS7 bylo možno pozorovat u Scid-myší první klinické příznaky zánětů kloubů, a to zčervenání a otok obou tibioterálních kloubů, stav se zhoršoval. Nebylo však možno pozorovat žádné takové příznaky u Scid-myší, infikovaných izoláteia ZS7 po jeho ozáření UV-světla, nebo izolátem B31, a to životaschopným, ani u kontrolních myší C.Bt17, infikovaných životaschopným izolátem ZS7.
Také histopathologicky bylo možno prokázat kloubní změny u Scid-myší, infikovaných životaschopným izolátem ZS7, jak je zřejmé z tabulky 1. Bylo možno prokázat těžké poškození kloubů, které se projevovalo zánětlivou hyperplasié synoviální výstelky, spojená s rozrušením chrupavky a/nebo kosti. Dále byl zjištěn zánět celého srdce s průnikem mononukleárních buněk do endokardu myokardu,a perikardu. Dále bylo možno pozorovat progrsivní zánět jater, přičemž bylo možno pozorovat vznik jaterní fibrosy, infiltrace mononukleárních buněk byla omezena na oblast portální žíly a velkých žil. Mimoto bylo možno pozorovat menší poškození hlavy, plic, mozku a příčně pruhovaných svalů.
•rl b
Λ β
• tC •g
X 3 «0 24 3 «ί X iH *H •H • ι · I I I ό 'J· I IA 02 ►2
O u
o.
u
O.
V)
I I I 00 LO | | m O m
o rH
XI f-t
| •rl +> | -rl | te w | K |
| +J | |||
| flk | B | ||
| ►» | O | O | |
| +i | 24 | X | |
| • | b | rH | |
| X | « | i | |
| o | &C | O | |
| o | |||
| b | 1 | ||
| •H | 4* | ||
| G. | 3 | ||
| » | a | • | |
| • | te | ||
| O | a | 4» | 9 |
| O | •rl | a | rH |
| 3 | •rl | • | |
| rH | •rl | X | X |
| O | ta | ||
| X | X | t | |
| •rH | +* | o | |
| O | b | •rl | |
| b | -3 | 8 | |
| •rH | o | ||
| * | rH | >2 | |
| t- | X | 24 | |
| rH | |||
| 1 | 1 | M | |
| CQ | 1 | x | |
| • | • | ||
| o | •rl | o | |
| b | 3 | ||
| Ή | « | rH | |
| >09 | OH | O | |
| ►2 | b | 3 | |
| B | O | l-H | |
| 3 | |||
| X | to | O | X |
| o | b | O | •rl |
| Ή | 3 | 24 | > |
| 3 | X | O | b |
| rH | +i | 24 | |
| 9 | • | O | |
| b | CQ | o | ► |
| P | |||
| 3 | |||
| O | •H | ||
| 24 | o | O | |
| 3. | 24 | ||
| 3 | o | ||
| ►2 | *H | ||
| t- | 3 | 3 | |
| rH | a | •H | |
| 1 | |||
| ca | |||
| • | |||
| a | •rl | 4» | |
| b | © | ||
| Ή | e | Ό | |
| >00 | *H | o | |
| ►> | b | a. | |
| E | O | ||
| 1 | 3 | ||
| 3 | te | ||
| •rl | b | ||
| O | 3 | 3 | |
| w | X | o | |
| • | B | ||
| « | CQ |
X m
Γ-» c/j
N
I—I 20 20 ¢0 Ό* ·- I | CN CN 02 O ΙΠ -jΠ rO J3
C C « Ό Al
| řo | **r | N· | CN | |
| •n< | o | r* | O | in |
| 20 | o | m | 00 | 02 , |
| cn | • | • | • | • |
| IA | 20 | cn | rH 1 | |
| IA | m | Xf | 20 ! | |
| v- | N* | O | rH | |
| m | ΙΛ | r—í | cn | CN ' |
| • | • | |||
| <M | CN | ΐ |
«3
Λ
JO J3 + + + + + + + c c 4 · + + ++ ++ ++ 44 +
III lilii o . .
___ *^· -a JO + . . | | | , I I I
CQ · CQ CQ . CQ O CQ · · + + + + + + c c
Δ J3 + + +4+4 + + · · 4 c c
02 02 A- cn <\i 02 Γίη n* m cn ru cn co co
O «o
O
O'0ajO2CNO2«0^J' I I «-«-ímCNCNCN—CN
ΙΑ Ό «0 CO «0 O O O o O Η Η H r· H X X X X X co
O *H c
| 1 | 3 | |
| •rl | CQ | •<H |
| HO | • | ϋ |
| >2 | u | m |
| 31 |
II c
Γ*
W
N
ΓW
N l~~ w
CN u
ur-l > cn 3 CQ r>
M
N
Γοο
CN i rCQ II • C
U —
X «
CQ «
► b
N «
O rH
O
N •rl
O s
β o
« b
<-H «-Ι
O
B
O
X «
« >
b x
o >
o
B rl
O zrudnutí a otok tibiotarsálních kloubů, : - znamená méně než 7,5/ig/ml séra >3 «
B
N r-l >2 jD «
- 14 Příklad 2
Účinnost specifické monoklonální protilátky proti antigenu B. burgdorferi 31kD na průběh Borreliosy-Lyme u Scid-myší
Získání monoklonální protilátky
Při imunizaci myši s neporušeným imunologickým systémem dochází při infekci 3. burgdorferi k expresi polyklonálních protilátek, specifických pro B. burgdorferi, jak je zřejmé z tabulky 1.
Myší samice inbredního kmene BALB/c ve stáří 10 týdnů byly imunizovány B. burgdorferi, kmenem B31, ATCC 35 210, |smen byl homogenizován ultrazvukem. Imunizace byla prováděna následujícím způsobem:
Den 0: 200/Ug antigenu Borrelia v úplném Freundově pomocném prostředku podkožně.
Den 21, 35, 49, 63: dalších lOO^ug antigenu intrajSeritoneálně ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, obsahujícím fosfátový pufr.
Den 66:vyjmutí sleziny a získání suspenze jednotlivých buněk.
Imunní slezinné buňky byly podrobeny fúzí s myelomovou buněčnou linií Ag6-PAI standardním způsobem
- 15 při použití polyethylenglykolu podle publikace J.H.Peters,
H. Bauagarten, M. Schulze, Monoklonale Antikórper, Springer-Verlag, Heidelberg.
Produkty fúze byly naočkovány do desek s 96 vyhloubeními. Po osmi dnech byly supernatanty kultury sledovány zkouškou ELISA v pevné fázi na přítomnost specifických monoklonálních protilátek proti B. burgdorferi podle svrchu uvedené publikace J.H. Peters a dalších.
Bu*nky hybridomu z kultur, produkujících protilátky byly po zředění déle klonovány. Supernatanty kultur jednotlivých klonů byly znovu vyšetřeny zkouškou ELISA v pevné fázi, analýzou Western-Blot a immunofluorescencí. Monoklonální protilátky LA-2 podtřídy IgG2b byly produkovány monoklonální linií hybridomu a touto linií rovněž vylučovány a reagovaly při zkoušce Western-Blot se strukturou 31kDa (Osp-A) všech vyšetřovaných kmenů B. burgdorferi, mimo jiné také izoláty ZS7 a B31. Tyto protilátky byly děleny elektroforeticky na SDS-gelu a také zkouškou Western-blot pomocí bílkoviny B. Burgdorferi přeneseny na membránu. Monoklonální protilátky LA-26.1C (anti-OspA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB, 34 kDa antigen, IgG2b) a LA 27.1 (anti OspB, 34 kDa antigen, IgGl) je možno získat a charakterizovat analogickým způsobem.
- 16 Infekce myší B. burgdorferi ZS7
Scid-myši C.B-17 byly infikovány podδ kožně v oblasti kořene ocasu množstvím 1 x 10 životaschopných jedinců izolátu B..burgdorferi ZS7.
Ošetření myší antiserem
Infikované Scid-myši byly' ošetřeny 2x týdně různými antisery. První skupině bylo podáno sérum NMS (normální myší sérum), druhé skupině sérum IMS (imunní myší sérum) a třetí skupině bylo podáno sérum s obsahem monoklonální protilátky LA-2 proti antigenu 31 kD-aB. burgdorferi. Dávka antisera byla v prvním týdnu lOC^ul nebo 100/ug pro LA-2, ve druhém týdnu 200^ul nebo 200^ug pro LA-2 a ve třetím týdnu 300/Ug nebo 300/ul pro LA-2,
Z následující tabulky 2 je zřejmé, že myši Scid, neošetřené nebo ošetřené NMS měly po 12 dnech klinické a histopathologické projevy zánětů kloubů, srdce a jater. Oproti tomu monoklonální protilátka LA-2 podstatně omezila tyto příznaky. Klinicky došlo pouze k lehkému zrudnutí a histopathologia’# pouze k marginálním změnám. Při podání IMS nebylo možno pozorovat žádné klinické projevy.
Průkaz B. burgdorferi kultivací in virro bylo možno získat pouze u neošetřených myší nebo myší, ošetřených NMS nikoliv v případě LA-2 nebo IMS.
| Ρ β Φ β Ο Ό | ||
| <50 | Ρ | |
| β | ο | |
| 3 | σ | |
| Χ5 | > | |
| • | Ρ | |
| CQ | Ρ Ρ | |
| Ν | 3 | |
| 0 Μ •3 β β | Μ | |
| •Η | ||
| β | ta | |
| φ | Ρ | >» |
| Ρ | Λ | |
| β | «Ρ | υ |
| Ο | Ρ | •Η |
| Ό | 0 | <50 |
| <50 | β. | Ο |
| β | φ | Ρ |
| 3 | Λ | ο |
| Λ | \ | Λ |
| 0 | Ρ | |
| • | Ρ | 0 |
| CQ | Ρ | β |
| Ρ | ο | |
| Ρ | Ό | Ρ |
| Ο | β | κ |
| Λί | 0 | Ρ |
| Φ <Η | Λ! | Λ |
β
I cP
I
| Ο β | >> Λ! | |||
| σι | υ | |||
| S | Ρ | |||
| φ | <50 | |||
| β | Ο | |||
| σ | φ | 1 Ρ | ||
| 0 | ο ο | |||
| Ρ | •3 | ρ Λ | ||
| Ρ | JO | ω ρ | ||
| Ρ | β | 3 | Λ | Ρ 0 |
| 0 | Ο | ϋ | X! β | |
| 3 | Ρ | Φ | ||
| Αί | β | >> | ||
| JD | Ρ | Ό | ||
| I | Ρ | Ο | ||
| 0 | ΰ | χυ | CJ | •Η |
| • | β | Ρ | β | |
| Ε-ι | ο | XD | •Η | |
| Ν | Ο | rd | ||
| Ρ | β | X |
χη >»
S
I
Ό
Ρ
Ο
W β
φ >β
Ρ φ
χα β
β
Φ ta
Ρ
Ρ β
Ο t«—I I
CQ η m ιι ιι β β
CM
I c
Ρ, cu η ιι ιι β β
| •3 | Í? |
| Λ | XL· |
| 3 | ε |
| Ο | Ν |
| Ρ Λ! | Ρ |
| Ρ | β Ρ |
| Ρ | Ό |
| 3 | β |
| β | Ρ |
| Ό | <0 |
| 3 | β |
| β | α |
| Ν | θ |
| Ό) | φ |
| Μ | Ν |
| Λ | 3 |
| Φ | Ο |
| Ρ | β |
Příklad 3
Klonování a exprese antigenu 31kD (OspA) z 3. burgdorferi ZS7
Příprava DNA
Vysokomolekulární DNA·,z kmene 3. burgdorferi ZS7 byla čištěna po kultivaci v modifikovaném Kellyho prostředí. Spirochety byly peletovány odstředěním při 10 000 g a třikrát promyty P3S-pufrem. Usušená peleta byla znovu suspendována v 10 ml TE s obsahem 10 mmol/1 tris a 1 mmol/1 EDTA při pH 4, pak byl na 15 minut při teplotě 30 °C přidán lysozym v množství 5 mg/ml, načež bala DNA uvolněna přidáním 1 ml 20% SDS. Po přidání 1,5 ml roztoku NaCl s obsahem 5 mol/1 byl roztok extrahován stejným objemem fenolu a pak chloroformem. DNA pak byla vysréžena přidáním dvou objemů absolutního ethanolu s nášlednou inkubací přes noc při teplotě -20 °C. Po odstředění byl zbytek rozpuš těn v O'^5 ml TE, pak byl inkubován s DNA-ázou, prostou RNA-ázy A (20/Ug/ml) po dobu 45 minut při teplotě 55 °C, načež byla na 1 hodinu při teplotě 37 °C přidána proteináza K v množství 0,1/Ug/ml. Pak byl přidán NaOAc do koncentrace 0,3 mol/1 a směs byla jako svrchu extrahována fenolem a chloroformem. Po vysrážení ethanolem byla DNA znovu uvedena do roztoku v TE.
- 19 Příprava genové banky
Vysokomolekulární DNA byla statisticky rozdělena na menší části působením ultrazvuku po dobu 3 sekundy. Pak byla užita T4-DNA-polymeráza (3C minut při 37 °C) a Henowův enzym (5 minut při 20 °S) k vyrovnání zakončení vzniklých fragmentů. Vzniklá DNA byla pak navázána do místa štěpení enzymu BamHI vektoru pro expresi pUEXl při použití strategie klonování použitím adaptéru podle pablikace Bresan und Stanley (1987) Nucl. Acid. fies., str. 1056. Po selekci podle velikosti při poůžití chromatografie s molekulárním sítem a prostředku Sephactyl S-1000 a po transformaci kompetentních buněk E. coli MC 1061 byl podíl re kombinantních jednotek pro tvorbu plaků (pfu) stanoven následujícím způsobem. Náhodně zvolené kolonie byly odebrány a pěstovány ve 2 ml selekčního prostředí LB s 25/Ug/ml ampicilinu až do nasycení. DNA plasmidu byla pak izolována běžným rozrušením za alkalických podmínek a pak byla rozštěpena enzymem BamHI. Více než 50 % analyzovaného plysmidu obsahovala včleněné řetězce DNA se středním průměrem - 1,5 kb
Pěstování na plotnách a screening genové banky B. burgdorferi ZS7
Buňky byly naneseny na desku s rozměrem 24 x 24 cm v množství 7 000 pfu na jedné desce a byly inkubovány přes noc při teplotě 30 °C. Po přenosu kolonií na nitrocelulosový filtr (NC) byla indukována exprese slo0 ženě bílkoviny s obsahem S-galaktosidázy dvouhodinovou inkubací při teplotě 42 °C. Filtr hyl přenesen na papír Whstman 3MM, předem zpracovaný 5% SDS a papír byl inkubován 25 minut při teplotě 95 °C. Pak byly bílkoviny podrobeny elektroblotu při použití běžného zařízení k provedení metody Western blot při použití částečně usušeného materiálu.
Po zpracování NC-filtrú DNA-ázou byly imunoreaktivní klony identifikovány za použití monoklonálních protilátek. Nespecifická vazná místa na NC-filtrech byla vysycena Čtyřhodinovou inkubací s PBS s obsahem 0,2 % hmotnostních želatiny a 3 mmol/l NaN^ při teplotě místnosti. Nakonec býly filtry inkubovány 18 hodin za stálého protřepúvání se super natanty kultury anti-31 KD monoklonálního klonu LA-2. Po důkladném promytí (PBS + 1 % objemové Tritonu X-100), pak PBS + 0,5 mol/1 chloridu sodného a nakonec PBS + 1 mol/1 chloridu sodného, každý stupeň trvá 10 minut, byly filtry inkubovány 1,5 hodin při teplotě místnosti za stálého protřepávání s králičí protilátkou proti myšímu IgG, značenou peroxidázou FCabíg v ředěná^l ; 10 000. Filtry byly znovu promyty jako svrchu a pak byly inkubovány s di-aminobenzidinem jako substrátem pro peroxidázu. Z 10^ rekombinantních pfu reagovalo 20 klonů s monoklonální protilátkou LA-2.
Analýza řetězce antigenu 31 kD (OspA)
Běžným způsobem byla izolována včleněná DNA rekombinantního kmene E. coli, klonu s positivní reakcí s protilátkou LA-2. Včleněná DNA tohoto klonu obsahovala gen OspA, který je kódem pro antigen 31 kD B. burgdor feri v celé jeho délce. Plastnid, který obsahoval tento ře* tězec, byl označen pZS-7/31-2 a byl označen podle budapešťské úmluvy a uložen do veřejné sbírky pod číslem DSM 5528.
Rekombinantní bílkovina, produkovaná tímto positivním klonem byla označena r2S7/31-2 a byl stanoven kódový řetězec DNA genu OspA. Tento řetězec je uveden v tabulce 5 společně s odvozeným řetězcem aminokyselin pro bílkovinu OspA.
Z tabulky 5 je rovněž zřejmé, že antigen 31 kD z B. burgdorferi je bílkovina, která obsahuje 273 aminokyselin.
Příprava nesložená bílkoviny
a) Klon, u nějž dochází k expresi imunoreaktivní bílkoviny rZS7/31-2 byl pěstován přes noc při 30 °C v 10 ml prostředí LB s ampicilinem. 1 ml kultury byl pak přidán ke 100 ml selekčního prostředí a materiál byl pěstován při 30 C za provzdušnovéní až do hustoty 6 x 10 buněk v 1 ml (Α^θθ = 0,2). Exprese rekombinančních bílkovin bylo dosaženo přenesením buněk do teploty 42 °C. Po zchlazení a odstředění byly buňky promyty pufrem STE, který obsahoval 10 mmoKl tris, 100 mmol/1 chloridu sodného a 1 mmol/1 EDTA při pH 6,0 a získaný materiál byl znovu uveden do suspenze v 0,6 ml pufru pro rozeušení buněk s obsahem 25 % sacharosy a 50 mmol/1 tris při pH 8,0. Po přidání 150/Ul roztoku s obsahem 10 mg/ml lysozymu byla směs inkubována 15 minut v ledu a pak ještě dalších 15 minut v ledu 'za přítomnosti lS^ul roztoku s obsahem 10 mg/ml DNA-ázy 1 za přítomnosti 5/Ul 1 mol/1 chloridu hořečnatého. Pak bylo přidáno 250/ul 4x směsi smáčedel (1 % Triton X 100, 0,5 % Deoxycholátu, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 tris, o pří 7,4) a směs byla znovu inkubována 5 minut v ledu. Po odstředění byla usazenina dvakrát promyta pufrem A (50 mmol/1 tris, mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,0) a pak byl materiál znovu uveden do suspenze v devíti objemech pufru A s obsahem 8 M močoviny a směs byla 1 hodinu inkubována při teplo tě místnosti. Pak byl vzorek zředěn devíti díly pufru B (50 mmol/1 dihydrogenfosforečnanu a hydrogenfosforečnanu draselného, 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 10,7), směs se ještě 30 minut míchá při teplotě místnosti a pH se udržuje hydroxidem draselným na hodnotě 10,7. Pak se pH rozto ku upraví na 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové a vzorek se dialyzuje přes noc proti pufru A při teplotě 4 °C, pak 10 minut při teplotě 4 °C, načež se odstřeluje 10 minut při teplotě 4 °C a 10 000 ot/min (rotor SS34). Supematant s obsahem rekombinantní bílkoviny se uchovává při -20 °C.
- 23 b) Vzhledem k tomu, že tento klon vylučuje iraunoreaktivní bílkovinu rZS7/31-2 také do živného prostředí, je možné čištění afinitní chromatografie přímo ze supernatantu kultury.
Příprava rekombinantní nesložené bílkoviny OspA a čištění afinitní chromatográfii
Rekombinantní bílkoviny pak byly čištěny afinitní chromatográfii. K tomuto účelu byly na aktivovanou Sepharose CL 43 kovalentně vázány čištěné monoklonální protilátky LA-2. Dialyzovaný extrakt močoviny byl s rekombfantní bílkovinou navázán na Sepharose CL 4B s myším IgG a nakonec byla tato směs přidána do sloupee LA-2-Sepharosy CL 4B. Po intenzivním promytí byla vázaná rekombinantní bílkovina podrobena eluci směsí 0,1 mol/1 glycinhydrochloridu a 0,1 mol/1 NaCl o pH g,5. Pak bylo pH této frakce neutralizováno okamžitým přidáním 1/10 objemu 0,5 mol/1 KgHFO^. Frakce s obsahem bílkoviny byly koncentrovány a dialyzovány. Pomoci elektroforézy na SDS-polyakrylamidoíém gelu byl stanoven stupeň čistoty.
Imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2
Rekombinantní bílkovina rZS7/z31-2 byla imunologicky zkoumána. Pro srovnání byla užita rekombinantní bílkovina r831/41-9 (povrchový antigen 41 kD B. burgdorferi).
Mikrotitrační plotny s plochým dnem byly převrstveny extraktem rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 a rB31/41-9 s použitím extraktu močovinou, popřípadě extraktem kmene E. coli MC 1061, který byl použit k expresi genu. Nespecifická vazné místa byla blokována 0,2% Želatinou v roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru. Do vyhloubení takto připravených mikrotitračních ploten byly přidány monoklonální protilátky LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), La-l (anti-41 kD, Flagellin) a ACHT-2 (anti-a^-Antichymotrypsin).
Vázané monoklonální protilátky by- . ly uvedeny do reakce s imunoglobuliny, specifickými proti myším a značenými peroxidázou. Vázané protilátky, značené peroxidázou byly kvantitativně stanoveny pomocí orthofenylendiaminy jako substráty pro peroxidázu. Absorpce při 492 nm (A^gg) byla stanovena přímo na mikrotitrační plotně pomocí automatizovaného fotometru. Velikost absorpce je přímo úměrná množství vázané monoklonální protilátky.
- 25 Monoklonální protilátka LA-2 specificky reaguje s bílkovinou rZS7/31-2, avšak nikoliv s MC 1061 nebo r331/41-9· Kontrolní reakce monoklonální protilátky LA-1 je specifická pro rD31/41-9· Monoklonální kontrolní protilátka ACHT-2 (negativní kontrola) se neváže na žádnou z uvedených bílkovin.
V tabulce 6 je znázorněno, že dochází k expresi antigenního epitopu na rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 po klonování z genomu B. burgdorferi ZS7, přičemž tento antigenní epitop je specificky rozpoznáván monoklonélní protilátkou LA-2.
Příklad 4
Srovnání specifických protilátek proti antigenu 31 kD (OspA) a 34 kD (OspB) s protilátkami, které jsou specifické pro antigen 41 kD (Blagellin)
Monoklonální protilátky LA-2 a LA-26.1 rozpoznávají antigen 31 kD OspA a je možno je přiřadit k isotypu IgG2’o a IgGl. Monoklonální protilátky LA-25.1 a LA-27.1 rozpoznávají antigen 34 kD OspB a je možno je přiřadit k isotypu IgG2b a IgGl. Monoklonální protilátky LA-1O a LA-21 jsou specifické pro periplasma26 tickou bílkovinu 41 kD, spojenou s bičíky B. burgdorferi a je možno je přiřadit k isotypu IgG2a a IgGl. Všechny svrchu uvedené protilátky je možno získat způsobem podle příkladu 2. Mělo oy být stanoveno, zda také monoklonální protilátky proti jinému sntigenu B. burgdorferi poskytují Scid-myším ochranu před klinickými projevy infekce.'
Polyklonální imunní sera anti-B31(IMS) bylo odebráno z myší C57BL/6 91 dnů po podkožním poθ dání 1 x 10 organismů B. burgdorferi B31. Polyklonální anti-ZS7 IMS byle odebrána z myší C57BL/6 po 68 dnech po θ podkožním naočkování 1 x 10° organismů B. burgdorferi ZS7. Obě sera obsahovala 60/Ug/ml specifických protilátek, jak bylo mošno prokázat zkouškou ELISA podle publikace Schaible a další, J. Exp. Med. 170 (1989), 1427 - 1432. Normální myší sérum (NMS) bylo odebráno z neinfikovaných myší C57BL/6.
Od naočkování v intervalech čtyř dnů byly svrchu uvedené protilátky nebo PBS-pufr podávány pasivně intraperitoneálně Scid-myším následujícím způsobem:
den 0 a 3: 100/Ul, den 7 a 10: 200^ul, den 13 a 17: 300/Ul.
Scid-myši, ošetřené protilátkami anti-ZS7IMS, anti-B31IMS nebo monoklonální protilátkou LA-2 nevykazovaly žádné viditelné klinické příznaky zánětu kloubů
- 27 nedošlo ke zčervenání ani otoku tibiotarsálních kloubů v průběhu 21 dnů. Neobjevily se ani příznaky zánětu srdce a jater. Histopathologické vyšetření neprokázaly změnu kloubů, srdce a jater u Scid-myší, které obdržely jakoukoliv z těchto protilátek.
Také další Osp-A specifické monoklonální protilátky LA-26.1 (IgGl) a OspB specifické protilátky LA-25.1 8 LA-27.1 potlačovaly nebo zmírňovaly všechny příznaky, zde však došlo k lehkým pathologickým změnám uvedených orgánů.
Naproti tomu měly Scid-myši po podání pufru PBS, NMS nebo monoklonální protilátky proti Flagellinu (LA-10 nebo LA-21) klinické příznaky typické arthritidy, jak je zřejmé u neošetřených myší a jak je uvedeno v tabulce 3. Těžké příznaky se zvyšovaly v průběhu času po naočkování a po celou dobu pozorování se nezmírnily.
ne
Ze Scid-myší, předem ošetřených anti-ZS7IMS nebo LA-2\>ylo možno izolovat spirochety. Oproti tomu bylo možno prokázat spirochety imunofluorescencí a kultivací z krve těch Scid-myší, které byly ošetřeny podáním pufru PBS, NMS nebo monoklonálními protilátkami LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1,
LA-10 nebo LA-21.
oo
ÍM
Λ! r-1 3 tí e<
o β φ ο η α Φ β . ο 03 4η ο 3 β 0Χ Ν Ο > 4π 0 Ό X Ο Μ 60Χ q <3 βΧ 3 β 3 3 θ (XXI μ ·Η ooo + + + + +
XH
XU
X +
(Λ
X
Ό β
(0 ο
ca •Η
I -ρ ο X Λ tím X Λ3 X 0X0 X X (ΧΛ: β χ ο υ 0 β
X XX já ca 6ο β χ χ o φ β £X Cuffl
| xo | CQ •rl |
| tí | -P |
| o | •H |
| ΐ £ | |
| X | X |
| X | β |
| tí | 0 |
| CU ř»> X | |
| tí | O |
| 3 | <30 |
| m | X |
β φ
*H
X
Φ xn o
ο-
| X | |
| 1 | X |
| • | XO |
| CQ | ř>> |
| • | a |
| o | |
| » | X |
| Ό | Φ |
| X | XJ |
| O | o |
I + + 4-1 +1 +1 β
X a
I +
'>»
Λί + + +1 +’ +1 + + +1+1 +1
JO 00 CM ÍM X tí
ÍM X (0 CO
| X | X | ||||||||
| o | o | tí | β | ||||||
| β | β | X | X | ||||||
| X | X | X | X | Χ“ν | z—* | ||||
| tí | β | X | X | c | CQ | CQ | |||
| o | o | w | ω | Φ | Φ | cu | CU | CU | |
| tí | tí | s | S | 60 | $ | 03 | ca | (0 | |
| X | X | <! | 0 | 0 | O | O | o | ||
| « | • | cu | X | X | o | ||||
| 60 | <30 | X | O | ca | Ph | ||||
| Φ | Φ | <n | ω | O | —' | X | rH | X | |
| tí | β | CQ | tSJ | • | * | • | |||
| l | 1 | o | X | UO | tr\ | c— | |||
| X | X | ÍM | X | ÍM | ÍM | CM | ÍM | ||
| co | w | X | X | 1 | 1 | 1 | 1 | t | 1 |
| CQ | tí | tí | <4 | <5 | *4 | <4 | |||
| Ph | § | 0 | 0 | 3 | t-3 | 1-4 |
OO ÍO tl II
C β m + it II β β uo m
II m n
II II β β m m
II II β β
X tí tí ca
Ό
OJ
XS
O
X
CO
X β
Ό >
O
XJ co β
tSJ
O
Φ •o λ
o '>>
Λ3
O
X <w o
o x;
x co
CU >β
Φ cu
X cn <3
O q
X
Ό ‘Φ *ro
XJ
O
Φ xo &
XS1
O a
rH >>
tí
Φ β
Φ o
ca
Φ β
o
X
4h
O β
a β
φ
4h β
O
Ό β
tí
N
CD tí •3 β
CU
II o
- 29 Fříklad5
Vliv antiséra myší, imunizovaných OspA na průběh onemocnění u Scid-myší
V tomto pokuse bylo prokazováno, že podání nativního OspA, izolovaného z 3. burgdorferi ZS-7 nebo rekombinantního OspA, izolovaného z bakterií E. coli, transformovaných rekombinantním plasmidem pZS-7/31-2,
DSM 5528 vyvolává u normálních myší kmene C57BL/6 tvorbu ochranných polyklonálních protilátek. V případě, že tyto protilátky jsou podány Scid-myším, chrání proti onemocnění. Bylo tedy možno prokázat, že rekombinantní OspA vyvolává ochrannou imunologickou odpověů, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA. Výsledky a podrobnosti pokusu jsou uvedeny v tabulce 4.
Získání rekombinantního OspA je uvedeno v příkladu 3.
Získání nativního OspA a imunizace myší tímto materiálem bude dále popsána.
Získání nativního 31kDa OápA
3,2 χ ΙΟ^θ spirochet se míchá 2 hodiny při 4 °C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu za přítomnosti in- 30 hibitoru proteézy (5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l benzamidinu a 0,5 mmol/l PMSF) při použití magnetického míchadla. Pak se směs odstřeSuje 90 minut s 10 000 ot/min a 4 °C V odstředivce (Sorvall). Vodná fáze s obsahem povrchové bílkoviny se izoluje a třikrát promyje chloroformem. Obsah bílkoviny se zjistí extinkcí při 280 nm nebo testem BCA.
V gelu s obsahem stříbra nebo metodou
Westernblot s králičím šerem proti B. burgdorferi lze prokáooo zat pro kmen ZS7 hlavní pás s molekulovou hmotností 31 £3tíoo ccc w ΰ&Ό a slabší pásy při í®, 34/á 65/^až 68 k=j· Ve směsi butanolu a vody poskytuje kmen B31 hlavní pás při 31 k-j a slabší pásy
0 i 34 kj·.
a
Imunizace myší nativním/rekombinantním OspA
Myši C57BL6 a myši C.B-17 byly očkovány třikrát v odstupu 7 až 10 dnů podáním 5/Ug nativního OspA kmene B31 nebo 10 mg nativního OspA kmene ZS7 nebo rekombinantního OspA téhož kmene ve 100/Ul pomocného prostředku (ABM3, Fa. Sebak, Aidenbach, MSP) podkožně v oblasti kořene ocasu. Nejdříve 3 t^dny po podledním podání bylo možno odebírat sérum 3 až 4 měsíce. Obsah specifických protilátek byl stanoven metodou ELISA.
h ffl u
Cl á
CU e
(0
| KO | CM | ||
| m | |||
| KO | o | O | o |
Vliv specifických monoklonálních a polyklonélních protilátek proti B. burgdorferi na
•a
JO 3 O i—I M
P
X)
M c
ffl «I
P φ
X» o
c
XD
N
T5
O ►
ř
>> e*
| a 1 | 1 | P |
| Ό | • | ffl |
| •rl | CQ | Ό |
| O | • | O |
| CO | O | CU |
+ 111 + 111 + 1111
| CD | co | CO | |
| rd O Cl P | a M | a z~k | |
| c | VI | • | |
| o | fi | X» | |
| AS | ► | a | |
| VI | •rl P | o M | |
| fi | ffl | ||
| ► | fi | Ci | |
| •H | «U. | ||
| P ffl | o! | -u | |
| «0 | CU | CU | |
| Φ | ta | ffl | |
| fi | O | o | |
| CM | «Η | •rl | |
| co | fl | P | P |
| e | a | fi Φ | ffl |
\o KO
II II fi fi
CM
II c
<n
II fi
| X) | ι—1 | |
| C | 3 | |
| ffl | ||
| ffl | O | |
| XJ 3 | a | |
| O | ||
| ffl • | • | v- r—1 |
| T9 | 3 | |
| P | ta | |
| ffl | X—k | |
| ·» | o | H |
| o | o | 3 |
| •rl | ffl | \ O |
| fi | fi | o |
| Ό | ffl | CM |
| *i | SP | |
| ffl | o | |
| ► | Aí | r-l |
| ι—1 | •H | r-l |
| 3 | P | ·* |
| \ | ffl | z^s |
| O | ffl | r-l |
| o | r-1 | 3 |
| i—1 | JO | |
| O | O | |
| 3 | O | |
| a | O | CM |
| φ | •3 | Nim* |
| VD X> | X) | C'- |
| O | fi | |
| WJ | ||
| > | O | »> |
| AS | rl | |
| XJ | Ό | 3 |
| fi | o | \ |
| iH | CU | O |
| XD | o | |
| ffl | •3 | H |
| C | a | |
| O | K> | |
| P | •rl | •V |
| •rl | fi | |
| Cl | ffl | A |
| ffl | 00 | O |
| CU | Cl | ffl |
| CD | o | c |
| Ci | •3 | |
| P | 00 |
| Φ | X |
| fi XD | H |
| Ό O | φ* |
| CU | e- |
| Φ r-l | 1 3 |
| >» XI | •rl |
| >> | Ci ffl |
| AS | v |
| P | Ci |
| XD | O |
| r-1 •rl | u |
| P | Ci |
| O | 3 |
| Ci | X> |
| CU <B | • CQ |
| AS ► | M |
| XD | O |
| 3 | AS |
| VI fi ► | ffl •rl |
| Ci C4 | ffl |
DalSÍ dávky protilátek byly podány 18 (300/Ul), vždy intraperitoneálně
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Očkovací látka proti boreliose , onemocnění Lyme , vyznačující setím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro an tigen 31 kD , OspA nebo 34 kD , OspB , Borrelia burgdorferi
- 2. Očkovací látka proti boreliose , onemocnění Lyme , vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro an tigen 31 kD , OspA, Borrelia burgdorferi.
- 3. Očkovačí látka proti boreliose , onemocnění Lyme , vyznačující se tím, že obsahuje jednu neoo větší počet monoklonálních protilátek, specifických prc an tigen 34 kD , OspB , Borrelia burgdorferi.
- 4. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačuj í cí se tím.že obsahuje protilátku, specifickou pro antige.n 31 kD Borrelia burgdorferi, kmenů ZS7, DSM 5527, nebo/a B31, ATCC 35210.
- 5. Očkovací látka podle nároku 1, v y z n a Č' ují cí se tím, že obsahuje protilátku, specifickou pro antigen 34 kD Borrelia burgdorferi, kmenů ZS7, DSM 5527, nebo/a B31, ATCC 35210.
- 6. Očkovací látka podle nároku 2, vyznač uj í cí se tím, že obsahuje monoklonální protilátku ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
- 7. Očkovací látka podle nároku 3, vyznačují c i se t i tn, že obsahuje monoklonální protilátku ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.- κ 3. Způsob výroby očkovací látky proti boreliose, vyznačující se tím, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich částmi, vytvoří fúzí buněk hybridom, produkující monoklonální protilátku LA2 podle nároku 2.
- 9. Způsob výroby očkovací látky proti boreliose, vyznačující se tím, že se z lymfocytů nebo slezinných 'ottněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich čászmi, vytvoří fúzí buněk hyb-ridom, produkující monoklonální protilátky LA 25.1, LA 26.1 a LA 27.1 podle nároku 3.
- 10. Způsob podle nároku 3, vyznačuj íc í se t í m , že se k imunizaci užijí kompletní organismy 3orrelia burgdorferi 331 nebo/a ZS7.
- 11. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t i m , že se k imunizaci užijí kompletní organismy 3orrelia burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
- 12. Monoklonální protilátka LA-2 proti OspA podle nároku 2, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 39091302.
- 13. Monoklonální protilátka LA-25,1 proti OspA podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 90050406 .
- 14. Monoklonální protilátka LA-25.1 proti OspS podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 90050405.
- 15. Monoklonální protilátka LA-27.1 proti 0sp3 podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 90050407.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3931236 | 1989-09-19 | ||
| DE4015911A DE4015911A1 (de) | 1989-09-19 | 1990-05-17 | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ456090A3 true CZ456090A3 (cs) | 1998-08-12 |
| CZ284538B6 CZ284538B6 (cs) | 1998-12-16 |
Family
ID=25885304
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS904560A CZ284538B6 (cs) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky |
| CZ95970A CZ284616B6 (cs) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ95970A CZ284616B6 (cs) | 1989-09-19 | 1990-09-19 | Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US5178859A (cs) |
| EP (5) | EP0418827B1 (cs) |
| JP (3) | JP3205932B2 (cs) |
| KR (2) | KR100205462B1 (cs) |
| AT (4) | ATE191499T1 (cs) |
| AU (1) | AU651560B2 (cs) |
| CA (1) | CA2025597C (cs) |
| CZ (2) | CZ284538B6 (cs) |
| DE (5) | DE4015911A1 (cs) |
| DK (4) | DK0418827T3 (cs) |
| ES (4) | ES2145077T3 (cs) |
| FI (1) | FI102248B (cs) |
| GR (3) | GR3018995T3 (cs) |
| HK (2) | HK1002405A1 (cs) |
| HR (1) | HRP940545B1 (cs) |
| HU (2) | HU212716B (cs) |
| IE (1) | IE903377A1 (cs) |
| NO (2) | NO311767B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ235260A (cs) |
| PL (2) | PL170229B1 (cs) |
| PT (1) | PT95349B (cs) |
| SI (1) | SI9011773B (cs) |
| SK (3) | SK283088B6 (cs) |
| YU (2) | YU48250B (cs) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| US7094391B1 (en) * | 1988-10-24 | 2006-08-22 | The University Of Texas System | Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens |
| US6143872A (en) * | 1988-10-24 | 2000-11-07 | Symbicom Aktiebolag | Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5582829A (en) * | 1990-04-05 | 1996-12-10 | Rx Technologies, Inc. | Sonicated borrelia burgdorferi vaccine |
| SG47447A1 (en) | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| ES2149759T3 (es) * | 1990-07-06 | 2000-11-16 | American Home Prod | Vacuna contra la enfermedad de lyme. |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
| US6872550B1 (en) | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6676942B1 (en) | 1991-08-15 | 2004-01-13 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| CA2115554A1 (en) * | 1991-08-15 | 1993-03-04 | Yves Lobet | Osp a proteins of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| WO1993008299A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | Connaught Laboratories Inc. | Preparation of recombinant borrelia proteins |
| EP0540457A1 (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-05 | Symbicom Ab | Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| US5656451A (en) * | 1993-07-30 | 1997-08-12 | Yale University | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi |
| US6716591B1 (en) | 1993-07-30 | 2004-04-06 | Yale University | B. burgdorferi polypeptides |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US5558993A (en) * | 1994-06-17 | 1996-09-24 | The Regents Of The University Of California | Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein |
| GB9511909D0 (en) * | 1995-06-12 | 1995-08-09 | Microbiological Res Authority | Vaccine |
| ATE301716T1 (de) | 1996-02-21 | 2005-08-15 | Univ Texas | Vmp-ähnliche sequenzen von pathogener borrelia |
| DE19632862B4 (de) * | 1996-08-14 | 2006-08-03 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe |
| US6458555B1 (en) * | 1996-08-21 | 2002-10-01 | Gerd Bach | Cytologic method of examining mucous membranes |
| US6060082A (en) * | 1997-04-18 | 2000-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery |
| DE19740735A1 (de) * | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| US6306623B1 (en) | 1998-02-24 | 2001-10-23 | The University Of California | Leptospiral major outer membrane protein LipL32 |
| DE69938183T2 (de) | 1998-07-31 | 2009-02-19 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc., La Crosse | Verwendungen eines borreliaziden epitops des aussermembranproteins c von borrelia burgdorferi (ospc) als impstoff |
| WO2000056298A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Luitpold Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations |
| WO2000078345A1 (en) * | 1999-06-21 | 2000-12-28 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Method for treatment of lyme disease |
| PT1311540E (pt) | 2000-08-18 | 2008-03-20 | Univ New York State Res Found | Ospa de borrelia burgdorferi modificada |
| EP2292762A3 (en) | 2002-12-20 | 2012-12-12 | Board of Regents, The University of Texas System | VMP-like sequences of pathogenic Borrelia species and strains |
| UA99719C2 (ru) | 2006-11-03 | 2012-09-25 | Шеринг-Плау Лтд. | Вакцина для собак против болезни лайма |
| WO2008116468A2 (en) | 2007-03-26 | 2008-10-02 | Dako Denmark A/S | Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases |
| EP2167537A2 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Compiled methods for analysing and sorting samples |
| EP2197908A2 (en) | 2007-09-27 | 2010-06-23 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics |
| US10968269B1 (en) | 2008-02-28 | 2021-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | MHC multimers in borrelia diagnostics and disease |
| US10722562B2 (en) | 2008-07-23 | 2020-07-28 | Immudex Aps | Combinatorial analysis and repair |
| GB0817244D0 (en) | 2008-09-20 | 2008-10-29 | Univ Cardiff | Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells |
| WO2010037402A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Dako Denmark A/S | Molecular vaccines for infectious disease |
| US11992518B2 (en) | 2008-10-02 | 2024-05-28 | Agilent Technologies, Inc. | Molecular vaccines for infectious disease |
| KR20120096932A (ko) * | 2009-11-17 | 2012-08-31 | 아박시스, 인크. | 라임병 항체의 검출을 위한 펩티드 및 방법 |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| PL223175B1 (pl) | 2012-10-22 | 2016-10-31 | Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk | Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie |
| US9610336B1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-04-04 | Amiram Katz | Immunotherapy for lyme disease |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4772464A (en) | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4888276A (en) | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5034515A (en) * | 1987-09-22 | 1991-07-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| AU7058691A (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-24 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologically active proteines from borrelia burgdorferi, related test kits and vaccine |
| SG47447A1 (en) * | 1990-06-15 | 1998-04-17 | Univ Yale | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease |
| ES2149759T3 (es) * | 1990-07-06 | 2000-11-16 | American Home Prod | Vacuna contra la enfermedad de lyme. |
| CA2057536C (en) * | 1990-12-21 | 1999-10-26 | John J. Dunn | Cloning and expression of borrelia lipoproteins |
| CA2115554A1 (en) * | 1991-08-15 | 1993-03-04 | Yves Lobet | Osp a proteins of borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines |
| EP0642574B1 (en) * | 1991-08-27 | 1998-12-09 | Novo Nordisk A/S | Detergent compositions |
| WO1993008299A1 (en) * | 1991-10-18 | 1993-04-29 | Connaught Laboratories Inc. | Preparation of recombinant borrelia proteins |
| EP0625052A4 (en) * | 1991-10-21 | 1995-07-19 | Medimmune Inc | SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR. |
-
1990
- 1990-05-17 DE DE4015911A patent/DE4015911A1/de not_active Withdrawn
- 1990-09-07 HU HU905816A patent/HU212716B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-09-11 NZ NZ235260A patent/NZ235260A/xx unknown
- 1990-09-12 AU AU62444/90A patent/AU651560B2/en not_active Ceased
- 1990-09-18 EP EP90117943A patent/EP0418827B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 AT AT94112144T patent/ATE191499T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 DK DK90117943.2T patent/DK0418827T3/da active
- 1990-09-18 ES ES94112144T patent/ES2145077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DK DK94112143T patent/DK0643974T3/da active
- 1990-09-18 DE DE59010888T patent/DE59010888D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 EP EP94112143A patent/EP0643974B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 SI SI9011773A patent/SI9011773B/sl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 FI FI904597A patent/FI102248B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT90117943T patent/ATE131732T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90307358A patent/PL170229B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 AT AT94112145T patent/ATE186646T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 ES ES94112145T patent/ES2141182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DE DE59010863T patent/DE59010863D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 AT AT94112143T patent/ATE175576T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 PL PL90286918A patent/PL169804B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 CA CA002025597A patent/CA2025597C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59010903T patent/DE59010903D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 DE DE59009978T patent/DE59009978D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-18 ES ES90117943T patent/ES2082812T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 DK DK94112144T patent/DK0633313T3/da active
- 1990-09-18 DK DK94112145T patent/DK0633028T3/da active
- 1990-09-18 ES ES94112143T patent/ES2129551T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 EP EP94112145A patent/EP0633028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 YU YU177390A patent/YU48250B/sh unknown
- 1990-09-18 EP EP94112144A patent/EP0633313B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-18 IE IE337790A patent/IE903377A1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-09-18 EP EP98105444A patent/EP0861664A3/de not_active Withdrawn
- 1990-09-18 NO NO19904062A patent/NO311767B1/no unknown
- 1990-09-19 SK SK1510-98A patent/SK283088B6/sk unknown
- 1990-09-19 JP JP24765090A patent/JP3205932B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-09-19 CZ CS904560A patent/CZ284538B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 KR KR1019900014814A patent/KR100205462B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 US US07/585,310 patent/US5178859A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-19 SK SK1511-98A patent/SK283089B6/sk unknown
- 1990-09-19 CZ CZ95970A patent/CZ284616B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-09-19 SK SK4560-90A patent/SK456090A3/sk unknown
- 1990-09-19 PT PT95349A patent/PT95349B/pt active IP Right Grant
-
1993
- 1993-05-27 US US08/068,063 patent/US5434077A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-15 HR HR940545A patent/HRP940545B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-20 US US08/406,623 patent/US5780030A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-20 US US08/407,350 patent/US5686267A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-24 HU HU95P/P00108P patent/HU211228A9/hu unknown
-
1996
- 1996-02-14 GR GR960400397T patent/GR3018995T3/el unknown
-
1997
- 1997-03-12 YU YU9097A patent/YU49370B/sh unknown
-
1998
- 1998-02-13 HK HK98101147A patent/HK1002405A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-23 US US09/027,843 patent/US5856447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-08-29 KR KR1019980035375A patent/KR100202128B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-23 HK HK98114958A patent/HK1013620A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-07 US US09/413,858 patent/US6613331B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-30 GR GR990403104T patent/GR3032010T3/el unknown
-
2000
- 2000-06-14 GR GR20000401362T patent/GR3033675T3/el not_active IP Right Cessation
- 2000-07-26 JP JP2000225341A patent/JP3328644B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-12-11 JP JP2000376159A patent/JP3418171B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-24 NO NO20014624A patent/NO315905B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ456090A3 (cs) | Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| Simon et al. | Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibodies protective against spirochetal infection in mice | |
| IE83320B1 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| DE69835682T2 (de) | Oberflächenantigene und proteine für zusammensetzungen zu diagnose und vorbeugung der lyme-kkrankheit | |
| US5656451A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi | |
| CA2244147A1 (en) | Decorin binding protein compositions and methods of use | |
| US5879952A (en) | 43 Kd protein vaccine and method for the production thereof | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| US20030103977A1 (en) | Antibodies to polysaccharide of C. neoformans | |
| JP2000510339A (ja) | インビボで発現されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉポリペプチド | |
| AU673912B2 (en) | Vaccine against lyme disease | |
| Blake et al. | Developing a gonococcal protein I vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050919 |