JP2001204467A - モノクローナル抗体ｌａ２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ライム−病（Ｌｙｍｅ−Ｋｒａｎｋｈｅｉ
ｔ）に対するモノクローナル抗体、病原性ボレリア・ブ
ルグドルフェリ菌株、抗原、組換えＤＮＡ、組換えベク
ター、抗原の取得法及び病原性Ｂ、ブルグドルフェリを
単離かつ再培養する方法の提供。 【解決手段】 ハイブリドーマ−セルラインＥＣＡＣＣ
８９０９１３０２から分泌された、ＯｓｐＡに対するモ
ノクローナル抗体ＬＡ２。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ライム−病（Lyme
−Krankheit）に対するワクチン、その取得法、モノク
ローナル抗体、病原性ボレリア・ブルグドルフェリ菌
株、抗原、組換えＤＮＡ、組換えベクター、抗原の取得
法及び病原性Ｂ．ブルグドルフェリを単離かつ再培養す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ライム−ボレリオース（Lyme−Borrelio
se）は、温帯における屡々、ダニにより媒介される伝染
病である。これは、スピロヘータボレリア・ブルグドル
フェリ(Borrelia burgdorferi)により惹起され、この
菌は特にマダニ（Ixodes）によりヒトに伝染される。こ
の病気は、多くの臓器例えば皮ふ、中枢又は末梢神経
系、心臓、肝臓、腎臓及び骨格筋系に羅病する慢性で漸
進性の伝染病である。抗生物質を用いる治療によるこの
病気の可能な処置は困難であるので、現在は、病原菌そ
のもの及び宿主のＢ．ブルグドルフェリでの感染に対す
る免疫応答を研究する多大の努力がなされている。ライ
ム病にかかったヒトでは、Ｂ．ブルグドルフェリに対す
る高い抗体価が確認されるが、この感染に対する保護の
作用は得られない。この病原体は非常に迅速に血管から
組織中に移行し、そこで、免疫系にもはや直接到達可能
ではないと考えられる。このことは、抗体による保護
は、感染の開始の直後にのみ、病原体がなお血管内に存
在するかぎりにおいて可能であることを意味している。

【０００３】種々の動物におけるＢ．ブルグドルフェリ
による自然の感染が発見された事実は、ライム病に関す
る実験室内モデルを作る試みをもたらした。このこと
は、限られた結果で成功した。例えば、マウスにおける
Ｂ．ブルグドルフェリに対して特異的な免疫応答の誘発
を目的とした実験では、既に長時間培養したＢ．ブルグ
ドルフェリ−単離体での同系交配−マウス種の感染は、
種々の臓器例えば脳、心臓、肺及び腎臓内での、ライム
病を有する患者で観察されるそれと匹敵する中程度であ
るが顕著な病理形態学的な変化をもたらしたことが判明
した（Schaible等による（１９８８）、Infect．Immun.
１，４１）。動物における重大な病気の発症は、おそ
らく、宿主の免疫防御及び／又は長時間にわたり試験管
内で培養されたスピロヘータの減少された毒性に依り、
阻止された（Johnson等による（１９８４）J. Clin． M
icrobiol.２０，７４７，Schwan 等による（１９８８）
Infect.and Immun. ５６，１８３７）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の基礎となって
いる課題は、ライム病に対する有効なワクチンを製造す
ることである。しかしながら、このためには、まず、適
当な実験動物モデルの開発が必要である。ところで、機
能的Ｔ−及びＢ−細胞のないマウス、いわゆるＳcid−
マウス（Ｓcid−Maus；Bosma 等によるNature（１９８
３）１０，５２参照）を実験動物として使用することが
提案された。それというのも、Ｓcid−マウスは病原性
Ｂ．ブルグドルフェリ−単離体での感染時に、多系統疾
病しかも、主として多発関節炎及び心筋炎を発症するか
らである。この動物モデルにより、はじめて、ライム病
に対するこのワクチンの作用を確かめることが可能にな
る。

【０００５】本発明の対象物は、Ｂ．ブルグドルフェリ
の３１ｋＤ抗原（ＯｓｐＡ）又は／及び３４ｋＤ抗原
（ＯｓｐＢ）殊に菌株Ｂ３１（ＡＴＣＣ３５２１０）又
は／及びＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）のＯｓｐＡ又は／及
びＯｓｐＢに関して特異的なモノクローナル抗体１種以
上を含有する、ライム病に対する受動ワクチンである。
ＩｇＧ群特にＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ１亜群の本発明によ
る抗体を含有するワクチンが有利である。本発明による
抗体の適用は、意外にも、例えばＢ.ブルグドルフェリの
４１ｋＤ表面抗原（Flagellin）に対する他の抗体の適
用とは反対に、免疫欠失実験動物特に生存可能な病原性
Ｂ．ブルグドルフェリ特にＢ．ブルグドルフェリＺＳ７
で感染されたＳcid−マウスにおいて、関節炎、心筋炎
及び肝炎の発症を完全に又は少なくとも充分に阻止する
作用をする。

【０００６】場合によっては、本発明によるワクチン
は、作用物質としての抗体と共になお慣用の担持剤、充
填剤及び助剤をも含有していてもよい。

【０００７】更に、本発明は、実験動物特に、Ｂ．ブル
グドルフェリ生物体又はその１部特に完全Ｂ．ブルグド
ルフェリＢ３１又は／及びＺＳ７生物体で免疫化されて
いるマウスのリンパ細胞又は脾臓細胞からの、ライム病
に対する受動ワクチンの取得法にも関し、この際、免疫
化された動物のリンパ細胞又は脾臓細胞から細胞融合に
より、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを取得する。

【０００８】ＯｓｐＡに対する本発明による抗体ＬＡ−
２（ＩｇＧ２ｂ）を産生するハイブリドーマ−セルライ
ン（ＥＣＡＣＣ８９０９１３０２）も本発明の対象物で
ある。更に、ＯｓｐＡに対する抗体ＬＡ−２６.１（Ｉ
ｇＧ１）を産生するハイブリドーマ−セルラインＥＣＡ
ＣＣ９００５０４０６並びにＯｓｐＢに対する抗体ＬＡ
−２５.１もしくはＬＡ−２７.１（ＩｇＧ２ｂもしくは
ＩｇＧ１）産生性のハイブリドーマ−セルラインＥＣＡ
ＣＣ９００５０４０５もしくはＥＣＡＣＣ９００５０４
０７も本発明の対象物である。

【０００９】同様に、本発明には、病原性Ｂ．ブルグド
ルフェリ菌株ＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）も包含される。

【００１０】更に、本発明のモノクローナル抗体と免疫
反応する抗原も本発明の対象物である。これは、Ｏｓｐ
ＡもしくはＯｓｐＢの全アミノ酸配列又はＯｓｐＡもし
くはＯｓｐＢの免疫原作用をする部分配列（免疫原性エ
ピトープ）のみをも含有する抗原である。当業者は、こ
の蛋白質の可能な免疫原性エピトープを困難なく、Ｏｓ
ｐＡ−蛋白質の構造分析（例えば Chou - FassmannAnal
yse）により確認し、実験的にその作用を試験すること
ができる。

【００１１】本発明の１目的物は、殊に本発明の抗体と
免疫反応する組換え抗原でもあり、この際抗原に関して
暗号化するＤＮＡ−配列は、組換えベクター特に蛋白質
表現のために好適である原核性ベクター上に存在する。

【００１２】殊に、本発明の目的物は、特異的に本発明
の抗体と免疫反応し、第１図に記載のアミノ酸配列又は
この配列からの免疫原性エピトープを有する、Ｂ．ブル
グドルフェリからの抗原である。相応して、本発明は、
(1)第１図に記載の配列、(2）遺伝子コードの変性の範
囲内でそれに相応する核酸配列又は(3) (1)又は／及び
(2)からの配列と厳しい条件下にハイブリド形成し、
Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７の３１ｋＤ抗原又はその免
疫原性エピトープに関して暗号化する配列を有する組換
えＤＮＡにも関する。ここで、「厳しいハイブリド形成
条件」なる概念は、マニアチス（Maniatis）等のモレキ
ュラー・クローニング・ア・ラボラトリイ・マニュアル
（Molecular Cloning Ａ Laboratory Manual（１９８
２），Cold Spring Harbor Labo- ratory New York）に
記載のような条件と解すべきである。

【００１３】特に、組換え非融合蛋白質又はβ−ガラク
トシダーゼ−融合蛋白質である、本発明の抗原が有利で
ある。

【００１４】更に、本発明は、本発明による組換えＤＮ
Ａの１以上のコピーを有する組換えベクターをも包含す
る。この本発明によるベクターは、原核性及び／又は真
核性のベクターであってよく、原核性ベクターが有利で
ある。この組換えベクターは、宿主細胞中に染色体外に
存在（例えばプラスミド）していてよいか又は宿主細胞
のゲノム内に組み込むこともできる（例えばバクテリオ
ファージラムダ）。本発明のベクターはプラスミドが有
利である。特に、組換えベクターｐＺＳ−７／３１−２
（ＤＳＭ５５２８）が有利である。

【００１５】１以上の本発明による抗体を用いるＢ．ブ
ルグドルフェリ遺伝子バンクの検査により、本発明によ
る抗原を取得する方法も本発明の対象であり、ここで
は、使用抗体と正の免疫反応を示すクローンを単離す
る。

【００１６】本発明による抗原は、それ自体、活性免疫
化のため、即ち、生物体内での抗体形成を誘発するため
に使用することができるので、作用物質としての本発明
の抗原を、場合によっては慣用の担持剤、充填剤及び助
剤と共に含有する、ライム病に対する活性ワクチンも本
発明に包含される。本発明による抗原を遺伝子工学的な
方法で取得するのが有利な実施形である。

【００１７】天然のもしくは組換えＯｓｐＡを正常マウ
スに適用すると、Ｓcid−マウスへの受動的伝達の後に
これをライム−ボレリオースに対して保護する防御抗体
の形成を誘発する事実が判明した。殊に、組換えＯｓｐ
Ａは、天然のＯｓｐＡと匹敵する保護的免疫応答を誘発
し、従って、ヒトのライム−ボレリオースに対するワク
チンに関する有望な候補であることが判明した。

【００１８】更に、本発明の対象は、ライム病に対する
受動ワクチンを取得する方法であり、この際、実験動物
特にマウスを本発明による抗原で免疫化し、この免疫化
された実験動物から常法で、保護性の、ポリクローナル
又はモノクローナルの抗体を取得する。

【００１９】最後に、本発明には、病原性Ｂ．ブルグド
ルフェリ生物体の単離及び再培養法も包含され、これ
は、免疫欠失実験動物特に、予め病原体で感染されたマ
ウスから病原体を取得し、この際、病原体の病原性を保
持残留させることよりなる。特に、感染されたＳcid−
マウスの血液及び／又は関節から病原性Ｂ．ブルグドル
フェリＺＳ７（ＤＳＭ５５２７）生物体を取得する方法
が有利である。

【００２０】次の実施例及び第１図及び第２図により本
発明を詳述する。

【００２１】第１図はＢ．ブルグドルフェリＺＳ７から
の３１ｋＤ抗原（ＯｓｐＡ）のＤＮＡ−及びアミノ酸配
列を示す図であり、第２図は、組換え蛋白質ｒＺＳ７／
３１−２の免疫学的特性を示す図である。

【００２２】

【実施例】例 １ Ｂ．ブルグドルフェリ菌株での感染によるＳcid−マウ
スでの関節炎、心臓炎及び肝炎の誘発 Ｂ．ブルグドルフェリでのマウスの処置 Ｃ．Ｂ−１７ Ｓcid種（Ｓcid−突然変異に関するホモ
接合体）及びＣ．Ｂ−１７種の成長したマウスに生存可
能であるか又は殺した（ＵＶ−照射）Ｂ．ブルグドルフ
ェリ生物体１×１０^５、５×１０^５、１×１０^５又は１
×１０^６を尻尾のつけ根に皮下注射する。

【００２３】ダニ及びマウスからのＢ．ブルグドルフェ
リの単離 この実験をすでに長期間培養されてきたＢ．ブルグドル
フェリ菌株Ｂ３１（ＡＴＣＣ３５２１０）及び雌のイキ
ソデス・リチヌスダニ（Ixodes rizinus Zecke）から単
離された、新らしい単離体Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７
（ＤＳＭ５５２７）を用いて実施した。すべてのＢ．ブ
ルグドルフェリ株を変性ケリーの培地（Kelly's Mediu
m）中で培養した（Barbour等著、１９８３年、Switzerla
nd．Curr.Microbiol.第８巻、第１２３頁）。エタノー
ルで殺菌したダニの腸中部から、又は感染したマウスの
血液から得られたＢ．ブルグドルフェリ生物体をカナマ
イシン８μｇ／ｍｌ及びフルオルウラシル２３０μｇ／
ｍｌを添加下にケリーの培地中でまず培養した（Johnso
n 等著、１９８４年、 Ｊ. Clin. Microbiol.第１巻、
第８１頁）。

【００２４】血清学的テスト Ｂ．ブルグドルフェリ特異的抗体の検出を慣用のエリザ
（ＥＬＩＳＡ）法により実施した（Justus等著、１９８
８年、Wehrmed. Ms chr. 第３２巻、第２６３頁）。免
疫グロブリン(Ｉg）の含量に関する標準曲線を抗マウス
Ｉｇ（Paesel，フランクフルト、西独からの血清溶液の
１：５００希釈）を含有するシャーレの塗布及び全−マ
ウスＩｇＧ−又はＩｇＭ含量の滴定（Calbiochem. LaJo
lla，ＵＳＡ）により得た。全血清ＩｇＭ及びＩｇＧを
同様に測定した。Ｂ．ブルグドルフェリ特異的ＩｇＭ−
又はＩｇＧ−抗体の濃度をＩｇμｇ／ｍｌ 血清で示し
た。

【００２５】免疫蛍光法及びギームザ（Giemsa）染色 血液５０μｌをヘマトクリット管中にピペットで採取し
（Bectonund Dickinson, Heidelberg, ＢＲＤ）、ヘマ
トクリット遠心分離機（ＥＣＣＯ，ＢＲＤ）中５０００
ｇで遠心分離した。この管を血清と赤血球の中間相で切
開し、血清の５μｌをスライドプレート上に担持した
（Superior, Bad Mergentheim, ＢＲＤ）。血清試料で
被覆されたスライドプレートを空中で乾燥し、１００％
エタノール中−２０℃で１分間固定する。家兎−抗Ｂ．
ブルグドルフェリ高免疫血清（１：１００希釈）と共に
室温で１時間恒温保持した後、このスライドプレートを
ＰＢＳ中で５回洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合山羊−家兎
−抗血清（１：２０希釈、Jackson Lab.， West Grov
e，ＵＳＡ）で１時間染色する。このスライドプレート
を洗浄し、カイザー（Kaiser）のグリセリン−ゼラチン
（Merck, Darmstadt, ＢＲＤ）中に埋め込み、すぐに蛍
光顕微鏡で検査した。未処置の血液滴を空気中で乾燥
し、メタノール中で固定し、ギームザ（０.１％、 Merc
k, Darmstadt, ＢＲＤ）で染色し、ＰＢＳ中で脱色し、
エンテラン（Entellan ； Merck, Darmstadt， ＢＲ
Ｄ）中に埋め込む。

【００２６】組織学的標本作製及び染色法 あらかじめＢ．ブルグドルフェリで感染させたマウスか
ら種々の内部器官（脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓及
び関節）を感染後の種々異なる時点で取り出し、凍結薄
片の調製のために液体窒素中で保存するか、又はパラフ
ィン又はメタクリレート中への埋め込みのために５％ホ
ルムアルデヒド（ＰＢＳ中）中で保存する。４〜７μｍ
の薄片を製造し、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、
エンテラン（ Entellan ; Merck 社、ダルムシュタット、
ＢＲＤ）中に埋め込む。免疫組織学をストレプトアビジ
ン／ビオチン／ペルオキシダーゼシステムを使用して実
施した（Kramer 等著、１９８９年、Eur. Ｊ．Immunol.
第１９巻、第１５１頁）。

【００２７】第１表は単離体ＺＳ７及びＢ３１のＢ．ブ
ルグドルフェリ生物体が、あらかじめ生存可能な生物体
を接種したＳcid-マウスの血液中に全実験期間の間検出
されたことを示す。いずれにせよ、試験管内において
は、菌株ＺＳ７のスピロヘーターのみを再培養すること
ができ、菌株Ｂ３１を再培養することはできなかった。
再培養した生物体と最初のＢ．ブルグドルフェリＺＳ７
単離体との比較の際に、蛋白質含量において又はプラス
ミドプロフィルにおいて全く変化を確認することはでき
なかった。Ｂ．ブルグドルフェリで感染したＳcid-マウ
ス中には全監察期間の間、重要でない抗体の力価は全く
検出されなかったか、又は著しく僅かであった。この動
物中では、Ｂ．ブルグドルフェリ特異的ＩｇＭ−又はＩ
ｇＧ−抗体は全く見い出されなかった（第１表）。これ
に対し、Ｂ．ブルグドルフェリで感染したすべてのＣ．
Ｂ−１７−対照マウスは多量の全−Ｉｇ及びＢ．ブルグ
ドルフェリ特異的ＩｇＭ−及びＩｇＧ−抗体の高められ
た力価を示した。Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７での感染
７日〜２０日後に、Ｓcid-マウスは関節炎の第１次臨床
症状（両方の脛骨足根骨関節の発赤及びはれ）を示し、
これは時間と共にひどくなった。これに対してＵＶ−照
射Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７で又は生存可能なＢ．ブ
ルグドルフェリＢ３１生物体で感染したＳcid-マウス及
び生存可能なＢ．ブルグドルフェリＺＳ７生物体で感染
したＣ．Ｂ−１７−対照マウスには全く関節炎の症状は
見い出されなかった。

【００２８】組織病理学も、生存可能なＢ．ブルグドル
フェリＺＳ７で感染したＳcid-マウス中での関節炎によ
る関節変化を証明した（第１表）。軟骨組織及び／又は
骨の糜爛及び破壊を伴なう、形成過度の炎症性関節液−
被覆細胞の存在により特徴付けられる重症の関節障害が
確認された。更に心内膜、心筋層及び心膜中への単核細
胞の浸潤を伴なう心臓全壁炎が確認された。同様に、肝
臓の進行性の炎症が確認され、この際、門脈域及び中心
静脈に限定された単核細胞の浸潤、肉芽腫症反応及び最
後に肝臓線維症が確認された。更に、腎臓、肺、脳及び
横紋筋中で僅かな障害が確認された。

【００２９】

【表１】

【００３０】＊：ギームザ(Geimsa)-染色又は免疫蛍
光； ＊＊：血液（Ｂ）、関節（Ｇ）からの単離； ° ：（＋）脛骨足根骨関節の発赤及びはれ; °°：（−）＜７.５μｇ／ｍｌ 血清 例 ２ Ｓcid-マウスのライム・ボレリオース（Lyme-Borrelios
e）の経過に対するＢ．ブルグドルフェリ３１ｋＤ抗原
にとって特異的なモクローナル抗体の作用 モノクローナル抗体の製造 完全な免疫システムを有するマウスをＢ．ブルグドルフ
ェリ生物体で免疫にする際に、Ｂ．ブルグドルフェリに
特異的であるポリクローナル抗体が表現される（第１表
参照）。

【００３１】生後１０週の、同血統交配種ＢＡＬＢ／ｃ
の雌マウスを超音波ホモジナイズドボレリエン（Borrel
ien；Ｂ．ブルグドルフェリ、Ｂ３１株；ＡＴＣＣ３５
２１０）で免疫にする。

【００３２】免疫法： ０日目：完全フロインドのアジュバント中のボレリエン
−抗原２００μｇを皮下注射 ２１日目、３５日目、４９日目、６３日目：燐酸塩緩衝
食塩水中のボレリエン−抗原１００μｇで促進（腹腔
内） ６６日目：脾臓の取り出し、及び個々の細胞懸濁液の製
造 この免疫脾臓細胞を骨髄腫細胞系Ａｇ８−ＰＡＩとポリ
エチレングリコールの使用下に標準法により融合させた
（Ｊ，Ｈ．Peters、 Ｈ． Baumgarten，Ｍ．Schulze
著、“ MonoklonaleAntikoerper ” Springer - Verlag
社、ハイデルベルグ）。

【００３３】融合生成物を９６穴組織培養プレート中に
播種した。８日後、Ｂ．ブルグドルフェリ特異的モノク
ローナル抗体の存在に関して細胞培養上澄を固層−エリ
ザを用いて調べた（Ｊ，Ｈ．Peters 等著、前記）。

【００３４】抗体−生産性培養からのハイブリドーマ細
胞を限界希釈法によりクローン化した。引き続き、個々
のクローンの培養上澄を新たに固相エリザ中で、かつウ
エスタンブロット分析により、かつ免疫蛍光試験により
特徴付けた。亜クラスＩｇＧ２ｂのモノクローナル抗体
ＬＡ−２はモノクローナルハイブリドーマ系から生産さ
れ、分泌され、かつウエスタンブロット法で、電気泳動
法によりＳＤＳ−ゲル上で分離され、ウエスタンブロッ
ト法で膜上に搬送されたＢ．ブルグドルフェリ蛋白質と
接触する際にすべての実験したＢ．ブルグドルフェリ菌
株（特に、単離体ＺＳ７及びＢ３１）からの３１ｋＤａ
−構造、（Ｏｓｐ−Ａ）と反応する。モノクローナル抗
体ＬＡ−２６.１ｃ（抗−ＯｓｐＡＩｇＧ１）、ＬＡ２
５.１（抗−ＯｓｐＢ（３４ｋＤａ抗原）；ＩｇＧ２
ｂ）及びＬＡ２７.１（抗−ＯｓｐＢ（３４ｋＤａ抗
原）、ＩｇＧ１）は同様に製造され、特徴付けられた。

【００３５】Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７でのマウスの
感染 Ｃ．Ｂ−１７ Ｓcid-マウスに生存可能なＢ.ブルグドル
フェリＺＳ７−生物体１×１０^８を尻尾のつけ根に皮下
注射した。

【００３６】抗血清でのマウスの処置 感染したＳcid−マウスを種々の抗血清で１週間あたり
２回処置した。第１の群をＮＭＳ（正常マウス血清）
で、第２の群をＩＭＳ（免疫マウス血清）で、かつ第３
の群をモノクローナル抗体ＬＡ−２（Ｂ．ブルグドルフ
ェリからの３１ｋＤ抗原に対する）で処置した。投与抗
血清の量は第１週目は１００μｌもしくはＬＡ−２にお
いて１００μｇ、第２週目は２００μｌもしくはＬＡ−
２において２００μｇ及び第３週目は３００μｌもしく
はＬＡ−２において３００μｇであった。

【００３７】第２表は未処置又はＮＭＳ処置Ｓcid−マ
ウスが１２日後に関節炎もしくは心臓炎及び肝炎の臨床
的及び組織病理学的徴候を現わしたことを示す。これに
対してモノクローナル抗体ＬＡ−２の投与がＳcid−マ
ウスにおいて明らかに症状の減少に作用した。臨床的に
は関節のわずかな発赤、そして組織病理学的には辺縁の
変化のみが確認された。ＩＭＳで処置したマウスは全く
臨床的関節炎の所見を示さなかった。

【００３８】Ｂ．ブルグドルフェリ病原体の検出は、未
処置又はＮＭＳ処置のマウスにおいてのみ試験管内培養
において得られた。ＬＡ−２又はＩＭＳ処置マウスにお
いてはＢ．ブルグドルフェリは検出されなかった（第２
表）。

【００３９】

【表２】

【００４０】例 ３ Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７からの３１ｋＤ抗原（Ｏｓ
ｐＡ）の発現クローン化 ＤＮＡ−調製 Ｂ．ブルグドルフェリ株ＺＳ７からの高分子ＤＮＡを変
性ケリーの培地中で培養することにより精製した。この
スピロヘーターを１００００ｇで遠心分離することによ
りペレットにし、ＰＢＳ−緩衝液中で３回洗浄する。乾
燥したペレットをＴＥ（トリス１０mmol／ｌ、ＥＤＴＡ
１mmol／ｌ、ｐＨ７.４）１０ｍｌ中に再懸濁し、リゾ
チーム（５ｍｇ／ｍｌ）で３０℃で１５分間処置し、２
０％ＳＤＳ１ｍｌを添加することによりＤＮＡを遊離す
る。ＮaＣｌ１.５ｍｌ（５mol／ｌ）の添加後、この溶
液を同容量のフェノールで抽出し、次いでクロロホルム
での抽出を行なう。次いで、このＤＮＡを無水エタノー
ル２容量を添加し、−２０℃で１夜恒温保持することに
より沈殿させた。遠心分離後、残分をＴＥ０.５ｍｌ中
に溶かし、ＤＮＡse不含ＲＮＡseＡ（２０μｇ／ｍｌ）
と４５分間５５℃で恒温保持し、３７℃でプロティナー
ゼＫ（０.１μｇ／ｍｌ）で１時間の処置を行なった。
この溶液を０.３mol／ｌＮaＯＡｃで調節し、フェノー
ル−クロロホルムで前記のように抽出した。エタノール
で沈殿させた後、ＤＮＡを再びＴＥ中に取り込む。

【００４１】遺伝子バンクの製造 高分子ＤＮＡを３秒間の超音波処置により静力学的に破
砕する。Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（３７℃で３０分
間）及びクレノウ酵素（２０℃で５分間）を、生じたＤ
ＮＡ−フラグメントの末端を平面にするために使用し
た。平らな末端を有するＤＮＡを発現ベクターｐＵＥＸ
１のＢamＨＩ−位中にアダプター／クロン化法の適用下
に連結する（ Bresan及び Stanley 著、１９８７年、Nu
cl.Acid.Res.，第１０５６頁）。セファクリル（Sephac
ryl）Ｓ−１０００を介するモレキュラーシーブ・クロ
マトグラフィーによる大きさ選択工程及びコンピテント
宿主細胞大腸菌（ＭＣ１０６１）の形質転換の後、組換
えプラーク形成単位（pfu）の量を次のように測定し
た：任意抽出クローンをとり出し、選択培地（２５μｇ
／ｍｌアンピシリンを有するＬＢ）２ｍｌ中で飽和まで
培養する。このプラスミド−ＤＮＡを常用のアルカリ性
溶菌法により単離し、引き続きＢamＨＩで切断する。分
析したプラスミドの５０％より多くが平均≧１.５kb の
長さのＤＮＡ−挿入を有した。

【００４２】Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７−遺伝子バン
クの平板培養及びスクリーニング細胞を２４×２４ｃｍ
プレート上に、プレートあたり７０００pfuの密度で平
板培養し、３０℃で１夜恒温保持する。ニトロセルロー
スフィルター（ＮＣ）上にクローンを移した後、β−ガ
ラクトシダーゼ−融合蛋白質の発現を４２℃で２時間の
恒温保持により誘発した。このフィルターを５％ＳＤＳ
処置したワットマン（Whatman）３ＭＭ紙上に移し、９
５℃で約２５分間恒温保持した。次いで、この蛋白質
を、常用の半乾燥ウエスタンブロット法装置を使用して
電気ブロットした。ＮＣ−フィルターをＤＮＡse−処置
した後、免疫活性クローンをモノクローナル抗体の使用
下に発現スクリーニングにより同定した。ＮＣ−フィル
ター上の非特異的結合位を０.２％（重量／容量）ゼラ
チンと３ mmol／ｌ ＮaＮ_３を含有するＰＢＳと４時間
恒温保持することにより飽和した。引き続き、このフィ
ルターを抗−３１ｋＤモノクローナル抗体クローンＬＡ
−２の培養上澄と共に１８時間連続的な振盪下に恒温保
持した。十分な洗浄（ＰＢＳ＋１％（容量／容量）トラ
イトンＸ−１００；ＰＢＳ＋０.５mol／ｌ 塩化ナトリ
ウム；ＰＢＳ＋１mol／ｌ 塩化ナトリウム；各工程１０
分間）の後、このフィルターを家兎−抗−マウス−Ｉｇ
Ｇ−抗体のペルオキシダーゼ標識Ｆ（ab）_２−調剤の
１：１００００希釈と室温で１.５時間連続的振盪下に
恒温保持した。このフィルターを再び前記のように洗浄
し、次いでペルオキシダーゼ基質としてのジアミノベン
チジンと共に恒温保持する。組換ＰＦＵ1０^４のうちの
２０クローンがモノクローナル抗体ＬＡ−２と反応し
た。

【００４３】３１ｋＤ抗原（ＯｓｐＡ）の配列分析 ＬＡ−２との抗体反応プラスの組換え大腸菌の挿入ＤＮ
Ａを常法で単離した。このクローンのＤＮＡ−挿入分は
Ｂ．ブルグドルフェリ３１ｋＤ抗原をコードするＯｓｐ
Ａ−遺伝子を完全な長さで含有する。この挿入分を有す
るプラスミドをｐＺＳ−７／３１−２と表わし、ＤＳＭ
にブタペスト条約にのっとり寄託した（ＤＳＭ５５２
８）。

【００４４】この免疫プラスのクローンから生産された
組換蛋白質はｒＺＳ７／３１−２として示された。Ｏｓ
ｐＡ−遺伝子のコードしたＤＮＡ−配列を決定した。こ
の配列をこれから誘導したＯｓｐＡ蛋白質のアミノ酸配
列と共に第１図に示した。

【００４５】第１図は、Ｂ．ブルグドルフェリの３１ｋ
Ｄ抗原がアミノ酸２７３を有する蛋白質に相当すること
明らかにする。

【００４６】非融合蛋白質の調製 ａ） 免疫反応性蛋白質ｒＺＳ７／３１−２を発現する
クローンをアンピシリンを含有するＬＢ１０ｍｌ中で３
０℃で一夜培養した。培養物１ｍｌを選択培地１００ｍ
ｌ中に装入し、良好な通気下に３０℃で密度８×１０^７
細胞／ｍｌ（Ａ６００＝０.２）まで培養した。組換蛋
白質の発現を４２℃への宿主細胞の移動により得た。冷
却し、遠心分離した後、細胞をＳＴＥ−緩衝液（１０mm
ol／ｌトリス、１００mmol／ｌ塩化ナトリウム、１mmol
／ｌＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）中で洗浄し、残分を溶菌緩
衝液（２５％蔗糖、５０mmol／ｌトリス、ｐＨ８.０）
０.６ｍｌ中に再懸濁させた。リゾチーム（１０ｍｇ／
ｍｌ）１５０μｌを添加し、この混合物を氷上で１５分
間恒温保持した後、ＤＮＡse１（１０ｍｇ／ｍｌ）１８
μｌと共に１mol／ｌ 塩化マグネシウム５ μｌの存在
下に、更に恒温保持（氷上１５分間）した。最後に４×
洗浄剤混合物（１％トライトン×１００、０.５％デオキ
シコレート、０.１mol／ｌ ＮaＣｌ、１０mmol／ｌ ト
リス、ｐＨ７.４）２５０μｌを添加し、氷上で５分間
恒温保持した。遠心分離後、残分を２回緩衝液Ａ（５０
mmol／ｌトリス、５０mmol／ｌＮaＣｌ、１mmol／ｌＥ
ＤＴＡ、ｐＨ８.０）で洗浄し、付加的に８Ｍ尿素を含
有する緩衝液Ａ９容量中に再懸濁し、室温で１時間恒温
保持した。この試料を緩衝液Ｂ(５０ mmol ＫＨ_２ＰＯ
_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４、５０mol／ｌＮaＣｌ、１mmol／ｌ
ＥＤＴＡ、ｐＨ１０.７）９部で希釈し、室温で３０分
間撹拌し、この際ｐＨ−値をＫＯＨの添加下に１０.７
に保持した。溶剤のｐＨ値をＨＣｌの添加により７.０
に調節した後、この試料を一夜緩衝液Ａに対して透析し
（４℃で）、ＳＳ３４−回転装置中で４℃、１００００
rpmで１０分間遠心分離した。組換蛋白質を含有する上
澄を−２０℃で保存した。

【００４７】ｂ） このクローンは免疫反応性蛋白質
ｒＺＳ７／３１−２を培地中にも分泌するので、培養上
澄から直接精製（アフィニティークロマトグラフィー）
することも可能である。

【００４８】組換ＯｓｐＡ（非融合）蛋白質の調製及び
アフィニティークロマトグラフィー精製 引き続き組換蛋白質をアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。この目的のためには精製したモノク
ローナル抗体ＬＡ−２を活性化セファロースＣＬ４Ｂに
共有結合させた。組換蛋白質を含有する透析尿素抽出液
をマウスＩｇＧ−セファロースＣＬ４Ｂに吸着し、引き
続きＬＡ−２−セファロースＣＬ４Ｂカラムを介して加
えた。強力な洗浄後、結合した組換蛋白質を０.１mol／
ｌ グリセリン／ＨＣｌ−０.１mol／ｌＮaＣｌ、ｐＨ
２.５で溶離した。集めたフラクションのｐＨ値を ０.
５ mol／ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４ ^１／_１０容量の添加によ
り、すぐに中和した。蛋白質含有フラクションを濃縮
し、透析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いて精製の度合を測定した。

【００４９】組換蛋白質ｒＺＳ７／３１−２の免疫学的
特徴付け 組換蛋白質ｒＺＳ７／３１−２を免疫学的に調べた。比
較のために組換蛋白質ｒＢ３１／４１−９（Ｂ．ブルグ
ドルフェリ４１ｋＤ表面抗原）を用いた。

【００５０】平板−マイクロ力価プレートを組換蛋白質
ｒＺＳ７／３１−２及びｒＢ３１／４１−９の尿素抽出
液で、もしくは遺伝子発現のために使用した大腸菌株Ｍ
Ｃ１０６１の尿素抽出液で塗布した。非特異的結合位を
燐酸塩緩衝食塩溶液中の０.２％ゼラチンで封鎖した。
このように準備したマイクロ力価プレートの窪みを前記
モノクローナル抗体ＬＡ−２（抗−３１ｋＤ、Ｏｓｐ−
Ａ）、ＬＡ−１（抗−４１ｋＤ、フラジェリン）もしく
はＡＣＨＴ−２（抗−α_１−抗キモトリプシン）で配合
した。結合したモノクローナル抗体をペルオキシダーゼ
標識した種特異性抗−マウス免疫グロブリンと反応させ
た。結合したペルオキシダーゼ標識抗体をペルオキシダ
ーゼ基質オルトフェニレンジアミンを使用して定量し
た。マイクロ力価プレート中で４９２nm（Ａ_４９２）に
おける吸収を自動プレート測光機を用いて直接測定し
た。吸収の強度は結合したモノクローナル抗体の量に関
する尺度である。

【００５１】モノクローナル抗体ＬＡ−２は特異的な方
法でｒＺＳ７／３１−２と反応するが、ＭＣ１０６１も
しくはｒＢ３１／４１−９とは反応しない。モノクロー
ナル抗体ＬＡ−１の対照反応はｒＢ３１／４１−９に関
して特異的である。モノクローナル対照抗体ＡＣＨＴ−
２（負対照）は蛋白質のいずれとも注目に値する反応を
示さない。

【００５２】第２図はモノクローナル抗体ＬＡ−２によ
り特異的な方法で認識される抗原エピトープが Ｂ．ブ
ルグドルフェリＺＳ７のゲノムからクローン化された組
換蛋白質ｒＺＳ７／３１−２上に発現されることを示
す。

【００５３】例 ４ ３１ｋＤ（ＯｓｐＡ）もしくは３４ｋＤ抗原（Ｏｓｐ
Ｂ）に関して特異的な抗体と４１ｋＤ抗原(フラジェリ
ン）に特異的な抗体との比較 モノクローナル抗体ＬＡ−２及びＬＡ-２６.１は３１ｋ
Ｄ抗原ＯｓｐＡを認識し、アイソタイプＩｇＧ２ｂもし
くはＩｇＧ１からのものである。モノクローナル抗体Ｌ
Ａ−２５.１及びＬＡ−２７.１は３４ｋＤ抗原ＯｓｐＢ
を認識し、アイソタイプＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ１か
らのものである。モノクローナル抗体ＬＡ−１０及びＬ
Ａ−２１はＢ．ブルグドルフェリのフラジェリン−結合
４１ｋＤペリプラズム蛋白質に関して特異的であり、ア
イソタイプＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ１からのものであ
る。すべての前記抗体は例２に記載された方法により得
られた。この実験においてはＳcid−マウス中の他の
Ｂ．ブルグドルフェリに対するモノクローナル抗体もラ
イム−ボレリオース（Lyme -Borreliose）の臨床的症状
の保護に作用するかどうかを確認した。

【００５４】Ｂ.ブルグドルフェリＢ３1−生物体１×1
０^８での皮下接種後９１日でＣ５７ＢＬ／６−マウスか
らポリクローナル抗−Ｂ３１−免疫血清（ＩＭＳ）を採
取した。Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７１×１０^８での皮
下接種後６８日でＣ５７ＢＬ／６−マウスからポリクロ
ーナル抗−ＺＳ７ ＩＭＳを採取した。両方の血清はエ
リザ−システムで測定したように特異的抗体６０μｇ/
ｍｌを含有した（Schaible 等著、J. Exp. Med.，第１
７０巻、１９８９年、第１４２７〜１４３２頁）。正常
マウス血清（ＮＭＳ）を非感染Ｃ５７ＢＬ／６−マウス
から採取した。

【００５５】接種時及びこれに続き４日間の間隔で、前
記抗体、ＩＭＳ、ＮＭＳ又はＰＢＳ−緩衝液を次の記録
によりＳcid−マウス中に腹腔内に受動移動した： ０日目及び ３日目：１００μｌ ７日目及び１０日目：２００μｌ １３日目及び１７日目：３００μｌ 抗−ＺＳ７ ＩＭＳ、抗−Ｂ３１ ＩＭＳで、又はモノク
ローナル抗体ＬＡ−２で処置したＳcid −マウスは全く
関節炎の臨床的症状を示さなかった、すなわち２１日間
の監察期間の間、脛骨足根骨関節の発赤及びはれは全く
現われなかった。同様に心臓炎及び肝炎の症状も全く確
認されなかった。組織病理学的検査は抗−ＺＳ７−ＩＭ
Ｓ、抗−Ｂ３１−ＩＭＳで、又はモノクローナル抗体Ｌ
Ａ−２で処置したＳcid−マウスの関節、心臓及び肝臓
に全く変化がないということを示した。

【００５６】アイソタイプＩｇＧ１の他のＯｓｐＡ−特
異的モノクローナル抗体 ＬＡ−２６.１並びにＯｓｐＢ
特異的抗体ＬＡ−２５.１及びＬＡ−２７.１は関節炎、
心臓炎及び肝炎の臨床的症状をやわらげる。ここでは検
査した器官中に弱い病理学的変化が見られた。

【００５７】これとは反対に、ＰＢＳ−緩衝液、ＮＭＳ
又はフラジェリンに対するモノクローナル抗体（ＬＡ−
１０又はＬＡ−２１)を投与されたＳcid−マウスは未処
置のＳcid−マウスに典型的な関節炎の臨床的徴候、病
理学的変化を示した（第３表）。最後にあげた動物の症
状の重さは接種後時間と共に上昇し、全監察期間の間低
下しなかった。まず抗ＺＳ７ ＩＭＳで、 又は抗ＬＡ−
２で処置したＳcid−マウスからは全くスピロヘーター
は単離されなかった。これとは反対に、ＰＢＳ−緩衝
液、ＮＭＳ又はモノクローナル抗体ＬＡ−２５.１、Ｌ
Ａ−２６.１、ＬＡ−２７.１、ＬＡ−１０又はＬＡ２１
で処置したＳcid−マウスの血液からの免疫蛍光法によ
り、かつ培養によりスピロヘーターの検出が可能であ
る。

【００５８】

【表３】

【００５９】例 ５ ＯｓｐＡで免疫したマウスからの抗血清の、Ｓcid−マ
ウスのライム・ボレリオースの経過に対する作用 この実験において、天然ＯｓｐＡ(Ｂ.ブルグドルフェリ
ＺＳ−７から単離）又は組換ＯspＡ（組換プラスミドｐ
ＺＳ−７／３１−２（ＤＳＭ５５２８）で形質転換した
大腸菌から単離）の正常マウス（マウス種Ｃ５７ＢＬ／
６）中への投与は保護ポリクローナル抗体を生産する。
この抗体をＳcid−マウスに投与する場合、ライム・ボ
レリオースに対する保護が生じる。この際、組換Ｏｓｐ
Ａは天然ＯｓｐＡと比較可能な保護免疫応答を誘発する
ことが確認される。この実験における結果及び実施方法
の詳細を第４表に記載する。

【００６０】組換ＯｓｐＡの獲得は例３に記載した。

【００６１】天然ＯｓｐＡの獲得並びにＯｓｐＡでのマ
ウスの免疫を次のように行なう： 天然３１ｋＤａ ＯｓｐＡの富化 スピロヘーター３.２×１０^１０をプロテアーゼ阻害剤
（５mmol／ｌＥＤＴＡ、５mmol／ｌベンズアミジン及び
０.５ mmol／ｌＰＭＳＦ）の存在下にＰＢＳ５ｍｌ／
７.５ｍｌ ｎ−ブタノール中で２時間マグネットスター
ラーで撹拌する。その後、この混合物を１００００rpm
及び４℃でゾルバル（Sorvall）−遠心分離機（固定角
度ローター）中で９０分間遠心分離する。表面蛋白質を
含有する水相を取り出し、クロロホルムで３回洗浄す
る。

【００６２】蛋白質含量を２８０nm での吸光により、
もしくはＢＣＡ−テストで測定する。

【００６３】抗−Ｂ．ブルグドルフェリ家兎血清でのウ
エスタンブロットもしくはジルベルゲル(Silber-gel）
法においては、菌株ＺＳ７にとって主バンドは３１ｋＤ
ａの分子量範囲に、かつ弱いバンドは２０，３４及び６
５〜６８ｋＤａに見い出された。Ｂ．ブルグドルフェリ
菌株Ｂ３１のブタノール／水 調剤は主バンドを３１kＤ
ａに、弱いバンドを２０及び３４ｋＤａに有する。

【００６４】

【表４】

【００６５】天然及び組換ＯｓｐＡでのマウスの免疫 Ｃ５７ＢＬ６もしくはＣ．Ｂ−１７マウスを７〜１０日
間の間隔で３回アジュバント（ＡＢＭ３； Sebak 社、A
idenbach ，ＢＲＤ） １００μｌ 中の５μｇ（菌株Ｂ
３１からの天然ＯｓｐＡ）もしくは１０μｇ（菌株ＺＳ
７からの天然ＯｓｐＡ、ＺＳ７からの組換ＯｓｐＡ）を
尻尾のつけねに皮下注射した。

【００６６】最後の免疫の後、早くても３週間後、３〜
４ケ月の血清を取り出すことができた。特異的な抗体の
含量はエリザシステムで測定する。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｂ．ブルグドルフェリＺＳ７からの３１ｋＤ抗
原（ＯｓｐＡ）のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す
図。

【図２】組換え蛋白質ｒＺＳ７／３−２の免疫学的特徴
を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 390040420 Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (71)出願人 500349247 ドイチェス クレープスフォルシュングス ツェントルム スチフツング デス エッ フェントリッヒェン レヒツ ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク １ イム ノイエンハイマー フェルト 280 (72)発明者 マルクス エム ジモン ドイツ連邦共和国 フライブルク カルト イザーシユトラーセ 35 (72)発明者 ウルリツヒ エー シヤイブレ ドイツ連邦共和国 フライブルク ツエー リンガーシユトラーセ ２ (72)発明者 クラウス アイヒマン ドイツ連邦共和国 フライブルク ロイテ バツハガツセ 38 エフ (72)発明者 ミヒアエル クラマー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク イム ノイエンハイマー フエルト 324 (72)発明者 ヴアリツヒ ラインハルト ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク ウン テレン ロンバツハ ６ アー

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハイブリドーマ−セルラインＥＣＡＣＣ
   ８９０９１３０２から分泌された、ＯｓｐＡに対するモ
   ノクローナル抗体ＬＡ２。