CZ2007791A3 - Universální vakcína k lécbe a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a zpusob její výroby - Google Patents

Abstract

Universální vakcína k lécbe a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití, vytvorená na bázi celobunecných bakterinu nebo bakteriálních lyzátu nebo purifikátu alespon jedné nebo více genomospecies borrelií, jejíž podstata spocívá v tom, že každá z genomospecies borrelií, vybraných prednostne ze skupiny Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, obsahuje minimálne jeden imunogenní protektivní protein vnejší membrány, bud OspA nebo OspC, nebo soucasne oba imunogenní protektivní proteiny OspA a OspC, poprípadne obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnejší membrány.

Description

Universální vakcína k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a způsob její výroby

Oblast techniky

Vynález se týká složení universální vakcíny k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a způsobu její výroby.

Dosavadní stav techniky

Lymeská borrelióza je chronické multisystémové infekční onemocnění, které je nejčastějšim infekčním onemocněním přenášeným členovci (arthropod born) a to v Evropě i ve Spojených státech. O významu tohoto onemocnění svědčí četnost publikací v časopisech zabývajících se infekční problematikou. Z tohoto pohledu je v poslední dekádě borrelióza svým významem zařazována za syndrom získané imunodeficience, jak je popsáno např. v Článku The biological and sociál phenomenon of Lyme disease (Barbour AG, Físh D, Science. 1993 Jun 11,260(5114):1610-6).

Onemocněni je vyvolané skupinou spirochet souhrnně označovaných jako Borrelia burgdorferi sensu lato. Tato skupina mikroorganismů je tvořena zejména třemi blízce příbuznými subspecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Zatímco Borrelia burgdorferi sensu stricto je příčinou prakticky všech onemocněni Lymeskou borreliózou na severoamerickém kontinentu, v Evropě převládají Borrelia garinii a Borrelia afzeli.

Závažné poškození savčího hostitelského organismu, stejně jako problémy spojené s diagnostikou i terapii Lymeské borreliózy jsou významným stimulem pro vývoj efektivních vakcinačních preparátů. Na druhé straně existují i výhrady k vývoji vakcin a jejich použití zejména u lidí. Jde především o to, že onemocnění není přenosné z člověka na člověka, je relativně snadno léčitelné antibiotiky a klinická manifestace se závažnými důsledky postihuje pouze část infikovaných pacientů. Navíc je toto onemocnění velmi zřídka fatální. Na místě je proto obava z případných vedlejších účinků nové vakcíny, které by za těchto okolností byly velmi těžko přijatelné, jak je popsáno ve stati Experimenta! immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp protems: an overview“ (Sadziene A, Barbour AG., Infection. 1996 Mar-Apr;24(2): 195-202).

První veterinární vakcína proti borrelióze byla vyvinuta ve Spojených státech v r. 1990 pro psy. Licencována byla v r. 1992, jak je známo z článků Performance of a Borrelia burgdorferi bacterin in borreliosis-endemic areas (Levý SA, Lissman BA, Ficke CM.. J Am Vet Med Assoc. 1993 Jun 1:202(11):1834-8.) nebo Immunization against Lyme disease? (Wormser, GP, Ann Intern Med 123,627 - 629, 1995).

Vakcína je celobuněčná, chemicky inaktívovaná, aplikovaná s vehikulem obsahujícím polymerové adjuvantní látky. Vakcína je aplikována intramuskulárně dvakrát v intervalu dvou až tří týdnů. Po roce je doporučena udržovací dávka (booster). Vakcinace domácích zvířat, zejména psů je doporučena bez ohledu na to, zda zvíře bylo infikováno, případné u něho probíhá onemocnění. Příprava této vakcíny vycházela z poznatků získaných v pokusech na hlodavcích. Protektivní efekt celobuněčné vakcíny byl poprvé popsán u křečků.

Vývoj celobuněčné vakcíny pro veterinární účely byl podporován především jednoduchostí přípravy a také nízkou cenou. Tato vakcína však nebyla doporučena pro humánní použití s ohledem na skutečnost, že některé antigeny borrelií zkříženě reagují s lidskými antigeny a nelze proto vyloučit indukci imunopatologických procesů, jak je popsáno ve statích Molecular mimicry and Lyme borreliosis: a shared antigenic determinant between Borrelia burgdorferi and human tissue (Aberer E et al., Ann Neurol.1989 Dec, 26(6):732-7) nebo Sérologie response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line. (Fikrig et al. 1993, Proč Nat Acad Sci USA. 1993 Jan 1,90(1):183-7).

• *· ·

Určitým varováním bylo např. zjištěni, že některé antigeny Borrelia burgdorferi aktivuji sety specifických T lymfocytů, které se podílely na rozvoji arthritidy u křečků, což je popsáno v článku Involvement of CD4+ T lymphocytes in induction of severe destructive Lyme arthritis in inbred LSH hamsters (Lim LC et al., Infect Immun. 1995 Dec; 63(12):4818-25).

Králíci jsou chráněni proti infekci, pokud je imunní sérum připravené imunizací zvířat imunogenními proteiny borreliózového kmene aplikováno před experimentální čelenží. Podání imunního séra po infekci nebrání rozvoji erythema migrans a viscerálním projevům infekce. Podobné výsledky byly zjištěny také u myší a křečků a popsány v Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice (Barthold SH/ et al, Lab. Invest.1996, Jan;74(1):57-67) nebo Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi (Barthold SH/ et al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1:59-17.) nebo Experimental infection of the hamster with Borrelia Burgdorferi (Johnson RC et al., Ann Acad Sci. 1988;539:258-63).

Těmito experimentálními poznatky byla naznačena možnost vývoje bezpečné subjednotkové vakcíny. Hlavními kandidátními antigeny pro takovou vakcínu se staly vnější povrchové proteiny (outer surface proteins Osp) označované jako OspA, B, C a D. Intenzívně byl studován zejména protein OspA. Protektivní efekt této subjednotkové vakcíny byl potvrzen experimentálně u myší, křečků a králíků a popsán v článcích Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA (Firking E et al., Science 1990 Oct 26; 250(4980):553-6) nebo Long-term protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA (Firking E et al., Infect Immun. 1992 Mar; 60(3):773-7). Laboratorní testy potvrdily, že aplikace tohoto proteinu ve formě purifikovaného, lipidovaného rekombinantního proteinu indukuje protektivní imunitu při parenterálním podání a chrání proti infekci borreliemi podanými nejen injekční cestou, ale též s pomocí klíštěcího vektoru. Potvrdilo se také, že infekční klíšťata sající na takto imunizovaných zvířatech ztrácejí svou infekciozitu, což je popsáno v Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine (Keller D et al.,. JAMA. 1994 Jun 8;271(22): 1764-8) nebo Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspA-immunized mice (Firking E et al.,Proc Nati Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):5418-21).

V nepřítomnosti lipidové jednotky vyžaduje indukce tvorby protilátek adjuvantni efekt Freundova kompletního adjuvans, nebo jiného imunitního adjuvans, jak je popsáno ve stati Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA (Erdile IF et al., Infect Immun. 1993 Jan;61(1):81-90). To naznačuje dvojí možný efekt vakcinace :

(1) spirochety jsou inaktivovány již v organismu klíštěte a je tak zabráněno transmisi infekce, (2) spirochety mohou být inaktivovány krátce po vstupu do hostitelského organismu ještě před antigenni variací a útlumem exprese antigenu Osp A.

K verifikaci protektivního efektu antigenu OspA byly připraveny dva různé konstrukty a vakcinačni formule:

1. Nativní a čistý rekombinantní OspA, popsaný v Recombinant outersurface protein a from Borrelia burgdorferi induces antibodies protective against spirochetal infection in míče (Simon MM et al.,.J Infect Dis. 1991 Jul;164(1):123-32)

2. OspA inkorporovaný do genomu BCG (Calmette, Guérin). OspA se exprimoval jako membránově asociovaný lipoprotein, což je známo z článku Protective immunity elicited by rBCG vaccines (Stover CK et al., Dev Biol Stand. 1994;82:163-70). V této formě byl testován při intraperitoneální aplikaci a také při intranasálním podání, jak je publikováno v Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi (Langermann S et al., Nátuře. 1994 Dec 8;372(6506):552-5). Při této formě aplikace byly dlouhodobě indukovány specifické IgG i IgA protilátky, což je patrné z článku Protective immunity elicited by recombinant bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme disease vacclne (Stover CKet al., J Exp Med. 1993 Jul 1; 178(1): 197-209).

V současné době jsou jediným producentem takové vakcíny pro humánní použití Spojené státy americké. Vakcína byla schválena Food and Drug Administration (FDA) 21. 12 1998 a je popsána ve studii Vaccination against Lyme disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group (Steere AC et al., N Engl J Med. 1998 Ju! 23;339(4):209-15). Jde o výrobek LYMErix firmy SmithKline Beecham.

• * « · · « «

Podle třetí fáze klinických zkoušek poskytuje vakcína 80 - 90% ochranu, jak je prokazováno ve stati A vaccine consisting of recombinant Borrelia burgdorferí outersurface protein A to prevent Lyme disease. Recombinant Outer-Surface Protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium (Sigal LH et al., N Engl J Med. 1998 Jut 23;339(4):216-22. Erratum in: N Engl J Med 1998 Aug 20;339(8):571).

I když je vakcína již v distribuci, je pod permanentní kontrolou s ohledem na minimum znalostí o dlouhodobém použití tohoto preparátu. Vakcína je aplikována injekčně třikrát v průběhu 12 měsíční periody (0, 1, 12) pro dosažení maxima imunitní odpovědi. Efektivnost vakcíny popisuje např. Wahlberg, který uvádí, že po dvou dávkách rekombinantního OspA proteinu vázaného na aluminium hydroxid ve fosfátovém pufru byla účinnost vakcíny 50% (1 rok), po třech vakcinačních dávkách (20 měsíců) byla účinnost 79%. Protilátkový titr klesal poměrně rychle a po dvou letech byl na úrovni prvního roku vakcinace (efektivnost 50%). Detaily o „booster“ efektu nejsou k dispozici. Doposud není povoleno aplikovat vakcinu dětem pod 15 let a lidem trpícím autoimunitním onemocněním, zejména artritidou. V souboru 5765 vakcinovaných jedinců se u dvou osob s fenotypem HLA-DR4 vyvinula arthritida, jak bylo zveřejněno v článku Guarded endorsement for Lyme disease vaccine (Marwick C, JAMA. 1998 Jun 24;279(24):1937-8).

Komerčně dostupná vakcína je připravena z proteinu OspA z Borrelia burgdorferí sensu stricto. Vzhledem k tomu, že tato bakterie je dominantním infekčním původcem Lymeské borreliózy na severoamerickém kontinentu, může být vakcína relativně efektivní pro obyvatelstvo USA. V evropských podmínkách však toto onemocnění vyvolávají zejména tři patogenní subspecies, a to Borrelia burgdorferí sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. U všech těchto kmenů je na evropském kontinentu popsána antigenní variabilita. V evropských podmínkách je proto vakcína připravená pouze z kmene Borrelia burgdorferí sensu stricto pro humánní i veterinární použití nepoužitelná. Při vývoji účinné formy vakcíny byly využity i nové trendy ve vakcinačních technologiích, kde například účinná DNA vakcína je publikována ve statích Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferí is independent of an eukaryotic promotér (Simon MM et al., Eur J Immunol. 1996 Dec;26(12):28315 • · · a o · · a · ♦ ·· ·

40) nebo DNA vaccines expressing a fusion product of outer surface proteíns A and C from Borrelia burgdorferi induce protective antibodies suitable for prophylaxis buf not for resolution of Lyme disease (Wallich R. et al.,. Infect Immun. 2001 Apr;69(4):2130-6).

Jiným možným východiskem je připravit vakcínu z proteinu OspC, který je exprimován na povrchu mikroorganismů v těle hostitele a podle literárních dokladů má humorální imunita proti tomuto proteinu protektivní charakter, jak je popsáno v Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent ofan eukaryotíc promotér (Simon MM et al., Eur. J. Immunol. 26, 2831-2840, 1996).

OspC je hlavním membránovým antigenem vyjádřeným v časné fázi infekce. U Borrelia burgdorferi sensu stricto je OspC vysoce variabilní. Epidemiologickou analýzou a sekvenováním genů pro OspC u jednotlivých izolátů a doplněním s GeneBank bylo pro tento antigen zjištěno 21 alelických skupin označovaných A-U, jak je popisováno v Four dones of Borrelia burgdorferi sensu stricto čase invasive infection in humans (Seinost G etal., Infect. Immun. 67, 3518-3524, 1999).

Vnější povrchový antigen A (OspA) je hlavním povrchovým antigenem, který je exprimován, když je Borrelia burgdorferi rezidentní v klíštěti. V okamžiku, kdy klíště začne nasávat krev na savcích, je syntéza tohoto antigenu reprimována a naopak je indukována syntéza antigenu OspC. Takto se OspC stává hlavním antigenem vnější povrchové membrány v časné fázi infekce, což je popsáno například v Induction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi duríng tick feeding (Schwan TG et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995). I když bylo prokázáno, že OspC má limitovanou povrchovou expozici, je potentním imunogenem. Imunizace OspC je protektivní proti borreliové infekci. Ochrana je však vázána na konkrétní alelu OspC, která kontroluje syntézu konkrétního proteinu. Infekce jiným typem borrelie vede u těchto imunizovaných jedinců k onemocnění. To samozřejmě limituje použití tohoto antigenu získaného pouze z jedné genomospecies borrelií pro přípravu univerzální vakcíny • · * · ·

• · · · · · * • v * ··· · ♦·♦ ·

Otázka úspěšné vakcinace proti Lymeské borrelióze zůstává tedy otevřenou otázkou. V Evropě je navíc komplikována existencí tří různých genomospecies (Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii) a onemocněním Lymeskou borreliózou vedle člověka i u různých druhů domácích a hospodářských zvířat. Problematikou onemocnění u psů a koček se věnuje stať Canine borreliosis (Littman MP, Vet Clin Smalt Anim 33, 2003, 827-862) a u koní Equine Abortion Associated with the Borrelia parker i- B. turicatae Tick-Borne Relapsing Fever Spirochete Group (Walker RL et al., Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 4, 1558-1562).

O možnost překonat tyto problémy přípravou tzv. „kokteilových vakcín“ se pokusili např. Livey et al., a své výsledky publikovali ve stati OspC vaccine candidate (Abstract of the Symposium on the Pathogenesis and Management of Tick-bome Diseases. 1998 Sept. 28-30. Vienna, Austria. 1998).

Se stávajícími problémy s diagnostikou a léčbou Lymeské borreliózy a vzhledem k nemožnosti účinně kontrolovat a snižovat rozšířeni vektorů borrelií, naléhavě vyvstala potřeba vakcíny schopné účinně imunizovat vnímavé druhy domácích a hospodářských zvířat i lidí proti infekci Borrelia burgdorferi sensu lato. Byly vyvinuty vakcíny na bázi celobuněčného bakterinu Borrelia burgdorferi pro použití u domácích zvířat, popsané např. v patentech US 4721617, US 6316005. Byly vyvinuty i vakcíny založené na obsahu proteinu OspA, OspC či dalších povrchových (outer surface proteins) imunogenních proteinů, izolovaných z kultivovaných kultur borrelií, exprimovaných jako rekombinantní proteiny v různých hostitelích (E. coli), nebo připravených synteticky, z nichž jako příklady je možno uvést spisy WO 094/25596, WO 96/05313, WO 9749812, US 6716574, US 2004067517, US 6676942, WO 0216422, US 5530103, US 6486130, US 6464985, EP 633028).

Tyto celobuněčné nebo subjednotkové vakcíny však nezahrnují ochranu proti celé šíři patogenních borrelií všech genomospecies, tedy zejména Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii a případně dalších. Jsou odvozeny vždy pouze z jedné genomospecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto.

Λ • · · Φ

Úkolem vynálezu je představit novou universální vakcínu, která obsahuje hlavní imunogenní proteiny OspA a OspC v různé kombinaci minimálně jednoho, dvou, s výhodou všech tři nejznámějšich patogenních genomospecies, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii a případně dalších, a může být úspěšně aplikovatelná bez teritoriálního omezení.

Podstata vynálezu

Uvedeného cíle je dosaženo vynálezem, kterým je universální vakcína k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití, vytvořená na bázi celobuněčných bakterinů nebo bakteriálních lyzátú nebo purifikátů alespoň jedné nebo více genomospecies borrelií, jejíž podstata spočívá v tom, že každá z genomospecies borrelií, vybraných přednostně ze skupiny Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, obsahuje minimálně jeden imunogenní protektivní protein vnější membrány, buď OspA nebo OspC, nebo současně oba imunogenní protektivní proteiny OspA a OspC, popřípadně obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnější membrány.

Ve výhodném provedení vakcína obsahuje všechny tři nejpatogenější genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garrínii, z nichž každý obsahuje současně oba imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC.

Dále je podstatou vynálezu, že imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC jsou ve vakcíně obsaženy s výhodou v poměru 1 : 1, že je vytvořena v lyofilizované či tekuté formě nebo je aplikována v purfovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, případně dalšími imunomodulátory, a .že pH vakcíny se pohybuje v rozmezí hodnot 4 až 9.

Konečně je podstatou vynálezu způsob výroby universální vakcíny k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití podle nároků 1 až 5, při jehož realizaci se každý z výrobních kmenů borrelií se kultivuje, inaktivuje a • · · · • · * · · « ·«·· ♦ · · • · · * «·« · ......

testuje až do stavu smísení samostatně, přičemž při kultivaci kmenů za účelem exprese antigenu OspA probíhá pomnožování a produkce kultury přednostně při teplotě 26 - 35’0 s dobou 6-18 dnů u každého kroku a při kultivaci kmenů za účelem exprese antigenu OspC probíhá pomnožování a produkce kultury přednostně při teplotě 36 - 38°C s dobou 6-18 dnů u každého kroku.

Předkládaným vynálezem se dosahuje nového účinku v tom, že po aplikaci dochází u vakcinovaných zvířat či člověka k tvorbě specifických OspA a OspC protilátek, které zabraňují přestupu patogenních borrelií z klíštěte do vakcinovaného organismu (OspA protilátky) a napomáhají jejich destrukci krátce po případném přestupu patogenních borrelií do vakcinovaného organismu (OspC protilátky) a případně k tvorbě dalších blíže nedefinovaných postvakcinačnich protektivních protilátek a stimulaci imunitních mechanismů. Dalším přínosem je, že kromě běžných dospělých jedinců je vakcínu možno aplikovat mláďatům domácích zvířat (přednostně psi a kočky) a mláďatům hospodářských zvířat (přednostně koně) od 3 týdnů jejich věku k navození aktivní protektivní imunity proti Lymeské borrelióze. Rovněž je možno vakcínu současně aplikovat s jinými přípravky, léčivy a vakcínami proti virovým, bakteriálním, mykotickým a jiným onemocněním psů, koček, koní a jiných druhů zvířat, pro které je vakcína určena.

Příklady provedení vynálezu

Příklad č.1:

Tento příklad provedeni demonstruje ověření protektivity universální vakcíny po imunizaci pokusných koček, psů a koní vůči čelenži virulentními kmeny Borrelia burgdorferi sensu lato, v žádném případě však neomezuje patentová práva vztahující se k tomuto patentu.

Příprava pokusného vzorku vakcíny a výsledky testací:

A) Kultivace výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspA:

Při kultivaci výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspA, byla jako výchozí surovina použita jedna z položek

- Médium BSK -H + králičí sérum

- Médium BSK - H complete a výrobní kmeny Borrelia afzelii, Borrelia garinii a Borrelia burgdorferi sensu stricto podle následně znázorněného schématického výrobního postupu :

Příprava kultivační půdy _____________________i_____________________ ________Výrobní kmeny________ ________________________1________________________ ____________Oživení____________

Pomnožování jednotlivých kmenů

->	Kontrola růstu a čistoty
—>	Kontrola růstu a čistoty Stanovení počtu

Stanovení přítomnosti OspA

Inaktivace jednotlivých kmenů

Koncentrace, purifikace antigenu ~

Stabilizace antigenu i

Kompletace vakcíny a adsorpce na ________aluminiumhydroxid________ ______________________I______________________ Plnění, adjustace, výstupní kontrola

Zkouška inaktivace

Stanoveni nepřítomnosti séra

Kontrola sterility, stanovení a úprava pH

Kontrola sterility, stanovení pH

Poznámka: Každý kmen borrelií (Borrelia afzelii, garinii a burgdorferi sensu stricto) se kultivuje, kontroluje, inaktivuje a testuje zvlášť až do stavu smísení všech kmenů (včetně kmenů s expresí antigenů OspC).

Vlastní kultivace se prováděla v plastových nebo skleněných Roux láhvích určených ke kultivaci kultur borrelií, když kultivační médium BSK se před vlastní kultivací obohatí 6% sterilního králičího séra vhodného pro kultivaci borrelií, popř, lze použit přímo kompletní BSK-H médium s obsahem 6% králičího séra. Matečné i pracovní výrobní kmeny jsou udržovány v zamraženém stavu při teplotě -196°C v tekutém dusíku.

* · · ·

• · · • · ·

Při oživováni kultury se ampule s kulturou vyjme z tekutého dusíku a rozmrazí se při teplotě cca 30°C. Ihned po rozpuštěni se inokuluje do zkumavky s živným médiem vytemperovaným na teplotu cca 28°C v poměru 1 + 9 (1 díl kultury + 9 dílů média). Každý kmen se kultivuje samostatně inkubace probíhá při teplotě 26 - 35°C po dobu 6 až 18 dní.

Při pomnožování kultury se dobře narostlá, životaschopná kultura (mění barvu kultivačního média z červené na žlutou) po mikroskopické kontrole za aseptických podmínek inokuluje do živného média v poměru 1 díl kultury + 9 dílů média. Kultivace probíhá 6 - 10 dnů při teplotě 26 - 35 °C. Další subpasáže dobře narostlých borrelií se provádí v poměru 1 díl násady : 10 až 100 dílům kultivačního média. Počet dalších subpasáží je závislý na požadovaném objemu borrelií pro přípravu vakcíny.

Při produkci kultury pro výrobu vakcíny se narostlé kultury z předchozích kultivací za aseptických podmínek použiji jako inokulum do živné půdy v 1 000 ml lahvích v poměru 1 díl násady : 10 až 100 dílům kultivačního média. Kultivace probíhá 6-10 dnů při teplotě 26 - 35 °C.

Stanovení počtu borrelií se provádí v temném poli mikroskopu pomocí PETROFF HAUSSER COUNTING CHAMBER.

Během procesu se provádějí mezioperační kontroly růstu a čistoty kultury pomocí makroskopického vyšetření, mikroskopického vyšetření a kultivačního vyšetření. Makroskopické vyšetření spočívá ve vizuálním sledování, když vhodná kultura mění barvu kultivačního media z červené barvy do žluté a v mediu se vyskytuje sediment. Mikroskopické vyšetření v temném poli mikroskopu sleduje, zda jsou Borrelie přiměřeně pohyblivé s malým množstvím detritu, bez známek bakteriální kontaminace. Při kultivačním vyšetření se hodnocená kultura borrelií přenese v množství 0,5 ml na předsušený krevní agar a kultivace probíhá při 35 - 37 °C po dobu 48 hod.

Při posouzení zkoušky se sleduje přítomnost jakéhokoliv bakteriálního nárůstu, který je nežádoucí a kultury s bakteriální kontaminací se vyřadí.

II • * · ♦ * · ·♦·· · * ·

Stanovení přítomnosti OspA se provádí se pomocí proteinové elektroforézy na SDS PAGE po obarvení Coomasie Blue nebo imunodetekcí metodou Western Blot s použitím anti OspA séra.

B) Kultivace výrobních kmenů borrelií za účelem exprese antigenu OspC :

Při přípravě kultivace se použijí stejné suroviny a stejné výrobní kmeny a postupuje se dle stejného schématického výrobního postupu jako u exprese antigenu OspA popsaného ad A).

Rovněž vlastní kultivace probíhá ve stejném procesu s tím rozdílem, že při oživování kultury se ampule s kulturou po rozpuštěni inokuluje do zkumavky s živným médiem vytemperovaným na teplotu cca 37’C v poměru 1 + 9 (1 díl kultury + 9 dílů média) a inkubace probíhá při teplotě 36 - 38 °C po dobu 6 až 18 dní. Rovněž pomnožování kultury probíhá analogicky s tím rozdílem, že kultivace probíhá 6—10 dnů při teplotě 36 - 38 °C. Identicky s popisem v ad A) se provádí produkce kultury pro výrobu vakcíny, stanovení počtu borrelií, mezioperační kontroly, kontrola růstu a čistoty kultury a stanovení přítomnosti OspC.

C) Vlastní příprava finální podoby vakcíny :

Koncentrované, purifikované, stabilizované a inaktivované bakteriální kmeny Borrelia burgdorferi senzu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii s prokázanou expresí povrchového proteinu OspA a koncentrované, purifikované, stabilizované a inaktivované bakteriální kmeny Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii s prokázanou expresí povrchového proteinu OspC se smíchají tak, aby povrchové OspA a OspC jednotlivých genomospecies Borrelií byly ve shodném poměru. Poté se Borreliová složka (90 % objemových) smíchá s Aluminiumhydroxid gelem (10 % objemových). Po dokonalé homogenizaci se provede kontrola a úprava pH na hodnotu 7,5 - 8,0. Vakcína se rozplní do zásobních lahví a provede se zkouška sterility. Poté je vakcína rozplněna do finálního expedičního balení, adjustována a předána do výstupní kontroly.

• ·

D) Výsledky testací

a) zkouška účinnosti na kočkách :

Provedla se vakcinace a revakcinace 6 koček pokusným vzorkem vakcíny a za 90 dni čelenž prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (Ixodes ricinus) genomospeciemi borrelií Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, včetně infekce 3 koček nevakcinovaných, kontrolních.

Vakcinace byla provedena dávkou 1 ml vakcíny subkutánně (s. c.) a za 3 týdny byla shodným způsobem provedena revakcinace. Před vakcinací a před revakcinací byl proveden odběr krve. Další odběry krve byly provedeny za 1 měsíc pro revakcinací. Za 3 měsíce po revakcinací byla provedena čelenž prostřednictvím klíšťat obecných (Ixodes ricinus) z přírodního sběru, která byla přirozeně infikována všemi třemi nejpatogenějšími genomospecies - Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii. Stupeň infekce klíšťat byl ověřen před zahájením čelenžního experimentu.

Po infekci byla všechna pokusná zvířata (kočky vakcinované i kočky nevakcinované- kontrolní) denně klinicky hodnocena a byl zaznamenáván jejich zdravotní stav, včetně měření tělesné teploty. Po infekci byly provedeny probatorní odběry krve ode všech pokusných zvířat 14. den, 28. den, 42. den a 60. den. Krev byla odebrána i v den čelenže, těsně před infekcí prostřednictvím klíšťat 7., 28. a 60. den po čelenži byly provedeny biopsie kůže v místě přisátí klíšťat s cílem reizolace borrelií z těchto vzorků. 60 den po čelenži byla všechna pokusná zvířata utracena a byla provedena patologicko - anatomická pitva s odběrem vzorků ze svalu, kloubní synovie, mízní uzliny, kůže a ledviny, s cílem reizolace borrelií z těchto predilekčních míst.

Dosažené výsledky jsou názorně presentovány v přehledných tabulkách Č. 1, 2, 3 a 4. Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že vakcina proti borelióze připravená z výrobních kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii exprimujícich povrchové proteiny OspA a OspC je pro kočky neškodná a vyvolává u nich protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím

		♦ • ·	« ·
	• ·	•
	• ♦ · ♦ ·	•
	•	•
• ·	*	·« 9	• ·

infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nejpatogenějšími genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imunity případně i vůči dalším známým genomospecies Borrelií.

Tabulka č. 1- Schéma čelenžního pokusu - kočky

Kočka č.

Vakcinace

Revakci nace

Čelenž

Odběry biologického materiálu po čelenži/ dny

Poznámka

7

14

28

35

42

49

56

60

IV

+

+

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

2V

+

+

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

3V

+

+

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

4V

+

+

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

5V

+

4-

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

6V

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

7KO

-

-

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

8KO

-

-

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

9KO

-

-

+

B

K

BK

K

-

BKP

Klinika- denně

Vysvětlivky:

V- vakcinace B-biopsie kůže

K.O- bez vakcinace (kontrola) K- odběr krve +- proveden úkon P-patologicko-anatomická pitva

- - neproveden úkon

Tabulka č. 2 - Klinické hodnocení po čelenži

Kočka č.	Klinické změny po čelenži- dny	Poznámka
7	14	21	28	35	42	49	56	60
IV	-	-	-	-			-	-	-	Klinika- sledována denně
2V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
3V	-		-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
4V	-		-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
5V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
6V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
7KO	*	-	-	-	-	-	+	+	+	Klinika- sledována denně
8KO		-	-	-		-	-	+		Klinika- sledována denně
9KO	-	-	-	-	-	-	-	-	4-	Klinika- sledována denně

*4 ···♦

Vysvětlivky:

+ - klinické příznaky

- - bez klinických příznaků

Tabulka č. 3- Nález borrelií v bioptátech kůže po čelenži

Kočka č.	Termín odběru bioptátů kůže- dny	Poznámka
7	28	60
IV
2V
3V
4V
5V
6V
7KO	+
8KO	+
9KO	+	+

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt - - negativní záchyt

Tabulka č. 4 - Nález borrelií v orgánech

Kočka Č.	Predilekční orgány (60 den- pitva).	Poznámka
sval	kůže	mízní uzlina	kloubní synovie	ledvina
IV	-		-		-	PA- neg.
2V	-		-		-	PA- neg.
3V	-		-		-	PA- neg.
4V	-		-			PA- neg.
5V	-		-			PA- neg.
6V	-		-			PA- neg.
7KO	-		+	+		PA- poz.
8KO	+		+	+		PA- poz.
9KO	+		+	+		PA- poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- - negativní záchyt

PA- patologicko-anatomická pitva ·»

b) zkouška účinnosti na psech :

Provedla se vakcinace a revakcinace 6 psů pokusným vzorkem vakcíny a za 90 dní čelenž prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (Ixodes ricinus) genomospeciemi borrelií, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, včetně infekce 3 psů nevakcinovaných, kontrolních, Vakcinace, revakcinace, odběry krve, klinické hodnocení, probatorní odběry a další úkony byly prováděny shodně jako u zkoušky na kočkách.

Dosažené výsledky jsou názorně presentovány v přehledných tabulkách č. 5, 6, 7 a 8. Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že vakcína proti borelióze připravená z výrobních kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii exprimujícich povrchové proteiny OspA a OspC je pro psy neškodná a vyvolává u nich protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nejpatogenějšími genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imunity případně i vůči dalším známým genomospecies Borrelií.

Tabulka č. 5- Schéma čelenžního pokusu - psi

Pes č.

Vakcinace

Revak cinace

Čelenž

Odběry biologického materiá u po čelenži/ dny

7

14

28

35

42

49

56

60

IV

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

2V

+

Η™

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

3V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

4V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

5V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

6V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

7KO

•

-

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

8KO

-

-

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

9KO

-

-

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

Vysvětlivky:

V- vakcinace B-biopsie kůže

KO- bez vakcinace (kontrola) K-odběr krve +- proveden úkon P-patologicko-anatomická pitva

- - neproveden úkon

• to	to	« toto ····
· to	• to	• ·	« to
• to to	to	to	• to to
• *to·· *	•	•	• · toto
	to	•	«toto
• toto *	···	««·	«« to

Tabulka č. 6 - Klinické hodnocení po čelenži

Pes č.	Klinické změny po čelenži- dny	Poznámka
7	14	21	28	35	42	49	56	60
IV	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
2V										Klinika- sledována denně - sledována denně
3V	-	-		-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
4V	-	-		-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
5V	-			-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
6V	-	-		-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
7KO	-	-		-	-	-	-	+	4-	Klinika- sledována denně
8KO	-	-		-	-	-	-	+	+	Klinika- sledována denně
9KO	-	-		-	-	-	-	+	+	Klinika- sledována denně

Vysvětlivky:

+ - klinické příznaky

- - bez klinických příznaků

Tabulka č. 7- Nález borrelií v bioptátech kůže po čelenži

Pes Č.	Termín odběru bioptátů kůže- dny	Poznámka
7	28	60
IV		-
2V		-
3V		-
4V		-
5V		-
6V		-
7KO	+	-
8KO	+	+
9KO	+	+

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- - negativní záchyt • « *·

Tabulka č. 8 - Nález borrelií v orgánech

Pes č.	Predilekční orgány (60 den- pitva).	Poznámka
sval	kůže	mízní uzlina	kloubní synovie	ledvina
IV	-		-	-		PA- neg.
2V	-		-			PA- neg.
3V	-		-			PA- neg.
4V	-		-			PA- neg.
5V	-		-			PA- neg.
6V	-		-			PA- neg.
7KO	+		+			PA- poz.
8K.0	+		+	+		PA- poz.
9K.0	+		+	+		PA- poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- - negativní záchyt

PA- patologicko-anatomická pitva

c) zkouška účinnosti na koních :

Provedla se vakcinace a revakcinace 6 koní pokusným vzorkem vakcíny a za 90 dní čelenž prostřednictvím přirozeně infikovaných klíšťat obecných (Ixodes ricinus) genomospeciemi borrelií, a to Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, včetně infekce 3 koní nevakcinovaných, kontrolních.

Vakcinace, revakcinace, odběry krve, klinické hodnocení, probatorní odběry a další úkony byly prováděny shodně jako u zkoušky na kočkách nebo na psech.

Dosažené výsledky jsou názorně presentovány v přehledných tabulkách 9, 10, 11 a 12. Z dosažených výsledků jednoznačně vyplývá, že vakcína proti borelióze připravená z výrobních kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii exprimujících povrchové proteiny OspA a OspC je pro koně neškodná a vyvolává u nich protektivní imunitu vůči přirozené infekci prostřednictvím infikovaných klíšťat obecných všemi třemi nejpatogenějšími genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii a z důvodu principu křížové imunity případně i vůči dalším známým genomospecies Borrelií.

*· ·*·» • 4 «14 1

Tabulka č. 9- Schéma čelenžního pokusu - koně

Kůň č.

Vakcinace

Revakci nace

Č ele nž

Odběry biologie

cého materiá

u po čelenži/ dny

Poznámka

7

14

28

35

42

49

56

60

IV

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

klinika - denně

2V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

3V

Η-

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

4V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

5V

+

+

+

B

K

BK

K

BKP

Klinika- denně

6V

+

+

+

B

K

BK

-

K

BKP

Klinika- denně

7KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

BKP

Klinika- denně

8KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

BKP

Klinika- denně

9KO

-

-

+

B

K

BK

-

K

BKP

Klinika- denně

Vysvětlivky:

V- vakcinace

KO - bez vakcinace (kontrola) B- biopsie kůže +- proveden úkon K- odběr krve

- - neproveden úkon P- patologicko-anatomická pitva

Tabulka č. 10 - Klinické hodnocení po čelenži

Kůň č.	Klinické změny po čelenži- dny	Poznámka
7	14	21	28	35	42	49	56	60
IV	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
2V										Klinika- sledována denně - sledována denně
3V	-	-		-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
4V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
5V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
6V	-	-	-	-	-	-	-	-	-	Klinika- sledována denně
7KO	-	-	-	-	-	-	-	-	+	Klinika- sledována denně
8KO	-	-	-	-	-	-	-	4-	+	Klinika- sledována denně
9KO	-	-	-	-	-		-	-	4-	Klinika- sledována denně

Vysvětlivky:

+ - klinické příznaky

- - bez klinických příznaků * ««**

Tabulka č. 11 - Nález borrelií v bioptátech kůže po čelenži

Kůň č.	Termín odběru bioptátů kůže- dny	Poznámka
7	28	60
IV	-
2V	-
3V	-
4V	-
5V	-
6V	-
7K.0	+
8KO	+
9KO	+

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt - - negativní záchyt

Tabulka č. 12 - nález borrelií v orgánech

Kočka č.	Predilekční orgány (60 den- pitva	Poznámka
sval	kůže	mízní uzlina	kloubní synovie	ledvina
IV						PA- neg.
2V						PA- neg.
3V						PA- neg,
4V						PA- neg.
5V						PA- neg.
6V				-		PA- neg.
7KO			+	+		PA- poz.
8KO			+	+		PA- poz.
9KO	+		+	+		PA- poz.

Vysvětlivky:

+ - pozitivní záchyt

- - negativní záchyt

PA- patologicko-anatomická pitva

Popsané příklady přípravy vakcíny nejsou jedinými možnými provedeními podle vynálezu, ale bez vlivu na jeho podstatu mohou být celobuněčné bakteriny nebo bakteriální lyzáty nebo purifikáty s obsahem imunogenních protektivních proteinů aplikovány v pufrovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či • * · · · · * · * · ♦ · ·» • · · · ·φ ·····♦ * « · · ·· • · · * · • ·· · ··· · ·· · olejovým imunitním adjuvans, popřípadě s imunitními komplexy (ISCOM), liposómy a dalšími přírodními či syntetickými imunitními adjuvanty.

Průmyslová využitelnost

Univerzální vakcínu k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy je možno použít ve veterinární i humánní medicíně a je možno ji úspěšně aplikovat vnitrosvalově (intramuskulárně), podkožně (subkutánně), vnitrokožně (intradermálně) nebo bezjehelně (transkutánně).

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Universální vakcína k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití, vytvořená na bázi celobuněčných bakterinů nebo bakteriálních lyzátů nebo purifikátů alespoň jedné nebo více genomospecies borrelií, vyznačující se tím, že každá z genomospecies borrelií, vybraných přednostně ze skupiny Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garinii, obsahuje minimálně jeden imunogenní protektivní protein vnější membrány, buď OspA nebo OspC, nebo současně oba imunogenní protektivní proteiny OspA a OspC, popřípadně obsahuje i další imunogenní protektivní proteiny vnější membrány.
2. 2. Univerzální vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že vakcína obsahuje všechny tři nejpatogenější genomospecies Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii a Borrelia garrinii, z nichž každý obsahuje současně oba imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC.
3. 3. Univerzální vakcína podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že imunogenní protektivní proteiny vnější membrány OspA a OspC jsou ve vakcíně obsaženy s výhodou v poměru 1:1.
4. 4. Univerzální vakcína podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že je vytvořena v lyofilizované či tekuté formě nebo je aplikována v purfovaném fyziologickém roztoku nebo s minerálním či olejovým imunitním adjuvans, případně dalšími imunomodulátory.
5. 5. Univerzální vakcína podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že její pH se pohybuje v rozmezí hodnot 4-9.
6. 6. Způsob výroby universální vakcíny k léčbě a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití podle nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že každý z výrobních kmenů borrelií se kultivuje, kontroluje, inaktivuje a testuje až do stavu smísení samostatně, přičemž při kultivaci kmenů za účelem exprese antigenu OspA probíhá pomnožování a produkce kultury přednostně při teplotě 26 - 35°C s dobou 6 - 18 dnů u každého kroku a při kultivaci kmenů za účelem exprese antigenu OspC probíhá pomnožování a produkce kultury přednostně při teplotě 36 - 38°C s dobou 6-18 dnů u každého kroku.