PL223175B1

PL223175B1 - Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie

Info

Publication number: PL223175B1
Application number: PL401324A
Authority: PL
Inventors: Anna Urbanowicz; Marek Figlerowicz
Original assignee: Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2012-10-22
Publication date: 2016-10-31
Also published as: WO2014065679A1; WO2014065679A4; US20150093408A1; EP2908852B1; US9562080B2; EP2908852A1; PL401324A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy zastosowania rekombinowanych białek TROSPA oraz TROSPA-Salp15 pochodzących z kleszcza pospolitego (/. ricinus) jako składnika szczepionki dla zwierząt przeciwko boreliozie. Przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka TROSPA znacznie zmniejszą szansę zakażenia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaływania białka kleszczowego TROSPA z białkiem OspA krętka Borrelia burgdorferi sensu lato. Oddziaływanie to jest kluczowe dla procesu zasiedlenia kleszcza przez krętki. Przeciwciała skierowane na białko TROSPA-Salp15 będą chroniły kręgowca przed zakażeniem na etapie wnikania krętków Borrelia poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na ich powierzchni dzięki oddziaływaniu kleszczowego białka Salp15 i krętkowego białka OspC. Szczepionka bazująca na kleszczowych białkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 może być stosowana samodzielnie bądź w połączeniu z rekombinowanymi białkami OspA i OspC krętków Borrelia burgdorferi sensu lato.

Kleszcze to pasożyty zewnętrzne, żywiące się krwią kręgowców. W ciągu swego cyklu życiowego kleszcze żerują na wielu żywicielach. Stwarza to możliwość przenoszenia pomiędzy tymi żywicielami różnych drobnoustrojów chorobotwórczych. Przykładem takiego drobnoustroju jest wywołujący boreliozę krętek Borrelia burgdorferi.

Krętek ten zasiedla kleszcze w stadium larwy lub nimfy, podczas ich żerowania na zakażonym kręgowcu. Grupa zwierząt, będących kompetentnymi gospodarzami krętka (tzn. zwierzęta u których infekcja utrzymuje się na stałe), stanowi naturalny rezerwuar B. burgdorferi. Do grupy tej należą gryzonie i inne drobne ssaki oraz ptaki (1,2, 3, 4, 5), natomiast ludzie i zwierzęta hodowlane są przypadkowymi gospodarzami dla B. burgdorferi.

W ciągu ostatniej dekady w Polsce i w Europie nastąpił gwałtowny wzrost zapadalności na boreliozę. Dane Zakładu Epidemiologii Państwowego Zakładu Higieny, dotyczące ludności polskiej są alarmujące, pokazują bowiem dziesięciokrotny wzrost liczby przypadków tej choroby na przestrzeni ostatniej dekady, z około 2 do 20 przypadków na 100 000 osób (Figura 1 - wykres 1). Podobne zjawisko można zaobserwować w pozostałych krajach europejskich.

Borelioza nie jest zwykle chorobą śmiertelną, jednak jakość życia cierpiących na nią osób jest znacznie niższa niż ta odczuwana przez chorych na cukrzycę, choroby serca, depresje, chorobę zwyrodnieniową stawów lub chorobę reumatoidalną. Borelioza wywiera także wyniszczający wpływ na zwierzęta domowe i hodowlane, powodując straty w rolnictwie. W związku ze wzrastającą liczbą zakażeń krętkami B. burgdorferi rodzi się konieczność zapobiegania dalszemu rozprzestrzenianiu się tego groźnego patogenu. Obecnie najczęściej stosowaną drogą prewencji boreliozy na świecie, a jedyną w Polsce, jest edukacja osób narażonych na kontakty z kleszczami. Polega ona głównie na zachęcaniu do stosowania odzieży ochronnej czy preparatów odstraszających kleszcze oraz instruowaniu, jak postępować w wypadku ukąszenia. Jednakże według danych z USA, skuteczność stosowania odzieży ochronnej wynosi 40% a skuteczność preparatów odstraszających kleszcze wynosi 20% (6, 7, 8). Szczepienia ochronne dla ludzi i zwierząt mogłyby stanowić skuteczną metodę prewencji boreliozy. W USA i w Europie podejmuje się próby stworzenia szczepionek ochronnych. Jedyną szczepionką, dopuszczoną do III fazy testów klinicznych i następnie zatwierdzoną przez FDA był preparat pod nazwą Lymerix, który został wprowadzony do obrotu w USA w 1998 roku (9, 10, 11). Aktywnym składnikiem tej szczepionki było rekombinowane białko powierzchniowe OspA B. burgdorferi sensu stricto. Przeciwciała skierowane na OspA neutralizują bakterie obecne w jelicie kleszcza, zapobiegając w ten sposób zakażeniu człowieka. Jednakże w 2002 roku szczepionka ta została wycofana z obiegu przez wytwórcę. Jako powody tej decyzji wymieniano mały popyt, wysoką cenę oraz niepożądane efekty uboczne typu reumatologicznego (arthralgia), które pojawiały się u nielicznych osób po zastosowaniu preparatu Lymerix. Ewentualne efekty uboczne wiązano z faktem, iż w białku OspA występuje antygen homologiczny do ludzkiego antygenu LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen 1) co w przypadku immunizacji białkiem OspA może prowadzić do reakcji autoimmunologicznej organizmu (12, 13, 14). Szczepionka bazująca na OspA podawana w trzech dawkach wykazywała stosunkowo wysoką skuteczność 79% w III fazie testów klinicznych (11). W USA nadal dostępne są szczepionki oparte o rekombinowane białko OspA przeznaczone dla zwierząt domowych (15).

PL 223 175 B1

Bardziej kompleksowe podejście do walki z boreliozą mogłoby polegać na ograniczeniu zakażeń B. burgdorferi wśród dzikich zwierząt, będących rezerwuarem krętka poprzez prowadzenie szczepień ochronnych. W jednej z grup badawczych w USA pracuje się nad szczepionką dla dzikich zwierząt opartą o białko OspA z wykorzystaniem wirusa Vaccinia, analogicznie jak ma to miejsce w przypadku szczepionek przeciwko wściekliźnie. Przygotowano preparat w formie karmy, zawierający nieszkodliwego zmodyfikowanego wirusa Vaccinia niosącego w swym DNA gen kodujący OspA. Wykazano, że u myszy które spożyły preparat, dochodziło do ekspresji genów wirusa oraz białka OspA. Obecność OspA w organizmie myszy prowadziła do powstawania przeciwciał anty-OspA na takim poziomie, jaki w warunkach laboratoryjnych dawał skuteczną ochronę przed zakażeniem B. burgdorferi (16).

Prewencję boreliozy w Europie komplikuje fakt, że szczepionki przeciwko B. burgdorferi produkowane w USA bazujące na jej białkach powierzchniowych, są w Europie nieskuteczne. Spowodowane jest to różnicami serologicznymi pomiędzy szczepami bakterii występującymi w różnych rejonach geograficznych świata. Wynikają one z faktu, że białka powierzchniowe B. burgdorferi kodowane są przez plazmidowy DNA, który wykazuje ogromną zmienność. Dlatego wciąż poszukuje się rozwiązań, które stanowiłyby alternatywę w stosunku do tworzenia szczepionek opartych o powierzchniowe białka krętka. W ostatnim czasie pojawiła się interesująca publikacja, w której opisano właściwości ochronne białka kleszczowego Salp15 (17). Białko Salp15 występuje w ślinie kleszcza. Oddziałuje ono z powierzchniowym białkiem OspC B. burgdorferi, tworząc na powierzchni bakterii ochronną otoczkę, która utrudnia rozpoznanie bakterii przez układ immunologiczny zakażanego kręgowca. Zwierzęta laboratoryjne immunizowane rekombinowanym białkiem Salp15 wykazywały znaczącą odporność na zakażenie B. burgdorferi. Pokazano także, że wzbogacenie białkiem Salp15 składu wcześniej opracowanych szczepionek bazujących na rekombinowanych białkach powierzchniowych OspA i OspC znacząco poprawiało skuteczność ochrony przed zakażeniem krętkiem.

Prace badawcze mające na celu uzyskanie szczepionki chroniącej ludzi przed zakażeniem B. burgdorferi nadal są intensywnie prowadzone.

W zgłoszeniu patentowym US 2007020286 przedstawiono rekombinowane chimeryczne białko będące kombinacją antygenów OspA i OspC B. burgdorferi jako potencjalną szczepionkę przeciwko boreliozie. W rozwiązaniu przedstawiono nowe chimeryczne kwasy nukleinowe, kodujące chimeryczne białko OspC Borrelia lub jego fragment antygenowy i chimeryczne białko OspA lub jego fragment antygenowy. Przedstawiono także białka chimeryczne kodowane przez sekwencje kwasów nukleinowych. Białka chimeryczne mogą być wykorzystane jako immunogeny szczepionki przeciwko boreliozie, jak i do reagentów immunodiagnostycznych.

W zgłoszeniu patentowym US 2012020973 opisano rekombinowane chimeryczne białko będące kombinacją antygenów białek OspA pochodzących z różnych gatunków Borrelia burgdorferi sensu lato jako potencjalną szczepionkę przeciwko boreliozie. Wynalazek dotyczy cząsteczek chimerycznego białka OspA mających zastosowanie w nowych szczepionkach przeciwko chorobie z Lyme. Bardziej szczegółowo, chimeryczne białka OspA zawierają część proksymalną z jednego serotypu OspA, wraz z częścią dystalną z innego serotypu OspA, przy jednoczesnym zachowaniu właściwości antygenowych obydwu białek wyjściowych. Chimeryczne cząsteczki OspA są dostarczane pojedynczo lub w połączeniu, tak by zapewnić ochronę przeciwko różnorodnym szczepom Borrelia. W rozwiązaniu przedstawiono także sposoby dostarczania chimerycznych cząsteczek OspA do obiektu, który ma być chroniony i leczony w przypadku choroby z Lyme lub boreliozy.

W zgłoszeniu patentowym WO 2008063240 przedstawiono przygotowanie szczepionki z wykorzystaniem bakterii Lactobacillus, produkującej białko OspA Borrelia burgdorferi. Wynalazek dotyczy bakterii Lactobacillus, w której 1) ekspresjonowany jest rekombinowany polipeptyd zawierający sekwencję sygnałową lipoproteiny z białka OspA Borrelia burgdorferi lub aktywny wariant sekwencji liderowej, przyłączony do jednego lub więcej wskazanych polipeptydów heterologicznych i/lub 2) zawiera podlegający ekspresji polinukleotyd kodujący rekombinowany polipeptyd zawierający sygnał lipoprot einy z białka OspA Borrelia burgdorferi lub jego aktywny wariant, przyłączony do jednego lub więcej wskazanych polipeptydów heterologicznych. W jednym z rozwiązań według wynalazku heterologiczny polipeptyd pochodzi z Yersinia pestis (pałeczki dżumy), czynnika etiologicznego dżumy. W innym rozwiązaniu heterologiczny polipeptyd pochodzi z Borrelia burgdorferi, czynnika etiologicznego choroby z Lyme. Opisano także kompozycje immunogenne, takie jak szczepionki z żywymi bakteriami zawierającymi bakterie; sposoby pozyskiwania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw polipeptydom i zestawy zawierające bakterie.

PL 223 175 B1

W opisie patentowym CZ301244 przedstawiono przygotowanie preparatu szczepionkowego na bazie lizatu z Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii i Borrelia garinii. W wynalazku przedstawiono szczepionkę ogólnego zastosowania do leczenia i profilaktyki boreliozy dla ludzi i zwierząt, opartej na: bakterynach utworzonych na bazie całych komórek, lizatów bakteryjnych lub oczyszczonych preparatów z trzech najbardziej patogennych gatunków genomowych Borrelia wybranych spośród: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii i Borrelia garinii, zawierającą co najmniej jedno immunogenne białko ochronne z błony zewnętrznej, zarówno OspA lub OspC, lub jednocześnie immunogenne białka ochronne z błony zewnętrznej OspA i OspC lub inne immunogenne białka ochronne z błony zewnętrznej. Ujawniono także sposób wytwarzania opisanej powyżej szczepionki.

W opisie patentowym US 2003138868 opisano szereg czynników pochodzących z Borrelia burgdorferi sensu lato, które mają potencjalne znaczenie dla prewencji boreliozy. Rozwiązanie dotyczy czynnika do diagnostyki i/lub leczenia choroby z Lyme, który zawiera antygeny dehydrogenazy aldehydu-3-fosfoglicerynowego (GAPDH), oligopeptydu permeazy, oligopeptydu ABC transportera peryplazmatycznego BP(oppA-2)(Bb), homologu transferazy glikozylowej IgtD, białka szoku cieplnego 90, fragmentu VLSE, domniemanej kasety (U76406) v1s rec. cV1s6 Borrelia burgdorferi, białka flageliny Borrelia garinii, (AE001578) hipotetycznego białka konserwatywnego cp32-6 Borrelia burgdorferi, prekursora p66 białka związanego z błoną Borrelia burgdoferii, BP (oppA-4)(Bc) periplazmatycznego transportera oligopeptydu ABC, aldozy fruktozo-bifosforanu (fba) Borrelia burgdorferi, białka DNAK, białka szoku cieplnego 70 Borrelia burgdorferi, orfE Borrelia burgdorferi, prekursora białka powierzchniowego B Borrelia burgdorferi, dehydrogenazy L-mleczanu (ldh), genu P83/100 Borrelia burgdorferi, enolazy 2-fosfoglicerynianu Borrelia burgdorferi, białka flageliny Borrelia garinii, hipotetycznego białka BBE28 Borrelia burgdorferi, homologu (rpoA) polimerazy DNA zależnej od RNA, białka P66 (fragment), flageliny (fragment), polimerazy DNA zależnej od RNA, integralnego białka błon zewnętrznych p66, homologu kinazy pirogronianowej (pyk), kinazy fosfoglicerynianu (pgk) i/lub BBU28760 NID, i/lub ich fragmenty i/lub sekwencje kwasu nukleinowego kodujące wskazane antygeny i/lub wskazane fragmenty.

Opis patentowy PL 169 804 opisuje sposób wytwarzania szczepionki przeciw boreliozie na podstawie przeciwciał swoistych dla białka OspA lub OspB Borrelia burgdorferi. Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw chorobie z Lyme, zawierająca jedno lub więcej przeciwciał monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) lub dla antygenu 34 kD(Osp B) Borrelia burgdorferi, sposób otrzymywania szczepionki przez fuzję limfocytów lub komórek śledziony z utworzeniem hybrydomy, która produkuje przeciwciało monoklonalne. Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało monoklonalne LA2 przeciw OspA, LA26.1 przeciw OspA, LA 25.1 przeciw OspB, LA 27.1 przeciw OspB, patogenny szczep B. burgdorferi ZS7, DSM 5527, antygen dający reakcję immunologiczną z przeciwciałem przeciw OspA, przeciw OspB, rekombinant DNA i rekombinowany wektor, sposób otrzymywania antygenów, szczepionka do czynnego uodpornienia przeciw chorobie Lyme, sposób otrzymywania szczepionki przeciw chorobie Lyme za pośrednictwem uodpornionych zwierząt oraz sposób izolacji i rekultywacji patogennych komórek B. burgdorferi od immunodefektywnych zwierząt doświadczalnych.

Pomimo, że wyłoniono wiele białek - kandydatów do roli szczepionki przeciwko boreliozie, żadne inne białko krętka B. burgdorferi, poza wymienionym OspA, nie zostało do tej pory dopuszczone do III fazy badań klinicznych (15). Różnice serologiczne pomiędzy szczepami bakterii występującymi w różnych rejonach geograficznych świata, wynikające z faktu, że białka powierzchniowe B. burgdorferi kodowane są przez plazmidowy DNA, który wykazuje ogromną zmienność powodują że wciąż poszukuje się rozwiązań, które stanowiłyby alternatywę w stosunku do tworzenia szczepionek opartych o powierzchniowe białka krętka.

Białko TROSPA występuje na powierzchni przewodu pokarmowego kleszcza i uczestniczy w procesie zasiedlania roztocza przez krętki B. burgdorferi s. I. Ze strony krętka w oddziaływaniu tym bierze udział białko powierzchniowe OspA (18). Białko Salp15 występuje w ślinie kleszcza. Oddziałuje ono z powierzchniowym białkiem OspC B. burgdorferi s. I., tworząc na powierzchni bakterii ochronną otoczkę, która utrudnia rozpoznanie bakterii przez układ immunologiczny zakażanego kręgowca (19). Zarówno białko TROSPA jak Salp15, choć pochodzą od kleszcza, odgrywają kluczowe role w dwóch różnych punktach cyklu życiowego B. burgdorferi. Przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białko Salp15 będą chroniły zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakt erii dzięki oddziaływaniu Salp15 - OspC. Zwierzęta laboratoryjne immunizowane rekombinowanym białkiem Salp15 wykazywały znaczącą odporność na zakażenie B. burgdorferi. Pokazano także, że

PL 223 175 B1 wzbogacenie białkiem Salp15 składu wcześniej opracowanych szczepionek bazujących na reko mbinowanych białkach powierzchniowych OspA i OspC znacząco poprawiało skuteczność ochrony przed zakażeniem krętkiem (20).

Celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki zawierającej w swym składzie białka TROSPA i TROSPA-Salp15, które posiadają właściwości immunogenne. Przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka TROSPA znacznie zmniejszą szansę zakażenia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaływania TROSPA - OspA. W ten sposób ograniczony zostanie naturalny rezerwuar bakterii, czego konsekwencją będzie zmniejszona zapadalność na boreliozę wśród ludzi i zwierząt. Ponadto, przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca, skierowane na antygen Salp15 obecny w białku fuzyjnym TROSPA-Salp15 będą chroniły zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dzięki oddziaływaniu Salp15 - OspC. Szczepionka bazująca na kleszczowych białkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 może być stosowana samodzielnie bądź w połączeniu z białkami OspA i OspC krętków Borrelia burgdorferi sensu lato.

Nieoczekiwanie okazało się, że możliwe stało się uzyskanie szczepionki zawierającej w swym składzie rekombinowane białka TROSPA i TROSPA-Salp15, które posiadają właściwości immunogenne.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw boreliozie bazująca na kleszczowych białkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15, charakteryzująca się tym, że zawiera rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ. ID nr 3 lub rekombinowane białko TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ. ID nr 4.

Korzystnie, gdy szczepionka zawiera białko będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA określonego sekwencją SEQ. nr 1 lub rekombinowane białko będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 określonego sekwencją SEQ. nr 2.

Korzystnie, gdy rekombinowane białko TROSPA i/lub TROSPA-Salp15 posiada właściwości immunogenne.

Korzystnie, gdy szczepionka jest stosowana samodzielnie lub w połączeniu z białkami OspA i OspC krętków Borrelia burgdorferi sensu lato.

Korzystnie, gdy szczepionka zawiera preparat białek rekombinowanych TROSPA z Ixodes ricinus oraz OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato.

Korzystnie, gdy chroni zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków.

Korzystnie, gdy przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca oddziałują z białkiem TROSPA w jelicie Ixodes ricinus.

Korzystnie, gdy przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka Salp15 oddziałują z ochronną otoczką utworzonej na powierzchni bakterii przez oddziaływanie Salp15 - OspC.

Korzystnie, gdy przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka TROSPA blokują lub utrudniają oddziaływania TROSPA - OspA, zaś przeciwciała skierowane na antygen Salp15 obecny w białku fuzyjnym TROSPA-Salp15 chronią zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków niszcząc ochronną otoczkę utworzoną na powierzchni bakterii poprzez oddziaływanie Salp15 - OspC.

Korzystnie, gdy przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka TROSPA zmniejszają szanse zakażenia nowych kleszczy Ixodes ricinus.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt genetyczny TROSPA, charakteryzujący się tym, że stanowi sekwencję SEQ. ID nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt genetyczny TROSPA-Salp15, charakteryzujący się tym, że stanowi sekwencję SEQ. ID nr 2.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowane białko TROSPA będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA, charakteryzujące się tym, że posiada sekwencję SEQ. ID nr 3.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowane białko TROSPA-Salp15 będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15, charakteryzujące się tym, że posiada sekwencję SEQ. nr 4.

Korzystnie, gdy rekombinowane białko posiada właściwości immunogenne.

Korzystnie, gdy rekombinowane białka opisane powyżej oddziałują z białkiem OspA z Borrelia burgdorferi sensu lato.

PL 223 175 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA określonego powyżej charakteryzujący się tym, że amplifikuje się gen kodujący białko TROSPA I. ricinus metodą PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus ze starterami o sekwencji SEQ. ID nr 5 i SEQ. ID nr 6, a następnie poddaje się go składaniu (splicingowi) w komórkach roślinnych, po czym amplifikuje się uzyskany mRNA TROSPA metodą odwrotnej transkrypcji i PCR za pomocą starterów o sekwencji SEQ. ID nr 7 i SEQ. ID nr 8, a następnie klonuje się w wektorze pET200/D-TOPO.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 określonego powyżej charakteryzujący się tym, że syntezuje się DNA na podstawie konstruktu genetycznego określonego SEQ. ID nr 1 oraz sekwencji kodującej białko Salp15 Iric-1 (gb EU128526.1), zoptymalizowanej w kierunku ekspresji w układzie bakteryjnym, a następnie uzyskaną sekwencję DNA TROSPA-Salp15 określoną SEQ. ID nr 2 amplifikuje metodą PCR ze starterami FUS11Af określonym SEQ. ID nr 9 i FUS11Ar określonym SEQ. ID nr 10, a następnie klonuje się w wektorze pET200/D-TOPO.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepionki określonej powyżej, charakteryzujący się tym, że prowadzi się ekspresję konstruktu genetycznego określonego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rekombinowanych białek określonych powyżej, charakteryzujący się tym, że prowadzi się ekspresję konstruktu genetycznego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanych białek TROSPA oraz TROSPA-Salp15 określonych powyżej pochodzących z kleszcza pospolitego (/. ricinus) do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie do immunizacji zwierząt.

Korzystnie, gdy preparat zawierający oczyszczone rekombinowane białko TROSPA o sekwencji SEQ. nr 3 podawany jest dożylnie.

Korzystnie, gdy preparat zawierający oczyszczone rekombinowane białko o sekwencji SEQ. nr 3 lub SEQ. nr 4 podawany jest doustnie.

Korzystnie, gdy preparat zawierający oczyszczone rekombinowane białka o sekwencji SEQ. nr 3 oraz rekombinowane białka OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato podawany jest doustnie.

Figura 1 przedstawia wykres obrazujący zapadalność na boreliozę wg danych Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku rozwiązanie przedstawiono na rysunku, gdzie: figura 2 przedstawia wybrane etapy tworzenia i ekspresji konstruktu genetycznego kodującego rekombinowane białko TROSPA. A - rozdział elektroforetyczny DNA: gen TROSPA zamplifikowany metodą PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus (g), cDNA TROSPA zamplifikowany z RNA wyizolowanego z N. benthamiana agroinfiltrowanego konstruktem zawierającym gen TROSPA (c), marker wielkości (w). B - rozdział elektroforetyczny oczyszczonego rekombinowanego białka TROSPA otrzymanego w E. coli (T), marker wielkości (w). C - porównanie sekwencji nukleotydowej GenBank EU034646.1. Ixodes ricinus TROSPA mRNA complete cds (gb|EU034646.1|) z konstruktem genetycznym kodującym rekombinowane białko TROSPA (TROSPA). Konserwatywne nukleotydy oznaczono „*”, niekonserwatywne nukleotydy oznaczono kursywą;

figura 3 porównanie sekwencji nukleotydowej konstruktu genetycznego kodującego rekombinowane białko TROSPA-Salp15 oraz odpowiadających jej sekwencji Ixodes ricinus Salp15 Iric-1 mRNA, complete cds GenBank: EU 128526.1 i Ixodes ricinus TROSPA mRNA, complete cds GenBank: EU034646.1. oznaczono nukleotydy identyczne pomiędzy sekwencjami kodującymi rekombinowane białko TROSPA-Salp15 oraz Ixodes ricinus TROSPA mRNA, complete cds GenBank: EU034646.1, „^Λ” oznaczono nukleotydy identyczne pomiędzy sekwencjami kodującymi rekombinowane białko TROSPA-Salp15 oraz Ixodes ricinus Salp15 Iric-1 mRNA, complete cds GenBank: EU 128526.1;

figura 4 przedstawia rozdział elektroforetyczny oczyszczonego rekombinowanego białka TROSPA-Salp15 otrzymanego w E. coli;

figura 5 przedstawia sekwencje aminokwasowe rekombinowanych białek TROSPA (podkreślono, wytłuszczono) oraz TROSPA-Salp15 (fragment kodujący białkową etykietę pochodzącą z pET200/D-TOPO wytłuszczono i oznaczono małymi literami, fragment kodujący sekwencję TROSPA podkreślono i wytłuszczono, fragment kodujący Salp15 podkreślono i oznaczono kursywą, fragment łączący oznaczono kursywą, miejsce rozpoznawane przez proteazę TEV podkreślono);

figura 6 ukazuje wykres przedstawiający wpływ stężenia rekombinowanego białka OspA na wydajność tworzenia kompleksu pomiędzy rekombinowanymi białkami TROSPA Ixodes ricinus i OspA

PL 223 175 B1 z Borrelia burgdorferi; fig. 6A - tworzenie kompleksu TROSPA - OspA. Oddziaływanie badano na mikropłytce ELISA opłaszczonej rekombinowanym białkiem TROSPA i inkubowanej z seryjnymi rozcieńczeniami rekombinowanego białka OspA oraz białka kontrolnego (OspC z B. burgdorferi). Detekcji związanego białka dokonywano przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał pierwszorzędowych anty-Borrelia oraz drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z alkaliczną fosfatazą, mierząc absorbancję produktu reakcji za pomocą fotometru Microplate Rider Model 550 firmy BIORAD; fig. 6B - porównanie wydajności tworzenia kompleksu pomiędzy rekombinowanymi białkami TROSPA i OspA w obecności surowicy królika immunizowanego rekombinowanym białkiem TROSPA. Jako kontrolę stosowano surowicę królika nieimmunizowanego. Oddziaływanie badano na mikropłytce ELISA opłaszczonej rekombinowanym białkiem TROSPA. Płytkę inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami surowicy immunizowanego i nieimmunizowanego królika, a następnie z rekombinowanym białkiem OspA o stężeniu 80 μg/ml. Detekcji związanego rekombinowanego białka OspA dokonywano przy użyciu przeciwciał anty-Borrelia sprzężonych z FITC, mierząc fluorescencję przy pomocy aparatu VICTOR X4 2030 Multilabel Reader firmy PerkinElmer.

figura 7 przedstawia analizę specyficzności przeciwciał anty-TROSPA powstałych w surowicy królików po dożylnej immunizacji preparatem rekombinowanego białka TROSPA. Zwierzętom podawano preparat rekombinowanego białka TROSPA w dawce 100 μg, w czterech punktach czasowych: 0, 14, 28 i 56 dni. Surowice pobierano przed immunizacją (fig. 7A), a następnie po 38 (fig. 7B), 66 (fig. 7C) i 87 (fig. 7D) dniach po immunizacji. Obecność przeciwciał w surowicy immunizowanych zwierząt stwierdzono metodą Western-blot z zastosowaniem przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą. T1 - oczyszczone białko TROSPA, T2 - lizat z bakterii produkujących białko TROSPA, K - lizat z bakterii produkujących inne białko (rekombinowane białko OspC z B. burgdorferi), M - marker masy;

figura 8 przedstawia poziom IgG w surowicy szczurów immunizowanych rekombinowanymi białkami TROSPA, TROSPA-Salp15 lub TROSPA, OspA i OspC; fig. 8A - mikropłytkę opłaszczoną rekombinowanym białkiem TROSPA inkubowano z rosnącymi rozcieńczeniami surowicy zwierząt immunizowanych przez dożołądkowe podanie preparatu rekombinowanego białka TROSPA lub TROSPA-Salp15; fig. 8B - mikropłytkę opłaszczoną rekombinowanym białkiem Salp15 inkubowano z rosnącymi rozcieńczeniami surowicy zwierząt immunizowanych przez dożołądkowe podanie preparatu białka TROSPA-Salp15; fig. 8C - mikropłytkę opłaszczoną jednym z rekombinowanych białek TROSPA, OspA lub OspC inkubowano z rosnącymi rozcieńczeniami surowicy zwierząt immunizowanych przez dożołądkowe podanie preparatu białka TROSPA OspA i OspC. Następnie dokonywano detekcji poziomu związanych IgG szczurzych przy pomocy komercyjnie dostępnych przeciwciał antyszczurzych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą. Na wykresie zaznaczono maksymalne rozcieńczenia surowic immunizowanych zwierząt, przy których obserwowano statystyczn i e istotną różnicę w stosunku do grupy kontrolnej zwierząt immunizowanych samym adiuwantem.

W celu lepszego zrozumienia rozwiązania przedstawiono przykładowe rozwiązania według w ynalazku.

P r z y k ł a d 1

Produkcja rekombinowanych białek kleszczowych TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 3 i TROSPA-Salp15 określonego sekwencją SEQ ID nr 4 oraz rekombinowanych białek OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato; badanie oddziaływania pomiędzy rekombinowanym białkiem kleszczowym TROSPA i rekombinowanym białkiem OspA Borrelia burgdorferi.

Gen TROSPA zamplifikowano metodą PCR na podstawie genomowego DNA wyizolowanego z I. ricinus zebranych na terenie kraju z zastosowaniem zestawu do izolacji DNA QIAamp DNA Mini Kit firmy QIAGEN. Do amplifikacji metodą PCR używano starterów TROSPAF i TROSPAR (Tabela 1) określonych sekwencjami SEQ ID nr 5 i SEQ ID nr 6, zaprojektowanych na podstawie sekwencji dostępnej w GenBank pod numerem EU034646.1. Ponieważ gen TROSPA zawiera jeden intron, należało poddać go składaniu. W tym celu gen TROSPA sklonowano w wektorze binarnym pICH10990 firmy Icon Genetics i uzyskany konstrukt zastosowano do agroinfiltracji N. benthamiana wg zaleceń producenta. Następnie zamplifikowano cDNA trospa i sklonowano w wektorze ekspresyjnym typu pET z zastosowaniem starterów TROTOPF i TRORPST określonych sekwencjami SEQ ID nr 7 i SEQ ID nr 8. Do klonowania i późniejszej ekspresji rekombinowanego białka TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 3 używano systemu Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot® (suplement 1), stosując się do zaleceń producenta. Wskutek klonowania do wektora pET200/D-TOPO utworzony został konstrukt genetyczny TROSPA określony sekwencją SEQ ID nr 1 pokazany na fig u8

PL 223 175 B1 rze 2C, kodujący rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3. Figura 2A i 2B pokazuje wybrane etapy tworzenia i ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA kodującego rekombinowane białko TROSPA. Produkowane w w/w systemie bakteryjnym rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3 zaopatrzone zostało w znacznik HIS dodany do jego końca N (suplement 1), co umożliwiło oczyszczanie białka przy użyciu chromatografii powinowactwa za pomocą kolumny niklowej. Elucji rekombinowanego białka TROSPA dokonywano przy 200 mM stężeniu imidazolu. Obraz rozdziału elektroforetycznego oczyszczonego w ten sposób białka TROSPA przedstawiono na figurze 2B. Preparat dializowano w buforze 1x PBS. Figura 5 pokazuje sekwencję aminokwasową rekombinowanego białka TROSPA.

Sekwencję DNA TROSPA-Salp15 uzyskano poprzez syntezę DNA na podstawie sklonowanej sekwencji kodującej rekombinowane białko TROSPA oraz sekwencji kodującej białko Salp15 Iric-1, opublikowanej w GenBank pod numerem EU128526.1, która została zoptymalizowana w kierunku ekspresji w układzie bakteryjnym. Sekwencję nukleotydową konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 kodującego rekombinowane białko TROSPA-Salp15 oraz porównanie odpowiednich jego fragmentów sekwencjami EU034646.1 i EU 128526.1 przedstawiono na figurze 3. Sekwencję DNA TROSPA-Salp15 amplifikowano metodą PCR ze starterami FUS11Af i FUS11Ar określonymi sekwencjami SEQ ID nr 9 i SEQ ID nr 10. Następnie klonowano i przeprowadzono ekspresję konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 określonego sekwencją SEQ nr 2 z użyciem systemu Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot® (suplement 1), stosując się do zaleceń producenta, uzyskując rekombinowane białko TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ ID nr 4. Białko to nie wiązało się do kolumny niklowej, pomimo obecności znacznika HIS obecnego na jego końcu N (suplement 1). Oczyszczony preparat rekombinowanego białka TROSPA-Salp15 uzyskano za pomocą chromatografii jonowymiennej z zastosowaniem złoża DEAE-celulozowego. Elucji rekombinowanego białka TROSPA-Salp15 dokonywano przy 200 mM stężeniu NaCl. Obraz rozdziału elektroforetycznego oczyszczonego w ten sposób rekombinowanego białka TROSPA-Salp15 przedstawiono na figurze 4. Preparat białka dializowano w buforze 1x PBS.

Sekwencje aminokwasowe rekombinowanych białek TROSPA i TROSPA-Salp15 pokazano na figurze 5. Poprawność sekwencji aminokwasowej rekombinowanych białek TROSPA i TROSPA-Salp15 produkowanych w E. coli potwierdzono metodą spektrometrii mas (spektrometr MALDI-TOF).

Sekwencje kodujące białka OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato (dokładnie: B. garinii, B. afzelii i B. burgdorferi sensu stricto) zamplifikowano metodą PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus zebranych na terenie kraju z zastosowaniem zestawu do izolacji DNA QIAamp DNA Mini Kit firmy QIAGEN. Do amplifikacji metodą PCR używano par starterów OspAf/OspAr i OspCf/OspCr (Tabela 1), zaprojektowanych na podstawie sekwencji dostępnych w GenBank: B. garinii osp A gene GenBank: X85441.1, Borrelia garinii gene for outer surface protein C, complete cds GenBank: D49498.1. Zamplifikowany DNA kodujący białka OspA i OspC (B. garinii, B. afzelii i B. burgdorferi sensu stricto) sklonowano i poddano ekspresji w systemie Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot®, stosując się do zaleceń producenta. W ten sposób otrzymano rekombinowane białka OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato, zaopatrzone w białkową etykietę na końcu N (suplement 1), co umożliwiło ich oczyszczanie przy użyciu chromatografii powinowactwa za pomocą kolumny niklowej. Elucji rekombinowanych białek OspA i OspC dokonywano przy 200 mM stężeniu imidazolu. Preparaty dializowano w buforze 1x PBS. Sekwencje aminokwasowe rekombinowanych białek OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato potwierdzono metodą spektrometrii mas (spektrometr MALDI-TOF).

Ponadto określono, iż rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ nr ID 3 i rekombinowane białko OspA zachowały naturalną zdolność do tworzenia kompleksu TROSPA OspA. Fakt ten został potwierdzony poprzez analizę oddziaływań metodą ELISA. Mikropłytkę ELISA opłaszczano rekombinowanym białkiem TROSPA poprzez inkubację roztworu białka o stężeniu 5 ąg/ml w buforze PBST. Następnie płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubację w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu, płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami rekombinowanego białka OspA oraz kontroli. Detekcji związanego białka dokonywano przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał pierwszorzędowych anty-Borrelia oraz drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z alkaliczną fosfatazą. Następnie porównano siłę oddziaływania pomiędzy rekombinowanymi białkami TROSPA i OspA w obecności surowicy królika immunizowanego rekombinowanym białkiem TROSPA, jako kontrolę stosowano surowicę królika nieimmunizowanego. W tym celu mikropłytkę ELISA opłaszczano rekombinoPL 223 175 B1 wanym białkiem TROSPA poprzez inkubację roztworu białka o stężeniu 5 μg/ml w buforze PBSTT. Następnie płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubację w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami białka surowicy królika immunizowanego białkiem TROSPA lub surowicy królika nieimmunizowanego. Następnie płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z rekombinowanym białkiem OspA o stężeniu około 80 μg/ml. Detekcji związanego rekombinowanego białka OspA dokonywano przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał anty-Borrelia sprzężonych z FITC. Wyniki eksperymentu, przedstawione na figurze 6B, potwierdziły zdolność do tworzenia kompleksu pomiędzy rekombinowanym białkiem TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 3 oraz rekombinowanym białkiem OspA. Potwierdzono także zdolność zaburzania tego oddziaływania przez przeciwciała anty-TROSPA (figura 6A).

T a b e l a 1. Sekwencje nukleotydowe starterów do reakcji PCR.

Nazwa startera	Sekwencja nukleotydowa
TROSPAF	TTTGGTCTCAAGGTATGGCGGCTATGGAGGC
TROSPAR	ATATTTAAATTCAACTTCCAGCGGCGC
TROTOPF	CACCATGGCGGCTATGGAGGC
TRORPST	ATCTGCAGTCAACTTCCAGCGGCGCTCTGGTCGG
FUS11Af	CACCATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGG
FUS11Ar	ATGGATCCTTAACAACCCGGAATATGACCA
OspAf	CACCATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGGT
OspAr	CCTTATTTTAAAGCGTTTTTA
OspCf	CACCATGAAAAAGAATACATTAAGTGC
OspCr	TTAAGGTTTTTTTTGGACTTTCTGC

P r z y k ł a d 2.

Immunizacja zwierząt

Przeprowadzono szereg badań, które wykazały, że rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3 i rekombinowane białko TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ ID nr 4 posiadają właściwości immunogenne i mogą zostać wykorzystane jako składnik szczepionki. Przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane przeciwko rekombinowanemu białku TROSPA znacznie zmniejszą szansę zakażenia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaływania TROSPA - OspA. W ten sposób ograniczony zostanie naturalny rezerwuar bakterii, czego konsekwencją będzie zmniejszona zapadalność na boreliozę wśród ludzi i zwierząt. Dodatkowo, przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca, skierowane na antygen Salp15 obecny w rekombinowanym białku TROSPA-Salp15 będą chroniły zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dzięki oddziaływaniu Salp15 - OspC, podobnie jak opisano powyżej (18). Szczepionka bazująca na rekombinowanych białkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 określonych sekwencjami SEQ ID nr 3 i 4 może być stosowana samodzielnie bądź w połączeniu z rekombinowanymi białkami OspA i OspC krętków Borrelia burgdorferi sensu lato.

A) Immunizacja zwierząt poprzez dożylne podanie preparatu zawierającego oczyszczone rekombinowane białko TROSPA z Ixodes ricinus określone sekwencją SEQ ID nr 3.

Prowadzono ekspresję konstruktu genetycznego TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 1 w układzie bakteryjnym z zastosowaniem systemu do ekspresji białka Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot® wg zaleceń producenta. Następnie oczyszczano rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3 przy użyciu chrom atografii powinowactwa za pomocą kolumny niklowej. Elucji rekombinowanego białka TROSPA dokonywano przy 200 mM w stężeniu imidazolu. Obraz rozdziału elektroforetycznego oczyszczonego w ten sposób rekombinowanego białka TROSPA przedstawiono na figurze 2B. Preparat dializowano w buforze 1x PBS. Preparat o stężeniu 800 μg/ml został użyty do immunizacji królików poprzez iniekcję dożylną. Zwierzętom wstrzykiwano preparat w dawce 100 μg, w czterech punktach czasowych: 0, 14,

PL 223 175 B1 i 56 dni. Surowice pobierano przed immunizacją, a następnie po 38, 66 i 87 dniach od pierwszej immunizacji. Obecność przeciwciał w surowicy immunizowanych zwierząt stwierdzono metodą Western-blot (Figura 7). W tym celu rozdzielano elektroforetycznie preparaty rekombinowanego białka TROSPA i przenoszono je na membranę PVDF. Membranę blokowano 1% roztworem BSA, a następnie inkubowano z surowicą króliczą rozcieńczoną 10 000 razy w buforze TBSTT. Detekcji związanych przeciwciał anty-rekombinowane białko TROSPA dokonywano za pomocą komercyjnie dostępnych przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą.

B) immunizacja zwierząt poprzez doustne podanie preparatu zawierającego oczyszczone rekombinowane białko TROSPA z Ixodes ricinus określone sekwencją SEQ ID nr 3 lub oczyszczone rekombinowane białko TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ ID nr 4.

Prowadzono ekspresje konstruktów genetycznych TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 1 i TROSPA-Salp15 określonego sekwencją SEQ ID nr 2 w układzie bakteryjnym z zastosowaniem systemu do ekspresji białka Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot® wg zaleceń producenta. Rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3 oczyszczano poprzez chromatografię powinowactwa na kolumnie niklowej. Elucji białka dokonywano przy 200 mM stężeniu imidazolu. Oczyszczony preparat rekombinowanego białka TROSPA-Salp15 określonego sekwencją SEQ ID nr 4 uzyskano za pomocą chromatografii jonowymiennej z zastosowaniem złoża DEAE-celulozowego. Elucji białka dokonywano przy 200 mM stężeniu NaCl. Obraz rozdziału elektroforetycznego oczyszczonego rekombinowanego białka TROSPA przedstawiono na figurze 1B. Obraz rozdziału elektroforetycznego oczyszczonego rekombinowanego białka TROSPA-Salp15 przedstawiono na figurze 4. Preparaty białek dializowano w buforze 1x PBS. Preparat o stężeniu 1 mg/ml został użyty do immunizacji oralnej szczurów. Zwierzętom podawano sondą dożołądkową preparat zawierający 200 μg jednego z białek lub preparat zawierający 200 μg jednego z białek oraz adiuwant (GEM, 21). Preparaty podawano w trzech punktach czasowych: 0, 14, 28 dni. Surowice pobierano po 42 dniach od pierwszej immunizacji. Obecność przeciwciał w surowicy immunizowanych zwierząt stwierdzono metodą ELISA. Mikropłytkę ELISA opłaszczano rekombinowanym białkiem TROSPA lub rekombinowanym białkiem Salp15 poprzez inkubację roztworu białka o stężeniu 5 μg/ml w buforze PBSTT. Następnie płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubację w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu, płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami surowic immunizowanych szczurów lub surowic szczurów immunizowanych samym adiuwantem. Detekcji związanych przeciwciał dokonywano przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał drugorzędowych anty-szczurzych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą, mierząc absorbancję produktu reakcji za pomocą fotometru Microplate Rider Model 550 firmy BIORAD. Poziom przeciwciał oznaczano metodą odwrotności maksymalnego rozcieńczenia (Figura 8A i B, 22).

C) immunizacja zwierząt poprzez doustne podanie preparatu oczyszczonych białek TROSPA z Ixodes ricinus określonego sekwencją SEQ ID nr 3, OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato.

Prowadzono ekspresje konstruktów genetycznych TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 1, OspA i OspC w układzie bakteryjnym z zastosowaniem systemu do ekspresji białka Champion™ pET200 Directional TOPO® Expression Kit with BL21 Star™ (DE3) One Shot® wg zaleceń producenta. Oczyszczano rekombinowane białka TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3, OspA i OspC przy użyciu chromatografii powinowactwa na kolumnie niklowej. Elucji białek dokonywano przy 200 mM stężeniu imidazolu. Preparaty białek dializowano w buforze 1x PBS. Preparat o stężeniu 1 mg/ml został użyty do immunizacji oralnej szczurów. Zwierzętom podawano sondą dożołądkową preparat zawierający po 200 μg każdego z białek lub preparat zawierający po 200 μg każdego z białek oraz adiuwant (GEM, 21). Preparaty podawano w trzech punktach czasowych: 0, 14, 28 dni. Surowice pobierano po 42 dniach od pierwszej immunizacji. Obecność przeciwciał w surowicy immunizowanych zwierząt stwierdzono metodą ELISA. Mikropłytkę ELISA opłaszczano rekombinowanym białkiem TROSPA, OspA lub OspC poprzez inkubację roztworu białka o stężeniu 5 μg/ml w buforze PBSTT. Następnie płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubację w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu, płytkę płukano pięciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieńczeniami surowic immunizowanych szczurów lub surowic szczurów immunizowanych samym adiuwantem. Detekcji związanych przeciwciał dokonywano przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał drugorzędowych anty-szczurzych sprzężonych z alkaliczną fosfatazą mierząc absorbancję produktu reakcji za pomocą fotometru Microplate Rider Model 550 firmy BIORAD. Poziom przeciwciał oznaczano metodą odwrotności maksymalnego rozcieńczenia (Figura 8C, 22).

PL 223 175 B1

Opisane powyżej testy dowiodły, że otrzymane rekombinowane białka TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3 oraz TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ ID nr 4 po wprowadzeniu do organizmu zwierzęcego drogą dożylną bądź pokarmową są zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Białka te zachowują również natywną strukturę, co udowadnia opisana powyżej analiza zdolności oddziaływania rekombinowanego białka TROSPA określonego sekwencją SEQ ID nr 3 z białkiem OspA. Przeciwciała powstające w organizmie zwierzęcia po immunizacji rekombinowanym białkiem TROSPA określonym sekwencją SEQ ID nr 3 zaburzają oddziaływanie między białkami TROSPA-OspA. Ponadto, przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca, skierowane na antygen Salp15 obecny w rekombinowanym białku TROSPA-Salp15 określonym sekwencją SEQ ID nr 4 będą chroniły zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dzięki oddziaływaniu Salp15 - OspC. Obserwacje te wskazują, że rekombinowane białka TROSPA określone sekwencją SEQ ID nr 3 oraz rekombinowane białka TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ ID nr 4 mogą służyć jako składniki szczepionki przeciwko boreliozie, chroniące zwierzęta przed zakażeniem krętkiem Borrelia burgdorferi oraz minimalizujące prawdopodobieństwo zakażania nowych kleszczy przez krętki Borrelia burgdorferi, a w konsekwencji zmniejszający pulę krętków krążących w środowisku.

Lista sekwencji

SEQ. nr 1:

Sekwencja konstruktu genetycznego TROSPA

ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGA

CAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCATCCCTTCAC

CATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGGTGGATATGGAGGCTATGGCGGCGGCTA

TGGCGGCGGCTATGGTGGCTACGGACACGGTGGCTTCCTCGGCGGCTTCGGCT

ATGGCCACGGAGGCTACGGTGGCTATGGACACGGCGTCGCTGTCGCTGCCGCT

CCAGTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCGGCCA

CGGTGGCTACGGACACGGTGGTTTCCTCGGCGGATACGGAGGTTACGGACACG

GAGGATTCGGCGGCTACGGTCTCGGCCACGGCGTCGCTGTCCATGCTGCCCCA

GTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCTACGGAGG

CTTCGGTTACAGCGGATATGGCGGACACGGCTACGGACACTAAGCAATTCATC

TCAAAGGGAAACCAACACTTCTTCGCCGCTTCTTATTTATGCGCTTGGGCCGAC

CAGAGCGCCGCTGGAAGTTGA

PL 223 175 B1

SEQ. nr 2:

Sekwencja konstruktu genetycznego TROSPA-Salpl5

ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGA

CAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCATCCCTTCAC

CATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGGTGGATATGGAGGCTATGGCGGCGGCTA

TGGCGGCGGCTATGGTGGCTACGGACACGGTGGCTTCCTCGGCGGCTTCGGCT

ATGGCCACGGAGGCTACGGTGGCTATGGACACGGCGTCGCTGTCGCTGCCGCT

CCAGTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCGGCTA

CGGTGGCTACGGACACGGTGGTTTCCTCGGCGGATACGGAGGTTACGGACACG

GAGGATTCGGCGGCTACGGTCTCGGCCACGGCGTCGCTGTCCATGCTGCCCCA

GTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCTACGGAGG

CTTCGGTTACGGCGGATATGGCGGACACGGCTACGGACACTAAGCAATTCATC

TCAAAGGGAAACCAACACTTCTTCGCCGCTTCTTATTTATGCGCTTGGGCCGAC

CAGAGCGCCGCTGGAAGTGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAA

GCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAAACCTG

TATTTTCAGGGAATGGAAAGCTTTGTTGCCATGAAAGTTGTTTGCATTACCGTG

CTGTTTGTTATTGTTGCCGTTAATGAAAGCGCAACCAGCGAAGCACGTACCAG

CAGCGCAGCAAAAGAAACCAAAAAAAAAAATGTGACCCTGCATTTTCCGAGC

TATATCCGTAATCCGCAGAAACTGGCACTGGAACTGCTGGAAATTTGCAAAAA

TAATAAAAGCCGCAATAGCCTGCCGAGCACCAATTATAGCGCCATTAATGATA

AATATGTGGATTTTAAAAATTGCACCTTTCTGTGCAAACATGCCGAAGATCGTA

ATGTTACCCTGGATCTGCCTCCGAATACCCTGTGTGGTCCGAATGGTGAAACCT

GTGCAGAAAAAAGCAAATGCGTTGGTCATATTCCGGGTTGTTAA

SEQ. nr 3:

Sekwencja rekombinowanego białka TROSPA - produktu ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMAAMEAMAVDMEAM

AAAMAAAMVATDTVASSAASAMATEATVAMDTASLSLPLQLSPRSLPQSSLSAT

AATVATDTVVSSADTEVTDTEDSAATVSATASLSMLPQLSPRSLPQSSLSATATEA

SVTADMADTATDTKQFISKGNQHFFAASYLCAWADQSAAGS

PL 223 175 B1

SEQ. nr 4:

Sekwencja rekombinowanego białka TROSPA-Salp 15 - produktu ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp 15

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMAAMEAMAVDMEAM

AAAMAAAMVATDTVASSAASAMATEATVAMDTASLSLPLQLSPRSLPQSSLSAT

AATVATDTVVSSADTEVTDTEDSAATVSATASLSMLPQLSPRSLPQSSLSATATEA

SVTADMADTATDTKQFISKGNQHFFAASYLCAWADQSAAGSEAAAKEAAAKEA

AAKEAAAKEAAAKENLYFQGMESFVAMKVVCITVLFVIVAVNESATSEARTSSAA

KETKKKNVTLHFPSYIRNPQKLALELLEICKNNKSRNSLPSTNYSAINDKYVDFKN

CTFLCKHAEDRNVTLDLPPNTLCGPNGETCAEKSKCVGHIPGC

SEQ. nr 5:

Oligonukleotyd DNA TROSPAF

TTTGGTCTCAAGGTATGGCGGCTATGGAGGC

SEQ. nr 6:

Oligonukleotyd DNA TROSPAR

ATATTTAAATTCAACTTCCAGCGGCGC

SEQ. nr 7:

Oligonukleotyd DNA TROTOPF

CACCATGGCGGCTATGGAGGC

SEQ. nr 8:

Oligonukleotyd DNA TRORPST

ATCTGCAGTCAACTTCCAGCGGCGCTCTGGTCGG

SEQ. nr 9:

Oligonukleotyd DNA FUS1 lAf

CACCATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGG

SEQ. nr 10:

Oligonukleotyd DNA FUS1 lAr

ATGGATCCTTAACAACCCGGAATATGACCA

PL 223 175 B1

L i t e r a t u r a

1. Chmielewska-Badera J. 1998. Seroepidemioligic study of Lyme boreliosis in the Lublin Region. Ann. Agric. Environ. Med. 5: 183-186.

2. Cisak E., Chmielewska-Badora J., Zwoliński J., Wójcik-Fatla A., Polak J., Dutkiewicz J. 2005. Risk of tick-borne bacterial dieseases among workers of Roztocze National Park (South-Eastern Poland). Ann. Agric. Environ. Med. 12: 127-132.

3. Derdakova M., Lencakova. 2005. Association of genetic variability within the Borrelia burgdorferi sensu lato with the ecology, epidemiology of Lyme borreliosis in Europe. Ann. Agric. Environ. Med. 12: 165-172.

4. Śpiewak R. 2004. Zawodowe choroby skóry u rolników indywidualnych. Post Dermatol. Alergol. 21:278-285.

5. Wodecka B., Skotarczak B. 2000. Genetyczna zmienność Borrelia burgdorferi s. 1. U kleszczy Ixodes ricinus zebranych w północnozachodniej Polsce. Wiadomości parazytologiczne. 46: 475-485.

6. Vazquez M., Muehlenbein C., Cartter M., Hayes E. B., Ertel S., Shapiro E. D. 2008. Effectiveness of personal protective measures to prevent Lyme disease. Emerg. Infect. Dis. 14: 210-216.

7. Connally N. P., Durante A. J., Yousey-Hindes K. M., Meek J. I., Nelson R. S., Heimer R. 2009. Peridomestic Lyme disease prevention: results of a population-based case-control study. Am. J. Prev. Med. 37: 201 -216.

8. Corapi K. M., White M. I., Phillips C. B., Daltroy L. H., Shadick N. A., Liang M.H. 2007. Strategies for primary and secondary prevention of Lyme disease. Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3: 20-25.

9. Steere A. C. 2008. Lyme disease vaccines. In Plotkin S. A., Orenstein W. A., Offit P. A. eds. Vaccines. Philadelphia: Saunders-Elsevier, 1253-66.

10. Sigal L. H., Zahradnik J. M., Lavin P., et al. 1998. A vaccine consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lyme disease. Recombinant Outer-Surface Protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium. N. Engl. J. Med. 339: 216-22.

11. Abbott A. 2006. Lyme disease: uphill struggle. Nature 439, 524-525.

12. Croke C. L., Munson E. L., Lovrich S.D., et al. 2000. Occurrence of severe destructive Lyme arthritis in hamsters vaccinated with outer surface protein A and challenged with Borrelia burgdorferi. Infect. lmmun. 68: 658-63.

13. Nardelli D. T., Munson E. L., Callister S. M., Schell R. F. 2009. Human Lyme disease vaccines: past and future concerns. Future Microbiol. 4: 457-69.

14. Drouin E. E, Glickstein L., Kwok W. W., Nepom G. T., Steere A. C. 2008. Human homologues of a Borrelia T cell epitope associated with antibioticrefractory Lyme arthritis. Mol. Immunol. 45: 180-9.

15. Earnhart, C. G., Buckles, E. L., and Marconi, R. T. 2007. Development of an OspC-based tetravalent, recombinant, chimeric vaccinogen that elicits bactericidal antibody against diverse Lyme disease spirochete strains. Vaccine 25: 466-480.

16. Bhattacharyaa D., Bensacib M., Lukerc K. E., et. al. 2011. Development of a baited oral vaccine for use in reservoir-targeted strategies against Lyme disease. Vaccine, 29: 7818-7825.

17. Dai J., Wang P., Adusumilli S., et. al., 2009. Antibodies against a Tick Protein, Salp15, Protect Mice from the Lyme Disease Agent. Cell Host & Microbe, 6: 482-492.

18. Pal U., Li X., Wang T., Montgomery R. R. et al. 2004. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell, 119: 457-468.

19. Hovius J. W., Ramamoorthi N., Van't Veer C. et al. 2007. Identification of Salp15 homologues in Ixodes ricinus ticks. Vector Borne Zoonotic Dis. 7: 296-303.

20. Dai J., Wang P., Adusumilli S., et. al., 2009. Antibodies against a Tick Protein, Salp15, Protect Mice from the Lyme Disease Agent. Cell Host & Microbe, 6: 482-492.

21. Saluja V., Visser M. R., van Roosmalen M. L. et al. 2010. Gastro-intestinal delivery of influenza subunit vaccine formulation adjuvanted with Gram-positive enhancer matrix (GEM) particles. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76: 470-474.

22. Frey A., Di Canzio J. i Zurakowski D. 1998. A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Meth. 221:35-41.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka przeciw boreliozie bazująca na kleszczowych białkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15, znamienna tym, że zawiera rekombinowane białko TROSPA określone sekwencją SEQ. nr 3 lub rekombinowane białko TROSPA-Salp15 określone sekwencją SEQ. ID nr 4.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera białko będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA określonego sekwencją SEQ. nr 1 lub rekombinowane białko będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 określonego sekwencją SEQ. nr 2.
3. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że rekombinowane białko TROSPA i/lub TROSPA-Salp15 posiada właściwości immunogenne.
4. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że jest stosowana samodzielnie lub w połączeniu z białkami OspA i OspC krętków Borrelia burgdorferi sensu lato.
5. Szczepionka według zastrz. 1 albo 4, znamienna tym, że szczepionka zawiera preparat białek rekombinowanych TROSPA z Ixodes ricinus oraz OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato.
6. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że chroni zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków.
7. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca oddziałują z białkiem TROSPA w jelicie Ixodes ricinus.
8. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka Salp15 oddziałują z ochronną otoczką utworzonej na powierzchni bakterii przez oddziaływanie Salp15 - OspC.
9. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka TROSPA blokują lub utrudniają oddziaływania TROSPA OspA, zaś przeciwciała skierowane na antygen Salp15 obecny w białku fuzyjnym TROSPA-Salp15 chronią zwierzę przed zakażeniem na etapie wnikania krętków niszcząc ochronną otoczkę utworzoną na powierzchni bakterii poprzez oddziaływanie Salp15 - OspC.
10. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciała obecne we krwi immunizowanego kręgowca skierowane na białka TROSPA zmniejszają szanse zakażenia nowych kleszczy Ixodes ricinus.
11. Konstrukt genetyczny TROSPA, znamienny tym, że stanowi sekwencję SEQ. ID nr 1.
12. Konstrukt genetyczny TROSPA-Salp15, znamienny tym, że stanowi sekwencję SEQ. ID nr 2.
13. Rekombinowane białko TROSPA będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA, znamienne tym, że posiada sekwencję SEQ. ID nr 3.
14. Rekombinowane białko TROSPA-Salp15 będące produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15, znamienne tym, że posiada sekwencję SEQ. nr 4.
15. Rekombinowane białko według zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, że posiada właściwości immunogenne.
16. Rekombinowane białko według zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, że oddziałuje z białkiem OspA z Borrelia burgdorferi sensu lato.
17. Sposób otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA określonego zastrzeżeniem 11, znamienny tym, że amplifikuje się gen kodujący białko TROSPA I. ricinus metodą PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus ze starterami o sekwencji SEQ. ID nr 5 i SEQ. ID nr 6, a następnie poddaje się go składaniu (splicingowi) w komórkach roślinnych, po czym amplifikuje się uzyskany mRNA TROSPA metodą odwrotnej transkrypcji i PCR za pomocą starterów o sekwencji SEQ. ID nr 7 i SEQ. ID nr 8, a następnie klonuje się w wektorze pET200/D-TOPO.
18. Sposób otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 określonego zastrzeżeniem 12, znamienny tym, że syntezuje się DNA na podstawie konstruktu genetycznego określonego SEQ. ID nr 1 oraz sekwencji kodującej białko Salp15 Iric-1 (gb EU128526.1), zoptymalizowanej w kierunku ekspresji w układzie bakteryjnym, a następnie uzyskaną sekwencję DNA TROSPA-Salp15 określoną SEQ. ID nr 2 amplifikuje metodą PCR ze starterami FUS11Af określonym SEQ. ID nr 9 i FUS11Ar określonym SEQ. ID nr 10, a następnie klonuje się w wektorze pET200/D-TOPO.
19. Sposób otrzymywania szczepionki określonej zastrzeżeniami 1 do 10, znamienny tym, że prowadzi się ekspresję konstruktu genetycznego określonego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli.
20. Sposób otrzymywania rekombinowanych białek określonych zastrzeżeniami 13 oraz 14, znamienny tym, że prowadzi się ekspresję konstruktu genetycznego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli.

PL 223 175 B1
21. Zastosowanie rekombinowanych białek TROSPA określonego w zastrzeżeniu 13 oraz TROSPA-Salp15 określonego w zastrzeżeniu 14 pochodzących z kleszcza pospolitego (I. ricinus) do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie do immunizacji zwierząt.
22. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym preparat zawierający oczyszczone rekombinowane białko TROSPA o sekwencji SEQ. nr 3 podawany jest dożylnie.
23. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym preparat zawierający oczyszczone rekombinowane białko o sekwencji SEQ. nr 3 lub SEQ. nr 4 podawany jest doustnie.
24. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym preparat zawierający oczyszczone rekombinowane białka o sekwencji SEQ. nr 3 oraz rekombinowane białka OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato podawany jest doustnie.