KR101192127B1 - 개 라임병 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개 라임병(canine Lyme disease)에 대한 백신, 및 백신을 단독으로 또는 다른 보호제와 조합하여 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
개, 라임병, 백신, 스피로헤타, 비. 부르그도르페리, 보렐리아

Description

개 라임병 백신{Canine lyme disease vaccine}
관련 출원에 대한 전후-참조
본 발명은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2006년 11월 3일 자로 출원된 미국 가특허원 제60/864,258호의 우선권을 청구하는 특허원이며, 상기 가특허원의 내용은, 전문이 참고로 본원에 인용되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 개 라임병(canine Lyme disease) 백신에 관한 것이다. 상기 백신을 단독으로 또는 다른 보호제와 조합하여 제조하고 사용하는 방법이 또한 제공된다.
개 라임병은 주로 미국에서 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi) 센수 스트릭토(sensu stricto: ss) 및 유럽에서 비. 부르그도르페리 ss, 비. 가니니이(B. ganinii), 및 비. 아프젤리이(B. afzelii)를 포함하는 보렐리아 종[(Borrelia species)(아종) 스피로헤타(spirochete)]로 감염되어 유발된다(참조: Baranton et al., Int. J. Sys. Bacteriol. 1992, 42:378-383; Hovius et al., J. Clin. Microbiol. 2000, 38:2611-2621). 스피로헤타들은 감염된 익소데스 아종(Ixodes spp.) 진드기가 혈분을 수득함에 따라 전이되고, 개에서 초래된 감염은 무증상 윤 활막염으로부터 급성 관절염 및 관절통에 이르는 범위의 임상 징후를 초래한다(참조: Jacobson et al., Semin. Vet. Med. Surg. 1996, 11:172-182; Summers et al, J. Comp. Path. 2005, 133:1-13). 중요하게도, 개 라임병 경우의 발병률은 증가된 수의 사람의 경우와 부합하여 매년 지속적으로 증가하고 있다(참조: Haninkova et al., Emerg. Infect. Dis. 2006, 12:604-610).
보렐리아 아종의 감염에 대한 반응으로 생산되는 항체는 2개의 독립된 기능을 갖지만, 지금까지는 두 반응 모두 포유동물 숙주로부터 격리된 스피로헤타를 제거하는데 효과적이지 않을 수 있었다. 항원 변이(참조: Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112; Tokarz et al., Infect. Immun. 2004, 72:5419-5432), 숙주 의태(host mimicry)(참조: Barbour et al. Microbiol. Rev. 1986, 50:381-400), 및 세포내 국재화(참조: Ma et al., Infect. Immun. 1991, 59:671-678)를 포함하는 천연 감염에 대한 정상적인 면역반응에서 이러한 결점에 대해 다수의 설명들이 주장되어져 왔다.
가장 일반적인 체액성 면역 반응은, 포식 세포가 섭취하도록 스피로헤타를 "표지"하는 비특이적 결합/식균(opsonizing)(피복) 항체의 생산이다. 안타깝게도, 식균 항체는 다른 미생물에 대해 공통적인 몇가지 단백질(즉, 세균 편모를 포함하는 41 kDa 단백질)에 의해 유도되므로, 백신화-유도된 항체-매개된 면역에 대한 이들의 가치에는 의문의 여지가 있다.
제2의 일반적인 면역 반응은 살보렐리아(borreliacidal; 치명적인) 항체의 생산이다. 식균 항체와는 다르게, 살보렐리아 항체는 단지 몇몇의 보렐리아 아종 단백질 상에서 에피토프(epitope)를 인지한다. 스피로헤타 상의 특이적 표적물(target)에 결합된 후, 대부분의 살보렐리아 항체는 일반적으로 포식 세포에 의한 섭취를 필요로하지 않고도 유기체를 사멸시키는 막 공격 복합체(membrane attack complex)를 형성하는 보체를 유도한다.
현재 백신에 사용된 개 라임병 세균 백신(bacterin)은, 기생충이 혈분을 수득하면서 감염된 진드기에서 OspA-발현 스피로헤타를 사멸시키는 OspA 살보렐리아 항체(참조: Hsien-Chu et al., JAVMA 1992, 201:403-411; Ma et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Wikle et al., Intern. J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28; Straubinger et al., Vaccine 2001, 20:181-193)를 유도함으로써 보호를 제공하도록 개발되었다(참조: Fikrig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89:5418-5421). 스트라우빈전(Straubinger) 등의 문헌(참조: Vaccine 2002, 20:181-193)에서는 전 세포 백신이 재조합체 OspA보다도 현저히 높은 역가의 살보렐리아 항체를 유도해 냈다고 보고하였다. 이러한 백신이 상당히 성공적일지라도, 백신화의 실패는 보고되어 왔다 (참조: Levy et al. JAVMA 1993, 202:1834-1838; Ma et al., Vaccine 1996, 14:1366-1374; Schutzer et al., N. Engl. J. Med. 1997, 337:794-795).
생성된 OspA 살보렐리아 항체는 종종 먹이를 섭취한 진드기를 멸균하는데 실패하는데, 그 이유는, 항체가 OspA를 발현하는 비. 부르그도르페리 ss(참조: Jobe et al., J. Clin. Microbiol. 1994, 32:618-622; Lovrich et al., Infect. Immun. 1995, 63:2113-2119)만을 인지하고, 진드기는 OspA를 발현하지 않는 비. 부르그도 르페리 ss 스피로헤타에 의해 일반적으로 감염(참조: Fikrig et al., Infect. Immun. 1995, 63:1658-1662; Ohnishi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2001, 98:670-675)되기 때문인 것으로 현재 이해되고 있다. 추가로, 진드기는 또한 비. 아프젤리이 및 비. 가리니이를 포함하는 기타 병원성 보렐리아 아종에 의해 일반적으로 감염(참조: Ornstein et al., J. Clin. Microbiol. 2001, 39:1294-1298)되는 반면에, OspA 항체는 게노스페시스(genospecies) 특이적(참조: Lovrich et al., Infect. Immun. 1995, 63:2113-2119)이다. 또한, OspA 살보렐리아 항체에 의해 보호되기 위한 "기회의 창(window of opportunity)"은, 단지 스피로헤타가 감염되기 쉬운 경우로 제한되는데, 그 이유는, 진드기 중간 창자(참조: Pal et al., J. Clin. Invest. 2000, 106:561-569)에 대한 부착을 매개하는 OspA의 발현이 감염된 진드기가 먹이 섭취를 시작한 직후 하향-조절되기 때문이다(참조: Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913).
비. 부르그도르페리 ss OspC는 살보렐리아 항체-매개된 면역성에 대해 다른 잠재적인 표적물이다(참조: Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). 이 단백질은 살보렐리아 항체를 유도하는 역할을 하는 에피토프를 가지는 것으로 여겨지며 병원성 보렐리아 아종 사이에서 보존되어 있다(참조: Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751). OspC 단백질의 특이적 기능이 알려져 있지 않다고 해도, OspC 발현이 포유동물의 감염을 위해 필요한 것이지, 진드기의 감염을 위해 필요한 것이 아님은 제안되어져 왔다(참조: Grimm et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. 101(9):3142-3147). 어떠한 경우에도, 라임병 스피 로헤타는 포유 동물에서 감염을 성취하기 위해서 진드기가 먹이를 섭취하기 시작한 직후 OspC를 발현(참조: Schwan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:2909-2913)하고, 당해 OspC 발현을 지속시켜야만 한다(참조: Stewart et al., Infect Immun. 2006, 74:3547-3553, Tilly et al., Infect. Immun. 2006, 74:3554-3564). 따라서, OspC 살보렐리아 항체의 "유효성의 창"은 OspA 살보렐리아 항체와 비교하여 현저히 증가한다.
OspC 단백질은 보호적 살보렐리아 항체를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌지만(참조: Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741, lkushima et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29:15-21), 몇몇의 선행 "맵핑(mapping)" 조사는 에피토프를 단백질의 상당히 불균일한 영역으로 국한시켜 왔다(참조: Buckles et al., Clin. Vacc. Immunol. 2006, 13:1162-1165). 따라서, 이들 영역에 대해 증가된 살보렐리아 OspC 항체는 단지 적은 수의 보렐리아 아종 분리주에 대해서만 항체-매개된 면역성을 제공할 것이다. 로브리히(Lovrich) 등은 문헌(참조: Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751)에서 단백질의 C-말단 7개 아미노산 (OspC7) 내의 OspC 살보렐리아 항체 에피토프를 확인하였다. 대부분의 에피토프는 병원성 보렐리아 아종사이에서 보존되어 있다. 그러나, OspA(즉, ospA/ospB 오페론을 함유)를 발현하는 전형적인 실험실적 비. 부르그도르페리 ss 분리주는 OspA 살보렐리아 항체를 유도하는 능력을 상당히 손상시키지 않고 OspC 살보렐리아 항체의 상당한 수준을 유도하도록 실험실에서 조작할 수 없다. 또한, OspA를 발현하는 사멸된, 전형적인 실험실적 비. 부르그도르페리 ss 분리주를 사용한 백신화는 살보렐리아 OspC 항체를 유도하지 않는다(참조: Schwan et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2909-2913, Obonyo et al., 1999, J. Clin. Microbiol., 37:2137-2141).
칼리스터(Callister) 등은 문헌(참조: 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,210,676호 및 제6,464,985호)에서 라임병에 대한 사람 및 기타 포유동물을 보호하는 백신을 제조하기 위해, OspC의 면역원성 폴리펩티드 단편을 단독 또는 OspA 폴리펩티드와 조합하여 사용하는 방법을 제안하여 왔다. 리베이(Livey) 등은 문헌(참조: 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,872,550호)에서 또한, 재조합체 OspA, OspB, 및 OspC 단백질의 조합물로부터 제조된 라임병에 대해 면역화시키는 백신을 제안하였다. 그러나, 현재까지, 재조합체 단백질 백신은 현재 시판되고 있는 백신들보다 개선되어 있지 않다. 따라서, 라임병으로부터 포유동물, 특히, 개를 보호하기 위한 개선된 백신에 대해 당해 분야의 지속적인 요구가 남아있다.
본원에서의 참조문헌의 언급은, 이러한 참조가 본원에 대한 "선행 분야"로서 이용가능하다는 승인으로서 해석되지 않아야 한다.
발명의 요지
따라서, 본 발명은 백신에서 사용될 수 있는 새로운 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 하나의 국면에서, 백신은 라임병에 대해 보호한다. 이러한 유형의 특정 양태에서, 백신 수령자는 개이다. 다른 양태에서, 백신 수령자는 애완용 고양이이다. 다른 애완용 포유동물들, 예를 들어, 말 및/또는 소도 본 발명의 백신 및/또는 방법으로 보호될 수 있다. 본 발명은 또한, 라임병 및 기타 질병, 예를 들면, 기타 개 감염성 질병에 대한 보호 면역성을 유발하기 위한 조합물 백신을 제공한다. 또한, 본 발명의 백신을 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 제공되고 있다.
본 발명의 백신은 OspC 항원을 발현하는, 면역학적 유효량의 제1 또는 단일 균주(임의적으로 불활성화됨)의 유기체를 포함한다. 균주는, 표준 배양 조건 하에 성장하는 경우, 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)로 백신화된 동물에서 유발된, 보존된 에피토프 OspC7에 대한 살보렐리아 항체를 포함하여, OspC-특이적 살보렐리아 항체의 존재하에 사멸된 균주이다. 이러한 유형의 특정 양태에서, 보렐리아 게노스페시스의 제1 또는 단일 균주는 OspC 항원을 구성적으로 발현한다. 보다 특정한 양태에서, 제1 균주는 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)이다.
추가로, 본 발명의 백신 조성물은 병원성 보렐리아 게노스페시스로부터의 하나 이상의 추가의 균주(제2 균주로서 본원에 총괄하여 표지될 수 있음)로부터, 면역학적 유효량의 불활성화된 유기체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 제2 균주는 OspA 및 OspB 항원을 나타낸다.
적절한 제2 균주의 예는 다음 중의 하나 이상을 포함한다:
비. 부르그도르페리 ss S-1-10 (ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호), 비. 부르그도르페리 ss B-31 (ATCC 기탁번호: 제35210호), 비. 아프젤리이(예를 들면, ATCC 기탁번호: 제51567호로서 시판됨) 및 비. 가리니이(예를 들면, ATCC 기탁번호: 제51383호 및 제51991호로서 시판됨), 비. 부르그도르페리 ss DK7, 비. 부르그도르페 리 ss 61BV3, 비. 부르그도르페리 ss ZS7, 비. 부르그도르페리 ss Pka, 비. 부르그도르페리 ss IP1,IP2,IP3, 비. 부르그도르페리 ss HII, 비. 부르그도르페리 ss P1F, 비. 부르그도르페리 ss Mil, 비. 부르그도르페리 ss 20006, 비. 부르그도르페리 ss 212, 비. 부르그도르페리 ss ESP1, 비. 부르그도르페리 ss Ne-56, 비. 부르그도르페리 ss Z136, 비. 부르그도르페리 ss ia, 및/또는 이의 조합.
백신 조성물은 대체로 각각의 개개 균주 밀리리터당 약 1 x 104 내지 약 1 x 1010개의 유기체를 포함한다. 특정 양태에서, 백신은 각각의 개개 균주 밀리리터당 약 1 x 106 내지 약 5 x 109개의 유기체를 포함한다. 다른 양태에서, 백신은 각각의 제2 균주 밀리리터당 약 1.0 x 108 내지 약 5 x 108개의 유기체를 포함하고, 제1 균주 밀리리터당 약 5.0 x 108 내지 약 5 x 109개의 유기체를 포함한다.
백신 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 보조제, 예를 들면, 알루미늄 화합물(예를 들면, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄), 대사가능한 오일 및 비-대사가능한 오일, 블록 중합체, 면역 자극 복합체, 비타민 및 무기물, 및 카보폴®(CARBOPOL®)(예: 상표명 CARBOPOL 941)를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 약제학으로 허용되는 보조제는 수 에멀젼(water emulsion; 상표명 Emulsigen®하에 시판됨) 중에 균일하게 분산된 마이크론 크기 유적을 포함한다.
임의로, 백신 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 면역 자극제(immune stimulant), 예를 들면, 사이토킨, 성장 인자, 케모카인, 림프구, 단핵구, 또는 림프 기관으로부터의 세포의 세포 배양물로부터의 상층액, 식물, 세균 또는 기생충으로부터의 세포 제제 및/또는 추출물, 또는 유사분열물질(mitogen)을 포함한다.
본 발명은 추가로 면역학적 유효량의, 본 발명의 위에서 기재된 백신을 개에게 주입시키는 것을 포함하여, 병원성 보렐리아 다종, 특히 비. 부르그도르페리 ss에 대해 개 또는 기타 포유동물을 면역화시키는 방법을 제공한다. 이러한 백신은 예를 들어, 각각의 개개 균주의 약 1 x 108 내지 약 3 x 109개의 유기체를 포함할 수 있다. 백신은 다음과 같은 경로에 의해 투여될 수 있다: 근육 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 피내 주사, 경구 투여, 비내 투여, 및 이의 조합. 특정 양태에서, 백신화 후, 면역화시킨 개는 살보렐리아 항체를 생산한다.
또한, 본 발명은 비. 부르그도르페리 ss OspC에 결합된 살보렐리아 항체를 함유하는 백신화된 동물로부터 수득한 혈청을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 OspC에 결합된 정제된 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 혈청은 OspC7-특이적 살보렐리아 항체의 상당한 부분을 포함한다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 개홍역바이러스(canine distemper virus); 개 아데노바이러스(canine adenovirus); 개 파르보바이러스(canine parvovirus); 개 파라인플루엔자 바이러스(canine parainfluenza virus); 개 코로나바이러스(canine coronavirus); 개 인플루엔자 바이러스(canine influenza virus); 및/또는 렙토스피라 세로바스(Leptospira serovars), 예를 들면, 렙토스피라 키르쉬네리 세로바 그립포티포사(Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa), 렙토스피라 인테로간스 세로바 카니콜라(Leptospira interrogans serovar canicola), 렙토스피라 인테로간스 세로바 익테로해모라기애(Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae), 및/또는 렙토스피라 인테로간스 세로바 포모나(Leptospira interrogans serovar pomona)에 대한 면역성을 유도하기 위한 면역원을 포함하여, 하나 이상의 기타 개 병원체 및/또는 면역원과 조합된 본 발명의 보렐리아 게노스페시스의 하나 이상의 균주를 포함하는 조합 백신을 제공한다. 본 발명의 조합 백신에 가할 수 있는 추가의 개 병원체는 레이쉬마니아 유기체(Leishmania organism), 예를 들면, 레이쉬마니아 메이저(Leishmania major) 및 레이쉬마니아 소아(Leishmania infantum); 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica); 마이코플라스마 종[Mycoplasma species; 예: 마이코플라스마 사이노스(Mycoplasma cynos)]; 광견병 바이러스; 아나플라스마 유기체[anaplasma organism; 예: 아나플라스마 파고사이토필럼(anaplasma phagocytophilum) 및 아나플라스마 플라티스(anaplasma platys); 및 에를리키아 카니스(Ehrlichia canis)를 포함한다.
본 발명의 여러 국면들은 다음의 도면 및 상세한 설명을 참조로 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 정상적인 개 혈청 대조군(NS), 또는 시험 제품으로 백신화한 후(조사 43일째)의 개 혈청(TP), 또는 비. 부르그도르페리 ss-감염된 진드기로 챌린지된 후(조사 134일째)(NI)의 웨스턴 블롯(Western blot)이다. 약 20 kDa의 분자량을 가진 단백질에 대한 감염-특이적 항체가 존재함을 주목해야한다.
도 2A는 정상적인 개 혈청 대조군(NS), 또는 위약으로 백신화하고 비. 부르그도르페리 ss-감염된 진드기로 챌린지한 후(134일째의 조사) 개개의 개(1 내지 15번으로 번호매겨짐)의 분리된 집단으로부터의 혈청의 웨스턴 블롯이다.
도 2B는 정상적인 개 혈청 대조군(NS), 또는 시험 제품으로 백신화한 후 개개의 개(1 내지 15번으로 번호매겨짐)의 개개의 집단으로부터의 혈청의 웨스턴 블롯이다. 위약으로 백신화한 14 마리의 개(93%)(참조: 도 2A) 및 시험 제품으로 백신화한 0 마리의 개(p < 0.0001)에서 감염-특이적 20 kDa 항체가 존재함을 주목해야한다(참조: 도 2B).
도 3A는 비. 부르그도르페리 ss로 감염되었던 위약-백신화된 개들의 관절에서 조직병리학적 변화의 대표적인 예이다. 직사각형 내의 영역은 호중구의 현저한 침윤 및 개 라임 관절염의 단핵 세포 특징을 나타낸다.
도 3B는 비. 부르그도르페리 ss로 감염되었던 시험 제품-백신화된 개들의 관절내에서 조직병리학적 변화 부재의 대표적인 예이다. 타원형 내의 영역은 호중구 및 단핵 세포 침윤의 결여를 나타낸다.
도 4는 라임 또는 라임-관련 증상(n=36)의 과거 병력(차트 검토)이 없는 개개의 개로부터의 정상적인 혈청(N), 공혈자(BD, n=100) 또는 콜레스테롤 스크리닝(screening) 중인 개개의 개로부터의 무특징적 혈청(CS, n=100), 또는 항핵 항체(ANA, n=20), 류마티스 인자(RF, n=20), 단핵증(EBV, n=10), 거대세포바이러 스(CMV, n=10), 매독(SYPH, n=13) 또는 록키산 홍반열(RMSF n=4)을 포함하는, 비. 부르그도르페리 ss 항원과 일반적으로 교차-반응한 혈액 인자 또는 질병을 가진 지원자로부터의 혈청을 사용한 OspC7 ELISA 반응성의 측정 결과를 나타낸다. 실선은 정상 및 잠재적인 교차-반응성 혈청의 평균 흡광도 값을 초과하는 3개의 표준 편차를 나타낸다. 실선 위의 값은 99% 확률(1% 백그라운드 값)에 대한 포지티브 결과에 상응한다.
도 5는 전형적 라임 병변을 가진 환자를 나타내는 이동 홍반을 가진 후보 라임병 환자(n=86)로 부터의 혈청, 마찬가지로 "비정형 병변"을 가진 라임병 환자(n=22), 및 전신 증상을 가진 후보 라임병 환자(n=49) [가장 초기의 임상적 징후]의 혈청을 사용한 OspC7 ELISA 반응성을 나타낸다. 실선은 상위 정상 및 잠재 교차-반응성 혈청의 흡수 평균 값을 초과하는 3개의 표준 편차를 나타낸다.
본 발명은 백신화된 동물 수령자에서 효과적인 살보렐리아 항체-매개된 면역성을 유도하는 보렐리아 게노스페시스의 하나 이상의 균주로부터의 유기체를 면역학적 유효량으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 이러한 균주의 유기체가 표준 보렐리아 게노스페시스 성장 조건하에 성장되는 경우, 이들은 OspC-특이적 항체, 예를 들면, 비. 부르그도르페리 ss 50772 (ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)로 백신화된 동물에서 유발되는 항체(들)의 존재에서 사멸된다.
본 발명의 하나의 국면에서, 본 발명의 백신에 의해 유도되는 항체의 유효성의 창은 OspA 살보렐리아 항체 단독을 기준으로 한 통상적인 백신과 비교하여 상당히 증가한다. 다른 국면에서, 본 발명의 백신은 예를 들면, 생체 내에서 OspC의 발현으로 인한 이로운 면역적 기억 반응을 촉진하는 더 나은 기회 및/또는 보렐리아 아종의 다수의 병원성 균주에 대한 추가적이고/이거나 강화된 보호를 제공한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 이러한 균주의 유기체가 표준 보렐리아 게노스페시스 성장 조건하에 성장되는 경우, 이들은 OspC 항원을 구성적으로 발현한다. 이러한 유형의 특정 양태에서, 이러한 균주의 유기체가 표준 보렐리아 게노스페시스 성장 조건하에 성장하는 경우, 이들은 보체 특이적 반응으로 사멸된다. 또 다른 양태에서, 이러한 균주의 유기체를 포함하는 백신에 의해 유도된 혈청 내 OspC-특이적 살보렐리아 항체 중 상당 부분은 보호된 에피토프 OspC7에 대해 특이적이며, 이로써, 다수의 병원성 보렐리아 게노스페시스(예를 들면, 비. 부르그도르페리 ss, 비. 아프젤리이, 및/또는 비. 가르니이)에 대한 보호를 제공한다. 여전히 다른 양태에서, 이러한 균주의 유기체는 OspA 또는 OspB 항원을 나타내지 않는다. 여전히 다른 양태에서, 이러한 균주의 유기체는 이러한 특성 중 임의로 2개 이상을 갖는다. 또 다른 양태에서, 이러한 균주의 유기체는 이러한 특성 중 임의로 3개 이상을 갖는다. 여전히 또 다른 양태에서, 이러한 균주의 유기체는 이러한 특성 중 임의로 4개 이상을 갖는다. 특정한 양태에서, 이러한 균주의 유기체는 이러한 모든 특성을 갖는다. 이러한 하나의 특정 균주는 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)이다.
대안적 양태에서, 본 발명의 백신은 위에서 기재한 바와 같은 제1 균주 및 하나 이상의 제2 균주의 유기체의 유효량을 포함하는 조성물이다. 제2 균주는 본 발명의 백신의 일부로서 투여되는 경우 살보렐리아 OspA 항체를 유도하는 병원성 보렐리아 게노스페시스에서부터 기원하는 것이 바람직하다. 또한, 하나 이상의 추가의 상용성 백신 게노스페시스가 본원에서 포함될 수 있다. 추가로, 본 발명의 백신은 하나 이상의 기타 포유동물(예: 개) 병원체 및/또는 면역원을 포함할 수 있다.
본 발명을 보다 완전히 이해하기 위해서, 다음 정의가 제공된다.
기재의 편리를 위해 단일 용어의 사용은 어떠한 방식으로라도 제한되는 것을 의도하지 않는다. 따라서, 예를 들어, "폴리펩티드"를 포함하는 조성물에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 폴리펩티드에 대한 언급을 포함한다. 또한, "유기체"에 대한 언급은 달리 나타내지 않는 한, 다수의 이러한 유기체에 대한 언급을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대략"은 용어 "약"과 호환적으로 사용되고, 지정된 값의 50 퍼센트 이내에 있음을 나타내며, 즉, 밀리리터당 "대략" 1 X 1010 개의 유기체를 함유하는 조성물은 밀리리터당 5 X 109 내지 5 X 1010 개의 유기체를 함유함을 나타낸다.
용어 "게노스페시스"은 지. 바란톤(G. Baranton) 등의 문헌[참조: G. Baranton et al, 1992, International J. of Systematic Bacteriology 42: 378-383]에서 처음 사용되었고 정의되었으며, 용어 "종"은 비-보렐리아 유기체의 분류를 기재하는데 있어서 사용된 것과 동일한 방식으로 본원에서 사용된다.
보렐리아 게노스페시스를 배양하기 위한 "표준 성장 조건"은 약 33℃ 내지 약 35℃ 범위의 온도에서, BSK(Barbour Stoenner Kelly) 배지에서 성장시키는 것이 요구된다. 본원에서 기재된 BSK 배지는 문헌[참조: Callister et al., Detection of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry, Sections 11.5.1-11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc. Supplement 26, (2003), 전문이 본원에 참고로 삽입됨]을 따라 제조되었다. [BSK 배지는 또한, 예를 들어, 제조원: 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마(Sigma)로부터 시판된다].
본원에서 사용된 것으로서 "OspC7"은 칼리스터(Callister) 등의 문헌(참조: 미국 특허 제6,210,676 B1호 및 제6,464,985 B1호, 본원에 이의 전문이 참조로 인용되어 있음)에 의해 기재된 바와 같이, 공지된 병원성 보렐리아 종 사이에서 전적으로 보존된, OspC의 C-말단 50개 아미노산 내 7개 아미노산 영역(참조: Lovrich et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, 본원에 이의 전문이 참조로 인용되어 있음)내에 위치된, 면역우성 OspC 살보렐리아 항체 에피토프이다. 상기 보존은 로브리히(Lovrich) 등에 의해 기재된 7개 아미노산 분절(segment)을 암호화하는 코돈 분절의 BLAST 조사로 용이하게 확인된다. 2006년 10월 9일자로 수행된 이러한 조사는 위에 나타난 OspC 7-머(mer) 에피토프 암호화 분절을 함유하는 100개의 보렐리아 종의 결과 목록을 생성시켰다.
"OspC-특이적 살보렐리아 항체"는 예를 들면, 비. 부르그도르페리 ss 50772 (ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)로 백신화된 동물의 혈청에서 발견되는 항체이며, OspC 항원의 임의의 에피토프에 선택적으로 결합되고 보체에 의존적으로 또는 이와 무관하게 스피로헤타를 사멸하는 항체이다. "OspC7-특이적 살보렐리아 항체"는 예를 들면, 비. 부르그도르페리 ss 50772 (ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)로 백신화된 동물의 혈청에서 발견되는 항체이며, 로브리히 등에 의해 문헌[참조: Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12:746-751, (2005), 본원에 전문이 참고로 삽입되어 있음]에 기재된 OspC의 7개 C-말단 아미노산에 선택적으로 결합하여, 스피로헤타(일반적으로, 보체-매개된 세포막 공격 복합체를 유도시킴으로써)를 사멸하는 항체이다. OspC의 살보렐리아 항체의 특이성은 잘 확립되어 있다. 예를 들면, OspC 살보렐리아 항체는 살보렐리아 항체 시험에서 비. 부르그도르페리 ss 50772의 감수성을 측정함으로써 라임병 혈청에서 일반적으로 검출된다. 근접하게 관련된 질병을 가진 사람 환자로부터의 혈청은 또한 균주 50772를 사멸하는 교차-반응성 항체를 단지 드물게(2%) 함유한다(참조: Callister, et al., 1996, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4): 399-402에 상세히 기재되어 있음). 또한, OspC7 살보렐리아 에피토프를 사용하는 펩티드 ELISA는 라임병 혈청 내 살보렐리아 항체를 정확하게 포획하고, 기타 근접하게 관련된 질병을 가진 환자로부터의 혈청은 또한 OspC7 펩티드에 결합하는 교차-반응성 항체를 단지 드물게(< 2%) 함유한다(참조: 도 4 및 도 5에 나타냄).
백신에 의해 유도된 혈청 내 OspC-특이적 살보렐리아 항체의 "상당한 부분"이 보존된 에피토프 OspC7에 대해 특이적인 경우, 이는 혈청 내 OspC-특이적 살보렐리아 항체에서의 측정가능한 감소에 이어 OspC7를 가진 혈청의 흡수가 존재함을 의미한다. 이는, 바람직하게는 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출된 혈청의 살보렐리아 항체 역가에서 2배 이상의 감소로서 정의되고, 보다 바람직하게는 혈청의 살보렐리아 항체 역가에서 2 내지 4배 또는 이상의 감소에 이어 OspC7을 가진 혈청의 흡수로서 정의된다.
"보체 특이적 반응"은 보렐리아 아종 유기체(들)가 살보렐리아 항체에 의해 사멸되도록 하기 위해 존재하는 혈청 보체를 요구하는 항체 반응이다.
본 발명의 목적을 위해, "불활성화된" 보렐리아 부르그도르페리 ss 유기체는 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있으나, 동물을 감염시킬 수는 없는 유기체이다. 보렐리아 부르그도르페리 ss 분리주는 이원 에틸렌이민, 포르말린, 베타-프로피올락톤, 티메로살(thimerosal) 또는 열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제에 의해 불활성화될 수 있다. 특정 양태에서, 보렐리아 부르그도르페리 ss 분리주는 이원 에틸렌이민에 의해 불활성화된다.
용어 "보조제" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 면역 시스템의 자극을 유발하는 하나 이상의 물질로 정의된다. 이와 관련하여, 보조제는 하나 이상의 백신 항원/분리주에 대한 면역 반응을 강화하는데 사용된다. 보조제는 백신 투여 전, 백신 투여와 함께, 또는 백신 투여 후에 표적 동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 보조제는 천연공급원, 재조합제 공급원을 포함하는 많은 수의 공급원으로부터 수득될 수 있고/있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 보조제로서 사용되는 화합물의 예는 알루미늄 화합물; 대사가능한(metabolizable) 및 대사가 가능하지 않은 오일; 블록 중합체(block polymer); ISCOM's(면역 자극 복합체); 비타민 및 무기질(비타민 E, 비타민 A, 셀레늄 및 비타민 B12를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다); 퀼 에이(Quil A)(사포닌); 및 폴리알케닐 에테르 또는 디비닐 글리콜로 가교결합된 아크릴산계 중합체, 예를 들면, 상표명 CARBOPOL®을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
때때로 면역 자극제로서 구체적으로 언급되는 보조제의 추가의 예는, 세균 및 진균 세포 벽 성분(예를 들어, 지다당질, 지단백질, 당단백질, 뮤라밀펩티드, 베타-1,3/1,6-글루칸), 식물로부터 기원한 다양한 복합 탄수화물(예를 들어, 글리칸, 아세만난), 동물로부터 기원한 다양한 단백질 및 펩티드[예를 들어, 호르몬, 사이토킨, 공-자극 인자(co-stimulatory factor)], 및 바이러스 및 기타 공급원으로부터 기원한 신규 핵산(예를 들어, 이본쇄 RNA, CpG)을 포함한다. 또한, 앞서 언급한 물질의 많은 조합물들은 보조 효과를 제공할 수 있으므로, 본 발명의 보조제를 형성할 수 있다. 하나의 바람직한 보조제는 Emulsigen®이다.
미국 특허 제6,210,676호에 명시된 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439) 및 미국 특허 제6,316,005호에 명시된 비.부르그도르페리 ss S-1-10(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680)은 각각 1999년 7월 30일 및 2000년 4월 11일자로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC; 미국 버지니아주 20110 마나사스 불러바드 유니버시티 10801 소재)에 기탁되었다. 본 발명에 대한 권리의 공동 소유자는 각자 이들 2개의 앞서 언급한 특허에 대한 권리를 갖는다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 특정 구성, 공정 단계, 및 물질에 제한되지 않고, 이러한 구성, 공정 단계, 및 물질이 다소 다양할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단시 특정 양태를 기술하는 목적을 위해 사용되는 것이지, 제한함을 의도하는 것이 아니며, 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위 및 이와 동등한 것에 의해서만 제한될 것이다.
추가의 백신 균주
?추가의 OspC 균주
하나의 국면에서, 본 발명은 단독으로, 또는 기타 보렐리아 게노스페시스 균주와 조합하여 라임병에 대해 보호하는 백신에 있어서 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)의 용도를 제공한다. 특히, 비. 부르그도르페리 ss 50772는 OspC를 발현하지 않는다고 잘못 보고되어 있었기 때문에, 이는 초기에 백신의 유용한 후보물로서 거부되었다 (참조: Anderson et al., 1996, J. Clin. Microbiol., 34:524-529).
또한, 본 발명은 본 발명의 백신용으로, 기타 이러한 유용한 분리주를 선택/확인하는 독특하고 특별한 기준을 제공한다. 특히, OspC-특이적 항체에 의해 사멸되는 감수성, 바람직하게는, 다음의 속성들 중 하나 이상 또는 모두를 갖는 분리주가 선택/동정될 수 있다: (i) 보체 특이적 반응을 통해 OspC-특이적 항체에 의해 사멸되는 감수성; (ii) 분리주에 의해 백신화된 수용체에서 OspC 살보렐리아 항체를 유도하는 능력; (iii) C-말단 7개 아미노산(OspC7) 내의 보존된 에피토프에 대해 특이적이 되도록 유도된 OspC 살보렐리아 항체의 상당한 부분; (iv) OspA 및 OspB를 발현하는 능력의 결여; 및/또는 (v) 시험관에서 OspC를 구조적으로 발현하는 능력.
A. 배양 조건에 의한 OspA/B 발현의 억제 및 OspC 발현의 향상
오보니오(Obonyo) 등은 문헌(참조: J. Clin. Microbiol. 1999, 37:2137-2141)에서 5일에 걸쳐 정상적인 병원성 보렐리아 아종 균주(참조: 비. 부르그도르페리 ss의 균주 JMNT 및 N40)와 진드기 세포주[익소데스 스카풀라리스(Ixodes scapularis) ISE6]를 공-배양함으로써, OspA 발현은 하향조절(downregulate)시키고, OspC 발현은 상향조절시킬 수 있음을 밝혔다. 가장 분명한 효과는 37℃에서의 배양에 의해 관측되었다. 따라서, 당해 방법은 하나 이상의 통상적인 병원성 보렐리아 균주를 본 발명의 백신용의 유용한 형태로 전환시킬 것이다.
B. 돌연변이에 의한 OspA/B 발현의 제어 및 OspC 발현의 향상
추가의 양태에서, OspA 및 OspB를 본래 발현하는 보렐리아 아종 균주의 유전자 조작을 사용하여 OspC 발현을 상향조절하는 OspA 및 OspB의 발현을 암호화하는 유전자를 하향조절하거나 또는 결실시킨다. 유전자 조작의 당해 공지된 방법은 본 발명의 목적을 위해 사용되도록 고려된다. 예를 들어, OspA/OspB 유전자의 불활성화된 유사체는 항생제 선택 마커로 제조된 보렐리아 아종 사용성 플라스미드의 형태로서, 이용가능한 보렐리아 아종 균주의 다수 유기체 내로 도입된다(참조: 예를 들어, Grimm et al., 2004, Proc. Nat'l Acad. Sci 101(9):3142-3147, 당해 문헌은, OspC 발현이 OspC 불활성화 및 상보성 플라스미드를 비. 부르그도르페리 B31-A3 균주 내로 삽입시킴에 의해, 보렐리아 아종내에서 차단할 수 있음을 보고하였음). 도입된 플라스미드 및 OspA/OspB를 지닌 천연적으로 존재하는 플라스미드 사이에서의 재조합 현상은 돌연변이된 OspA/OspB 플라스미드를 지닌 몇몇의 성공적인 재조합체 보렐리아 아종 유기체를 생성할 것이다. 선택은, 예를 들면, 상응하는 항생제의 존재하에서 결합된 항생제 내성 및 성장을 통해 전제될 수 있다. OspA/OspB 발현이 선택적으로 제거된 보렐리아 아종 유기체는 OspC 발현을 상향조절하는 것으로 고려된다.
임의의 추가 양태에서, OspA, OspB, 및/또는 하나 이상의 추가의 Osp 항원을 발현하는 하나 이상의 추가의 비. 부르그도르페리 ss 또는 보렐리아 아종 유기체는 추가의 유기체로서 백신 조성물 속에 포함될 수 있다.
바람직하게는, 각각의 개개 불활성화된 유기체는 백신 중에 약 1 x 104 내지 약 1 x 1010 유기체/mL 범위의 농도로 존재한다. 특히, 백신은 바람직하게는 비. 부르그도르페리 ss S-1-10의 1.0 x 108 유기체/mL 이상의 투여량 및 비. 부르그도르페리 ss 50772의 5.0 x 108 유기체/mL 이상의 투여량으로 개에게 투여된다.
?추가의 OspA 균주
OspA 항원을 제공하는 제2 균주는 통상적인 병원성의 실험적 비. 부르그도르페리 ss 분리주(참조: Barbour et al., 1985, J. Clin. Microbiol. 52:478-484), 예를 들어, 비. 부르그도르페리 ss B-31(ATCC 기탁번호: 제35210호)일 수 있다. 특정한 제2 유기체는 예시화된 비. 부르그도르페리 ss S-1-10 균주(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호)이다. 북미의 외부 지역에 최적화된 백신 조성물에 대한 제2 유기체로서 사용하기에 적합한 추가의 균주는 예를 들면 다음 균주를 포함한다: 비. 부르그도르페리 ss B-31 (ATCC 기탁번호: 제35210호), 비. 아프젤리이 (예를 들면, ATCC 기탁번호: 제51567호로서 이용가능함) 및 비. 가르니이 (예를 들면, ATCC 기탁번호: 제51383호 및 제51991호로서 이용가능함), 및 아래 표 1에 기재된 것들.
균주 국가 배양 장소
비. 부르그도르페리 ss DK7 1 덴마크 피부
비. 부르그도르페리 ss 61BV3 1 독일 피부
비. 부르그도르페리 ss ZS7 1 스위스 진드기
비. 부르그도르페리 ss Pka 1 독일 진드기
비. 부르그도르페리 ss IP1, IP2, IP3 1 프랑스 CSF
비. 부르그도르페리 ss HII 1 이탈리아 혈액
비. 부르그도르페리 ss P1F 1 스위스 활액
비. 부르그도르페리 ss Mil 1 슬로바키아 진드기
비. 부르그도르페리 ss 20006 1 프랑스 진드기
비. 부르그도르페리 ss 212 1 프랑스 진드기
비. 부르그도르페리 ss ESP1 1 스페인 진드기
비. 부르그도르페리 ss Ne-56 1 스위스 진드기
비. 부르그도르페리 ss Z136 1 독일 진드기
비. 부르그도르페리 ss ia 2 핀란드 CSF
1 참조: Lagal et al., J. Clin. Microbiol. 2003, 41:5059-5065.
2 참조: Heikkila et al., J. Clin. Microbio 1. 2002, 40:1174-1180.
백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있다. "보조제"는 특수 항원에 대해 면역 반응을 비특이적으로 증가시킴으로써, 목적 항원에 대해 적절한 면역 반응을 생성하기 위해 필요한 주입의 빈도 및/또는 주어진 백신 내 필요한 항원의 양을 감소시키는 제제이다. 동물의 백신화에 적합한 보조제는 Adjuvant 65(피넛 오일, 만니드 모노올레이트 및 알루미늄 모노스테아레이트); 프로인드 완전 또는 불완전 보조제(Freund's complete or incomplete adjuvant); 미네랄 겔(mineral gel), 예를 들면, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 및 백반; 표면활성제, 예를 들면, 헥사데실아민, 옥타데실아민, 라이소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시메틸)프로판디아민, 메톡시헥사데실글리세롤, 및 플루로닉 폴리올; 다가음이온, 예를 들면, 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산, 및 CARBOPOL®(예: CARBOPOL 941); 펩티드, 예를 들면, 무라밀 디펩티드, 디메틸글리신 및 터프트신; 및 오일 유제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 보조제 관련 정보는 다음 문헌[참조: 예를 들면, P. Tijssen에 의한 연속물, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, 3rd Edition, 1987, Elsevier, New York, 본원에 참조로 인용됨]에 기재되어 있다.
때때로, 백신 조성물은 또한, 약제학적으로 허용되는 면역 자극제, 예를 들어, 세균 및/또는 진균 세포 벽 성분(예를 들어, 지다당질, 지단백질, 당단백질, 뮤라밀펩티드), 식물로부터 기원한 다양한 복합 탄수화물(예를 들어, 글리칸, 아세만난), 동물로부터 기원한 다양한 단백질 및 펩티드[예를 들어, 호르몬, 사이토킨, 공동-자극 인자], 및 바이러스 및 기타 공급원으로부터 기원한 신규 핵산(예를 들어, 이본쇄 RNA, CpG)을 포함한다.
백신 조성물은 정맥내, 근육내, 피하내, 경구, 비강내, 피내, 및/또는 복강내 백신화을 포함하는 표준 경로에 의해 즉시 투여된다. 당업자는, 백신 조성물이 각각의 유형의 수용체 동물의 유형 및 투여 경로에 대해 적절하게 제형화되어 있음을 인식할 것이다.
따라서, 본 발명은 또한, 비. 부르그도르페리 ss 및 기타 보렐리아 아종에 대해 개를 면역시키는 방법을 제공한다. 하나의 이러한 방법은 면역학적 유효량의 본 발명의 백신을 개에게 주입시켜 개가 적절한 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체를 생산하도록 함을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명의 피하내 투여는 OspC7에 대해 특이적인 살보렐리아 항체를 포함하는 고 농도의 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체를 생산한다. 다른 양태에서, 본 발명은 유해한 보렐리아 아종에 대해 효과적인, 특이적인 최소량의 각각의 비. 부르그도르페리 ss 균주를 포함하는 백신을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명의 백신은 개에서 비. 부르그도르페리 ss 및 다른 병원성 보렐리아 spp. 감염을 방지하는데 효과적이다. 특정 양태에서, 백신은 본 발명의 2개의 비. 부르그도르페리 ss 균주 및 약제학적으로 허용되는 보조제와의 안전하고, 면역학적으로 효과적인 조합물을 포함한다.
본 발명은, 특이적 최소량의 2개의 비. 부르그도르페리 ss 분리주를 포함하는 백신이 진드기 챌린지에 수반된 보렐리아 아종으로부터 개를 보호함을 기재하고 있다. 또한, 본 발명은 백신화된 개에서 특이적인 최소량의 비.부르그도르페리 ss-특이적 OspA 및 보렐리아 아종-특이적 OspC 살보렐리아 항체를 유발시키는 백신을 기재하고 있다. 또한, 발명의 백신은 허용되는 면역 자극제 및/또는 보조제와 함께 투여될 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 추가의 이해를 제공하기 위해 제공되지만, 본 발명의 유효한 범위를 어떠한 방식으로도 제한함을 의미하지는 않는다.
실시예 1
재조합체 OspA를 사용한 백신화
A. 물질 및 시약
?동물:
5주 내지 10주령의 LVG 햄스터를 챨스 리버 브리딩 래보러토리즈 인코포레이티드(Charles River Breeding Laboratories, Inc., 미국 매사추세츠주 윌밍톤에 소재함)로부터 입수하였다. 햄스터를 21℃의 주변 온도에서 우리당 3 또는 4마리씩 사육하고, 음식 및 물을 무제한 제공하였다.
?햄스터의 백신화 및 혈청의 수집:
햄스터에게 시판되는 재조합체 OspA (rOspA) 백신[RECOMBITEK® Lyme, 제조원: 미국 조지아주 둘루쓰 소재의 메리알 리미티드(Merial Limited)] 0.5 mL를 목 뒤에 피하로 백신화한 다음, 초기 백신화 후 3주째에 추가 접종(booster)하였다. 초기 백신화 후 3, 7, 9, 및 15주째에 5마리의 햄스터 그룹 각각을 노즈-앤-마우쓰 컵(nose-and-mouth cup)에 함유된 에테르를 흡입시켜 약간 마취시킨 다음, 심장내 구멍으로 혈액을 흐르게 하였다. 혈액이 응고되도록 둔 다음, 혈청을 분리시키고 -70℃에서 사용할 때까지 저장하였다. 또한, 3마리의 백신화되지 않은 햄스터로부터의 혈청을 혼주시킨 다음, 정상적인 혈청 대조군으로서 사용하였다. 추가 대조군으로서, 20마리의 햄스터에 비. 부르그도르페리 ss S-1-10을 함유한 시판되는 전 세포 개 라임병 백신[Galaxy, 제조원: 미국 미네소타주 멘도타 하이츠에 소재하는 솔바이 애니멀 핼쓰 인코포레이티드(Solvay Animal Health, Inc.)에서, 현재는 미국 네브라스카주 엘크호른에 소재하는 쉐링-프라우 애니멀 핼쓰(Schering-Plough Animal Health)] 0.25 mL로 뒤쪽 2개의 허벅지에 백신화하였다. 햄스터에게 추가 접종한 후, 혈청을 상기한 바와 같이 수집하였다.
BSK 배지의 제조:
바르보-스토에너-켈리(Barbour-Stoenner-Kelly: BSK) 브로쓰 배지는 비. 부르그도르페리의 시험관 내 배양을 위해 사용되었으며, 본 발명의 전반에 걸쳐 기재된 방법 및 살보렐리아 항체 시험에 사용된 1차 기질이었다. BSK 배지는 칼리스터 등의 문헌[참조: Detection of Borreliacidal Antibodies by Flow Cytometry, Section 11.5.1-11.5.12, Current Protocols in Cytometry, John Wiley and Sons, Inc., Supplement 26, (2003), 이의 전문은 본원에 참조로 인용되어 있음]에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. 간략하게는, BSK 배지는 다음 방법에 의해 제조되었다.
물질:
HEPES[제조원: 시그마(Sigma)]
네오펩톤(Neopeptone)[제조원: 디프코(Difco)]
시트르산 나트륨 (제조원: 시그마)
글루코스 (제조원: 시그마)
중탄산나트륨 (제조원: 시그마)
TC 이스톨레이트 (제조원: 디프코)
피루브산 (제조원: 시그마)
N-아세틸 글루코사민 (제조원: 시그마)
소 혈청 알부민(제조원: 시그마)
젤라틴 (미생물학적 등급; 제조원: 디프코)
5N NaOH
L-글루타민을 함유하고 중탄산나트륨을 함유하지 않은, 1Ox 콘나우트 메디칼 리서치 래보러토리스(Connaught Medical Research Laboratories: CMRL) 1066[제조원: 엠피 바이오메티칼스(MP Biomedicals)] 또는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 1640 배지(제조원: 시그마)
토끼 혈청[제조원: 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)], 56℃에서 45분 동안 열-불활성화시킴.
56℃ 수욕
정압 펌프(Positive-pressure pump)
밀리포어 필터 매니폴드(Millipore filter manifold)
프리필터(Prefilter) (124 mm)
0.2-, 0.45-, 및 0.8-μm 필터 (142-mm 직경)
0.2-μm 벨 필터(bell filter)
100-ml 멸균 용기
암시야 현미경(Dark-field microscope)
BSK 배지의 제조
1. 다음 성분을 2 내지 4시간 동안 혼합하면서 2리터들이 플라스크에 합하였다. 900 mL 미니-큐(Mini-Q) 이중 여과된 또는 탈이온화된 증류수:
6.0 g HEPES
5.0 g 네오펩톤
0.7 g 시트르산 나트륨
5.0 g 글루코스
2.2 g 중탄산나트륨
2.5 g TC 이스톨레이트
0.8 g 피루브산
0.4 g N-아세틸 글루코사민
50 g 소 혈청 알부민 (분획 V)
2. 상기 성분을 격렬하게 교반하면 비. 부르그도르페리에 대해 독성인 생성물이 파괴될 수 있기 때문에 가장 천천히 교반되는 플레이트 셋팅을 사용하여 천천히 혼합하였다.
3. BSK 성분이 혼합되는 동안, 젤라틴 용액을 다음과 같이 제조하였다: 500-mL 플라스크 속에, 200 mL의 밀리-큐 이중-여과된 또는 탈이온화된 증류수 및 14 g의 젤라틴을 합하고, 용해시키기 위해 교반하면서 배지 셋팅 상에서 가열하였다. 이후에, 용액을 121℃에서 15분 동안 오토클레이브(autoclave)시킨 다음, 56℃ 수욕 속에 두었다.
4. BSK 성분이 완전히 용해되면, 용액을 5N NaOH를 이용하여 pH 7.5로 조절하였다.
5. 이후에, 200 mL의 젤라틴 용액, 100 mL의 1Ox CMRL 1066 배지, 및 64 mL의 열-불활성화시킨 토끼 혈청(56℃에서 45분)을 다른 BSK 성분과 합한 다음, 완전히 혼합하였다.
멸균된 BSK 배지
6. 정압 펌프를 사용하여, BSK 배지를 124-mm 프리필터 및 최소(아래) 내지 최대(위) 공극 크기로 쌓여진 142-mm 0.2-, 0.45-, 및 0.8-μm 공극 직경 필터(pore diameter filters)가 수배로 로딩된 밀리포어 필터 매니폴드를 통해 펌핑(pumping)하였다. [BSK 배지는 오토클레이브시킴으로써 멸균시킬 수 없다. 예비-여과 과정이 필터 멸균 이전에 큰 미립자를 제거하기 위해 필요하다.]
7. 이후에, BSK 배지를 정압 펌프 및 멸균 0.2-μm 벨 필터를 사용하여 멸균 용기 내로 필터-멸균시켰다.
확인된 멸균성
8. 멸균 BSK 1-mL 분취량을 무균 제거한 다음, 멸균 1.5-mL 미세원심분리 튜 브에 옮기고, 35℃에서 밤새 항온처리시켰다. 남은 필터-멸균된 BSK를 4℃에서 저장하였다.
9. 항온처리에 이어, 멸균 BSK를 암시야 현미경을 사용하여 시험하여 멸균성을 확인하였다.
10. 이후에, 멸균 BSK를 멸균 저장 용기내로 옮겼다. [멸균 BSK 배지의 산화를 줄이기 위해서 저장 용기를 채울 때 윗 공간부분을 최소로 유지하였다.]
바르보르-슈에너-켈리(Barbour-Stoenner-Kelly: BSK) 배지의 품질 관리
BSK 배지를 사용하기 전에, BSK가 작은 수의 보렐리아 아종의 성장을 지지하고, 생존가능한 스피로헤타가 응집되지 않고 성장하는지를 보증 하는 것이 중요하다. BSK 배지의 고도의 가변성 성분은 소 혈청 알부민(BSA)이다. 본원에 사용된 품질 관리 프로토콜은 문헌(참조: Callister et al., 2003, 상기 참조)에 상세히 기재된 바와 같이, 시험 배양물을 사용하여 항온처리하고 수득한 배양물을 검사하였다.
?OspA 살보렐리아 항체의 검출:
OspA 살보렐리아 항체는 유동 세포측정 과정(flow cytometric procedure) 및 비. 부르그도르페리 ss S-1-10 (참조: Callister et al., Arch. Intern. Med. 1994, 154:1625-1632)를 사용하여 검출하였다. 스피로헤타의 새로운 배양물을 신선한 BSK를 사용하여 5 x 106 스피로헤타/mL의 농도로 희석시켰다. 동시에, 혈청 샘플을 신선한 BSK로 1:40으로 희석시킨 다음, 0.2 마이크론(㎛) 공극-크기의 미세 원심분리 필터를 통해 통과시켜 멸균시켰다. 이어서, 200 ㎕ 분취량을 멸균 1.5 mL 스크류-캡 미세원심분리 튜브로 옮긴 다음, 연속적으로 BSK 속에서 1:80 내지 1:20,480으로 희석시켰다. 혈청 샘플을 56℃에서 10분 동안 열-불활성화시킨 다음, 스피로헤타 현탁액 100 ㎕ 분취량(5 x 105 스피로헤타) 및 멸균 기니아피그 보체(제조원: 시그말) 10 ㎕를 가하였다. 검정물을 완전히 혼합한 다음, 35℃에서 16 내지 24 시간동안 항온처리하였다.
항온처리 후, 각각의 검정 현탁액 100 ㎕를 PBS 400 ㎕ 및 아크리딘 오렌지 1 ㎍/mL를 함유한 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 이후에, FACScan 유동세포측정기 [FACScan flow cytometer, 제조원: 벡톤 디킨슨 임뮤노사이토메트리 시스템(Becton Dickinson lmmunocytometry Systems), 미국 캘리포니아주 산호세 소재]를 사용하여 살보렐리아 활성을 검출하였다. 스피로헤타를 게이팅(gating)(CellQuest software, 제조원: 벡톤 디킨슨)에 의해 분리하고, 저속 셋팅된 유동 속도로 1 내지 2분 동안 분석하였다. 아크리딘 오렌지를 수포를 발생하는, 비-생존 스피로헤타 안에 끼어넣은 경우, 발생하는 증가된 형광 강도를 모니터링함으로써 OspA 살보렐리아 항체를 간접적으로 검출하였다. 정상적인 혈청 대조군과 비교하여 평균 형광 강도에 있어 13% 이상의 이동(shift)은 포지티브로 고려한다(참조: Callister et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002, 9:908-912). 이후에, 수포발생의, 비운동성 비. 부르그도르페리의 존재를 암시야 현미경으로 확인하였다. 포지티브 대조군을 각각의 검정에 포함시키며, 매 수행마다 동일한 반응성(+/- 1 희석액)이 검 정간 변이성을 최소하기 위해 요구되었다. 또한, 각각의 개로부터 수집한 혈청 샘플을 동시에 검정하였다.
B. 결과
rOspA 백신을 사용한 백신화는 15주 후 검출되지 않는, 7주 후에 단지 최소량(평균 역가 < 61)의 OspA 살보렐리아 항체를 유도하였다(참조: 표 2). 대조적으로, 대표적인(참조: Barbour et al., J. Infect. Dis. 1985, 152-478-484) 비. 부르그도르페리 ss 균주(S-1-10)를 함유한 개 백신으로 백신화시킨 햄스터는 7주 째에 피크된 고 수준의 살보렐리아 OspA 항체(역가 > 2560)를 유도한 다음, 조사기간 동안 상승된 상태로 유지되었다.
rOspA 또는 GALAXYTM(S-1-10) 개 라임병 백신으로 백신화한 후 OspA 살보렐리아 항체b의 평균 역가a.
백신 3주 7주 9주 15주
rOspA 9 61 4 NDc
S-1-10 1470 >2560 970 735
a 상호 희석액(Reciprocal dilution).
b 비. 부르그도르페리 ss S-1-10을 사용함으로써 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
따라서, 개 재조합체 OspA 백신은 햄스터에서 OspA 살보렐리아 항체의 현저한 역가를 유발하지 못한다.
실시예 2
재조합 OspC를 사용한 백신화
A. 물질 및 방법
?동물:
5주 내지 10주령의 LVG 햄스터들을 챨스 리버 브리딩 래보러토리즈, 인코포레이티드(Charles River Breeding Laboratories, Inc., 미국 매사추세츠주 윌밍톤 소재)로부터 입수하였다. 햄스터를 21℃의 주위 온도에서 우리당 3 또는 4마리씩 사육하고, 음식 및 물을 무제한 제공하였다.
?재조합체("r") OspC 백신의 제조:
rOspC를 앞서 기재한 pX3-22를 함유하는 이. 콜라이(E. coli) JM109로부터 회수하였다(참조: Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741). 간략하게, 이. 콜라이는 37℃에서 암피실린을 함유하는 2xTY 액체배지 속에서 배양하였고, 이소프로필-β-d-갈락토피라노시드(IPTG) (0.1 mM)를 대수증식기 동안에 가하였다. 세포를 원심분리하여 펠렛(pellet)화하고, 인산염 완충된 염수(PBS) 속에 재현탁시킨 다음, 초음파처리하여 분해하였다. 트리톤 X-100 (1% 용적/용적)을 가한 다음, 분해물을 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 이후에, 초음파처리된 이. 콜라이 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시킨 다음, 상층액을 아미노 말단 상의 바이오티닐화된 정제 태그를 통해 OspC를 결합시키는 소프트링크 수지(SoftLink resin)[제조원: 프로메가(Promega)]를 함유하는 칼럼 상에 통과시켰다. 이후에, 결합 OspC는 5 mM 바이오틴(제조원: 시그마)이 또한 함유된 정제 완충액을 사용하여 용출시켰다.
?햄스터의 백신화 및 혈청의 수집:
햄스터에 rOspC 75㎍이 함유된 프로인드 완전 보조제 0.1 mL를 목 뒤에 피하로 백신화한 후에, 초기 백신화 후 3주째에 프로인드 불완전 보조제 0.1 mL 중 75㎍의 rOspC를 추가 접종하였다. 초기 백신화 후, 5주째에, 햄스터를 노즈-앤-마우쓰 컵에 함유된 에테르를 흡입시켜 약간 마취시킨 다음, 심장내 구멍으로 혈액을 흐르게하였다. 혈액이 응고되도록 둔 다음, 혈청을 분리시키고 -70℃에서 사용할 때까지 저장하였다. 또한, 3마리의 정상 햄스터로부터의 햄스터 혈청을 혼주시킨 다음, 정상적인 혈청 대조군으로서 사용하였다.
?OspC 항체의 검출:
rOspC를 피복 완충액(0.015 M Na2CO3, 0.035M NaHCO3, pH 9.6) 속에 1000ng/mL으로 희석한 다음, 100㎕ 양을 각각의 평편바닥 아민-결합 미세역가 웰[flat-bottomed amine-binding microtiter well; 제조원: 코스타(Costar), 미국 매사추세츠주 캠브릿지에 소재]에 가하였다. 미량 역가 플레이트를 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리한 후, 플레이트를 PBS(pH 7.2)로 3회 세척한 다음, 실온에서 진탕시키면서 0.05% TWEEN 20 (제조원: 시그마) 및 1% 소 혈청 알부민(제조원: 시그마)을 함유한 PBS로 1시간 동안 차단시켰다. 차단 후, 플레이트를 PBS로 다시 세척하였다. 이후에, PBS/트윈(Tween) 중의 1:80 내지 1:20,480으로 연속적으로 희석시킨 햄스터 혈청 100㎕ 양을 각각의 웰에 가한 다음, 역가 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 역가 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, PBS/트윈 속에 1:3000으로 희석시킨 항-햄스터 IgG 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합체[제조원: 오르가논 테크니카 카펠(Organon Teknika Cappel)] 100㎕를 각각의 웰에 가한 다음, 역가 플레이트를 실온에서 1시간 동안 재-항온처리하였다. 이후에, 역가 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, o-페닐렌디아민 포스페이트(0.4 mg/ml; 제조원: 시그마) 100 ㎕를 각각의 웰에 가한 다음, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 1N H2SO4 100 ㎕를 가함으로써 반응을 정지시킨 다음, 490 nm[모델 EL 311; 제조원: 바이오테크 인코포레이티드(Bio-Teck Inc.), 미국 버몬트주 위노오스키 소재]에서의 흡광도를 즉시 측정하였다.
?OspC 살보렐리아 항체의 검출:
OspC 살보렐리아 항체를 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용하는 것을 제외하고는, 상기(실시예 1)에서 기술한 바와 같이 검출하였다.
B. 결과
rOspC 백신을 사용한 백신화는 ELISA에 의해 검출된 고 수준의 OspC 항체를 유도(참조: 아래 표 3)하였지만, 단지 저 수준(역가 80)의 살보렐리아 활성이 존재하였다. 이에 따라, rOspC를 사용한 백신화는 고 농도의 OspC 항체를 유도하였지만, 반응물은 감염에 대한 보호를 제공하지 않는 거의 대부분의 항체(예: 식균화)를 포함하였다. 이는, 비. 부르그도르페리 ss 50772 백신 중 75㎍ 농도의 단백질이 다수의 추가의 비-OspC 단백질의 존재에 대해 고려하지 않고 계산되었음을 고려할 때 특히 중요하다. 따라서, 총체적인 결과(실시예 1 및 2)는, 재조합체 Ospc가 완전한 비. 부르그도르페리 ss보다 현저히 적은 양의 살보렐리아 항체를 자극하였다는 이전의 발견(참조: Straubinger et al. Vaccine 2003, 20:181-193)을 입증하였다.
rOspC로 백신화한 후 OspC ELISA 또는 OspC 살보렐리아 항체 시험b에 의해 검출된 항체의 평균 역가a.
하기 시험에 의해 검출된 항체 역가
샘플 OspC ELISA OspC 살보렐리아 항체 시험
정상 NDC ND
rOspC 10240 80
a 5마리의 햄스터로부터 혼주된 혈청의 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
따라서, 개 재조합체 OspC 백신은 햄스터에서 OspC 살보렐리아 항체의 현저한 역가를 유발시키지 않는다.
실시예 3
비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10을 사용한 백신화
A. 물질 및 방법
?유기체:
비. 부르그도르페리 ss S-1-10은 비. 부르그도르페리 ss B31로부터 일반적으로 구별할 수 없는 대표적인 병원성 균주이다(참조: Barbour et al., J. Infect. Dis., 1985, 152:478-484). 분리주는 미국 위스콘신주 라 크로쎄 소재의 군데센 루테란 메디칼 파운데이션(Gundersen Lutheran Medical Foundation)의 스티븐 엠. 칼리스터(Steven M. Callister) 박사에 의해, 라 크로쎄 근처에서 1988년 2월에 포획된 흰발 마우스[white-footed mouse, 페로마이스쿠스 류코푸스(Peromyscus leucopus)]의 신장에서 초기에 회수된 다음, 개 라임병 백신 내 삽입용으로 솔바이 애니멀 핼쓰(Solvay Animal Health)에 의해 허가되었다. 후속적으로 시판 생성물(GALAXYTM Lyme)이 1997년 4월 17일에 쉐링 프라우 애니멀 핼쓰)Schering Plough Animal Health)에 의해 입수되었다. 당해 유기체는 OspA, OspB, 및 OspC를 발현한다. 그러나, 감염된 비. 부르그도르페리 ss 분리주의 전형으로서, 스피로헤타가 실험 BSK 배지에서 배양되는 경우, 상당히 높은 농도의 OspA 및 OspB가 생산된다. OspC의 발현은 35℃에서 배양함으로써 극대화될 수 있음이 밝혀졌다(참조: Schwan, Biochem. Soc. Trans. 2003, 31:108-112).
?동물
8주령의 비글 퍼피(beagle puppies)[공급원: 리드글란 팜스(Ridglan Farms), 미국 위스콘신 마운트 호렙 소재]를 공동 사육한 다음, 음식 및 물을 무제한 제공하였다. 실험을 검토한 다음, 쉐링 프라우 애니말 핼쓰 케어 앤드 유즈 커미티(Schering Plough Animal Health Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인받았다.
?비. 부르그도르페리 ss S-1-10 백신의 제조:
35℃에서 BSK 속에서 항온처리하여 대수증식기에 도달한 비. 부르그도르페리 ss S-1-10의 신규 배양물을, 이원 에틸렌이민(BEI)을 10 mM이 고 농도로 가한 다음, 추가 48시간 동안 항온처리하여 불활성화시켰다. 불활성시킨후, 멸균 티오황산 나트륨을 가하고 35℃에서 6 내지 12시간 동안 항온처리함으로써 BEI를 중화시켰다. 이후에, 스피로헤타를 원심분리시켜 펠렛화한 다음, ≤30 ㎍의 겜타마이신/mL 및 ≤30 단위의 나이스타틴/mL를 함유한 멸균 평형 염 용액 속에 재현탁시켰다. 이후에, 스피로헤타를 5% Emulsigen®[참조: 엠브이피 래보러토리스, 인코포레이티드(MVP Laboratories, Inc.)] 및 1% HEPES와 배합(blending)시켜 1.0 mL 투여량이 2.5 x 107 이상의 스피로헤타를 함유하도록 하였다.
?백신화 및 혈청의 수집:
개를 S-1-10 백신 1 mL 투여량으로 목에 피하로 백신화한 다음, 21일 후 추가의 1 mL 투여량을 추가 접종하였다. 전 혈액을 경정맥의 정맥천자에 의해 추가 백신화(조사 21일째) 직전에 즉시 수집한 다음, 조사 28, 35, 47, 83, 및 113일째에 수집하였다. 혈청을 원심분리로 분리한 다음, 시험할 때까지 -2O℃에서 저장하였다.
?살보렐리아 항체의 검출:
OspA 및 OspC 살보렐리아 항체를 실시예 1 및 2에서 상기한 바와 같이, 비. 부르그도르페리 ss S-1-10 및 50772를 사용하여 유동 세포분석기로 검출하였다.
B. 결과
비. 부르그도르페리 ss S-1-10을 사용한 백신화는 조사 21일째에 검출가능하고, 조사 28일째에 피크된 다음, 조사 113일째에 검출가능하도록 잔존하는 고 수준의 살보렐리아 OspA 항체를 신뢰있게 유도한다(참조: 아래 표 4). 대조적으로, OspC 살보렐리아 항체는 검출되지 않았다(참조: 1:80 미만 역가). 따라서, 통상의 비. 부르그도르페리 ss 균주는 35℃에서 스피로헤타를 항온처리함으로써 OspC 발현을 극대화시킴에도 불구하고 OspC 살보렐리아 항체 생성을 유도하는 것에 실패했다.
비. 부르그도르페리 ss S-1-10으로 백신화한 후 OspA 또는 OspC 살보렐리아 항체의 평균 역가a (n=8).
살보렐리아 항체 21일 28일 35일 47일 83일 113일
OspAb 202 9481 9481 4740 1613 1382
OspCc NDd ND ND ND ND ND
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss S-1-10을 사용함으로써 검출됨.
c 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출됨.
d ND = 검출되지 않음.
따라서, 비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10을 사용하는 백신은 OspC 살보렐리아 항체의 상당한 역가를 유발시키는데 실패했다.
실시예 4
비. 부르그도르페리 ss 분리주 50772를 사용한 백신화
A. 물질 및 방법
?유기체:
비. 부르그도르페리 ss 50772는 OspC 항원을 발현시킴으로써 균주를 확인하는데 실패한 앤더슨(Anderson) 등의 문헌(참조: J. of Clin. Microbiol., 1996, 34:524-529)에 초기 보고된 고유의 OspA-/OspB- 균주이다. 50772 균주는 문헌[참조: 미국 특허 제6,464,985호, 이의 전문은 본원에 참조로 인용되어 있음]에 OspC 항원을 발현하는 것으로서 기재되어 있고, 당해 균주는 상기 특허문헌에 ATCC 기탁번호: 제PTA-439호로 기탁된 것으로서 보고되어 있다.
?동물
8주령의 비글 퍼피(공급원: 리드글란 팜스, 미국 위스콘신주 마운트 호렙 소재)를 공동 사육한 다음, 음식 및 물을 무제한으로 제공하였다. 실험을 검토한 다음, 쉐링 프라우 애니멀 핼쓰 애니멀 케어 앤드 유즈 커미티: IACUC)에 의해 승인받았다.
?비. 부르그도르페리 ss 50772 백신의 제조:
비. 부르그도르페리 ss 50772 백신을 실시예 3에서 상기한 바와 같이 제조하였다.
백신화 및 혈청의 수집:
개를 50772 백신 1 mL 투여량으로 목에 피하로 백신화한 다음, 21일 후 추가의 1 mL 투여량으로 추가 접종하였다. 전혈을 경정맥의 정맥천자에 의해 추가 백신화(조사 21일째) 직전에 즉시 수집한 다음, 조사 28, 35, 47, 83, 및 113일째에 수집하였다. 혈청을 원심분리로 분리한 다음, 시험할 때까지 -2O℃에서 저장하였다.
?살보렐리아 항체의 검출:
OspC 살보렐리아 항체를 실시예 1 및 2에 상기한 바와 같이, 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용하는 유동 세포분석기로 검출하였다.
B. 결과
비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용한 백신화는 조사 35일째에 피크된 다음, 조사 113일째에 검출가능하도록 잔존하는 고 수준의 살보렐리아 OspC 항체를 신뢰있게 유도하였다(참조: 아래 표 5). 따라서, rOspC 또는 전통적인 비. 부르그도르페리 ss 분리주(S-1-10)를 사용한 백신화와는 대조적으로, 고유의 비. 부르그도르페리 ss 균주 50772를 사용한 백신화는 상당한 수준의 OspC 살보렐리아 항체를 유도하였다.
비. 부르그도르페리 ss 50772로 백신화한 후 OspC 살보렐리아 항체b의 평균 역가a (n=8).
21일 28일 35일 47일 83일 113일
NDc 5530 1097 435 274 202
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
따라서, 비. 부르그도르페리 ss 분리주 50772를 포함하는 백신은 고 농도의 OSpC 살보렐리아 항체를 유도한다.
실시예 5
비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10 및 50772를 포함하는 백신의 제조
A. 물질 및 방법
?성장:
비. 부르그도르페리 ss S-1-10 및 비. 부르그도르페리 ss 50772의 동결된 스톡 배양물을 표준 조건하에 항온처리하는데, 즉, 스톡 배양물을 각각 33 ± 2℃ 및 35 ± 2℃에서 5% CO2로 강화된 공기 대기하에 5 내지 17 mL의 BSK(Barbour Stoenner Kelly) 배지[참조: Callister et al., 1990, J. of Clinical Microbiology 28: 363-365, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있음]를 함유하는 각각의 스크류 캡 배양 튜브 속에서 성장시켰다. 대수증식기에 도달한 후, 배양물을 이용하여 150 내지 200 mL의 신선한 BSK 배지에 접종시킨 다음, 배양물이 대수증식기에 도달할 때까지 배양하였다. 이후에, 수득한 현탁액을 사용하여 상기한 바와 같이, 추가 배양 이전에 10 내지 20 리터 병(생산 배양)에 함유된 5 내지 10 리터의 신선한 BSK에 백신화하였다.
?불활성화:
생산 배양물 중의 스피로헤타를, BEI를 1OmM의 농도로 가한 다음, 24 내지 48시간 동안 천천히 교반시키면서 항온처리함으로써 불활성화시켰다. 스피로헤타를 불활성화시킨 후, BEI를, 멸균 3.015M 티오황산 나트륨 10.6 mL를 BSK/스피로헤타 현탁액의 각각의 리터에 가한 다음, 6 내지 12시간 동안 천천히 교반시키면서 항온처리함으로써 중화시켰다.
?농도 및 배합:
불활성화된 스피로헤타를 원심분리시켜 펠렛화한 다음, 젠타마이신 30 ㎍/mL 및 나이스타틴 30 단위/mL를 함유한 멸균 평형 염 용액 속에 재현탁시켰다. 시험 백신을 5% Emulsigen®[제조원: 엠브이피 래보러토리즈, 인코포레이티드MVP Laboratories, Inc.)]와 배합시킨 다음, 2.0 mL 유리 바이알에 채워서 각각의 투여량(1.0 mL)이 ≥2.5 x 107 유기체/mL의 비. 부르그도르페리 ss S-1-10, ≥5.0 x108 유기체/mL의 비. 부르그도르페리 ss 50772, 1% HEPES, 29 ㎍/mL 젠타마이신, 및 29 단위/mL 나이스타틴을 함유하도록 하였다.
실시예 6
비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10 및 50772를 포함하는 백신의 안전성 및 효능
A. 물질 및 방법
?동물:
8주령의 비글 퍼피(공급원: 리드글란 팜스, 미국 위스콘신주 마운트 호렙 소재)를 개별적으로 또는 공동 사육한 다음, 음식 및 물을 무제한으로 제공하였다. 실험을 검토한 다음, 쉐링 프라우 애미널 핼쓰 애니멀 케어 앤드 유즈 커미티((IACUC)에 의해 승인받았다.
?백신화 및 혈청의 수집:
개에게 백신 1 mL 투여량을 목에 피하로 백신화한 다음, 21일 후 추가의 1 mL 투여량으로 추가 접종하였다. 전혈을 경정맥의 정맥천자에 의해 초기 백신화(조사 -3일째) 직전에 수집한 다음, 조사 28, 35, 43, 78, 106, 134, 162 및 197일째에 또한 수집하였다. 혈청을 원심분리로 분리한 다음, 시험할 때까지 -2O℃에서 저장하였다.
?백신화 후 관찰:
각각의 백신화 후, 주입 부위를 반응이 느껴지지 않을 때까지 매일 촉진한 다음, 항문 온도를 백신화 후 4 내지 6시간 및 백신화 후 1 내지 3일에 기록하였다.
?진드기 챌린지:
제2 백신화 후 3주째에, 개의 흉강의 우측 상을 면도한 다음, 10마리의 암컷 및 10마리의 수컷 비. 부르그도르페리 ss-감염된 아이. 스카퓰라리스(I. scapularis) 진드기를 테이프와 붕대 랩으로 면도된 자리를 확보한 고무 컵 안에 위치시켰다.
?진드기 내 비. 부르그도르페리 ss의 검출:
진드기 구기(mouthpart)를 작은 칼로 제거한 다음, 중간 창자를 손질하고 유리 슬라이드 위에 도말한 다음, 실온에서 밤새 건조하도록 두었다. 건조시킨 후, 슬라이드를 8 내지 10분 동안 아세톤 속에 고정시킨 다음, 공기-건조시켰다. 종-특이적인 마우스 OspA 모노클로날 항체 H5332를 PBS (pH 7.2) 속에 1:40으로 희석시킨 다음, PBS 속에 1:500으로 희석된 염소 항-마우스 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지된 면역글로불린 G 항체로 도말하였다. 항온처리한 후, 슬라이드를 PBS로 세척한 다음, 공기-건조시키고, 형광 현미경으로 검사하였다. 각각의 슬라이드를 2개의 숙련된 미생물학자가 독립적으로 검사하였다.
?혈액 샘플:
전혈을 조사 78, 106, 134, 162, 및 197일째에 혈청 분리 수송(serum separation transport: SST) 튜브 속에 수집한 다음, 혈청을 분리시키고, 시험할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
?OspA 항체의 제거:
재조합체(r) OspA를 앞서 기재한 바와 같이(참조: Callister et al., J. Infect. Dis. 1993, 167:158-164), OspA-글루타티온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질을 발현하는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli: "E. coli") DH5α로부터 회수하였다. 요약하면, 이. 콜라이를 37℃에서 암피실린을 함유하는 2xTY 브로쓰 속에서 항온처리한 다음, 이소프로필-β-d-갈락토피라노시드("IPTG")(0.1 mM)를 대수증식기 동안에 가하였다. 세포를 원심분리하여 펠렛화하고, 인산염 완충된 염수("PBS") 중에 재현탁시킨 다음 초음파처리하여 분해하였다. 트리톤 X-100(1% 용적/용적)을 가한 다음, 분해물을 10,000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이후에, 융합 단백질을 함유하는 상층액을 글루타티온-세파로스 4B 칼럼[제조원: 파마시아(Pharmacia)] 위에 통과시킨 다음, 재조합체 OspA를 50 mM 트리스-Cl (pH 8.0) 및 5 mM 환원된 글루타티온으로 용출시키고, 정제 완충액(50 mM 트리스 [pH 8], 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100) 속에 재현탁시켰다.
이후에, rOspA 융합 단백질을 시아노겐 브로마이드(CNBr) 활성화에 의해 세파로스 4B에 결합시켰다. 상세하게는, CNBr-활성화된 세파로스 4B(제조원:파마시아) 0.8 g을 커플링 완충액(0.1 M NaHCO3-0.5 M NaCl, pH 8.3)으로 세척하고, 커플링 완충액 중의 OspA 2 mg을 겔에 가한 다음, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 온화하게 진탕하였다. 겔을 커플링 완충액으로 2회 세척한 후, 4 mL의 에타놀아민(pH 9)을 가한 다음, 겔을 결합되지 않은 부위를 차단하도록 2시간 동안 항온처리하였다. 겔을 0.1 M 아세트산나트륨-0.5 M NaCl(pH 4.0) 50 mL로 3회 세척한 이후에, PBS 속에 평형화시켰다. PBS 속에 10배 희석된 면역 혈청 샘플 1 mL를 칼럼 상에 4회 통과시켰다.
?OspC 항체의 제거:
rOspC를 앞서 기재한 바와 같이(참조: Rousselle et al., J. Infect. Dis. 1998, 178:733-741), pX3-22를 함유하는 이. 콜라이 JM109로부터 회수하였다. 재조합체 단백질의 생산은 rOspA에 대해 상기한 바와 같이 유도되었다. 이후에, 초음파처리된 이.콜라이 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상층액을 아미노 말단 상의 바이오티닐화된 정제 태그를 통해 OspC를 결합하는 소프트링크 수지(SoftLink resin, 제조원: 프로메가)를 함유하는 칼럼 위에 통과시켰다. 이후에, 결합된 OspC를 5 mM 바이오틴(제조원: 시그마)이 또한 함유된 정제 완충액을 사용하여 용출시켰다.
이후에, 테트라링크 테트라메릭 아비딘 수지(제조원: 프로메가) 1 mL 용적을 세척하고, PBS 40 mL 속에 현탁시킨 다음, 70-mm 폴리프로필렌 칼럼으로 10-mm 위로 로딩(loading)시켰다. PBS 1 mL 용적 속에서 투석된 rOspC 0.5 mg을 칼럼 위에 통과시키고, 결합을 단백질 검정[제조원: 바이오-라드(Bio- Rad)]에 의해 확인하였다. PBS 속에서 10배 희석된 면역 혈청 1 mL 용적을 칼럼 위에 4회에 걸쳐 통과시켰다.
?OspC7-특이적 항체의 제거:
OspC의 7C-말단 아미노산(OspC7)을 함유하는 융합 단백질을 앞서 기재한 바와 같이(참조: Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있음), pXT7을 함유하는 이. 콜라이 JM109로부터 회수하였다. 재조합체 단백질의 생산은 위의 rOspA에 대해 기재된 바와 같이 유도하였다. 이후에, 초음파처리된 이.콜라이 세포를 원심분리에 의해 펠렛화한 다음, 상층액을 아미노 말단 상 바이오티닐화된 정제 태그를 통해 OspC7을 결합하는 소프트링크 수지(제조원: 프로메가)를 함유하는 칼럼 상에 통과시켰다. 이후에, 결합된 OspC7을 5 mM 바이오틴(제조원: 시그마)이 또한 함유된 정제 완충액을 사용하여 용출시켰다. 이후에, 테트라링크 테트라메릭 아비딘 수지(제조원: 프로메가) 1 mL 용적을 세척하고, PBS 40 mL 속에 현탁시킨 다음, 70-mm 폴리프로필렌 칼럼으로 10-mm 위로 로딩시켰다. PBS 1 mL 용적 속에 투석된 rOspC 0.5 mg 양을 칼럼 위에 통과시킨 다음, 결합을 단백질 검정(제조원: 바이오-라드)으로 확인하였다. PBS 속에 10배 희석된 면역 혈청 1 mL 용적을 칼럼 상에 4회에 걸쳐 통과시켰다.
?살보렐리아 항체의 검출:
OspA 및 OspC 살보렐리아 항체를 실시예 1 및 2에서 상기한 바와 같이, 비. 부르그도르페리 ss S-1-10 및 50772를 사용하여 유동 세포분석기로 검출하였다.
?피부 생검:
피부 생검을 조사 78, 106, 134, 162, 및 197일째에 일회용 4 mm 천공 장치로 진드기가 부착된 인접한 위치에서 수행하였다. 생검을 젤라틴(BSK+G)이 보충된 BSK(참조: Callister et.al, J. Clin. Microbiol. 1990, 28:363-365) 9 mL, 40 내지 50 마이크로그람(㎍)/mL 리팜핀(rifampin), 및 8 ㎍/mL 카나마이신을 함유한 별개의 튜브 내로 위치시켰다. 배양물을 35 ± 2℃에서 3주 동안 항온처리한 다음, 스피로헤타에 대해 암시야 현미경으로 주마다 검사하였다.
?면역 제어:
개에게 챌린지한 후 13주째에 시작하여 5일 동안 덱사메타손(0.4 mg/lb 체중)을 매일 투여함으로써 면역 제어하였다.
?임상적 관찰:
개를 견직(사지에 전체 체중이 가해지는 것이 힘듦), 절름발이(걷거나 뛰는 동안 사지를 지지함) 또는 불구(lameness)(체중을 지탱하지 못함)를 포함하는 사지/관절 장애에 대해 매일 관찰하였다. 2명 이상의 관찰자의 의견에 따라 점수를 매긴 다음, 개를 담당 수의사가 검사하여 어떠한 다른 외부 손상도 배제되도록 하였다.
? 부검:
3 이상의 지속적인 관찰 기간 동안 사지/관절 장애를 갖는 개들을 안락사시킨 다음, 부검하였다. 팔꿈치, 손목, 무릎, 발목, 심장, 비장, 방광 및 양쪽의 신장에서 조직 샘플을 수집한 다음, 배양에 의한 비. 부르그도르페리 분리를 수행하였다. 관절 조직을 9 mL BSK+G를 함유한 각각의 튜브속에서 배양시켰다. 다른 조직(심장, 비장, 방광, 및 신장)을 9 mL BSK+G와 합하고, 스토마커(stomacher)로 철저히 균질화시킨 다음, 1 mL의 양을 신선한 BSK+G 9 mL를 함유한 별개의 튜브로 옮겼다. 배양액을 35 ± 2℃에서 항온처리하였다.
남아 있는 개를 조사 말기에 안락사시킨 다음, 부검하였다. 이러한 개들로부터의 조직 샘플을 관절낭, 및 팔꿈치, 손목, 무릎, 및 발목의 힘줄로부터 수집한 다음, 조직병리학 검사를 위해 10% 완충된 포르말린 속에 저장하였다. 또한, 팔꿈치, 손목, 무릎, 및 발목의 관절낭의 샘플을 9 mL BSK+G 또는 항생제가 첨가된 BSK+G를 함유하는 개개의 튜브 내에 위치시킨 다음, 35 ± 2℃에서 3주 동안 항온처리하였다.
?웨스턴 블롯팅(Western Blotting):
웨스턴 블롯팅을 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 비. 부르그도르페리 ss 297을 샘플 완충액 속에서 5분 동안 비등시킨 다음, 총 단백질 150 ㎍을 0.1 % SDS-12% 폴리아크릴아미드 겔(콤브(comb) 없이 4% 폴리아크릴아미드 농축 겔) 상에 로딩시켰다. 단백질 농도를 단백질 측정 키트(protein determination kit)로 측정한 다음, 2개의 겔을 전기영동 유닛에 동시에 진행시켰다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스로 옮기고, 니트로셀룰로스를 띠(strip)로 자른 다음, 22℃에서 30분 동안 PBS-0.3% 트윈 20으로 차단하였다. 띠를 22℃에서 1시간 동안 1:100으로 희석된 개 혈청과 함께 항온처리한 다음, PBS-0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 항-개 IgG[제조원: 커크가아드 앤드 페리 래보러토리즈(Kirkegaard & Perry Laboratories), 미국 매릴랜드주 게이터스부르그 소재]를 가한 다음, 띠를 TMB 막 퍼옥시다제 기질 시스템(TMB Membrane Peroxidase Substrate System: 제조원: 커크가아드 앤드 페리 래보러토리즈, 미국 매릴랜드주 게이더스부르그 소재)으로 발현하기 전에 22℃에서 30분 동안 항온처리하였다.
B. 결과
?백신의 안전성:
개는, 항문 온도가 증가하지 않고, 임상적으로 정상적인 다음의 백신화을 유지하였다. 그러나, 상기 백신으로 백신화된 개들은 8일 내에 가라앉은 주입 위치가 약간 부풀어올랐다. 가장 넓은 반응은 1 x 1 x 0.5 cm (백신화한지 24 시간 후)로 측정되었다.
?백신화 후 혈청학:
위약을 사용한 백신화는 비. 부르그도르페리 ss에 대해 특이적인 항체를 유도하는데 실패했다. 대조적으로, 당해 백신을 사용한 백신화는 비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10 또는 50772를 사용함으로써 검출된 상당한 수준의 살보렐리아 항체를 유도하였다. 살보렐리아 항체의 평균 역가는 추가 접종 백신화(조사 28일째) 후 1주째에 피크된 S-1-10을 사용함으로써 검출되며, 조사 197일째에도 검출가능하게 잔존하였다(참조: 아래 표 6). 유사하게, 분리주 50772에 대해 특이적인 고 농도의 살보렐리아 항체는 조사 28일째에 존재하여, 조사 43일째에 상승된 채로 유지되었고, 조사 197일째에 검출가능하게 잔존하였다(참조: 아래 표 7).
백신으로 백신화한 후 살보렐리아 항체b의 평균 역가a (n=15)
그룹 -3일 21일 28일 35일 43일 78일 106일 134일 162일 197일
백신화된
그룹		 NDc >211 >8128 >6160 >4889 1404 970 970 1016 220
대조군 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss S-1-10을 사용한 살보렐리아 항체 시험을 사용함에 의해 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
백신으로 백신화한 후 살보렐리아 항체b의 평균 역가a (n=15)
그룹 -3일 21일 28일 35일 43일 78일 106일 134일 162일 197일
백신화된
그룹		 NDc ND 1470 884 221 50 48 46 42 42
대조군 ND ND ND ND ND N/Ad N/A N/A N/A N/A
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용한 살보렐리아 항체 시험을 사용하여 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
d N/A = 적용가능하지 않음.
?OspA 및 OspC 살보렐리아 항체의 확인:
살보렐리아 활성이 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체로 인한 것임을 확인하기 위해, 당해 백신으로 백신화시킨 5마리의 개로부터의 면역 혈청을 rOspA 또는 rOspC를 함유하는 별개의 칼럼 위에 통과시킨 다음, 살보렐리아 활성에 대한 효과를 시험하였다. 재조합체 단백질로 혈청을 흡수시킴으로써 OspA-특이적 또는 OspC-특이적 항체를 제거하는 것은 비. 부르그도르페리 ss S-1-10 또는 50772 분리주를 각각 사용함으로써 검출된 살보렐리아 활성을 상당히 감소시켰다(≥4배의 감소). 따라서, 발견들을 총괄하면, 백신이 상당한 수준의 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체를 유도하고, 비. 부르그도르페리 ss S-1-10 또는 50772에 의해 검출된 살보렐리아 활성이 거의 대부분 특이적 OspA 또는 OspC 살보렐리아 항체임이 확인되었다. 아래 표 8을 참조한다.
백신으로 백신화된 개(n=5)로부터의 혈청에서 살보렐리아 활성에 있어 OspA 또는 OspC 항체 제거의 효과
살보렐리아 항체 역가a
OspAb OspCc
혈청 흡수 전 흡수 후 흡수 전 흡수 후
1 5120 160 5120 640
2 2560 160 5120 320
3 10240 NDd 5120 320
4 2560 ND 1280 160
5 1280 80 2560 320
OspA 대조군 2560 ND
OspC 대조군 2560 ND
a 상호 희석액.
b 조사 43일째 수집된 혈청.
c 조사 28일째 수집된 혈청.
d ND = 검출되지 않음.
?OspC7-특이적 살보렐리아 항체의 확인:
OspC 살보렐리아 항체가 OspC7에 대해 특이적인 상당한 부분의 살보렐리아 항체를 함유하는 것을 확인하기 위해서, 당해 백신으로 백신화된 5마리 개의 면역 혈청을 rOspC7을 함유한 칼럼 위에 통과시킨 다음, 살보렐리아 활성에 대한 효과를 시험하였다. 재조합체 OspC7 단백질로 혈청을 흡수시킴으로써 OspC7-특이적 항체를 제거하는 것은 비. 부르그도르페리 ss 50772 분리주를 사용함으로써 검출된 살보렐리아 활성을 상당히 감소시켰다(2 내지 4배 감소). 이에 따라, 백신이 보존된 OspC7 에피토프에 대해 특이적인 상당한 수준의 OspC 살보렐리아 항체를 유도시킴을 확인하였다. 아래 표 9를 참조한다.
백신으로 백신화된 개(n=5)로부터의 혈청에서 살보렐리아 활성에 있어서 OspC7 항체 제거의 효과.
살보렐리아 항체 역가a
혈청 흡수전 흡수후
1 20480 5120
2 10240 5120
3 10240 2560
4 5120 2560
5 10240 2560
OspC 대조군 2560 ND
a 상호 희석액.
b 조사 28일째 수집된 혈청.
c ND = 검출되지 않음.
?감염된 진드기를 멸균시키는 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체의 능력:
백신화된 또는 대조군 개 위에 기생하는 진드기의 중간창자를 실험하여 당해 백신에 의해 유도된 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체가 진드기를 멸균시켰는지를 확인하였다. 비. 부르그도르페리 ss는 15마리의 위약-백신화된 개 중 13마리의 개 위에 기생하는 106마리의 암컷 진드기 중 34(32%)마리의 진드기 표본에서 검출되었다(참조: 아래 표 10). 대조적으로, 당해 백신으로 백신화한 개 위에 기생하는 암컷 진드기로부터의 중간창자에서는 스피로헤타(99마리 중 0마리)가 검출되지 않았다(p < 0.0001).
백신화된 개 또는 대조군 개로부터 제거된 암컷 진드기에서 비. 부르그도르페리 ss의 검출
시험 그룹 처리된 암컷 진드기 (충혈 및 비충혈) 비. 부르그도르페리에 대한 포지티브 표본 포지티브 개의 총 숫자
백신화된 그룹 99/151(61%) 0/99(0%) 0/15
대조군 106/148(64%) 34/106(32%) 13/15*
* P < 0.0001
?피부로부터 비. 부르그도르페리 ss의 회복을 방지하는 백신의 능력:
또한, 백신-유도된 살보렐리아 항체는 스피로헤타가 피부를 콜로니화(colonize)시키는 것을 막는다. 비. 부르그도르페리 ss는 한달 간격으로 위약-백신화시킨 후 진드기-챌린지시킨 개로부터 수집된 71개의 생검 중 56개(79%)로부터 회수되었고(참조: 아래 표 11), 스피로헤타는 15마리 개 중의 14(93%)마리로부터의 하나 이상의 피부 생검으로부터 회수되었다. 대조적으로, 비. 부르그도르페리 ss는 백신으로 백신화된 개로부터 수집된 임의의 피부 생검으로부터 회수되지 않았다(p < 0.0001)
백신화된 또는 백신화되지 않는 대조군 개의 피부에서의 비. 부르그도르페리 ss의 분리.
처리 그룹 78일 106일 134일 162일 197일 총 포지티브 생검 포지티브 개의 총 숫자
백신화된 그룹 0/15 0/15 0/15 0/15 0/13 0/73(0%) 0/15(0%)
대조군 12/15 13/15 11/15 11/14 9/12 56/71 (79%) 14/15* (93%)
P < 0.0001
?감염의 혈청학적 흔적을 방지하는 백신의 능력:
백신은 또한 라임병-특이적 항체의 확장을 방지한다. 이전의 조사(참조: SPAHC Report B01-184-01 R)는, 비. 부르그도르페리 ss에 의한 감염이 약 20 kDa 단백질을 결합시키는 개 항체를 신뢰있게 유도하고, 상기 반응은 백신에 의해 유도되지 않음을 입증하였다(참조: 도 1). 현재의 조사에서는, 감염-특이적 20 kDa 단백질을 결합하는 항체는 15마리 위약-백신화된 대조군 개 중의 14마리(93%) 개로부터의 면역 혈청에서 용이하게 검출되었다(참조: 도 2A). 또한, 임의의 20 kDa 단백질 항체를 함유하지 않는 혈청을 피부로부터 스피로헤타를 수득하는데 또한 실패한 대조군 개로부터 수집하였다. 대조적으로, 20 kDa 단백질 항체는 당해 백신으로 백신화된 어떠한 개에 의해서도 생산되지 않았다(p < 0.0001)(참조: 도 2B).
또한, 라임병을 앓는 개는 비. 부르그도르페리 ss 50772 분리주를 사용함으로써 또한 검출가능한 비-OspC 살보렐리아 항체를 생산한다(참조: Callister et al., J. Clin. Microbiol. 2000, 38:3670-3674). 반응의 특이적 표적물은 알려지지 않았지만, 상기 항체는 감염의 고도의 특이적인 혈청진단 확인을 제공한다. 당해 백신으로 백신화된 개는 이미 OspC 살보렐리아 항체를 생산하지만, 어떠한 개도 진드기 챌린지 후에 비. 부르그도르페리 ss 50772-특이적 살보렐리아 항체의 상당한(4배 이상) 증가를 발현시키지는 않았다. 따라서, 백신화된 개들이 스피로헤타로 감염된 것 같지는 않다. 대조적으로, 살보렐리아 항체는 챌린지 전에 위약--백신화된 개에 의해 생성되지 않지만, 15마리의 개 중 10마리(67%; p = 0.0002)가, 진드기가 먹이섭취 한 후, 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출된 상당한 수준(역가 ≥ 1:640)의 살보렐리아 항체를 발현시켰다(참조: 아래 표 12).
진드기 챌린지 후, 살보렐리아 항체b의 평균 역가a
처리 그룹 78일 106일 134일 162일 197일 역가가 증가된 개의 총 숫자
백신화된 그룹 50 48 46 42 42 0/15
대조군 >121 >463 >640 >390 >403 10/15*
* P = 0.0002
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출됨.
?명백한 사지/관절 장애를 방지하는 백신의 능력:
선행 조사(참조: Summers et al., J. Comp. Path. 2005, 133:1-13, Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28)는, 단지 비. 부르그도르페리 ss로 감염되면 명백한 사지/관절 장애(예를 들면, 종창, 불구)를 거의 유발하지 않음을 입증하였고, 우리의 발견은 이를 확인하였다. 단지 한 마리(8%)의 위약-백신화된 대조군 개가 관절 이상을 발현하였다. 왼쪽 앞다리는 진드기-챌린지 후 9주째에 경직되었고, 비. 부르그도르페리 ss 스피로헤타는 팔꿈치로부터 회수되었다. 그러나, 이러한 발견은, 당해 백신으로 백신화된 2마리 개가 또한 하나 이상의 사지에서 경직이 발현된 반면, 대조적으로 위약을 투여받은 개에서는, 스피로헤타가 어떠한 조직에도 회수되지 않았기 때문에 대단한 것은 아니었다.
증상의 발현을 명백하게 악화시키기 위해서, 남아있는 개를 면역제어하였다. 결과적으로, 3마리의 위약-백신화된 대조군 개가 절름발이가 되었고, 비. 부르그도르페리 ss는 이들 개 중 2마리에서 회수되었다. 대조적으로, 당해 백신으로 백신화된 면역제어된 개는 불구로 발현되지 않았다. 따라서, 발견들을 총괄하면, 백신이 상기한 결과가 상당하지 않을지라도(p = 0.0996), 라임 관절염의 발병을 방지함을 제안하였다. 그러나, 아래 제시되고 기술된 추가 데이터를 참조한다.
?비. 부르그도르페리 ss 감염과 연관된 침식적 변화(erosive change)를 방지하는 백신의 능력:
위에서 논의한 개의 관절을 현미경으로 검사하였지만, 이러한 발견은 백신의 효능을 확실히 입증하였다. 당해 백신으로 백신화된 남아있는 개(n=13)의 관절낭은 정상이었다. 대조적으로, 위약-백신화된, 11마리의 남아있는 대조군 개 중의 6마리(p = 0.0034)로부터의 하나 이상의 관절 조직은 호중구 및 단핵 세포의 침윤으로 특징지어진 상당한 염증을 가졌다(참조: 도 3). 또한, 비. 부르그도르페리 ss는 백신으로 백신화된 개의 어떠한 조직으로부터도 회수되지 않았지만, 스피로헤타는 침식적 변화를 가진 6마리의 위약-백신화된 대조군 개 중의 5(83%)마리의 관절 조직으로부터 회수되었다. 따라서, 발견들을 총괄하면, 백신이 개 라임 관절염을 방지함을 입증하며, 또한, 증상이 대부분 임상적 활액막염에 의해 종종 특징지어진다는 선행 보고를 입증하였다(참조: Summers et al., J. Comp. Path. 2005, 133:1-13; Wikle et al., J. Appl. Res. Vet. Med. 2006, 4:23-28).
실시예 7
OspC7 에피토프에 대해 지시된 천연-발생 살보렐리아 항체의 특이성
살보렐리아 항체가 포유동물에서 OspC7에 대해 유발됨을 입증하는 데이터가 다음과 같이, 라임병 또는 라임-관련 증상의 과거병력을 가지거나 가지지 않은 개개인(사람)의 혈청을 분석함으로써 수득되어져 왔다.
A. 물질 및 방법
1. 혈청:
라임병 또는 라임-관련 증상(n=36)의 과거 병력(차트 검토)이 없는 개인으로부터의 정상 혈청, 공혈자(n=100) 또는 콜레스테롤 스크리닝(n=100)을 겪고 있는 개인으로부터의 무특징적 혈청, 또는 항핵 항체(n=20), 류마티스 인자(n=20), 단핵증(n=10), 거대세포바이러스(n=10), 매독(n=13) 또는 록키산 홍반열(n=4)을 포함하는, 비. 부르그도르페리 ss 항원으로 일반적으로 교차-반응한 혈액 인자 또는 질병을 가진 지원자로부터의 혈청은 -20℃에서 저장된, 보관된 샘플로 부터의 혈청이다. 라임병 혈청은 2003년 또는 2004년 동안에 기관(Gundersen Lutheran Medical Center)에서 평가된 환자로부터 수집되었다. CDC 감시 기준(surveillance criterion)(참조: 질병 통제 및 예방을 위한 센터. Morb. Mort. Wkly. Rep. 1990, 39:19-21.)을 충족시키는 이동홍반(EM)을 가진 환자의 혈청(n=86)은 유사 라임(likely Lyme)으로서 분류되었고, 진드기 노출(tick exposure) 및 비정형 피부 병변을 가진 환자로 부터의 혈청(n=22)은 후보 라임(n=49)으로 분류되었으며, 진드기 노출 및 초기에 두통, 열, 근육통 및 관절통을 포함하는 전신 증상을 갖는 환자로 부터의 혈청은 가능한 라임(possible Lyme)으로서 분류되었다. 혈청은 초기 방문에 수집되어 -20℃에서 보관되었으며, 시험 직전에 블라인딩(blinding)되었다.
OspC7 펩티드. 7-aa OspC7 펩티드(AESPKKP; 서열 1)를 자동 합성기[제조원: 프로테인 테크놀로지스(Protein Technologies)]를 사용하고, Fmoc 방법(참조: Fields, et al., Peptide Res. 1991, 4:95-101)으로 위스콘신 생물공학센터 대학(미국 위스콘신주 매디슨에 소재)에서 합성하였다. 합성에 이어, 펩티드의 아미노-말단을 HBTU 활성화에 의해 수동으로 바이오티닐화한 다음, 고압 액체 크로마토그래피로 정제하였다. 조성물을 매트릭스-지원 레이저 탈착 이온화법-비행시간형(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight: MALDI-TOF) 질량 분광법(mass spectrometry)을 사용하여 확인하였다(질량 예상치 1095.4; 질량 관측치 1095.8).
OspC7 ELISA. 미량역가 플레이트(microtiter plate)[Immunolon 2 HB; 제조원: 터모 랩시스템스(Thermo Labsystems), 미국 매사추세츠 프랭클린 소재]의 각각의 웰을 탄산염 완충액(90 mM NaHCO3, 60 mM Na2CO3; pH 9.6) 속에 함유된 스트렙타비딘[제조원: 피어스(Pierce), 미국 일리노이주 로크랜드 소재] 4 ㎍/ml의 현탁액 100㎕로 피복한 다음, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 항온처리한 후, 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 트리스-완충된 염수(TBS-T; 13 mM 트리스 HCl, 3 mM 트리스 염기, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl; pH 7.4)로 5회 세척하였다. 세척 후, 바이오티닐화된 OspC7 펩티드 1㎍/mL를 함유하는 차단 완충액(blocking buffer)(15 mM NaCl, 10 mM 트리스 HCl, 3% 소 태아 혈청, 0.05% 트윈 20) 200 ㎕를 각각의 웰에 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 회전(150 rpm)시키면서 항온처리하였다. 플레이트를 TBS-T로 3회 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 차단 완충액 속에 1:200으로 희석된 혈청 100 ㎕ 양과 반응시켰다. 제2 항체는 차단 완충액 속에 1/15,000으로 희석된 퍼옥시다제-접합(peroxidase-conjugate)된 염소 항-사람 IgM 및 IgG(제조원: 커크가아드 페리 래보러토리즈, 미국 매릴랜드주 게이터스부르그 소재)이었다. 1시간 동안 항온처리한 후, 결합된 제2 항체는 시트레이트 완충액[제조원: 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 중의 o-페닐렌디아민 및 과산화수소를 첨가하고, 490 nm에서의 OD[SpectraMax 250; 제조원: 몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 써니베일 소재] 측정으로 정량화시켰다.
B. 결과
이전 조사(참조: Jobe et al., Clin. Diagn. Lab. Immuno. 2003, 10:573-578, Lovrich et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005, 12:746-751)에서, 고도로 보존된 면역우성(immunodominant) OspC 살보렐리아 항체 에피토프를 C-말단과 가장 가까운 7개의 아미노산(OspC7)내 영역으로 국재화하였다. 보렐리아 아종을 사용한 감염에 특이적인, 에피토프 유도된 항체를 확인하기 위해서, 라임병을 가진 환자로부터의 혈청(도 5) 및 정상적 대상체 또는 기타 질병을 가진 환자의 혈청을 사용하여 OspC7을 사용함으로써 보렐리아 아종 단백질(도 4)에 또한 결합할 수 있는 항체를 생산하는 ELISA의 반응성을 비교하였다. 도 4 및 도 5에서, 흡광도 1.25에서의 선은 정상 및 잠재적 교차-반응 혈청의 평균 흡광도에 대한 3개의 표준 편차를 정의한다. 따라서, 선 위에 속하는 결과는, 반응성이 현저한(진 양성: true positive), 99% 확률을 가진다. 현저한 반응성은 단지 정상 또는 잠재적 교차-반응 혈청(도 4)에서 거의 검출되지 않았다(참조: 도 4). 또한, 포지티브 결과의 대부분은, 혈청(CS)이 군더센 루테란 메디칼 센터(Gundersen Lutheran Medical Center)에서 다양한 병을 보이는 100명의 환자 그룹으로부터 수득되기 때문에, 라임병 환자로부터 기원할 수 있는 혈청을 사용하여 수득되었음에 주목해야만 한다. 상기 영역은 라임병의 고도의 풍토적으로 집중된 지역으로, 환자의 신원과 임상적 병력은 알려지지 않았다. 대조적으로, 포지티브 혈청은 위스콘신주의 비-풍토적 지역인 밀워키에서 공혈자(BD)로부터 무작위로 수집된 혈청 샘플(n=100) 중에서 검출되지 않았다.
또한, 포지티브 결과(비-반응적이어야만 하는 혈청의 평균을 초과하는 3 이상의 표준 편차: 도 4 참조)가 라임병 환자로 부터의 혈청 중에서 일반적으로 검출되었고, 흡광도 값은 높았다(도 5). 따라서, 당해 발견들을 총괄하면, OspC7 에피토프에 대해 지시된 항체의 고 특이성 및 사람 라임병 동안의 반응의 면역우성이 입증되었다.
위에서 예시된 데이터를 요약하면, 8주령 퍼피의 그룹(15마리의 개)을 백신화시킨 다음, 5.0 x 108 비. 부르그도르페리 ss 50772, 2.5 x 107 비. 부르그도르페리 S-1-10 ss 및 5% Emulsigen®을 함유하는 백신 또는 단지 5% Emulsigen®을 함유하는 위약으로 추가백신화시켰다. 백신은 빠르게 분해된 주입 영역에서 약간 부풀었다. 보다 현저하게는, 백신이 추가 백신화한지 1주 후 피크된, 고 농도의 살보렐리아 OspA 및 OspC 항체를 유도한 다음, 조사기간 동안 검출가능하게 잔류하였다. 또한, OspC 살보렐리아 항체의 상당한 부분이 OspC 내의 고도로 보존된 에피토프에 대해 특이적이었다.
비. 부르그도르페리 ss-감염된 암컷 아이. 스카퓰라리스(I. scapularis) 진드기는 이후에, 백신화된 개에 기생하도록 둔 다음, 진드기의 중간 창자를 검사하여 혈분 내 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체가 비. 부르그도르페리 ss를 완전히 제거하였음을 확인하였다. 특히, 비. 부르그도르페리 ss는 위약으로 백신화된 대조군 개로부터 수집된 34(32%) 마리의 진드기에서 검출되었고, 백신(p < 0.0001)으로 백신화된 개에 기생하는 진드기(n=99)에서는 검출되지 않았다. 또한, 백신 수용체는 감염을 확인하는데 일반적으로 사용되는 몇가지 직접적인 및 간접적인 방법에 의해서 라임병에 대해 네가티브인 것으로 남아있었다. 대조적으로, 10(67%)마리의 대조군 개는 "감염-특이적" 20 kDa 비. 부르그도르페리 ss 단백질에 대해 항체를 생산했고, 8(53%)마리의 개는 "감염-특이적" 살보렐리아 항체를 생성했다. 또한, 4(27%)마리의 개는 지속적인 절름발이를 발현했고, 비. 부르그도르페리 ss는 4마리 절름발이 동물 중의 3(75%)마리의 관절에서 회수되었다. 또한, 검사된 11 마리의 위약-백신화된 개 중의 6(55%)마리의 관절낭에서 염증 침윤이 발현되었다. 보다 상세하게는, 비. 부르그도르페리 ss는 14마리(93%) 및 8마리(53%) 대조군 개의 피부 및 관절로부터 각각 회수된 반면, 스피로헤타는 시험 생산물로 백신화된 개로부터 회수되지 않았다. 따라서, 본 발명의 라임병 백신은 최소한의 부작용을 유발하며, 비. 부르그도르페리 ss의 감염에 대해 완전한 보호를 제공하였다.
실시예 8
비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10 및 50772를 포함하는 백신의 면역성 기간
A. 물질 및 방법
?동물:
물질 및 방법이 위의 실시예 6에 기재되어 있다.
?백신화 및 혈청의 수집:
개를 당해 백신 1 mL 투여량으로 목에 피하로 백신화한 다음, 21일 후 추가의 1 mL 투여량으로 추가 백신화하였다. 전혈을 경정맥의 정맥천자에 의해 초기 전(조사 -4일째)에 수집한 다음, 추가 백신화(조사 21일째)하고, 또한, 조사 28, 35, 49, 79, 114, 142, 175, 210, 238, 266, 302, 322, 357 및 394일째에 수집하였다. 혈청을 원심분리로 분리한 다음, 시험할 때까지 -2O℃에서 저장하였다.
?백신화 후 관찰:
개를 매일 관찰하였다.
?진드기 챌린지:
제2 백신화 후 1년째에, 개를 흉강의 우측을 면도한 다음, 10마리 암컷과 10마리 수컷 비. 부르그도르페리-감염된 아이. 스카퓰라리스 진드기를 테이프와 붕대 랩으로 면도된 자리를 확보한 고무 컵 안에 두었다. 진드기가 7일 동안 먹이를 먹도록 두었다.
?진드기에서 비. 부르그도르페리 ss의 검출:
위의 실시예 6에 기재된 방식으로 검출을 수행하였다.
?혈액 샘플:
전혈을 챌린지 후(post-challenge: PC) 43일째, PC 77일째, PC 112일째, PC 147일째, PC 174일째, 및 PC 241일째 조사일에 혈청 분리 수송(SST)에서 수집한 다음, 혈청을 분리하고 시험할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
?살보렐리아 항체의 검출:&&
OspA 및 OspC 살보렐리아 항체를 위의 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 유동 세포분석기로 검출하였다.
?피부 생검:
피부 생검을 챌린지 후(PC) 43일째, PC 77일째, PC 112일째, PC 147일째, PC 174일째, 및 PC 241일째 조사일에 1회용 4 mm 천공 장치를 가지고 진드기 부착에 인접한 부위로부터 수득하였다. 생검을 위의 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다.
?면역 제어:
개를 챌린지 후 약 20주를 시작으로 5일 동안 덱사메타손(0.4 mg/lb 체중)을 매일 투여함으로써 면역 제어하였다.
?임상적 관찰:
위의 실시예 6에서와 같이 임상적 관찰을 수행하였다.
?부검:
위의 실시예 6에서와 같이 부검을 수행하였다.
B. 결과
?백신화 후 혈청학:
위약을 사용한 백신화는 비. 부르그도르페리 ss에 대해 특이적인 항체를 유도하는데 실패했다. 대조적으로, 당해 백신을 사용한 백신화는 비. 부르그도르페리 ss 분리주 S-1-10 및 50772를 사용함으로써 검출된 상당한 수준의 살보렐리아 항체를 유도하였다. S-1-10에 대한 살보렐리아 항체의 평균 역가는 추가 접종 후 1주째(조사 28일째)에 1회 피크된 다음, 조사 394일째에도 검출가능하게 잔류하였다(참조: 표 13). 유사하게, 분리주 50772에 대해 특이적인 고 농도의 살보렐리아 항체는 조사 28일째에 검출된 다음, 역가가 조사 49일째에 상승된 채 유지되었고, 조사 79일째에 저 수준이 검출가능하게 잔류하였다(참조: 표 14).
백신을 사용한 백신화 후 살보렐리아 항체b의 평균 역가a (n=15).
그룹 -4일 21일 28일 35일 49일 79일 114일 142일
백신화
그룹		 NDc 192 >7075 >5120 >4457 735 926 532
대조군 ND ND ND ND ND ND ND ND
그룹 175일 210일 238일 266일 302일 322일 357일 394일
백신화
그룹		 702 611 926 557 508 351 211 175
대조군 ND ND ND ND ND ND ND ND
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss S-1-10을 사용한 살보렐리아 항체 시험을 사용하여 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
백신으로 백신화한 후 살보렐리아 항체b의 평균 역가a (n=15).
그룹 -4일 21일 28일 35일 49일 79일 114일 142일
백신화
그룹		 NDc 40 1689 532 69 41 ND ND
대조군 ND ND ND ND ND ND ND ND
그룹 175일 210일 238일 266일 302일 322일 357일 394일
백신화
그룹		 ND ND ND ND ND ND ND ND
대조군 ND ND ND ND ND ND ND ND
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용한 살보렐리아 항체 시험을 사용하여 검출됨.
c ND = 검출되지 않음.
?감염된 진드기를 멸균시키는 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체의 능력:
백신화된 또는 대조군 개 위에 기생하는 진드기의 중간창자를 실험하여 당해 백신에 의해 유도된 OspA 및 OspC 살보렐리아 항체가 진드기를 멸균시키는 것을 확인하였다. 비. 부르그도르페리 ss는 15마리의 위약-백신화된 개 중의 12마리 개 위에 기생하는 95마리 암컷 진드기 중 15마리(16%)로부터의 진드기 표본에서 검출되었다(참조: 표 15). 대조적으로, 비. 부르그도르페리 ss는 15마리의 백신화된 개(p = 0.0003) 중의 2마리의 개 위에 기생하는 75마리의 암컷 진드기 중 단지 2마리(3%)로부터의 진드기 표본에서 검출되었다.
백신화된 또는 대조군 개로부터 제거된 암컷 진드기 내 비. 부르그도르페리 ss의 검출.
시험 그룹 처리된 암컷 진드기a 비. 부르그도르페리에 대한 포지티브 표본 포지티브인 개의
총 수
백신화 그룹 75/148(51%) 2/75(3%) 2/15
대조군 95/146(65%) 15/95(16%) 12/15*
*p = 0.0003
a충혈 및 비충혈
?피부로부터 비. 부르그도르페리 ss의 회수를 방지하는 백신의 능력:
또한, 백신-유도된 살보렐리아 항체는 피부에서 비. 부르그도르페리 유기체의 지속적인 감염을 막는다. 비. 부르그도르페리 ss는 한달 간격으로 위약-백신화된 개에 이은 진드기-챌린지로부터 수집된 75개의 생검 중 33개(44%)에서부터 회수되었다(참조: 표 16). 대조적으로, 비. 부르그도르페리 ss는 백신(p < 0.0001)으로 백신화된 개로부터 수집된 75개의 생검 중 단지 6개(8%)에서부터 회수되었다. 스피로헤타는 15마리의 백신화된 개 중 6마리(40%)의 개와 비교하여, 15마리의 대조군 개 중 10마리(67%)의 개로부터 하나 이상의 피부 생검으로부터 회수되었다. 그러나, 백신화된 개로부터의 분리는 챌린지 후 단지 초기 1개월로 제한되는 반면, 10마리의 배양 포지티브 대조군 개 중의 8마리(80%)는 조사 다음달 내내 비. 부르그도르페리-포지티브 피부 생검을 가졌다.
백신화된 개 또는 백신화되지 않은 대조군 개의 피부로부터 비. 부르그도르페리 ss의 분리.
시험그룹 PC
43일		 PC
77일		 PC
112일		 PC
147일		 PC
174일		 포지티브인
생검 (총)b 		포지티브인 개
(총)c 		포지티브인 개
(총)d
백신화
그룹(A)		 6/15 0/15 0/15 0/15 0/15 6/75(8%) 6/15(8%) 0/6(0%)
대조군(B) 9/15 8/15* 7/15a* 6/15* 3/15 33/75**
(44%)		 10/15(67%) 8/10(80%)
a 1마리의 새로운 개.
b 포지티브인 총 생검.
c 포지티브인 개의 총 숫자.
d 초기 1개월 후 포지티브인 개의 총 숫자.
* p < 0.05
** p < 0.0001
?감염의 혈청학적 흔적을 방지하는 백신의 능력:
백신은 또한 라임병-특이적 항체의 발현을 방지한다. 라임병을 가진 개는 또한, 비. 부르그도르페리 ss 50772 분리주를 사용함으로써 검출가능한 비-OspC 살보렐리아 항체를 생산한다(실시예 6에 기재된 바와 같음). 특히, 시험 백신으로 백신화된 개에게서 관찰되지 않았던 것과 비교하여, 챌린지 후 15마리의 위약-백신화된 대조군 개 중의 5마리(33%)에서 균주 50772에 대해 살보렐리아 항체의 증가된 수준(4배 이상의 증가)이 관찰되었다.
진드기 챌린지 후, 살보렐리아 항체b의 평균 역가a
시험 그룹 PC 43일 PC 77일 PC 112일 PC 147일 PC 174일 증가된 역가를 가진
개의 총 숫자
백신화된
그룹		 40 40 40 40 40 0/15
대조군 48 66 88 88 106 5/15c
a 상호 희석액.
b 비. 부르그도르페리 ss 50772를 사용함으로써 검출됨.
c 4배 이상 증가된 역가
?비. 부르그도르페리 ss 감염과 연관된 명백한 사지/관절 장애 및 침식적 변화를 방지하는 백신의 능력:
앞서의 조사는 비. 부르그도르페리 ss만으로 감염된 것이 명백한 사지/관절 장애를 거의 유발시키지 않음(실시예 6)을 입증하였고, 진드기 챌린지 모델이 나이가 든 개에서 덜 효과적임을 밝혔다. 명백한 징후의 발현을 악화시키기 위해서, 개를 챌린지한지 약 3개월 후 덱사메타손으로 면역제어하였다. 4마리의 위약-백신화된 대조군 개는 절름발이로 되거나 또는 관절 조직에서 침식적 병변을 발현시켰다. 대조적으로, 본 발명의 백신으로 백신화된 개는 관절 조직에서 종종 보여지는 침식적 병변 또는 사지/관절 장애의 어떠한 임상적 징후도 발현하지 않았다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 의한 범위로 제한되어서는 안된다. 또한, 본원에 기재된 것 외에 본 발명의 다양한 변형이 앞의 기재로부터 당해분야의 숙련가에게 명백해 질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.
또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자질량 값은 근사치이며 상세한 설명을 위해 제공되는 것임이 이해되어야 한다.
다양한 공보가 본원에 언급되어 있으며, 이의 전문은 참조로 본원에 인용되어 있다.
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Claims (25)

  1. 면역학적 유효량의 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호) 및 비. 부르그도르페리 ss S-1-10(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호)을 포함하는 개 라임병에 대한 백신.
  2. 제1항에 있어서, 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호) 및 비. 부르그도르페리 ss S-1-10(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호)이 불활성화(inactivate)되는 백신.
  3. 제1항에 있어서, 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호)가 이의 세포 표면 위에 OspC 항원을 나타내고; 개가 상기 백신으로 면역화된 경우, OspC-살보렐리아 항체(OspC-borreliacidal antibody)가 개에서 유도되는 백신.
  4. 제3항에 있어서, OspC-특이적인 살보렐리아 항체의 상당한 부분이 OspC7에 대해 특이적인 백신.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 비. 부르그도르페리 ss S-1-10(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호)이 이의 세포 표면 위에 OspA 항원 또는 OspB 항원을 나타내거나, 또는 OspA 항원 및 OspB 항원 둘 다를 나타내는 백신.
  7. 제6항에 있어서, 개가 상기 백신으로 면역화된 경우, OspC-살보렐리아 항체 및 OspA-살보렐리아 항체가 개에서 유도되는 백신.
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서, 밀리리터당 1 x 104 내지 1 x 1010개의 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-439호) 및 밀리리터당 1 x 104 내지 1 x 1010개의 비. 부르그도르페리 ss S-1-10(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호)을 포함하는 백신.
  10. 제9항에 있어서, 밀리리터당 5.0 x 108 내지 5 x 109개의 비. 부르그도르페리 ss 50772(ATCC 기탁번호: 제PTA-4399호) 및 밀리리터당 1.0 x 108 내지 5 x 108개의 비. 부르그도르페리 ss S-1-10(ATCC 기탁번호: 제PTA-1680호)을 포함하는 백신.
  11. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 보조제를 추가로 포함하는 백신.
  12. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 면역 자극제(immune stimulant)를 추가로 포함하는 백신.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 면역학적 유효량의 제1항에 따른 백신을 개에게 주입시킴을 포함하여, 병원성 보렐리아 게노스페시스(Borrelia genospecies)에 대해 개를 면역화시키는 방법.
  18. 면역학적 유효량의 제6항에 따른 백신을 개에게 주입시킴을 포함하여, 병원성 보렐리아 게노스페시스에 대해 개를 면역화시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 불활성화된 비. 부르그도르페리 센수 스트릭토(B. burgdorferi sensu stricto: ss)를 개에게 추가로 주입시키는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 불활성화된 비. 부르그도르페리 ss B-31 (ATCC 기탁번호: 제35210호), 비. 아프젤리이(B. afzelii)(ATCC 기탁번호: 제51567호) 및 비. 가리니이(B. garinii)(ATCC 기탁번호: 제51383호 또는 제51991호), 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 균주를 추가로 주입시키는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 면역화된 개가 살보렐리아 항체를 생산하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 개에게 보렐리아 종의 각각의 균주 5 x 107 내지 5 x 109개를 주입시키는 방법.
  23. 제21항에 따른 방법으로 면역화시킨 개로부터 수득한 비. 부르그도르페리 OspC에 결합하는 살보렐리아 항체를 포함하는 혈청.
  24. 제21항에 따른 방법으로 면역화시킨 개로부터 수득한 비. 부르그도르페리 ss OspC에 결합하는 살보렐리아 항체.
  25. 제24항에 있어서, OspC7-특이적 항체를 포함하는 살보렐리아 항체.
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