NL1006680C2 - Werkwijze voor het detecteren van de aanwezigheid van een immunologisch reactief molecuul in een monster. - Google Patents

Description

WERKWIJZE VOOR HET DETECTEREN VAN DE AANWEZIGHEID VAN EEN IMMUNOLOGISCH REACTIEF MOLECUUL IN EEN MONSTER

De uitvinding betreft een werkwijze voor het detecteren van de aanwezigheid van een immunologisch reactief molecuul in een monster, omvattende het in contact brengen van het monster met een standaardoplos-5 sing van een of meer immunologisch reactieve referen-tiemoleculen in een incubatiemengsel teneinde de vorming van immuuncomplexen tussen het immunologisch reactieve referentiemolecuul en het te detecteren immunologisch reactieve molecuul mogelijk te maken, en het vaststellen 10 of immuuncomplexen gevormd zijn door het vergelijken van een of meer van de fysische parameters molecuulgewicht, lading en vorm van de componenten van het incubatiemengsel met dezelfde fysische parameters van de componenten van de standaardoplossing.

15 Een dergelijke werkwijze is bijvoorbeeld van belang om bij een proefobject, zoals een patiënt of een te onderzoeken dier, de aanwezigheid van een molecuul, dat een immunologische reactie kan opwekken, vast te stellen. Dergelijke moleculen zijn bijvoorbeeld haptenen, 20 macromoleculen, pathogenen of immuunreactie opwekkende delen hiervan. Dergelijke moleculen bevinden zich in het lichaam wanneer sprake is van een infectie. Echter, ook kan het gewenst zijn om andere moleculen in andere soorten monsters aan te tonen. Gedacht kan bijvoorbeeld 25 worden aan het aantonen van de aanwezigheid van een bepaald eiwit in een plant, of het aantonen van moleculen in bodem- of watermonsters.

Door artsen of veeartsen wordt een infectie gewoonlijk vastgesteld aan de hand van klinische sympto-30 men en/of anamnese. Daarnaast vormt laboratoriumonderzoek naar de aanwezigheid van ziekteverwekkers of de reactie van het proefobject op de ziekteverwekker hierbij een belangrijk onderdeel. Beproefde methoden daarvoor zijn bijvoorbeeld kweektechnieken, serologische bepalingen of 35 DNA-onderzoek.

Een aantal ziektes heeft echter het nadeel dat de ziekteverwekkers slechts in lage concentraties aanwe- 1006680 2 zig zijn of niet geïsoleerd kunnen worden uit het proefobject. Herpesvirussen zijn bijvoorbeeld vaak niet aantoonbaar in de bloedbaan omdat ze aanwezig zijn in het zenuwstelsel en daardoor slecht toegankelijk zonder zware 5 schade te berokkenen aan het proefobject. Het aantonen van dergelijke ziektes gaat dientengevolge vaak op een indirecte wijze door het aantonen van specifieke antistoffen in lichaamsvloeistoffen. Dergelijke antistoffen zijn gericht tegen de veroorzaker van de ziekte. De 10 aanwezigheid van antistoffen betekent dat het proefobject in aanraking geweest is met het desbetreffende antigeen en/of de ziekteverwekker.

Dergelijke methodes om de aanwezigheid van ziekteverwekkers of antilichamen daartegen in het lichaam 15 van een proefobject aan te tonen, worden zowel in de humane gezondheidszorg als in de veterinaire gezondheidszorg gebruikt. Daarbij is het van cruciaal belang dat de methode niet alleen snel, maar bovendien betrouwbaar is. Het spreekt voor zich dat zowel in de humane gezondheids-20 zorg als bij veterinaire toepassingen valspositieve of valsnegatieve resultaten desastreuze gevolgen kunnen hebben.

Met name voor de veterinaire gezondheidszorg is er verder een grote en groeiende behoefte aan het vast-25 stellen van de status van gezondheid van vee, met name runderen, varkens en pluimvee. Dit geldt niet alleen voor de klassieke diagnostiek, dat wil zeggen het identificeren van de oorzaak van een heersende ziekte of aandoening, maar ook voor die vormen van diagnostiek die breder 30 inzetbaar zijn ten behoeve van het volgen ('monitoring') van het verloop van een (subklinische) infectie en prognostiek .

Niet alleen in de parasitologie, maar ook bij virologische aandoeningen, zoals IBR bij runderen en de 35 ziekte van Auzjesky en de blaasjesziekte bij varkens of de ziekte van Marek bij pluimvee, of bij bacteriologische aandoeningen, zoals Salmonella bij pluimvee, is het vaststellen van de aanwezigheid van antilichamen in serum 1006680 3 van groot belang voor het inperken of uitroeien van de bijbehorende ziekte. Er is derhalve grote behoefte aan een diagnostische methode voor het aantonen van seropositiviteit en dan bij voorkeur tegen meerdere ziektes in 5 één test, waarbij de test snel, zeer betrouwbaar en goedkoop moet zijn.

De snelheid van de methode is van belang, omdat vaak zeer veel monsters getest moeten worden, soms zelf afhankelijk van de probleemstelling honderden of duizen-10 den tot miljoenen.

De methode moet betrouwbaar zijn, omdat het missen van een promille bij deze grote aantallen in de veterinaire sector kan betekenen dat in absolute aantallen een groot aantal zieke dieren gezond wordt verklaard. 15 Deze kunnen vervolgens weer een besmettingshaard vormen. Voor de humane gezondheidszorg spreekt de hoogst mogelijke betrouwbaarheid voor zich.

Vooral in de veterinaire sector is het goedkoop zijn van de methode belangrijk, omdat de marges in die 20 bedrijfstak relatief klein zijn. Maar ook in de humane sector heeft prijsbeheersing van overheidswege van belang.

Momenteel worden voor bovenbeschreven diagnostiek van infecties met name ELISA-technieken en aanver-25 wante, immunologische technieken gebruikt. Deze voldoen weliswaar aan de snelheids- en kostenbehoefte, maar hebben door de gebruikte methodologie een inherente foutenkans.

Bij ELISA's worden eiwitten (antilichamen of 30 antigenen) geadsorbeerd aan de wand van kleine reactie-putjes die vervolgens gevuld worden met het te testen monster. Na verloop van tijd wordt in een volgende stap de binding van eiwitten (antigenen of antilichamen) uit het monster aan de reeds gebonden eiwitten aan de wand 35 van de reactieputjes zichtbaar gemaakt door het toevoegen van gelabelde antistoffen, die specifiek zijn voor het antigeen of antilichaam uit het monster.

1006680 4

Cruciaal bij deze methode is dat tot drie keer toe de reactieputjes gespoeld moeten worden om niet gebonden eiwitten uit het monster te verwijderen. De wijze en duur van spoelen moeten goed afgestemd zijn op 5 de eigenschappen van het te detecteren molecuul uit het monster. Onvoldoende spoelen zal kunnen leiden tot vals-positieven, terwijl teveel spoelen het verwijderen van geadsorbeerde eiwitten betekent en derhalve valsnegatieve bepalingen. Hoewel het risico wordt geminimaliseerd door 10 het gebruik van geautomatiseerde en gerobotiseerde apparatuur, kan de inherente foutenkans zeker bij grote aantallen een serieus methodologisch nadeel zijn, waardoor opnieuw besmettingen kunnen optreden, omdat besmettingshaarden niet als zodanig worden herkend.

15 Een geheel andere methode wordt beschreven in de Nederlandse octrooiaanvrage 93.00965. Hierin wordt seropositiviteit (het in het lichaam aanwezig zijn van een antigeen of antilichamen tegen een gezocht antigeen) vastgesteld door middel van een elektroforetische metho-20 de. Eerst wordt het monster in contact gebracht met een standaardoplossing van een of meer immunologisch reactie-ve referentiemoleculen in een incubatiemengsel. Hierdoor wordt de vorming van immuuncomplexen tussen het immunologisch reactieve referentiemolecuul en het te detecteren 25 immunologisch reactieve molecuul in het monster mogelijk gemaakt. De referentiemoleculen kunnen antigenen of antilichamen zijn.

Het vaststellen of immuuncomplexen gevormd zijn vindt vervolgens plaats door het vergelijken van de 30 componenten van het incubatiemengsel met de componenten van de standaardoplossing met behulp van elektroforetische technieken. De theorie hierachter is dat wanneer in de standaardoplossing een specifiek antigeen aanwezig is als referentiemolecuul, dit tijdens de incubatiestap kan 35 reageren met in het monster aanwezige antilichamen. Het antigeen in de standaardoplossing zal na elektroforese op een bepaalde plaats op de elektroforesegel terechtkomen. Doordat in het incubatiemengsel binding van het antigeen 1006680 5 uit de standaardóplossing aan een of meer antilichamen uit het monster kan optreden zullen de fysische eigenschappen van het antigeen veranderen, waardoor deze na elektroforese op een andere plaats op de gel terecht -5 komt, dan een antigeen dat geen onderdeel uitmaakt van een immuuncomplex. De omgekeerde situatie, waarbij het referentiemolecuul een antilichaam is en het te detecteren molecuul een antigeen, werkt analoog. De fysische eigenschappen van het antilichaam zullen na vorming van 10 een immuuncomplex veranderen en op de gel waarneembaar zijn.

Elektroforese is met name gebaseerd op de fysische parameters iso-elektrisch punt en molecuulgewicht. Veranderingen in iso-elektrisch punt van het referentie-15 molecuul worden bepaald door middel van iso-elektrische focussering (IEF), terwijl verschillen in molecuulgewicht kunnen worden vastgesteld door middel van natieve polyacrylamide gelelektroforese (PAGE). Bij beide methoden wordt de standaardoplossing als referentie meegenomen 20 naast het incubatiemengsel.

Gebleken is nu dat in de hier beschreven detec-tiemethode IEF-elektroforese een groot aantal nadelen heeft. In geval van IEF moeten er bijvoorbeeld altijd zogeheten 'flatbed-gels' gebruikt worden. Deze worden 25 gegoten op een horizontaal oppervlak zonder afdekplaat, zodat nooit gegarandeerd kan worden dat de resulterende gel volledig vlak is. Het gevolg is dan dat door eventuele oneffenheden in de gel de banden, die ontstaan na kleuring van de gescheiden eiwitten, niet allemaal op één 30 lijn liggen. Ook het zogeheten 'smilen' van de gel kan dit tot gevolg hebben.

In principe kan het menselijk oog dit soort afwijkingen in het looppatroon wel waarnemen. Echter, wanneer grote hoeveelheden monsters onderzocht moeten 35 worden, zal het elektroforetisch scheiden van de incuba-tiemengsels en referentieoplossingen bij voorkeur gerobotiseerd worden. Aflezing vindt dan plaats door middel van een computer, die echter niet in staat is om onderscheid 1006680 6 te maken tussen een werkelijk verplaatste band en een band die onder invloed van een oneffenheid in de gel of smilingeffecten op een andere plaats terechtgekomen is. Dit leidt tot foutieve aflezingen met alle gevolgen van 5 dien.

Daarnaast is het positioneren van een opbreng-strip op een dergelijke flatbed-gel moeilijk te robotiseren. Vaak zal het te scheiden monster onder de opbreng-strip uitlopen, waardoor eveneens slechte resultaten 10 verkregen worden.

Om de gescheiden eiwitten in IEF-gels zichtbaar te maken, zullen in de praktijk de referentiemoleculen vaak gelabeld worden. Over het algemeen gebeurt dit op de NH3*-groepen door middel van een kleurstof. Het gevolg is 15 dat door het afschermen van de NH3+-groepen op het refe-rentiemolecuul het gehele immuuncomplex zuurder wordt en bij iso-elektrische focussering naar een zure pH in de gel zal lopen. Echter, eenmaal daar aangekomen, zal, onder invloed van de daar heersende lage pH, het complex 20 tussen het te detecteren molecuul en het referentiemole-cuul uit elkaar vallen, waarna het gelabelde referentie-molecuul weer terugloopt naar zijn eigen iso-elektrische punt. Hoewel in een dergelijke situatie wel een immuuncomplex gevormd is, zal dit niet gedetecteerd worden. Dit 25 leidt tot valsnegatieve resultaten.

In de praktijk is verder gebleken dat natieve elektroforese bijvoorbeeld door de genoemde smilingeffecten, maar ook door de grootte van immuuncomplexen, niet tot gewenste resultaten leidt.

30 Het is derhalve het doel van de onderhavige uitvinding een geheel nieuwe methode te verschaffen voor het detecteren van de aanwezigheid van een immunologisch reactief molecuul in een monster. Deze methode is wel gebaseerd op het in contact brengen van het monster met 35 een standaardoplossing van een of meer immunologisch reactieve referentiemoleculen in een incubatiemengsel ten einde de vorming van immuuncomplexen tussen het immunologisch reactieve referentiemolecuul en het te detecteren J006680 7 immunologisch reactieve molecuul mogelijk te maken, waarna vastgesteld wordt of immuuncomplexen gevormd zijn door het vergelijken van een of meer van de fysische parameters molecuulgewicht, lading en vorm van de compo-5 nenten van het incubatiemengsel met dezelfde fysische parameters van de componenten van de standaardoplossing, zoals bij de bekende detectiemethode. Echter, er wordt vastgesteld of immuuncomplexen gevormd zijn door het kolomchromatografisch scheiden van de componenten van het 10 incubatiemengsel, het op dezelfde wijze als in de voorgaande scheiding kolomchromatografisch scheiden van de standaardoplossing en het vergelijken van de elutiepatro-nen van beide scheidingen, waarbij een verandering in de elutiesnelheid van het immunologisch reactieve referen-15 tiemolecuul in het incubatiemengsel ten opzichte van de elutiesnelheid van hetzelfde immunologisch reactieve referentiemolecuul in de standaardoplossing duidt op de vorming van een immuuncomplex.

De kolomchromatografische scheiding vindt bij 20 voorkeur plaats door middel van gelpermeatie. Hierbij wordt uitsluitende geselecteerd op verschillen in grootte tussen het referentiemolecuul in de standaardoplossing en het referentiemolecuul in het incubatiemengsel.

Daarnaast kan door complexvorming ook de lading 25 van het referentiemolecuul veranderen. In dit geval kan de kolomchromatografische scheiding gebaseerd zijn op ionenwisselaarschromatografie.

Bij elektroforesetechnieken is nooit duidelijk waardoor een afwijking veroorzaakt wordt. De detectie van 30 gevormde immuuncomplexen volgens de uitvinding is daarentegen volledig onafhankelijk van de kwaliteit van een voor de scheiding gebruikte gel of het effect van een kleurstoflabel op de zuurgraad van het gevormde immuuncomplex.

35 De kwaliteit van de gebruikte chromatografieko- lom heeft geen invloed op het eindresultaat van de detectiemethode volgens de uitvinding, omdat elk monster en elke referentie met dezelfde kolom getest kan worden.

1006680 8

Eventuele fouten in het vaststellen van een uitslag zijn uiterst minimaal, aangezien vervuiling en andere zaken die het functioneren van het systeem negatief beïnvloeden niet tot een foute diagnose leiden, maar tot een herken-5 baar afwijkend elutiepatroon, dat direct aangeeft dat het systeem niet naar behoren gewerkt heeft. Indien een dergelijke afwijking vastgesteld wordt, kan de test opnieuw uitgevoerd worden. In plaats van valspositieve of valsnegatieve uitslagen treden in geval van afwijkingen 10 duidelijke, als afwijking herkenbare verstoringen in het elutiepatroon op. Een dergelijke betrouwbaarheid missen zowel de ELISA- als de elektroforesescheiding.

De scheiding van referentiemolcuul en complex kan specifiek geoptimaliseerd worden door verschillende 15 gelpermeatiematerialen te kiezen uitgaande van het te detecteren molecuul. Een groot antigeen zal een ander kolommateriaal vereisen dan een hapteen. De deskundige kan op basis van zijn kennis van het te detecteren molecuul een geschikt kolommateriaal kiezen. De flexibiliteit 20 van het systeem is daardoor zeer groot.

De hele kolomchromatografische scheiding kan vrij gemakkelijk geautomatiseerd worden uitgevoerd. Geautomatiseerde chromatografische detectiesystemen met daaraan gekoppelde registratie-apparaten zijn op zich 25 bekend. Een en ander kan daardoor vrij eenvoudig geïmplementeerd worden.

Om de gevoeligheid van de methode verder te verhogen is het mogelijk gevormde immuuncomplexen te detecteren door op zichzelf bekende kleuringsreacties 30 voor eiwitten toe te passen. Ook kan het referentiemole-cuul in de standaardoplossing voorzien worden van een label. Omdat slechts de moleculen met label gedetecteerd worden, worden niet terzake doende moleculen buitengesloten. Er kunnen allerlei soorten labels gebruikt worden, 35 zoals textielkleurstoffen, fluorescerende stoffen of radioactieve labels.

Het te testen monster kan bijvoorbeeld bestaan uit serum, bloed, plasma of speeksel. Daarnaast kunnen 1006680 1 9 echter ook materialen als eieren of melk getest worden.

De monsters behoeven geen aanvullende behandeling te ondergaan.

Het te detecteren immunologisch reactieve 5 molecuul kan een antigeen zijn, gekozen uit haptenen, macromoleculen, pathogenen, of immunologisch reactieve delen daarvan, in welke situatie het immunologisch reactieve referentiemolecuul een antilichaam is. Ook kan de omgekeerde situatie voorkomen, waarbij het te detecteren 10 immunologisch reactieve molecuul een antilichaam is en het immunologisch reactieve referentiemolecuul een antigeen, gekozen uit haptenen, macromoleculen, pathogenen, of immunologisch reactieve delen daarvan. In geval van een antigeen kan de vorming van een immuuncomplex bij-15 voorbeeld worden aangenomen wanneer het molecuulgewicht van het antigeen in het incubatiemengsel met tenminste 160 kiloDalton is toegenomen. IgG antilichamen hebben namelijk een molecuulgewicht van 160 kDa. Per antigeen kunnen ook meerdere antilichamen binden.

20 In de onderhavige aanvrage worden de volgende definities gehanteerd.

'Immunologisch reactief' wil zeggen in staat om met een ander molecuul een 'immuuncomplex' te vormen.

Heel algemeen wordt hiermee een complex tussen een anti-25 geen en een antilichaam of deel daarvan bedoeld. Echter ook reacties tussen antilichamen en daartegen gerichte anti-idiotype antilichamen zijn mogelijk. 'Antigeen' omvat alles wat een immunologische reactie kan opwekken, zoals haptenen, macromoleculen, pathogenen of onderdelen 30 daarvan. De term 'antilichaam' wordt in de gebruikelijke zin gebezigd, maar kan wel verschillende typen antilichamen omvatten, zoals IgG, IgM, IgA, IgE etc. of delen daarvan.

'Referentiemolecuul' wordt gebruikt om het 35 bekende molecuul aan te duiden dat in de standaardoplossing en daarmee ook in het incubatiemengsel voorkomt. Het referentiemolecuul kan een antigeen of een antilichaam zi jn.

1006680 10

Het 'te detecteren molecuul' is het molecuul dat in het te onderzoeken monster moet worden aangetoond. Ook dit molecuul kan een antilichaam of een antigeen zijn.

5 De 'standaardoplossing1 is een oplossing, die tenminste een of meer referentiemoleculen bevat. Het 'monster' is de te testen vloeistof of substantie. Bij elkaar gevoegd vormen het monster en de standaardoplossing het 'incubatiemengsel'. De standaardoplossing als 10 zodanig wordt ook gebruikt als referentie.

De onderhavige uitvinding zal verder worden geïllustreerd in de onderstaande voorbeelden, die slechts ter verduidelijking en niet ter beperking gegeven zijn.

15 VOORBEELDEN

VOORBEELD 1

Het aantonen van een antilichamen teaen antiaeen Fll van E.coli in een serummonster 20 Om de aanwezigheid van antilichamen (seroposi tiviteit) tegen Fll , een antigeen van Escherichia coli. in serum van varkens aan te tonen werd 0,5 ml serummonster gemengd met 100 μΐ van een standaardoplossing van met FITC gelabeld Fll antigeen in PBS. Het zo verkregen 25 mengsel werd na menging geplaatst in een autosampler bij kamertemperatuur.

10 μΐ van het incubatiemengsel werd vervolgens zonder verdere behandeling op een gelpermeatiekolom met een inhoud van 1 ml gebracht. De kolom werd geëlueerd met 30 PBS. Het eluaat werd on-line gemeten met behulp van een fluorescentiedetector. Op deze wijze werden zowel seropositieve als seronegatieve sera (referentie) behandeld. Figuur 1 geeft het resultaat.

De eerste piek in de grafiek geeft seronegatief 35 referentieserum weer. De overige zes pieken zijn van een verdunningsreeks van seropositief serum met steeds dezelfde hoeveelheid standaardoplossing. Vergelijking van de eerste piek met de overige zes laat zien dat in de 1006680 11 aanwezigheid van antilichamen in het serum de piek naast de piek met antigeen een piek van groter materiaal verschijnt. Dit is het antigeen-antilichaamcomplex. In aanwezigheid van meer serum wordt de piek van het complex 5 groter. Op een gegeven moment verschijnt er nog slechts een piek van het complex. Al het antigeen in de standaardoplossing is nu gebonden aan antilichaam in het serum. De vorm van de piek is belangrijk. Bij seronegati-viteit heeft de piek een Gauss-vorm, bij seropositivi-10 teit, wanneer al het antigeen of antilichaam uit de standaardoplossing gebonden is, heeft de piek juist geen Gauss-vorm.

VOORBEELD 2 15 Het aantonen van een antilichamen tegen een vaccin

Op dezelfde wijze als beschreven in Voorbeeld l werd in varkensserum van gevaccineerde varkens de aanwezigheid van antilichamen tegen het vaccin aangetoond. Figuur 2 geeft het resultaat.

20 De eerste piek is het resultaat van de test met serum van een niet-gevaccineerd varken. Deze piek is een duidelijke Gauss-kromme. De overige vijf pieken geven een verdunningsreeks van de standaard aan met positief serum. De gevoeligheid van de eerste seropositieve piek komt 25 overeen met de gevoeligheid van de gebruikelijk ELISA. De vier andere seropositieve pieken met grotere verdunningen geven aan dat de gevoeligheid van de test volgens de uitvinding duidelijk groter is dan die van ELISA. In de figuur is tevens te zien dat bij hogere concentraties de 30 piek in twee pieken uiteen valt.

J00668 0

Claims (5)

1. Werkwijze voor het detecteren van de aanwezigheid van een immunologisch reactief molecuul in een monster, omvattende het in contact brengen van het monster met een standaardoplossing van een of meer immu- 5 nologisch reactieve referentiemoleculen in een incubatie-mengsel teneinde de vorming van immuuncomplexen tussen het immunologisch reactieve referentiemolecuul en het te detecteren immunologisch reactieve molecuul mogelijk te maken, en het vaststellen of immuuncomplexen gevormd zijn 10 door het vergelijken van een of meer van de fysische parameters molecuulgewicht, lading en vorm van de componenten van het incubatiemengsel met dezelfde fysische parameters van de componenten van de standaardoplossing, met het kenmerk, dat het vaststellen of immuuncomplexen 15 gevormd zijn tot stand gebracht wordt door het kolomchro-matografisch scheiden van de componenten van het incubatiemengsel, het op dezelfde wijze als in de voorgaande scheiding kolomchromatografisch scheiden van de componenten van de standaardoplossing, en het vergelijken van de 20 elutiepatronen van beide scheidingen, waarbij een verandering in de elutiesnelheid van het immunologisch reactieve referentiemolecuul in het incubatiemengsel ten opzichte van de elutiesnelheid van hetzelfde immunologisch reactieve referentiemolecuul in de standaardoplos-25 sing duidt op de vorming van een immuuncomplex.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de kolomchromatografische scheiding gelper-meatie is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het 30 kenmerk, dat de kolomchromatografische scheiding ionen-wisselaarschromatografie is.

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het te detecteren immunologisch reactieve molecuul een antigeen is gekozen uit haptenen, macromole- 35 culen, pathogenen, of immunologisch reactieve delen 1006680 daarvan, en het immunologisch reactieve referentiemole-cuul een antilichaam.

5. Werkwijze volgens conclusie 1-3, met het kenmerk, dat het te detecteren immunologisch reactieve 5 molecuul een antilichaam is en het immunologisch reactieve referentiemolecuul een antigeen is gekozen uit haptenen, macromoleculen, pathogenen, of immunologisch reactieve delen daarvan. 1006660