DE19960113A1

DE19960113A1 - Mittel und Verfahren zur Diagnose von Lyme Borreliose sowie Borreliose-Impfstoff

Info

Publication number: DE19960113A1
Application number: DE19960113A
Authority: DE
Inventors: Peter Jungblut; Aydan Dilgimen; Sascha Thies; Brigitte Wittmann
Original assignee: WITA PROTEOMICS AG
Current assignee: WITA PROTEOMICS AG
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2001-06-13
Also published as: WO2001042790A2; EP1238280A2; US20030138868A1; WO2001042790A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur Diagnose von Lyme Borreliose sowie einen Borreliose-Impfstoff. Mit GAPDH und Oligopeptid-Permease konnten zwei Antigene der Borreliose identifiziert werden, die durch hohe Spezifität und Sensivität gekennzeichnet sind.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur Diagnose von Lyme Borreliose sowie einen Borreliose- Impfstoff. Mit GAPDH und Oligopeptid-Permease konnten zwei Antigene der Borreliose identifiziert werden, die durch hohe Spezifität und Sensivität gekennzeichnet sind.

Eine der häufigsten von Zecken übertragenen Infektionskrankheiten des Menschen ist Lyme Borreliose (LM). Die Krankheit wird durch Spirochäten des Borrelia burgdorferi Komplexes hervorgerufen. Die Krankheit kommt in verschiedenen Manifestationen vor, so z. B. Erythema migrans (EM), Neuroborreliose, Akrodermatiits chronica atrophicans (ACA), Lymphadenosis cutis benigna (LCB), Lymphozytäre Meningoradikulitis (Bannwarth- Syndrom).

Die Species des Borrelia burgdorferi Komplexes (auch anders Borrelia burgdorferi sensu lato genannt) werden in drei Hauptgenospezies eingeteilt, B. burgdorferi. sensu stricto, B. garinii und B. afzelii.

Balmelli, T, und Piffaretti, J. C. (Int. J. Syst. Bacteriol. 1996, 46, 167-172) sowie Valsangiacomo, C. et al. (Int. Syst. Bacteriol. 1997, 47, 1-10) haben noch eine Untereinteilung in fünf Spezies vorgenommen.

Während B. burgdorferi sensu stricto hauptsächlich in Nordamerika vorkommt, ist in Europa B. garinii und in Asien B. afzelii am häufigsten vertreten. Seren von Lyme Borreliose-Patienten enthalten in der Regel nur Antikörper gegen eine der drei bekannten Spezies.

Mit dem immunogenen Protein OspA (outer-surface lipoproteine), einem für die Borreliose bekannten Testantigen, konnte in den USA eine entsprechende Vakzine bereitgestellt werden. Diese polyvalente Vakzine OspA schützt Mäuse gegen B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzelii. (Gern, L. Vaccine 1997, 15 1551-1557).

Da es aber signifikante Unterschiede von OspA in den verschiedenen Borreliaspezies gibt, inbesondere außerhalb Nordamerikas, ist es als Testantigen und zum Einsatz in diagnostischen Kits nur bedingt geeignet.

So ist nach wie vor für die in Europa und Asien hauptsächlich vorkommenden B. garinii und B. afzelii eine multiple Vakzine notwendig, die gegen die europäischen und asiatischen Borreliaspecies gerichtet ist. Eine Vakzine muss deshalb andere bzw. weitere Proteine und/oder Peptide enthalten, um einen breiten Schutz zu ermöglichen.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, weitere Antigene zur Diagnose von LM aufzufinden und einen entsprechenden Impfstoff bereitzustellen, der ein breites Anwendungsspektrum gestattet.

Überraschend wurden mit dem glykolytischen Enzym Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und dem Enzym Oligopeptid-Permease, einem Oligopeptid ABC- Transporter, zwei Antigene gefunden, die sowohl zum Nachweis von Borreliose im frühen als auch im späten Krankheitsstadium erfolgreich eingesetzt werden können. Beide Enzyme sind bekannt und deren Gene in Nature, 1997, 390, 580-586 beschrieben.

Die beiden Antigene sowie ihre Fragmente reagieren insbesondere spezifisch mit anti-B. garinii-Antikörpern und weisen keine Kreuzreaktivität mit anderen nicht Lyme Borreliose spezifischen Antikörpern auf. Sie besitzen eine hohe Sensitivität und Spezifität (ihre Signal-Frequenz liegt bei mehr als 50%). Diese beiden Proteine waren bisher nicht als immunrelevante Borreliose Antigene bekannt.

Mit der vorliegenden Erfindung kann LM, welche in Europa insbesondere durch den weit verbreiteten Stamm B. garnii, induziert wird, diagnostiziert und therapiert werden.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb diagnostische Mittel zum Nachweis von Lyme Borreliose, welche die Antigene Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) oder Oligopeptid-Permease oder deren Fragmente enthalten. In bevorzugter Weise reagieren diese Antigene spezifisch mit anti-B. garinii-Antikörpern.

Die Antigene können aus B. garnii isoliert und gereinigt werden oder nach an sich bekannten Techniken chemisch oder gentechnisch als rekombinante Proteine oder in Form ihrer Gene (DNA, cDNA) zur Verfügung gestellt werden.

Die Identifizierung der Antigene aus B. garnii erfolgte durch die Kombination der hochauflösenden zwei dimensionalen Elektrophorese mit der Matrix- unterstützten Laserdesorptions-Ionisationsmassenspek trometrie (MALDI-MS).

Die erfindungsgemäßen Antigene liegen in dem erfindungsgemäßen Mittel bevorzugt an einen festen Träger immobilisiert vor. Als feste Träger fungieren alle an sich bekannten festen Phasen, die in Form von Membranen, Teststreifen, Papier, Film, Filter, Platten oder Kugeln vorliegen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Lyme Borreliose, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Antigen GAPDH, das Antigen Oligopeptid Permease oder deren Fragmente mit einer biologischen Probe, die Borreliose-Antikörper enthält, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen- Antiköper-Komplexes gestatten, in Kontakt gebracht wird, und nach einer Inkubationzeit die Komplexbildung eines Antikörpers mit dem Antigen nachgewiesen wird.

Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt der Nachweis der Borreliose-Antikörper in einem Immunoassay, bevorzugt in einem Festphasenimmunoassay, unter direkter oder indirekter Kopplung eines Reaktionspartners mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz. Besonders bevorzugt kann der Nachweis in einem ELISA, einem RIA oder einem Fluoreszenzimmunoassay erfolgen. Die Durchführung dieser Nachweisverfahren ist dem Fachmann gut bekannt.

So wird z. B. in einem ELISA das Antigen, im vorliegenden Fall z. B. GAPDH oder Oligopeptid Permease, direkt oder indirekt an eine Trägersubstanz, wie beispielsweise Polystyrol, gebunden. Nach Inkubation mit den nachzuweisenden Antikörpern, z. B. aus dem Serum von Patienten, werden Antigen-gebundene Antikörper direkt oder indirekt mittels Enzym-gekoppelter Substanzen nachgewiesen. Diese Substanzen können Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden wie z. B. Avidin, das an eine Biotin-Markierung bindet, sein. Als Enzyme kommen beispielsweise die Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase, Urease oder Glucoseoxidase in Betracht. Durch Zugabe eines chromogenen Substrats können die gebundenen Enzyme und damit beispielsweise die gebundenen Antikörper quantifiziert werden.

Auch in einem Radio-Immunoassay ist das Antigen, z. B. GAPDH oder Oligopeptid Permease, direkt oder indirekt an eine Trägersubstanz, wie beispielsweise Polystyrol, gebunden. Nach Inkubation mit den nachzuweisenden Antikörpern, z. B. aus dem Serum von Patienten, werden Antigen-gebundene Antikörper mittels Substanzen nachgewiesen, die eine radioaktive Markierung, beispielsweise ¹²⁵I, tragen. Diese Substanzen können Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden wie z. B. Avidin, das an eine Biotin-Markierung bindet, sein. Die gebundene Radioaktivität kann mittels eines geeigneten Meßgeräts quantifiziert werden.

Nach dem gleichen Prinzip werden in einem Fluoreszenzimmunoassay die Antigen-gebundenen Antikörper mittels Substanzen nachgewiesen, die eine Fluoreszenz-Markierung, beispielsweise Fluorescein- Isothiocyanate (FITC) tragen. Diese Substanzen können Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden wie z. B. Avidin, das an eine Biotin-Markierung bindet, sein. Die gebundene Menge an Fluoreszenzfarbstoff wird dann mittels eines geeigneten Meßgeräts quantifiziert.

Als biologische Probe werden im Sinne der Erfindung tierische oder menschliche Flüssigkeiten wie z. B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Liquor und Synovialflüssigkeit verstanden. Der Borreliose-Nachweis beim Menschen wird vorzugsweise durch Nachweis von Borreliose-Antikörpern im Serum durchgeführt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Borreliose- Impfstoff, der die Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (GAPDH), die Oligopeptid Permease oder deren Fragmente bzw. die für diese Proteine oder Fragmente kodierende DNA enthält.

Claims

1. Mittel zur Diagnose von Lyme Borreliose enthaltend die Antigene Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (GAPDH), Oligopeptid-Permease oder deren Fragmente.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene spezifisch mit anti-B. garinii- Antikörpern reagieren.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene an einem festen Träger immobilisiert sind.

4. Verfahren zum Nachweis von Lyme Borreliose, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einer biologischen Probe, die Borreliose- Antikörper enthält, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes gestatten, in Kontakt gebracht wird, und die Komplexbildung nachgewiesen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Körperflüssigkeit ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis in einem ELISA durchgeführt wird.

7. Borreliose-Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er das Protein Glyceraldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (GAPDH), ein Fragment davon oder eine für das Protein oder Fragment kodierende DNA enthält.

8. Borreliose-Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er das Protein Oligopeptid-Permease, ein Fragment davon oder eine für das Protein oder Fragment kodierende DNA enthält.