CZ301244B6 - Univerzální vakcína k lécbe a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a zpusob její výroby - Google Patents

Abstract

Univerzální vakcína k lécbe a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití je vytvorena na bázi celobunecných bakterinu nebo bakteriálních lyzátu nebo purifikátu trí nejpatogennejších genomospecies borrelií - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, a prípadne dalších, pricemž každá z použitých genomospecies borrelií obsahuje soucasne oba imunogenní protektivní proteiny vnejší membrány OspA a OspC, poprípade obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnejší membrány. Rešení zahrnuje také zpusob výroby vakcíny.

Description

Univerzální vakcína k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a způsob její výroby

Oblast techniky

Vynález se týká složení univerzální vakcíny k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a způsobu její výroby.

tú

Dosavadní stav techniky

Lymeská borrelióza je chronické multisystémové infekční onemocnění, které je nejčastějším infekčním onemocněním přenášeným členovci (arthropod bom) a to v Evropě i ve Spojených státech. O významu tohoto onemocnění svědčí četnost publikací v časopisech zabývajících se infekční problematikou. Z tohoto pohledu je v poslední dekádě borrelióza svým významem zařazována za syndrom získané imunodeficience, jak je popsáno např. v článku „The biological and sociál phenomenon of Lyme disease“ (Barbour AG, Fish D, Science, 1993 Jun 11; 260(5114):1610-6).

Onemocnění je vyvolané skupinou spirochet souhrnně označovaných jako Borrelia burgdorferi sensu lato. Tato skupina mikroorganismů je tvořena zejména třemi blízce příbuznými subspecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Zatímco Borrelia burgdorferi sensu stricto je příčinou prakticky všech onemocnění Lymeskou borreliózou na severo25 americkém kontinentu, v Evropě převládají Borrelia garinii a Borrelia afzelii.

Závažné poškození savčího hostitelského organismu, stejně jako problémy spojené s diagnostikou i terapií Lymeské borreliózy jsou významným stimulem pro vývoj efektivních vakcinačních preparátů. Na druhé straně existují i výhrady k vývoji vakcín a jejich použití zejména u lidí. Jde především o to, že onemocnění není přenosné z Člověka na Člověka, je relativně snadno léčitelné antibiotiky a klinická manifestace se závažnými důsledky postihuje pouze část infikovaných pacientů. Navíc je toto onemocnění velmi zřídka fatální. Na místě je proto obava z případných vedlejších účinků nové vakcíny, které by za těchto okolností byly velmi těžko přijatelné, jak je popsáno ve stati „ Experimental immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview “ (Sadziene A, Barbour AG., Infection. 1996 Mar-Apr;24(2):195-202).

První veterinární vakcína proti borrelióze byla vyvinuta ve Spojených státech v r. 1990 pro psy. Licencována byla vr. 1992, jak je známo z článků Performance of a Borrelia burgdorferi bacterin in borreliosis-endemic are as“ (Levý SA, Lissman BA, Ficke CM., J. Am. Vet. Med.

Assoc. 1993 Jun 1;202(11):1834-8.) nebo „Immunization against Lyme disease?“ (Wormser, GP., Ann Intem Med 123, 627 - 629, 1995).

Vakcína je celobuněčná, chemicky inaktivovaná, aplikovaná s vehikulem obsahujícím polymerové adjuvantní látky. Vakcína je aplikována intramuskulámě dvakrát v intervalu dvou až tří týdnů.

Po roce je doporučena udržovací dávka (booster). Vakcinace domácích zvířat, zejména psů je doporučena bez ohledu na to, zda zvíře bylo infikováno, případně u něho probíhá onemocnění. Příprava této vakcíny vycházela z poznatků získaných v pokusech na hlodavcích. Protektivní efekt celobuněčné vakcíny byl poprvé popsán u křečků.

Vývoj celobuněčné vakcíny pro veterinární účely byl podporován především jednoduchostí přípravy a také nízkou cenou. Tato vakcína však nebyla doporučena pro humánní použití s ohledem na skutečnost, že některé antigeny borrelií zkříženě reagují s lidskými antigeny a nelze proto vyloučit indukci imunopatologických procesů, jak je popsáno ve statích „Molecular mimicry and Lyme borreliosis: a shared antigenic determinant between Borrelia burgdorferi and human tissue“ (Aberer E et al., Ann Neurol. 1989 Dec; 26(6):732-7) nebo „Sérologie response to the

-1CZ 301244 B6

Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line“.

(Fikrigetal. 1993, Proč Nat Acad Sci U S A. 1993 Jan 1:90(1):183-7).

Určitým varováním bylo např. zjištění, že některé antigeny Borrelia burgdorferi aktivují sety spe5 cifických T lymfocytů, které se podílely na rozvoji arthritidy u křečků, což je popsáno v článku „Involvement of CD4+ T lymphocytes in induction of severe destructive Lyme arthritis in inbred LSHhamsters“ (Lim LC et al., Infect Immun. 1995 Dec; 63(12):4818-25).

Králíci jsou chráněni proti infekci, pokud je imunní sérum připravené imunizací zvířat imunogenío nimi proteiny borreliózového kmene aplikováno před experimentální čelenží. Podání imunního séra po infekci nebrání rozvoji erythema migrans a viscerálním projevům infekce. Podobné výsledky byly zjištěny také u myší a křečků a popsány v „Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice“ (BartholdSWet al, Lab. Invest. 1996, Jan;74(1):57-67) nebo „Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi “ (Barthold SW et is al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1:S9-17.) nebo „Experimental infection of the hamster with Borrelia Burgdorferi“ (Johnson RC et al, Ann Acad Sci. 1988;539:258-63).

Těmito experimentálními poznatky byla naznačena možnost vývoje bezpečné subjednotkové vakcíny. Hlavními kandidátními antigeny pro takovou vakcínu se staly vnější povrchové proteiny (outer surface proteins Osp) označované jako OspA, B, C a D. Intenzivně byl studován zejména protein OspA. Protektivní efekt této subjednotkové vakcíny byl potvrzen experimentálně u myší, křečků a králíků a popsán v článcích „Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA'* (Firking E et al, Science 1990 Oct 26; 250(4980):553-6) nebo „Long-term protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA “ (Firking E et al, Infect Immun. 1992 Mar; 60(3):773-7). Laboratorní testy potvrdily, že aplikace tohoto proteinu ve formě purifikovaného, lipidovaného rekombinantního proteinu indukuje protektivní imunitu při parenterálním podání a chrání proti infekci borreliemi podanými nejen injekční cestou, ale též s pomocí klíštěcího vektoru. Potvrdilo se také, že infekční klíšťata sající na takto imunizovaných zvířatech ztrácejí svou infekciozítu, což je popsáno v „Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine (Keller D et al, JÁMA. 1994 Jun 8;271(22): 1764-8) nebo „Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspAimmunized mice“ (Firking E etal, Proč Nati Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):5418-21).

V nepřítomnosti lipidové jednotky vyžaduje indukce tvorby protilátek adjuvantní efekt Freundo35 va kompletního adjuvans, nebo jiného imunitního adjuvans, jak je popsáno ve stati „Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA “ (Erdile IF et al, Infect Immun. 1993 Jan;61 (1):81-90), To naznačuje dvojí možný efekt vakcinace:

(1) spirochetyjsou inaktivovány již v organismu klíštěte a je tak zabráněno transmisi infekce, (2) spirochety mohou být inaktivovány krátce po vstupu do hostitelského organismu ještě před antigenní variací a útlumem exprese antigenů Osp A.

K verifikaci protektivního efektu antigenů OspA byly připraveny dva různé konstrukty a vakcinační formule:

1, Nativní a čistý rekombinantní OspA, popsaný v „Recombinant outer surface protein a from

Borrelia burgdorferi induces antibodies protective against spirochetal infection in mice“ (Simon MM etal, J. infect Dis. 1991 Jul; 164(1):123-32)

2. OspA inkorporovaný do genomu BCG (Calmette, Guérín). OspA se exprimoval jako membrá50 nově asociovaný lipoprotein, což je známo z článku „Protective immunity elicited by rBCG vaccines“ (Stover CK et al, Dev Biol Stand. 1994;82:163-70). V této formě byl testován při intraperitoneální aplikaci a také při intranasálním podání, jak je publikováno v „Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi“ (Langermann Set al, Nátuře. 1994 Dec 8;372(6506):552-5). Při této formě

-2CZ 301244 B6 aplikace byly dlouhodobě indukovány specifické IgG i IgA protilátky, což je patrné z článku „ Protective immunity elicited by recombinant bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme disease vaccine“ (Stover CK et aí, J Exp Med. 1993 Jul 1;178(1):197-209).

V současné době jsou jediným producentem takové vakcíny pro humánní použití Spojené státy americké, Vakcína byla schválena Food and Drug Administration (FDA) 21. 12. 1998 a je popsána ve studii „ Vaccination against Lyme disease with recombinant Borrelia burgdorferí outer-surface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group“ (Steere AC et aí, N Engl J Med. 1998 Jul 23;339(4):209-15). Jde o výrobek LYMErix firmy SmithKline Beecham. Podle třetí fáze klinických zkoušek poskytuje vakcína 80-90% ochranu, jak je prokazováno ve stati „A vaccine consisting of recombinant Borrelia burgdorferí outer-surface protein A to prevent Lyme disease. Recombinant Outer-Surface Protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium“ (Sigal LH et aí, N Engl J Med. 1998 Jul 23;339(4):216-22. Erratum in: N is Engl J Med 1998 Aug 20;339(8):571).

I když je vakcína již v distribuci, je pod permanentní kontrolou s ohledem na minimum znalostí o dlouhodobém použití tohoto preparátu. Vakcína je aplikována injekčně třikrát v průběhu 12 měsíční periody (0, 1, 12) pro dosažení maxima imunitní odpovědi. Efektivnost vakcíny popisuje např. Wahlberg, který uvádí, že po dvou dávkách rekombinantního OspA proteinu vázaného na aluminium hydroxid ve fosfátovém pufru byla účinnost vakcíny 50% (1 rok), po třech vakcinačních dávkách (20 měsíců) byla účinnost 79%. Protilátkový titr klesal poměrně rychle a po dvou letech byl na úrovni prvního roku vakcinace (efektivnost 50%). Detaily o „booster“ efektu nejsou k dispozici. Doposud není povoleno aplikovat vakcínu dětem pod 15 let a lidem trpícím autoimunitním onemocněním, zejména artritidou. V souboru 5765 vakcinovaných jedinců se u dvou osob s fenotypem HLA-DR4 vyvinula arthritida, jak bylo zveřejněno v článku „Guarded endorsement for Lyme disease vaccine “ (Marwick C, JAMA, 1998 Jun 24;279(24):1937-8).

Komerčně dostupná vakcína je připravena z proteinu OspA z Borrelia burgdorferí sensu stricto.

Vzhledem k tomu, že tato bakterie je dominantním infekčním původcem Lymeské borreliózy na severoamerickém kontinentu, může být vakcína relativně efektivní pro obyvatelstvo USA.

V evropských podmínkách však toto onemocnění vyvolávají zejména tří patogenní subspecíes, a to Borrelia burgdorferí sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. U všech těchto kmenů je na evropském kontinentu popsána antigenni variabilita. V evropských podmínkách je proto vakcína připravená pouze z kmene Borrelia burgdorferi sensu stricto pro humánní i veterinární použití nepoužitelná. Při vývoji účinné formy vakcíny byly využity i nové trendy ve vakcinačních technologiích, kde například účinná DNA vakcína je publikována ve statích „Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promotér“ (Simon MM et aí, Eur J Immunol. 1996 Dec;

26(12):2831-40) nebo „DNA vaccines expressing a fusion product of outer surface proteins A and Cfrom Borrelia burgdorferi induce protective antibodies suitable for prophylaxis but not for resolution of Lyme disease“ (Wallich R. et aí, Infect Immun. 2001 Apr;69(4) :2130-6).

Jiným možným východiskem je připravit vakcínu z proteinu OspC, který je exprimován na povrchu mikroorganismů v těle hostitele a podle literárních dokladů má humorální imunita proti tomuto proteinu protektivní charakter, jak je popsáno v „Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promotér“ (Simon MM etal, Eur. J. Immunol. 26, 2831-2840,1996),

OspC je hlavním membránovým antigenem vyjádřeným v časné fázi infekce. U Borrelia burgdorferi sensu stricto je OspC vysoce variabilní. Epidemiologickou analýzou a sekvenováním genů pro OspC u jednotlivých izolátů a doplněním s GeneBank bylo pro tento antigen zjištěno 21 alelických skupin označovaných A-U, jak je popisováno v „Four clones of Borrelia burgdorferi sensu stricto čase invasive infection in humans“ (Seinost G et aí, Infect. Immun. 67,

3518-3524, 1999).

-3CZ 301244 B6

Vnější povrchový antigen A (OspA) je hlavním povrchovým antigenem, který je exprimován, když je Borrelia burgdorferi rezidentní v klíštěti. V okamžiku, kdy klíště začne nasávat krev na savcích, je syntéza tohoto antigenů reprimována a naopak je indukována syntéza antigenů OspC.

Takto se OspC stává hlavním antigenem vnější povrchové membrány v časné fázi infekce, což je popsáno například v „Jnduction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi during tick feeding“ (Schwan TG et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995). I když bylo prokázáno, že OspC má limitovanou povrchovou expozici, je potentním imunogenem. Imunizace OspC je protektivní proti borreliové infekci. Ochrana je však vázána na konkrétní alelu OspC, ío která kontroluje syntézu konkrétního proteinu. Infekce jiným typem borrelie vede u těchto imunizovaných jedinců k onemocnění. To samozřejmě limituje použití tohoto antigenů získaného pouze z jedné genomospecies borrelií pro přípravu univerzální vakcíny.

Otázka úspěšné vakcinace proti Lymeské borrelióze zůstává tedy otevřenou otázkou. V Evropě je navíc komplikována existencí tří různých genomospecies (Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii) a onemocněním Lymeskou borreliózou vedle člověka i různých druhů domácích a hospodářských zvířat. Problematikou onemocnění u psů a koček se věnuje stať „ Canine borreliosis “ (Littman MP, Vet Clin Smáli Anim 33, 2003, 827-862) a u koní „ Equine Abortion Associated with the Borrelia parker i- B. turicatae Tick-Bome Relapsing Fever

Spirochete Group“ (Walker RL et al, Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 4, 15581562).

O možnost překonat tyto problémy přípravou tzv. „kokteilových vakcín“ se pokusili např. Livey et al., a své výsledky publikovali ve stati „OspC vaccine candidate“ (Abstract of the Symposium on the Pathogenesis and Management of Tick-borne Diseases. 1998 Sept. 28-30. Vienna,

Austria. 1998).

Se stávajícími problémy s diagnostikou a léčbou Lymeské borreliózy a vzhledem k nemožnosti účinně kontrolovat a snižovat rozšíření vektorů borrelií, naléhavě vyvstala potřeba vakcíny schopné účinně imunizovat vnímavé druhy domácích a hospodářských zvířat i lidí proti infekci

Borrelia burgdorferi sensu lato. Byly vyvinuty vakcíny na bázi celobuněčného bakterinu Borrelia burgdorferi pro použití u domácích zvířat, popsané např. v patentech US 4 721617, US 6 316 005. Byly vyvinuty i vakcíny založené na obsahu proteinu OspA, OspC či dalších povrchových (outer surface proteins) imunogenních proteinů, izolovaných z kultivovaných kultur borrelií, exprimovaných jako rekombinantní proteiny v různých hostitelích (E. coli), nebo připra35 vených synteticky, z nichž jako příklady je možno uvést spisy WO 94/25596, WO 96/05313, WO 97/49812, US 6 716 574, US 2004067517, US 6 676 942, WO 02/16422, US 5 53 103, US 6 486 130, US 6 464 985, EP 633 028).

Tyto celobuněčné nebo subjednotkové vakcíny však nezahrnují ochranu proti celé šíři patogen40 nich borrelií všech genomospecies, tedy zejména Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii a případně dalších. Jsou odvozeny vždy pouze z jedné genomospecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto.

Úkolem vynálezu je představit novou univerzální vakcínu pro humánní a veterinární použití, která obsahuje současně oba hlavní imunogenní proteiny vnější membrány OspA a OspC tří nejpatogennějších genomospecies borrelií, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii, a případně dalších, a může být úspěšně aplikovatelná bez teritoriálního omezení.

Podstata vynálezu

Uvedeného cíle je dosaženo vynálezem, kterým je univerzální vakcína k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití, jejíž podstata spočívá v tom, že je vytvořena na bázi celobuněěných bakterinů nebo bakteriálních lyzátů nebo purifikátů tri nejpatogen-4CZ 301244 B6 nějších genomospecies borrelií - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, a případně dalších, a obsahuje současně oba imunogenní projektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC, popřípadě obsahuje i další imunogenní projektivní proteiny vnější membrány.

Dále je podstatou vynálezu, že imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC jsou ve vakcíně obsaženy s výhodou v poměru 1 : 1, že je vytvořena v lyofilizované či tekuté formě, je aplikována vpufrovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, případně dalšími ímunomodulátory, a že pH vakcíny se pohybuje v rozmezí io hodnot 4 až 9.

Konečně je podstatou vynálezu způsob výroby univerzální vakcíny k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití, při jehož realizaci se každý z výrobních kmenů borrelií kultivuje, inaktivuje a testuje až do stavu smísení samostatně, přičemž při kultivaci is kmenů za účelem exprese antigenu OspA probíhá pomnožování a produkce kultuiy při teplotě 26 až 35 °C s dobou 6 až 18 dnů u každého kroku a při kultivaci kmenů za účelem exprese antigenu OspC probíhá pomnožování a produkce kultury při teplotě 36 až 38 °C s dobou 6 až dnů u každého kroku.

Předkládaným vynálezem se dosahuje nového účinku v tom, že po aplikaci dochází u vakcinovaných zvířat či člověka k tvorbě specifických OspA a OspC protilátek, které zabraňují přestupu patogenních borrelií z klíštěte do vakcinovaného organismu (OspA protilátky) a napomáhají jejích destrukci krátce po případném přestupu patogenních borrelií do vakcinovaného organismu (OspC protilátky) a případně k tvorbě dalších blíže nedefinovaných postvakcinačních protektiv25 nich protilátek a stimulaci imunitních mechanismů. Dalším přínosem je, že kromě běžných dospělých jedinců je vakcínu možno aplikovat mláďatům domácích zvířat (přednostně psi a kočky) a mláďatům hospodářských zvířat (přednostně koně) od 3 týdnů jejich věku k navození aktivní protektivní imunity proti Lymeské borrelióze. Rovněž je možno vakcínu současně aplikovat sjinými přípravky, léčivy a vakcínami proti virovým, bakteriálním, mykotickým a jiným onemocněním psů, koček, koní a jiných druhů zvířat, pro které je vakcína určena.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad provedení demonstruje ověření protektivity univerzální vakcíny po imunizaci pokusných koček, psů a koní vůči čelenži virulentními kmeny Borrelia burgdorferi sensu lato, v žádném případě však neomezuje patentová práva vztahující se k tomuto patentu.

Příprava pokusného vzorku vakcíny a výsledku testací:

A) Kultivace výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspA:

Při kultivaci výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspA, byla jako výchozí surovina použita jedna z položek

- Médium BSK -H + králičí sérum

- Médium BSK - H complete a výrobní kmeny Borrelia afzelii, Borrelia garinii a Borrelia burgdorferi sensu stricto podle 50 následně znázorněného schématického výrobního postupu:

-5CZ 301244 B6

Kontrola růstu a čistoty

Inaktivace jednotlivých kmenů

| Plnění, adjustace, výstupní kontrola 1

Kontrola růstu a Čistoty Stanovení počtu Stanovení přítomností OspA

Zkouška inaktivace

Stanovení nepřítomnosti séra

Kontrola sterility, stanovení a úprava pH

Kontrola sterility, stanovení pH

Poznámka: Každý kmen borrelií (Borrelia afzelii, garinii a burgdorferi sensu stricto) se kultivuje, kontroluje, inaktivuje a testuje zvlášť až do stavu smísení všech kmenů (včetně kmenů s expresí antigenů OspC).

Vlastní kultivace se prováděla v plastových nebo skleněných Roux láhvích určených ke kultivaci kultur borrelií, když kultivační médium BSK se před vlastní kultivací obohatí 6% sterilního králičího séra vhodného pro kultivaci borrelií, popř. lze použít přímo kompletní BSK-H médium s obsahem 6% králičího séra. Matečné i pracovní výrobní kmeny jsou udržovány v zamraženém stavu pří teplotě -196 °C v tekutém dusíku.

Při oživování kultury se ampule s kulturou vyjme z tekutého dusíku a rozmrazí se při teplotě cca 30 °C. Ihned po rozpuštění se inokuíuje do zkumavky s živným médiem vytemperovaným na teplotu cca 28 °C v poměru 1 + 9 (1 díl kultury + 9 dílů média). Každý kmen se kultivuje samostatně inkubace probíhá při teplotě 26 až 35 °C po dobu 6 až 18 dní.

Pri pomnožování kultury se dobře narostlá, životaschopná kultura (mění barvu kultivačního média z červené na žlutou) po mikroskopické kontrole za aseptických podmínek inokuíuje do živného média v poměru 1 díl kultury + 9 dílů média. Kultivace probíhá 6 až 10 dnů při teplotě

26 až 35 °C. Další subpasáže dobře narostlých borrelií se provádí v poměru 1 díl násady : 10 až

100 dílům kultivačního média. Počet dalších subpasází je závislý na požadovaném objemu borrelií pro přípravu vakcíny,

Při produkci kultury pro výrobu vakcíny se narostlé kultury z předchozích kultivací za aseptic25 kých podmínek použijí jako inokulum do živné půdy v 1000 ml lahvích v poměru 1 díl násady :

lOaž 100 dílům kultivačního média. Kultivace probíháóaž lOdnů při teplotě 26až35 °C.

Stanoven počtu borrelií se provádí v temném poli mikroskopu pomocí PETROFF HAUSSER COUNTÍNG CHAMBER.

Během procesu se provádějí mezioperační kontroly růstu a čistoty kultury pomocí makroskopického vyšetření, mikroskopického vyšetření a kultivačního vyšetření. Makroskopické vyšetření spočívá ve vizuálním sledování, když vhodná kultura mění barvu kultivačního media z červené

-6CZ 301244 Bó barvy do žluté a v mediu se vyskytuje sediment. Mikroskopické vyšetření v temném poli mikroskopu sleduje, zda jsou Borrelie přiměřeně pohyblivé s malým množstvím detritu, bez známek bakteriální kontaminace. Při kultivačním vyšetření se hodnocená kultura borrelií přenese v množství 0,5 ml na předsušený krevní agar a kultivace probíhá při 35 až 37 °C po dobu 48 hod.

Při posouzení zkoušky se sleduje přítomnost jakéhokoliv bakteriálního nárůstu, kterýje nežádoucí a kultury s bakteriální kontaminací se vyřadí.

Stanovení přítomnosti OspA se provádí pomocí proteinové elektroforézy na SDS PAGE po io obarvení Coomasie Blue nebo imunodetekcí metodou Western Blot s použitím anti OspA séra.

B) Kultivace výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspC:

Při přípravě kultivace se použijí stejné suroviny a stejné výrobní kmeny a postupuje se dle stejného schématického výrobního postupu jako u exprese antigenu OspA popsaného ad A).

Rovněž vlastní kultivace probíhá ve stejném procesu s tím rozdílem, že při oživování kultury se ampule s kulturou po rozpuštění inokuluje do zkumavky s živným médiem vytemperovaným na teplotu cca 37 °C v poměru 1 + 9 (1 díl kultury + 9 dílů média) a inkubace probíhá při teplotě 36 až 38 °C po dobu 6 až 18 dní. Rovněž pomnožování kultury probíhá analogicky s tím rozdílem, že kultivace probíhá 6 až 10 dnů při teplotě 36 až 38 °C. Identicky s popisem v ad A) se provádí produkce kultury pro výrobu vakcíny, stanovení počtu borrelií, mezioperační kontroly, kontrola růstu a čistoty kultury a stanovení přítomnosti OspC.

C) Vlastní příprava finální podoby vakcíny:

Koncentrované, purifíkované, stabilizované a inaktivované bakteriální kmeny Borrelia burgdorferi senzi stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii s prokázanou expresí povrchového proteinu OspA a koncentrované, purifíkované, stabilizované a inaktivované bakteriální kmeny Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii s prokázanou expresí povrchového proteinu OspC se smíchají tak, aby povrchové OspA a OspC jednotlivých genomospecies

Borrelií byly ve shodném poměru. Poté se Borreliová složka (90% objemových) smíchá s Aluminiumhydroxid gelem (10 % objemových). Po dokonalé homogenizaci se provede kontrola a úprava pH na hodnotu 7,5 až 8,0. Vakcína se rozplní do zásobních lahví a provede se zkouška sterility. Poté je vakcína rozplněna do finálního expedičního balení, adjustována a předána do výstupní kontroly.

D) Výsledky testací

a) zkouška účinnosti na kočkách:

Provedla se vakcinace a revakcinace 6 koček pokusným vzorkem vakcíny a za 90 dní čelenž prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (Ixodes ricinus) genomospeciemi borrelií Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, včetně infekce 3 koček nevakcinovaných, kontrolních.

Vakcinace byla provedena dávkou t ml vakcíny subkutánně (s. c.) a za 3 týdny byla shodným způsobem provedena revakcinace. Před vakcinací a před revakcinací byl proveden odběr krve.

Další odběry krve byly provedeny za 1 měsíc pro revakcinaci. Za 3 měsíce po revakcinací byla provedena čelenž prostřednictvím klíšťat obecných (Ixodes ricinus) z přírodního sběru, která byla přirozeně infikována všemi třemi nejpatogennějšími genomospecies - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Stupeň infekce klíšťat byl ověřen před zahájením čelenžního experimentu.

Po infekci byla všechna pokusná zvířata (kočky vakcinované i kočky nevakcinované - kontrolní) denně klinicky hodnocena a byl zaznamenáván jejich zdravotní stav, včetně měření tělesné teploty. Po infekci byly provedeny probatomí odběiy krve ode všech pokusných zvířat 14. den,

-7CZ 301244 B6

28. den, 42. den a 60. den. Krev byla odebrána i v den čelenže, těsně před infekcí prostřednictvím klíšťat 7., 28. a 60. den po čelenži byly provedeny biopsie kůže v místě přisátí klíšťat s cílem reizolace borrelií z těchto vzorků. 60 den po čelenži byla všechna pokusná zvířata utracena a byla provedena patologicko - anatomická pitva s odběrem vzorků ze svalu, kloubní synovie, mízní uzliny, kůže a ledviny, s cílem reizolace borrelií z těchto predilekčních míst.

Dosažené výsledky jsou názorně prezentovány v přehledných tabulkách č. 1, 2, 3 a 4. Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že vakcína proti borelióze připravená z výrobních kmenů BorTelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii exprimuj ících povrchové io proteiny OspA a OspC je pro kočky neškodná a vyvolává u nich protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nejpatogennějšími genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imunity případně i vůči dalším známým genomospecies Borrelií.

Tabulka č. 1 - Schéma Čelenžního pokusu - kočky

Kočka č.

Vakcinace

Revakci nace

Celenž

Odběry biologického materiálu po čelenži/ dny

Poznámka

7

14

28

35

42

49

56

60

IV

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

2V

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

3V

+

+

+

B

K

BK

K

-

-

BKP

Klinika- denně

4V

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

5V

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

6V

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

7KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

BKP

Klinika- denně

8KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

9KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

Vysvětlivky:

V - vakcinace B-biopsie kůže

KO- bez vakcinace (kontrola) K-odbér krve +- proveden úkon P-patologicko-anatomická pitva

- - neproveden úkon

Tabulka č. 2 - Klinické hodnocení po čelenži

Kočka č.	Klinické změny po i	Selenži-	dny	Poznámka
7	14	21	28	35	42	49	56	60
IV	-		-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
2V			-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
3V			-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
4V			-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
5V			-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
6V			-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
7KO			-	-	-	-	+	Ί-	+	Klinika- sledována denně
8KO			-	-	-	-	-	4-	+	Klinika- sledována denně
9KO			-	-	-	-	-	-	+	Klinika- sledována denně

Vysvětlivky:

+ - klinické příznaky — bez klinických příznaků

-8CZ 301244 B6

Tabulka č. 3 - Nález borrelií v bioptátech kůže po čelenži

Kočka č.	Termín odběru bioptátů kůže- dny	Poznámka
7	28	60
IV	-		-
2V	-		-
3V	-		-
4V	-		-
5V	-		-
6V			-
7KO	+		-
8KO	+		-
9KO	+	+	-

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- - negativní záchyt

Tabulka č.4- Nález borrelií v orgánech

Kočka č.	Predilekční orgány (60 den- pitva).	Poznámka
sval	kůže	mízní uzlina	kloubní synovie	ledvina
IV	-	-	-	-	-	PA- neg.
2V	-	-	-	-	-	PA- neg.
3V	-	-	-	-	-	PA- neg.
4V	-	-	-	-	-	PA- neg.
5V	-	-	-	-	-	PA- neg.
6V	-	-	-	-	-	PA- neg.
7KO	-	-	+	+	-	PA- poz.
8KO	+	-	+	+	-	PA- poz.
9KO	+	-	+	+	-	PA- poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt - - negativní záchyt PA- patologicko-anatomická pitva

b) zkouška účinnosti na psech:

Provedla se vakcinace a revakcinace 6 psů pokusným vzorkem vakcíny a za 90 dní čelenž prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (Ixodes ricinus) genomospeciemi borrelií, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, včetně infekce 3 psů nevakcinovaných, kontrolních. Vakcinace, revakcinace, odběry krve, klinické hodnocení, probatomí odběry a další úkony byly prováděny shodně jako u zkoušky na kočkách.

Dosažené výsledky jsou názorně prezentovány v přehledných tabulkách č. 5, 6, 7 a 8, Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že vakcína proti borelióze připravená z výrobních kmenů

Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii exprimujících povrchové proteiny OspA a OspC je pro psy neškodná a vyvolává u nich protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nej patogennějším i genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imunity případně i vůči dalším známým genomospecies Borrelií.

-9CZ 301244 B6

Tabulka č. 5- Schéma čelenžního pokusu - psi

Pesč.

Vakcinace

Revak c i nace

Čelcnž

Odběry biologického materiálu po čelenži/ dny

7

14

28

35

42

49

56

60

IV

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

2V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

3V

+

+

+

B

K

BK

K

-

-

BKP

Klinika- denně

4V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

5V

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

6V

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

7KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

BKP

Klinika- denně

8KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

9KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

Vysvětlivky:

V- vakcinace B-biopsie kůže

KO- bez vakcinace (kontrola) K-odběr krve +- proveden úkon P-patologicko-anatomická pitva

- - neproveden úkon

Tabulka č. 6 - Klinické hodnocení po čelenži

Pes C.	Klinické změny po čelenži- dny	Poznámka
7	14	21	28	35	42	49	56	60
IV	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
2V										Klinika- sledována denně - sledována denně
3V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
4V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
5V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
6V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
7KO	-	-	-	-	-	-	-	+	+	Klinika- sledována denně
8KO	-	-	-	-	-	-	-	+	+	Klinika- sledována denně
9KO	-	-	-	-	-	-	-	+	4-	Klinika- sledována denně

Vysvětlivky:

+ - klinické příznaky --bezklinických příznaků

Tabulka č. 7 - Nález borrelií v bioptátech kůže po čelenži

Pesč.	Termín odběru bioptátů kůže- dny	Poznámka
7	28	60
Iv	-	-	-
2V	-	-	-
3V	-	-	-
4V	-	-	-
5V	-		-
6V	-	-	-
7KO	+	-	-
8KO	+	+	-
9KO	+	+	-

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt - - negativní záchyt

-10CZ 301244 B6

Tabulka č. 8 - Nález borrelií v orgánech

Pes č.	Predilekční orgány (601	en- pitva).	Poznámka
sval	kůže	mízní uzlina	kloubní synovie	ledvina
IV	-		-	-	-	PA- neg.
2V	-		-	-	-	PA- neg.
3V			-	-		PA- neg.
4V	-		-	-	-	PA- neg.
5V	-		-	-	-	PA- neg.
6V	-		-	-	-	PA- neg.
7KO	+		+	-	-	PA- poz.
8KO	+		+	+	-	PA- poz.
9KO	+		+	+	-	PA- poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt ’ - negativní záchyt PA- patologicko-anatomická pitva

c) zkouška účinnosti na koních:

ío Provedla se vakcinace a revakcinace 6 koní pokusným vzorkem vakcíny a za 90 dní čelenž prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (íxodes ricinus) genomospeciemi borrelií, a to Borrelía burgdorferi sensu stricto, BorTelia afzelii a Borrelia garinii, včetně infekce 3 koní nevakcinovaných, kontrolních.

Vakcinace, revakcinace, odběry krve, klinické hodnocení, probatomí odběry a další úkony byly prováděny shodně jako u zkoušky na kočkách nebo na psech.

Dosažené výsledky jsou názorně prezentovány v přehledných tabulkách 9, 10, 11 a 12. Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že vakcína proti boreíióze připravená z výrobních kmenů

Borrelia burgdorferi sensu stricto, BorTelia afzelii a Borrelia garinii exprimujících povrchové proteiny OspA a OspC je pro koně neškodná a vyvolává u nich protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nepatogennějšími genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imunity případně i vůči dalším známým genomospecies Borrelií.

Tabulka č. 9- Schéma Čelenžního pokusu - koně

Kůň č.

Vakcinace

Revakci nace

ele nž

Odběry biologického matená

u po Celenži/ dny

Poznámka

7

14

28

35

42

49

56

60

IV

+

+

+

B

K

BK

K

-

BKP

klinika - denně

2V

+

+

+

B

K

BK

-

K

-

BKP

Klinika- denně

3V

+

+

+

B

K

BK

-

K

BKP

Klinika- denně

4V

+

+

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

5V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

6V

+

+

B

K

BK

-

K

-

BKP

Klinika- denně

7KO

-

-

+

B

K

BK

K

-

-

BKP

Klinika- denně

8KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

9KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

-

-

BKP

Klinika- denně

Vysvětlivky:

V- vakcinace

KO - bez vakcinace (kontrola) B- biopsie kůže +- proveden úkon K- odběr krve — neproveden úkon P- patologicko-anatomická pitva

-11 CZ 301244 B6

Tabulka ě. 10 - Klinické hodnocení po čelenži

Kůň č.	Klinické změny po Čelenži- dny	Poznámka
7	14	21	28	35	42	49	56	60
IV	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
2V										Klinika- sledována denně - sledována denně
3V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
4V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
5V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
6V	-	-	-	-	-	-	*	-	-	Klinika- sledována denně
7KO	-	-	-	-	-	-	-	-	+	Klinika- sledována denně
8KO	-	-	-	-	-	-	-	+	+	Klinika- sledována denně
9KO	-	-	-	-	-	-	-	-	+	Klinika- sledována denně

Vysvětlivky:

+ -klinické příznaky --bez klinických příznaků io Tabulka č. 11 - Nález borrelií v bioptátech kůže po čelenži

Kůň č.	Termín odběru bioptátů kůže- dny	Poznámka
7	28	60
IV		-	-
2V	-	-	-
3V	-	-	-
4V	-	-	-
5V	-	-	-
6V	-	-	-
7KO	+	-	-
8KO	+	-	-
9KO	+	-	-

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt - - negativní záchyt

-12CZ 301244 Bó

Tabulka č. 12 - nález borrelií v orgánech

Kočka č.	PredilekČní orgány (60 den- pitva	Poznámka
sval	kůže	mízní uzlina	kloubní synovie	ledvina
IV		-	-	-	-	PA- neg.
2V		-	-	-	-	PA- neg.
3V			-	-		PA- neg.
4V		-		-		PA- neg.
5V		-	-	-		PA- neg.
ÓV		-	-	-		PA- neg.
7KO		-		+		PA- poz.
8KO		-	+	+		PA- poz.
9KO	+	-	+	+		PA- poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- - negativní záchyt

PA- patologicko-anatomická pitva

Popsané příklady přípravy vakcíny nejsou jedinými možnými provedeními podle vynálezu, ale bez vlivu na jeho podstatu mohou být celobuněčné bakteriny nebo bakteriální lyzáty nebo io purifikáty s obsahem imunogenních protektivních proteinů aplikovány v pufrovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, popřípadě s imunitními komplexy (ISCOM), liposomy a dalšími přírodními či syntetickými imunitními adjuvanty.

Průmyslová využitelnost

Univerzální vakcínu k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy je možno použít ve veterinární i humánní medicíně a je možno ji úspěšně aplikovat vnitrosvalovč (intramuskulámě), podkožně (subkutánně), vnitrokožně (intradermálně) nebo bezjehelně (transkutánně).

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Univerzální vakcína k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití, vyznačující se tím, že je vytvořená na bázi celobuněčných bakterinů nebo bakteriálních lyzátů nebo purifikátů tří nejpatogennějších genomospecies borrelií - BorTelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, a případně dalších, přičemž každá

30 z použitých genomospecies borrelií obsahuje současně oba imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC, popřípadě obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnější membrány.

2. Univerzální vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že imunogenní protekti35 vní proteiny vnější membrány OspA a OspC jsou ve vakcíně obsaženy s výhodou v poměru 1:1.

3. Univerzální vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že je vytvořena v lyofilizované či tekuté formě, je aplikována v pufrovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, případně dalšími imunomodulátory.

4. Univerzální vakcína podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že její pH se pohybuje v rozmezí hodnot 4 až 9.

13CZ 301244 B6

5. Způsob výroby univerzální vakcíny k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že každý z výrobních kmenů borrelií se kultivuje, kontroluje, inaktivuje a testuje až do stavu smísení samostatně, přičemž pří kultivací kmenů za účelem exprese antigenu OspA probíhá pomnožování a produkce

5 kultury při teplotě 26 až 35 °C s dobou 6 až 18 dnů u každého kroku a při kultivaci kmenů za účelem exprese antigenu OspC probíhá pomnožování a produkce kultury při teplotě 36 až 38 °C s dobou 6 až 18 dnů u každého kroku.