KR102154806B1 - 체액에 의한 항원항체 반응 저해를 방지하는 물질 - Google Patents

체액에 의한 항원항체 반응 저해를 방지하는 물질 Download PDF

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닛뽄하무가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 체액, 특히 타액 등의 생체 점막 유래 성분을 포함하는 시료를 사용한 면역 측정법에서의 항원항체 반응 저해에 대한 효과적인 억제제를 제공하는 것, 및 면역 측정법에서의 허위양성 및 허위음성을 억제하는 것을 목적으로 한다. 　본 발명은 면역 측정법에서의 시료 중의 체액에 유래하는 면역반응 저해 작용을 억제하는 면역반응 저해 억제제로서, 이하의 (1) 및 (2)의 어느 하나의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 저해 억제제를 제공한다.
(1)「R1-SO3H」의 설폰산 화합물 또는 그 염,
(2)「N+-R2R3R4R5」의 제4급 암모늄이온 또는 그 염.
상기 식에서, R1은 직쇄상의 C5∼C30알킬기, 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기로 치환된 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있고, R2∼R5는 각각 독립해서 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C30알킬기에 의해 치환되어 있는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있다.

Description

체액에 의한 항원항체 반응 저해를 방지하는 물질
본 발명은 면역 측정법에서의 체액 성분, 특히 타액 등 생체 점막 유래 성분에 의한 항원항체 반응 저해를 억제하는 저해 억제 물질의 제공, 및 당해 저해 억제 물질을 사용한 신속, 간편, 동시에 정확한 면역 측정법에 관한 것이다.
인간, 동물의 질병 등의 진단에는 현재 다양한 간이검사법이 개발되어 있다. 간이 진단법은 검출하고 싶은 대상물질(병원체 등)에 대한 특이적 항체의 결합반응(항원항체 반응)을 사용해서 진단하는 방법이 주류이고, ELISA, 면역크로마토그래피법, 라텍스 응집법 등이 널리 알려져 있다. 환자, 병든 가축에서 검체를 채취 후, 신속, 그리고 간편하게 결과를 얻을 수 있기 때문에, 증상이 조기 시점에서 치료를 개시할 수 있다는 점에서 간이검사 시약 및 키트의 중요성은 의료, 축산의 현장에서 해마다 높아지고 있다.
현재 인간이나 가축의 질병 진단에서는 일부의 병원체에서 환자로부터 채취한 인두 면봉 등을 검체로 해서 신속 진단을 실시하는 방법 등 간이 진단법의 실용화가 진행되고 있다. 그러나 이것은 인플루엔자의 신속 진단 등 일부 장면에 한정되고 있어, 아직 진단 가능한 대상이 한정되고 있다.
그 요인에 하나로서, 검체에 혼입하는 인간ㆍ동물 유래의 타액 등의 체액 성분이 항원항체 반응에 악영향(허위양성화, 허위음성화)을 끼치게 되고, 진단 결과가 정확하게 수득되지 않는 현상이 발생하는 경우가 있다는 것을 들 수 있다. 예를 들면, 가축 생산에 중대한 피해를 초래하는 구제역에서는 현장에서의 신속한 진단이 중요하기 때문에 커다란 기기를 필요로 하지 않는 면역크로마토그래피가 필요하다고 되어 있지만, 소 타액 등 생체 점막 유래 성분이 검체에 혼입하는 것에 의해 면역크로마토그래피의 반응 이상이 발생해서 정확한 진단을 할 수 없다는 문제점이 있었다.
체액 검체 중에서도 특히 타액 등의 생체 점막 유래 검체의 경우, 점막 면역계에 유래하는 생체 방어성분을 많이 포함하고 있어, 면역 측정법에 의한 피검출 물질의 검출에 있어서, 허위음성이나 허위양성의 원인이 되는 것이 알려져 있다(특허문헌 1, 2).
이러한, 타액 등 체액 성분에 의한 항원항체 반응의 저해를 억제하기 위한 저해 억제 물질의 연구개발도 활발하게 진행되어 왔고, 주로, 각종 계면활성제 등 계면활성작용을 가지는 물질, 또는 설폰산기, 카복실기 혹은 황산기 등 이온성 작용기를 분자 중에 다수 가지는 분자량이 큰 폴리머를 사용하는 기술이 주목받고 있다. 예를 들면, 비이온성 또는 양성 계면활성제에 의해 타액 중의 뮤신에 의한 돌연변이 연쇄 구균의 응집을 가용화하는 기술(특허문헌 3), 설폰산기 및/또는 카복실기를 가지는 양이온 교환수지를 사용해서 인두 유래 검체를 전처리하는 기술(특허문헌 4), 설폰산기, 카복실산기 등을 가지는 소수성 환식 모노머의 중합 폴리머로 이루어지는 이온성 계면활성제에 의해 혈청 중의 방해 물질 작용을 억제하는 기술(특허문헌 5), 설폰산기 또는 그 염을 함유하는 공액 디엔계 공중합체에 의해 혈액 중의 방해 물질 작용을 억제하는 기술(특허문헌 6), 황산기를 2개 이상 가지는 평균분자량 5,000∼500,000의 황산 덱스트란염을 사용해서 생체 점막 유래 성분 중의 IgA 등의 방해 작용을 억제하는 기술(특허문헌 1) 등이 제안되고 있다. 또, 저분자 화합물을 사용한 예에서는 변, 타액 등의 검체 중의 헤모글로빈의 면역학적 측정에서의 방해 물질을, SH기를 가지는 화학물질에 의해 억제하는 기술(특허문헌 7)이나, 우식 원인세균의 측정, 동정 검사 시의 타액 등 구강내 검체를 도데실 황산나트륨 등 음이온 계면활성제로 처리하는 방법(특허문헌 2)이 제안되고 있다. 그리고 HCV 등 바이러스 함유 혈액 유래 검체 중의 바이러스 항원의 측정 시에, 검체를 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 계면활성제 함유 처리액을 사용함으로써, 바이러스 입자로부터의 항원 추출의 효율화와 함께 혈청 중 성분의 측정 저해를 억제할 수 있다는 것이 기재되어 있다(특허문헌 8).
그러나 어느 것이나, 특정한 병원체 등 한정된 대상 항원에 대해서는 일정한 효과를 올리고 있지만, 타액 등 체액 성분에 의한 광범위한 항원항체 반응의 저해에 대한 강력한 억제제를 제공하기까지는 이르러 있지 않고, 널리 단백질 항원, 및 당해 항원을 포함하는 각종 병원체 전반에 적용할 수 있는 강력한 반응 저해 억제제의 제공이 강하게 소망되고 있었다.
일본 공개특허공보 2014-149189호 일본 공개특허공보 2009-52945호 일본 공개특허공보 2002-357599호 일본 특허 제4969245호 일본 공개특허공보 2005-241415호 일본 공개특허공보 H09-304384호 일본 공개특허공보 2010-117244호 일본 특허 제3171827호
본 발명은 체액 시료, 특히 타액 등의 생체 점막 유래 시료를 사용하여 특정한 병원체뿐만 아니라, 널리 일반적인 단백질 항원이 간편하고 정확한 면역 측정법을 제공하는 것이고, 또, 그때에 사용하는 타액 등 체액 성분에 의한 항원항체 반응 저해에 대한 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명에서는 이 문제의 해결을 위해서, 체액 성분 중에서도 면역반응 저해 작용이 강한 타액에 주목하고, 타액 성분 유래가 광범위한 단백질 항원에 대한 강한 면역반응 저해 작용을 억제할 수 있는 물질이라면, 광범위한 병원체, 알레르겐의 검출, 측정 기술에 적용할 수 있는 반응 저해 억제제가 될 수 있는 것은 아닌가라고 생각했다.
그래서, 대량으로 분비되는 소 타액을 다수의 개체로부터 모아서 각각의 면역반응 저해 활성을 조사하고, 가장 저해 활성이 높은 타액 시료를 사용하고, 간편하게 효과를 확인할 수 있는 면역크로마토그래피를 사용해서 스크리닝 실험을 실시하는 것으로 했다. 그때의 검출대상 항원으로서는 캄필로박터 항원을 선택하고, 시판하고 있는 캄필로박터 검출 키트를 사용했다.
우선, 이전에, 타액 등 체액 시료에서 특정한 병원체 등의 면역반응에서 일정한 효과가 확인되고 있는 각종 계면활성제를 시험했지만, 어느 쪽의 계면활성제의 효과도 충분한 것이 아니었다. 이어서, 각종 칼럼 수지를 시험한바, 특히 설폰산기를 가지는 강산성 양이온 교환수지의 효과가 높았지만, 건조에 의해 성능이 열화되는 등, 효과가 안정되지 않는다는 결점이 있었다.
다음에 설폰산기를 가지는 강산성 양이온 교환수지의 효과 안정화를 검토하기 위해서, 수지의 불순물을 면역크로마토그래피용 전개액으로 세정하고, 구제역 항원검출 면역크로마토그래피를 사용해서 타액 검체에 대한 컨트롤 라인의 반응성을 계측했다. 동시에, 비교를 위해서 세정 후의 세정액에 대해서도 동일한 계측을 실시했다. 그 결과, 놀랍게도, 세정액 쪽이 세정 후의 수지에 10배 가까운 강한 반응성을 나타냈다. 즉, 설폰산기를 가지는 강산성 양이온 교환수지에 있어서 관찰된 높은 면역 저해 억제효과는 강산성 양이온 교환수지 제조과정에서 생성되어 불순물로서 혼재하고 있었던 설폰산기를 가지는 저분자 화합물이었을 것으로 해석된다.
그래서, 불순물로서 혼재하고 있을 가능성이 높은 여러 저분자의 설폰산염에 대해서, 타액 검체에 대한 컨트롤 라인의 반응성 및 구제역 바이러스 검출 감도를 측정해서 그 반응 저해 억제효과를 평가한바, 적어도 하나의 탄소 수 5 이상의 직쇄 알킬기를 가지는 지방족 또는 방향족의 설폰산염이 각종 단백질 항원의 면역 측정법에 있어서, 높은 반응 저해 억제효과를 나타내고, 허위양성, 허위음성을 방지할 수 있다는 것을 알아냈다.
또, 설폰산염과 마찬가지로 강한 이온성 작용기를 가지는 저분자 화합물을 검색하고, 각종 제4급 암모늄염에 대해서도 동일한 반응 저해 억제효과를 확인했다.
이상의 것으로부터, 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 가지는 지방족 또는 방향족 설폰산 혹은 그 염, 및 제4급 암모늄이온 혹은 그 염은, 면역 측정법에어서의 타액 등 체액의 혼입에 의한 면역반응 저해의 억제제로서 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상의 지견을 얻음으로써, 본 발명을 완성할 수 있었다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
[1] 면역 측정법에서의 시료 중의 체액, 특히 생체 점막 유래의 체액에 유래하는 면역반응 저해 작용을 억제하는 면역반응 저해 억제제로서, 이하의 (1) 및 (2)의 어느 하나의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 저해 억제제;
(1) 「R1-SO3H」의 설폰산 화합물 또는 그 염
(2) 「N+-R2R3R4R5」의 제4급 암모늄이온 또는 그 염
상기 식에서, R1은 직쇄상의 C5∼C30알킬기, 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기로 치환된 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있고,
R2∼R5는 각각 독립해서 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C30알킬기에 의해 치환되어 있는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있다.
여기에서, 본 발명의 「면역반응 저해 억제제」란 피검 시료 중에 존재할 가능성이 있는 표적 항원을 검출 또는 측정하기 위한 항원항체 반응을 이용한 면역 측정법에서 피검 시료 중에 포함되거나, 또는 포함될 가능성이 있는 체액에 유래하는 면역반응 저해 작용을 유의하게 억제하는 화합물 또는 당해 화합물을 유효성분으로서 포함하는 조성물을 가리킨다.
[2] 상기 [1]에서, (1)의 식에서, R1은 미치환의 직쇄상 C5∼C20의 알킬기이거나, 직쇄상의 C5∼C20의 알킬기를 가지는 페닐기로 치환된 직쇄상의 C1∼C20알킬기이거나, 또는 직쇄상의 C5∼C20의 알킬기로 치환된 페닐기인, 면역반응 저해 억제제.
[3] 상기 [1]에서, (2)의 식에서, R2∼R5는 각각 독립해서, 탄소환식 방향족기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C1∼C20알킬기, 또는 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C20알킬기로 치환되어 있는 탄소환식 방향족기인 면역반응 저해 억제제.
[4] 상기 [1]에서, (2)의 식에서, R2∼R5는 각각 독립해서, 미치환 혹은 페닐기로 치환되어 있는 직쇄상의 C1∼C20알킬기, 또는 직쇄상의 C5∼C20알킬기로 치환되어 있는 페닐기인 면역반응 저해 억제제.
[5] 상기 [4]에서, (2)의 식에서, R2∼R5가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나의 경우인 면역반응 저해 억제제;
(a) R2∼R5 중 어느 1개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기이고, 다른 3개가 메틸기 혹은 에틸기인 경우,
(b) R2∼R5 중 어느 1개가 메틸기 혹은 에틸기이고, 다른 3개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기인 경우,
(c) R2∼R5의 전부가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기인 경우,
(d) R2∼R5 중 어느 1개가 벤질기이고, 다른 3개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기인 경우, 또는
(e) R2∼R5 중 어느 2개가 메틸기 혹은 에틸기이고, 다른 2개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C6∼C20알킬기인 경우.
[6] 상기 [5]에서, (2)의 식에서, R2∼R5가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나의 경우인 면역반응 저해 억제제;
(a) R2∼R5 중 어느 1개가 직쇄의 C3∼C16알킬기이고, 다른 3개의 R2가 메틸기인 경우,
(b) R2∼R5 중 어느 1개가 메틸기이고, 다른 3개가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우,
(c) R2∼R5의 전부가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우,
(d) R2∼R5 중 어느 1개가 벤질기이고, 다른 3개가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우, 또는
(e) R2∼R5 중 어느 2개가 메틸기이고, 다른 2개가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우.
[7] 상기 [1], [3] 내지 [6] 중 어느 하나에서, (2)가 암모늄이온의 염으로서, 할로겐화 수소, 질산, 헥사플루오로 인산, 3불화 2수소, 및 과염소산인 그룹에서 선택된 화합물과의 염인 면역반응 저해 억제제.
[8] 상기 [1]∼ [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역 측정방법.
더 구체적으로는, 표적 항원 특이적 항체를 사용해서 피검 시료 중에 존재 하거나 또는 존재할 가능성이 있는 표적 항원을 검출 또는 측정하는 방법으로서,
(a) 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 피검 시료와 표적 항원 특이적 항체를 접촉시키는 공정
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)과 동시, 또는 그것에 앞서 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)에 앞서 실시되는 경우에는, 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 항체 희석액, 블록킹액, 및 반응 버퍼용액으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인 방법이라고 할 수 있다.
[9] 피험체 유래의 체액, 특히 생체 점막 유래의 체액을 함유하는 시료 중의 피검물질을 측정하는 ELISA, 면역크로마토그래피법, 웨스턴 블롯법, 면역 블롯법, 면역 침강법, 및 라텍스 응집법에서 선택된 어느 하나의 면역 측정법에 있어서, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 사용하는 것을 포함하는 허위양성 및/또는 허위음성이 억제된 면역 측정방법.
더 구체적으로는, 이하의 [9a], [9b] 또는 [9c]의 방법이라고 할 수 있다.
[9a] 면역크로마토그래피법을 사용한 표적 항원의 검출 또는 측정방법으로서,
(a) 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 멤브레인 상에서 피검시료와 표적 항원 검출용 항체를 접촉시키는 공정,
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)과 동시, 또는 그것에 앞서 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)에 앞서 실시되는 경우에는, 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 면역크로마토그래피 전개액, 항체 희석액, 블록킹액, 면역크로마토그래피용 멤브레인의 전 처리액, 컨쥬게이트 패드 고정용 용액, 및 샘플 패드 고정용 용액으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인 방법.
[9b] ELISA를 사용한 표적 항원의 검출 또는 측정방법으로서,
(a) 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 피검시료와 표적 항원 검출용 항체를 접촉시키는 공정,
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)와 동시, 또는 다른 때에 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)와 다른 때에 실시되는 경우에는, 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 블록킹액, 1차 항체 희석액, 2차 항체 희석액, 및 세정용 완충액으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인 방법.
[9c] 웨스턴 블롯법, 면역 블롯법, 면역 침강법, 및 라텍스 응집법에서 선택된 어느 하나의 방법을 사용한 표적 항원의 검출 또는 측정방법으로서,
(a) 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 피검시료와 표적 항원 검출용 항체를 접촉시키는 공정,
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)와 동시, 또는 그것에 앞서 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)에 앞서 실시되는 경우에는, 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 블록킹액, 항체 희석액, 및 반응 버퍼로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인 방법.
[10] 상기 [9]에서, 피험체 유래의 체액을 함유하는 시료가, 타액, 객담, 인두 면봉, 비강 면봉, 비강 흡인액, 및 각결막 면봉으로부터 선택된 생체 점막 유래의 체액을 적어도 1종 함유하는 방법.
[11] 상기 [8] 내지 [10] 중 어느 하나에서, 피검물질이 병원체, 병원 미생물, 호르몬, 염증 관련 물질, 프로스타글란딘, 및 메타볼릭 신드롬 관련 물질로 이루어지는 그룹에서 선택된 물질인 방법.
[12] 상기 [11]에서, 상기 병원체 또는 병원 미생물이 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노 바이러스, RS 바이러스, 코로나 바이러스, 광견병 바이러스, 백일해균, 용혈성 연쇄구균, 대장균, 식중독 세균, 클라미디아ㆍ트라코마티스 및 마이코플라즈마로부터 선택된 병원체 또는 병원 미생물인 방법.
[13] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 측정용 키트.
[14] 상기 [13]에서, 면역 측정용 키트가 ELISA, 면역크로마토그래피법, 웨스턴 블롯법, 면역 블롯법, 면역 침강법, 및 라텍스 응집법에서 선택된 어느 하나의 면역 측정법을 위한 키트인 키트.
[15] 피험체가 병원성 질환에 이환하고 있는지의 여부를, 피험체 유래의 체액, 특히 생체 점막 유래의 체액을 사용해서 면역반응에 의해 진단하기 위한 키트로서,
피검체액 시료의 희석제, 전개액, 블록킹액의 적어도 하나에 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 면역반응 저해 억제제가 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
[16] 상기 [15]에서, 병원성 질환이 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노 바이러스, RS 바이러스, 코로나 바이러스, 광견병 바이러스, 백일해균, 용혈성 연쇄구균, 대장균, 식중독 세균, 클라미디아ㆍ트라코마티스 및 마이코플라즈마로부터 선택된 병원체 또는 병원성 미생물에 의해 발생되는 질환인 것을 특징으로 하는 키트.
본 발명의 면역반응 저해 억제제를, 각종 면역 측정방법에서 전처리액 또는 전개액에 사용하는 것에　의해, 타액 등의 체액 시료 또는 타액 등이 혼입할 가능성이 있는 피검시료에 대해서도, 항원항체 반응의 저하를 효율적으로 억제할 수 있다. 종래, 타액 등의 체액의 영향을 제외하기 위해서 전처리 등이 필요했지만, 본 발명에 의해 전처리 등이 없이 타액 등의 체액이 혼입할 가능성이 있는 검체를 측정할 수 있게 되었기 때문에, 의료나 축산의 현장에서의 신속하고, 정확한 대응이 가능하게 되고, 검사 품질의 향상, 생산성의 향상에 공헌하는 것이 기대된다.
특히, 소, 돼지 등의 가축의 질병 진단에 있어서 구제역, 인플루엔자 바이러스 등의 중요 질병의 진단을, 타액이나 비강/인두 면봉 등의 면역반응 저해 활성이 강한 피검시료라고 해도 신속하고, 동시에 간편한 면역크로마토그래피 키트를 사용해서 정확하게 진단을 실시하는 것이 가능하게 되었다.
도 1은 면역크로마토그래피에 대한 소 타액에서의 저해 활성의 검증. 캄필로박터 검출 면역크로마토그래피인 NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에 있어서 캄필로박터 양성 검체를 시험했을 때의 테스트 라인에 대한 영향(항 캄필로박터 항체로 캄필로박터균 검출 시의 반응 저해)와 컨트롤 라인에 대한 영향(항 IgG 항체로 항구제역 항체를 검출할 때의 반응 저해)
도 2는 캄필로박터 검출용 면역크로마토그래피(NH 면역크로마토그래피 캄필로박터)에서 소 타액 검체를 희석하는 것에 의해 반응성의 회복 가능성의 검증.
도 3은 구제역 항원 검출용 면역크로마토그래피를 사용한 직쇄 알킬설폰산염의 면역반응 저해의 억제효과 검증. 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨을 0.3(w/V)% 첨가한 소 타액 49검체에서의 구제역 바이러스 검출 시험 결과.
1. 본 발명의 면역반응 저해 억제제
(1-1) 본 발명의 면역반응 저해 억제제로서 사용할 수 있는 화합물
본 발명에서 「면역반응 저해 억제제」라고 할 때, 피검시료 중에 존재할 가능성이 있는 표적 항원을 검출 또는 측정하기 위한 항원항체 반응을 이용한 면역 측정법에 있어서, 피검시료 중에 포함되는(또는 포함될 가능성이 있는) 체액, 특히 생체 점막 유래의 체액에 유래하는 면역반응 저해 작용을 억제하는 화합물 또는 당해 화합물을 유효성분으로서 포함하는 조성물을 가리킨다.
본 발명의 면역반응 저해 억제제의 하나는 분자 중에 치환될 수도 있는 C5 이상의 직쇄 알킬기를 가지는 지방족 또는 방향족 설폰산 또는 그것들의 염이다.
다른 하나는 분자 중에 치환될 수도 있는 C3 이상의 직쇄 알킬기를 가지는 제4급 암모늄이온 혹은 그 염으로서, 모두 분자 내에 커다란 전하의 치우침이 있는 저분자 화합물인 것을 특징으로 하고 있다.
(1-2) 직쇄 알킬기 함유 설폰산 화합물 또는 그 염
본 발명의 면역반응 저해 억제제 가운데, 직쇄 알킬기 함유 설폰산 화합물은 분자 중에 치환될 수도 있는 C5∼C30직쇄상 알킬기를 적어도 하나 가지고 있고, 하기 식(1)의 설폰산 화합물 혹은 그 염이다.
「R1-SO3H」 (1)
상기 식에서, R1은 직쇄상의 C5∼C30알킬기, 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기로 치환된 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있다.
즉,
(a) 치환될 수도 있는 직쇄상의 C5∼C30, 바람직하게는 C7∼C20, 더 바람직하게는 C8∼C15, 특히 바람직하게는 C10∼C12알킬설폰산 또는 그 염,
(b) 치환될 수도 있는 직쇄상의 C5∼C30, 바람직하게는 C7∼C20, 더 바람직하게는 C8∼C15, 특히 바람직하게는 C10∼C12알킬기를 가지는 탄소환식 방향족 (아릴)설폰산 또는 그 염,
(c) 치환될 수도 있는 직쇄상의 C5∼C30, 바람직하게는 C7∼C20, 더 바람직하게는 C8∼C15, 특히 바람직하게는 C10∼C12알킬기를 가지는 탄소환식 방향족 (아릴)기를 가지는 직쇄상의 C1∼C30, 바람직하게는 C1∼C20, 더 바람직하게는 C1∼C15, 특히 바람직하게는 C1∼C12알킬설폰산 또는 그 염이다.
직쇄상의 C5∼C30알킬기로서는 탄소 수가 클수록 반응 저해 억제효과가 높은 경향이 인정되지만, 제조의 용이함, 측정용 시료로의 용해의 용이함으로부터 탄소 수의 길이가 제한된다.
탄소환식 방향족기 (아릴기)로서는 페닐기 또는 나프틸기가 바람직하고, 페닐기가 특히 바람직하다.
이것들의 직쇄 알킬기 함유 설폰산 화합물은 직쇄 알킬기 이외의 치환기를 가지고 있을 수도 있고, 예를 들면, 할로겐 분자, 하이드록시기, 알케닐기, 사이클로알킬기, 사이클로알케닐기, 알콕실기, 아실기, 아세틸기, 포르밀기, 카보닐기, 카복실기, 아미노기, 이미노기, 시아노기, 아조기, 니트로기, 티올기, 케톤기, 등 알킬기를 치환할 수 있는 작용기라면 어떤 치환기일 수도 있지만, 직쇄 알킬기 함유 설폰산 화합물 전체의 분자 내 전하 치우침을 손상하지 않는 작용기가 바람직하다. 구체적으로는 플러스의 전하를 가지거나, 또는 전하를 가지지 않는 작용기가 바람직하다.
이것들의 직쇄 알킬기 함유 설폰산 화합물이 대표적인 예로서, 1-펜탄설폰산, 1-헥산설폰산, 1-헵탄설폰산, 1-옥탄설폰산, 1-노난설폰산, 1-데칸설폰산, 1-도데칸설폰산 및 1-도데실설폰산 등의 직쇄 알킬설폰산; 및 1-도데실벤젠설폰산, p-옥틸벤젠설폰산, 및 p-톨루엔설폰산 등의 직쇄 알킬벤젠설폰산;을 예시할 수 있지만, 이것들 화합물에는 한정되지 않는다.
또, 직쇄 알킬기 함유 설폰산의 염으로서는 설포기(설폰산기)를 알칼리 금속 화합물, 알칼리토류 화합물, 암모니아 등의 염기 화합물로 중화한 염을 가리킨다. 바람직하게는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 등이 있고, 특히 나트륨염이 바람직하다.
(2) 제4급 암모늄이온 또는 그 염
본 발명의 면역반응 저해 억제제 가운데, 제4급 암모늄이온 또는 그 염은 분자 중에 치환될 수도 있는 직쇄 알킬기 또는 치환될 수도 있는 아릴기 중 어느 하나의 기를 적어도 하나 가지고 있는, 하기 식(2)의 항상 정전하를 가지는 제4급 암모늄카티온, 또는 할로겐 등 아니온과의 염인 제4급 암모늄염이다.
「N+-R2R3R4R5」 (2)
의 제4급 암모늄이온 또는 그 염
상기 식에서, R2∼R5는 각각 독립해서 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C30알킬기에 의해 치환되어 있는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있다.
여기에서, 독립한 R2∼R5 중 적어도 하나의 기는,
(i) 직쇄상의 C3∼C30, 바람직하게는 C3∼C20, 더 바람직하게는 C5∼C15의 직쇄 알킬기이거나, 또는
(ii) 직쇄상의 C3∼C30, 바람직하게는 C3∼C20, 더 바람직하게는 C5∼C15의 알킬기로 치환된 탄소환식 방향족기(아릴기)를 치환기로서 가지고 있는 C1∼C30, 바람직하게는 C3∼C20, 더 바람직하게는 C5∼C15의 직쇄 알킬기인 것이 바람직하다.
또, 탄소환식 방향족기(아릴기)로서는 페닐기 또는 나프틸기가 바람직하고, 페닐기가 특히 바람직하다.
본 발명이 바람직한 형태에서는, R2∼R5가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나의 경우로서 표기할 수 있다.
(a) R2∼R5 중 어느 1개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20, 바람직하게는 C3∼C16알킬기이고, 다른 3개가 메틸기 혹은 에틸기, 바람직하게는 메틸기인 경우,
(b) R2∼R5 중 어느 1개가 메틸기 혹은 에틸기, 바람직하게는 메틸기이고, 다른 3개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20, 바람직하게는 C3∼C12알킬기인 경우,
(c) R2∼R5의 전부가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기, 바람직하게는 미치환의 직쇄 C3∼C12알킬기인 경우,
(d) R2∼R5 중 어느 1개가 벤질기이고, 다른 3개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기, 바람직하게는 미치환의 직쇄 C3∼C12알킬기인 경우, 또는
(e) R2∼R5 중 어느 2개가 메틸기 혹은 에틸기, 바람직하게는 메틸기이고, 다른 2개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C6∼C20알킬기, 바람직하게는 미치환의 직쇄 C3∼C12알킬기인 경우.
본 발명의 면역반응 저해 억제제로서 사용할 수 있는 제4급 암모늄이온 또는 그 염은, 직쇄 알킬기 이외의 치환기를 가지고 있을 수도 있고, 예를 들면, 할로겐 분자, 하이드록시기, 알케닐기, 사이클로알킬기, 사이클로알케닐기, 알콕실기, 아실기, 아세틸기, 포르밀기, 카보닐기, 카복실기, 아미노기, 이미노기, 시아노기, 아조기, 니트로기, 티올기, 케톤기, 등 알킬기를 치환할 수 있는 작용기라면 어떤 치환기일 수도 있지만, 제4급 암모늄이온 전체의 분자 내의 전하의 치우침을 손상하지 않는 작용기가 바람직하다. 구체적으로는 음의 전하를 가지거나, 또는 전하를 가지지 않는 작용기가 바람직하다.
이것들의 제4급 암모늄이온이 대표적인 예로서, n-옥틸트리메틸, 라우릴트리메틸암모늄, 미리스틸트리메틸암모늄, 스테아릴트리메틸암모늄, 도데실트리메틸암모늄; 메틸트리옥틸암모늄, 메틸트리부틸암모늄; 테트라부틸암모늄, 테트라메틸암모늄; 및 벤질트리부틸암모늄;을 예시할 수 있지만, 이것들 암모늄이온에는 한정되지 않는다.
본 발명의 면역반응 저해 억제제로서 사용할 수 있는 제4급 암모늄이온은 항상 정전하를 가지고 반응성이 높기 때문에, 안정한 암모늄염으로서 사용하는 것이 바람직하다. 안정한 암모늄염을 형성하는 아니온은 할로겐, 질산, 헥사플루오로 인산, 3불화 2수소, 혹은 과염소산 등이고, 바람직하게는 Cl, Br, 또는 I 등의 할로겐화물이다.
2. 본 발명의 면역 측정법에서의 검출, 측정 대상
(2-1) 검출, 측정 대상
본 발명에서의 검출 물질은 면역 측정법 등 항원항체 반응을 이용한 면역 측정법으로 측정할 수 있는 항원 또는 항체이다. 항원으로서는 항체를 제작할 수 있는 것이라면 어떤 항원일 수도 있지만, 단백질, 당 단백질 또는 펩티드가 바람직하고, 이것들의 물질을 포함하는 원생동물, 진균, 세균, 마이코플라즈마, 리케차, 클라미디아, 바이러스 등도 검출할 수 있다. 특히, 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노 바이러스, RS 바이러스, 코로나 바이러스, 광견병 바이러스, 백일해균, 용혈성 연쇄구균, 또는 캄필로박터, 살모넬라, 병원성 대장균 등의 식중독 세균과 같은 병원성의 바이러스나 세균을 신속, 그리고 정확하게 검출 또는 정량할 때에 적용하는 것이 바람직하다.
또한, 타액 시료로부터의 프로스타글란딘 등의 에이코사노이드, 코르티솔 등 스트레스 호르몬, 테스토스테론, 에스트라디올 등의 성 호르몬, 멜라토닌, 인슐린 등의 각종 호르몬, TNF-α, IL-1β 등 염증 관련 물질, α-아미라제 등 소화효소, 아디포넥틴 등의 메타볼릭 신드롬 관련 물질의 ELISA, 면역 측정법(EIA) 등에 의한 검출, 측정(고치대학 정기 간행물 간호학부편 제64권, 제73∼83쪽, 2014)의 시에도 유용하다.
또, 음식품, 사료 등의 품질관리에 있어서, 보존 시에 인간이나 동물의 체액이 혼입될 우려가 있는 경우, 음식품, 사료 중의 알레르겐 단백질 항원의 검출 또는 정량에도 적용할 수 있다.
상기 항원을 검출하기 위한 항체는 측정 대상으로 하는 항원과 특이적으로 반응해서 결합하는 항체라면 모노클로널 항체가 아니더라도, 폴리클로널 항체, 항혈청을 사용할 수도 있다.
(2-2) 피검시료
본 발명의 면역 측정법에 사용되는 피검시료는 표적 항원 혹은 표적 항체를 가지고 있거나, 또는 가지고 있을 가능성이 있는 시료이고, 특별하게 한정되지 않지만, 방해물질의 영향을 억제한다고 하는 본 발명의 효과를 크게 발휘할 수 있는 생체 시료, 특히 타액 등의 생체 점막 유래 시료가 바람직하고, 전형적으로는 인간이나 동물(돼지, 소, 닭, 염소, 양 등의 가축, 개, 고양이 등의 애완동물 등)로부터 채취하는 생체 점막 유래의 체액, 예를 들면, 타액, 구강 면봉, 객담, 인두 면봉, 비강 면봉, 비강 흡인액, 및 각결막 면봉 등으로부터 선택되는 검체 또는 그 희석액 등을 들 수 있다. 기타, 이것들 체액이 혼입될 우려가 있는 음식품, 사료 등도 피검시료가 될 수 있다. 특히, 타액 시료는 가장 비침습적인 채취 방법이기 때문 바람직하다.
3. 본 발명의 면역 측정법 및 본 발명의 면역반응 저해 억제제의 사용방법
(3-1) 본 발명 항원항체 반응을 사용한 검출계, 측정계
본 발명의 면역반응 저해 억제제는 항원항체 반응을 사용한 검출계, 측정계라면 모두 적용할 수 있다. 구체적으로는 면역크로마토그래피, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역블롯, 면역 침강, 라텍스 응집법 등에 적용하면, 허위음성 및 허위양성을 억제할 수 있어 바람직하다. 특히, 타액 등 점막 유래 물질의 영향을 받기 쉬운 면역크로마토그래피법에 적용하면 효과가 높다.
이하, 각 면역 측정법에 대해서 본 발명이 전형적인 사용방법을 예시해서 간단하게 설명하지만, 본 발명의 사용방법은 이것들 의 방법에는 한정되지 않는다.
(a) 면역크로마토그래피법에서의 사용방법
면역크로마토그래피법에서는 니트로셀룰로오스막 등의 적당한 멤브레인 상에 미리 피검시료 중의 표적 항원 특이적인 항체(캡쳐 항체)를 고정화해 두고, 검체 적하부에 준비한 금속 콜로이드 등으로 표지한 항체와, 검체 중의 항원과 형성한 면역 복합체를, 상기 멤브레인의 모세관 현상을 이용해서 이동 전개시킨다. 캡쳐 항체 상에 면역 복합체가 포획되었을 경우의 표지량(테스트 라인)을 육안으로 정성 판정할 수 있다. 인식기로서 면역크로마토그래피 리더(이하, IC 리더라고도 한다.)를 사용하면 반응성을 수치화할 수도 있다. 고정화한 캡쳐 항체의 하류에는 금속 콜로이드로 표지한 항체를 인식하는 항 IgG 항체 등이 고정화되어 있고, 잉여의 금속 콜로이드 표지 항체가 결합하는 위치가 컨트롤 라인으로서 육안 혹은 면역크로마토그래피 리더로 확인된다.
면역크로마토그래피법에서는 피검시료를 완충액 등으로 희석해서 사용하지만, 본 발명의 면역반응 저해 억제제를 미리 희석액 중에 첨가해 두거나, 또는 피검시료와 동시에 희석액 중에 첨가할 수 있다.
그때, 희석액으로서 일반적인 면역크로마토그래피법의 전개액으로서 사용되고 있는 트리스 완충액이나 인산 완충액 등(필요에 따라서 계면활성제나 알부민 등의 단백질을 첨가할 수 있다)을 사용하면, 그대로 면역크로마토그래피법의 전개액으로서 사용할 수 있다.
또, 금속콜로이드 표지 항체, 라텍스 입자 표지 항체 등의 희석액 중에 첨가해 둘 수도 있다. 라텍스 입자의 블록킹에 사용할 수도 있다.
또, 면역크로마토그래피법에서 사용하는 니트로셀룰로오스막 등의 멤브레인을 블록킹하기 위한 멤브레인 전 처리액이나, 컨쥬게이트 패드, 샘플 패드로의 고정을 위한 용액 중에도 사용할 수 있다.
즉, 본 발명의 면역 측정법 가운데 면역크로마토그래피법을 사용한 표적 항원의 검출 또는 측정방법은,
(a) 본 발명의 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 멤브레인상에서 피검시료와 표적 항원 검출용 항체를 접촉시키는 공정,
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)와 동시, 또는 그것에 앞서 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)에 앞서 실시되는 경우에는, 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 면역크로마토그래피 전개액, 항체 희석액, 블록킹액, 면역크로마토그래피용 멤브레인의 전 처리액, 컨쥬게이트 패드 고정용 용액, 및 샘플 패드 고정용 용액으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인, 방법이라 할 수 있다.
면역크로마토그래피법등의 면역 측정법에 있어서, 희석액, 전 처리액 등 중에 첨가하는 본 발명의 면역반응 저해 억제제가 최적인 농도 범위는 면역반응 저해 억제제의 종류에 의해서도, 피검 대상 생물의 종류, 연령, 혼입하는 체액의 종류, 검출 대상이 되는 표적 항원의 종류 등에 의해서도 다르지만, 일반적으로 0.01∼10(w/V)%이고, 바람직하게는 0.02∼5.0(w/V)%, 더욱 바람직하게는 0.05∼3.0(w/V)%, 특히 바람직하게는 0.1∼1.0(w/V)%이다.
(b) ELISA
ELISA는 직접 흡착법이라면 피검시료 용액을 마이크로플레이트, 글래스비드 등 고상으로 흡착시키고, 항원항체 반응 및 효소반응에 관여하지 않는 단백질(스킴밀크, 알부민 등)로 고상을 블록킹한 후, 표적 항원 특이적 항체를 반응시켜서 항원항체 반응을 일으키게 하고, 여분의 항체를 씻어 낸다(항체가 표지되어 있지 않은 경우에는 효소 표지 2차 항체를 반응시켜서 2차 항체의 세정공정이 부가된다.) 이어서 표지한 효소의 기질을 첨가해서 효소반응 생성물을 검출한다.
샌드위치법이라면 표적 항원에 특이적인 포획 항체를 고상으로 흡착시키고, 블록킹 공정 후, 피검시료 용액 및 포획 항체와는 다른 에피토프를 인식하는 항원 특이적 항체(1차 항체)을 반응시키고, 1차 항체가 표지되어 있지 않은 경우에는 추가로 표지 2차 항체를 반응시킨다.
직접 흡착법이더라도, 샌드위치법이더라도, ELISA에서의 피검시료 희석액, 블록킹용의 스킴밀크 등 용해액, 및/또는 표적 항원 특이적 항체, 2차 항체 등의 항체용 희석액 중에 첨가해서 사용할 수 있다.
즉, 본 발명의 면역 측정법 가운데 ELISA를 사용한 표적 항원의 검출 또는 측정방법은,
(a) 본 발명의 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 피검시료와 표적 항원 검출용 항체를 접촉시키는 공정
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)와 동시, 또는 다른 때에 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)와 다른 때에 실시되는 경우에는 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 블록킹액, 1차 항체 희석액, 2차 항체 희석액, 및 세정용 완충액으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인, 방법이라 할 수 있다.
(c) 기타의 면역 측정법에서의 사용방법
그 외에, 본 발명의 면역반응 저해 억제제가 바람직하게 사용되는 면역 측정법에 면역 응집법이 있다. 면역 응집법은 항원항체 반응에 의해 발생하는 반응액의 혼탁도나 흡광도와 같은 광학적 성질의 변화에 의거해서, 피검시료 중의 항원 또는 항체를 검출 또는 정량하는 방법으로, 면역 비탁법 및 라텍스 입자를 사용하는 라텍스 응집법도 포함된다. 표지한 항혈청을 포함하는 반응액, 또는 표적 항원에 특이적인 항체를 코팅한 라텍스 입자를 현탁한 반응액 중에 피검시료를 첨가하고, 면역 복합체의 형성에 의해 항혈청 또는 라텍스 입자가 응집함으로써, 혼탁도나 흡광도가 변화되는 것을 관찰, 측정한다.
그 때의 피검시료 희석액 등에 첨가하는 외에, 라텍스 입자의 블록킹용 용액이나 반응액 중에도 사용할 수 있다.
기타, 웨스턴 블롯법에서는 피검시료 희석액 이외에, 항체 희석액, 블록킹액에 첨가할 수 있고, 면역 침강법에서도 피검시료 희석액 이외에, 항체 희석액, 반응 버퍼 용액 중에 첨가한다.
즉, 다른 면역 측정법에서도 피검시료 희석액, 항체 희석액, 블록킹액 및 반응 버퍼 용액을 조제하는 공정의 적어도 어느 하나의 공정, 및/또는 피검시료와 표적 항원 특이적 항체를 반응시키는 공정에서, 본 발명의 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
더 구체적으로는,
웨스턴 블롯법, 면역 블롯법, 면역 침강법, 및 라텍스 응집법에서 선택된 어느 하나의 방법을 사용한 표적 항원의 검출 또는 측정방법으로서,
(a) 본 발명의 면역반응 저해 억제제를 첨가하는 공정, 및
(b) 피검시료와 표적 항원 검출용 항체를 접촉시키는 공정
을 포함하고,
여기에서 상기 공정(a)는 상기 공정(b)와 동시, 또는 그것에 앞서 실시되는 것이고, 상기 공정(a)가 상기 공정(b)에 앞서 실시되는 경우에는 상기 첨가하는 공정은 피검시료 희석액, 블록킹액, 항체 희석액, 및 반응 버퍼로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 하나에 대해서 실시되는 것인, 방법이라 할 수 있다.
(3-2) 면역 측정용 키트
본 발명의 면역반응 저해 억제제는 통상의 각종 면역 측정법용의 키트와 조합시켜서 본 발명의 면역반응 저해 억제제 키트로 하는 것이 가능이다. 또, 이것들 각종 면역 측정법용 키트에서 사용하는 희석용 완충액, 전개액, 반응액, 블록킹액 등의 적어도 하나의 용액 중에, 미리 본 발명의 면역반응 저해 억제제를 소정의 농도로 용해해서 용기에 충전한 것을 키트에 포함시킴으로써 더욱 편리성을 높일 수 있다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 기타의 용어나 개념은 당해 분야에서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 의거하는 것이고, 본 발명을 실시하기 위해서 사용하는 여러 가지 기술은 특히 그 출전을 명시한 기술을 제외하고는 공지의 문헌 등에 의거하여 당업자라면 용이, 그리고 확실하게 실시 가능하다. 또, 각종 분석 등은 사용한 분석기기 또는 시약, 키트의 취급 설명서, 카탈로그 등에 기재된 방법을 준용해서 실시했다.
또, 본 명세서 중에 인용한 선행기술문헌, 특허공보 및 특허출원명세서 중의 기재 내용은 본 발명의 기재 내용으로서 참조되는 것으로 한다.
( 실시예 1) 타액에 의한 면역반응 저해
(1-1) 타액에 의한 캄필로박터 항원의 검출 저해
본 실시예에서는 캄필로박터 검출 면역크로마토그래피에서의 항원항체 반응 저해를 확인하기 위해서, 소 타액을 전개액으로 희석한 검체에 대해서 캄필로박터(Campylobacte Rjejuni; ATCC29428) 사균액을 8×106cfu/㎖가 되도록 첨가해서 교반한 검체를, 캄필로박터 검출 면역크로마토그래피(NH 면역크로마토그래피 캄필로박터(NH Foods Lt.)에 적하하고, 테스트 라인 및 컨트롤 라인을 면역크로마토그래피 리더(Hamamatsu Photonics K.K.의 C10066)에 의해 측정했다(도 1). 테스트 라인은 항 캄필로박터 항체가 컨트롤 라인은 항 마우스 IgG 항체가 각각 도포되어 있고, 각각 캄필로박터 균체, 항 캄필로박터 항체에 반응한다.
그 결과, 검토한 소 타액 중 유래하는 개체마다 각 검체의 저해 정도는 다르지만, 소 타액을 검체로 했을 경우 컨트롤의 PBS를 검체로 했을 경우와 비교해서 반응이 내려 가는 것이 확인되었다. 또 완전히 다른 조합인 항원항체 반응에 대해서도 발휘하는 저해 정도는 거의 변함없는 것이 관찰되었다.
따라서 본 검체에서 강한 저해 작용을 나타낸 타액을, 저해 활성 억제 물질 검색을 위한 검토 시료로서 선택했다.
(1-2) 캄필로박터 항원에 대한 소ㆍ돼지 타액에 의한 저해 상황
이 실시예에서는, (1-1)과 동일한 캄필로박터 항원 단백의 면역 측정에 대한 타액에 의한 저해 상황이, 소 타액뿐만 아니라, 돼지의 타액이기도 하는 것을 확인한다.
구체적으로는, 소ㆍ돼지 타액을 PBS로 10배 희석하고, NH 면역크로마토그래피 캄필로박터(NH Foods Ltd)에 사용했다. 소 타액에서는, 20검체 중, 컨트롤 라인이 저해된 허위음성 검체가 2예, 허위양성이 1례이었던 것에 대해, 돼지 타액에서는 54검체 중 허위음성은 0예이었지만, 허위양성이 되는 타액검체가 12예도 존재했다(표 1).
또, 구강 내에 고농도로 캄필로박터가 존재할 가능성은 낮기 때문에, 테스트 라인에서 높은 측정값을 나타낸 경우에는 허위양성으로 카운트했다. 또, 컨트롤 라인이 저해된 타액에 대해서는 테스트 라인도 허위음성이 될 가능성이 높다고 생각했다.
결과의 상세 일부를 표 2에 나타낸다.
Figure 112019089693739-pct00001
Figure 112019089693739-pct00002
(1-3) 각종 면역크로마토그래피에 대한 타액에 의한 반응 저해
본 실시예에서는 실시예(1-1)에서 수득된 가장 저해 활성이 높은 타액 시료(G)를 사용하고, 검출 대상의 항원 단백질이 다른 각종 면역크로마토그래피에 대한 타액 성분의 혼입에 의한 면역반응 저해의 정도를 관찰했다.
구체적으로는, 다른 항원 단백질 검출용 면역크로마토그래피의 모델로서, 식품의 알레르겐 단백질인 계란, 우유, 밀 단백질, 또 병원균의 검출 모델로서 장관 출혈성 대장균 O157, 병원 바이러스의 검출 모델로서 구제역 바이러스를 선택하고, 각각 「FASTKIT 슬림 계란」, 「FASTKIT 슬림 밀」 (NH Foods Ltd), 및 「NH 면역크로마토그래피 O157」 (NH Foods Ltd), 「구제역 항원검출 면역크로마토그래피」 (개발품)을 사용해서 실험을 실시했다.
식품의 알레르겐 단백질의 검출 실험에는 타액 시료(G)를 10배 희석한 희석 타액 시료를 제작하고, 이에 대해서 알레르겐 단백질의 계란 단백질, 및 밀 단백질을 각각 약 25ng/㎖가 되도록 혼화한 시료 100㎕을 면역크로마토그래피에 제공했다.
한편, 장관 출혈성 대장균 O157 검출 실험에는, 타액 시료(G)을 10배 희석한 희석 타액 시료를 제작하고, 「O157」(야외주)(1×106cfu/㎖)을 희석 타액 시료에서 26배 희석한 시료 100㎕을 면역크로마토그래피에 제공했다. 구제역 바이러스 검출 시험에는 실시예(1-1)과는 다른 검토에서 수득된 저해 활성이 높은 타액 시료(R)을 사용했다. 타액 시료(R)을 10배 희석한 희석 타액 시료를 제작하고, 이에 대해서 구제역 바이러스(O/JPN/2010주)를 104. 75TCID50/㎖가 되도록 혼화한 시료 60㎕을 면역크로마토그래피에 제공했다.
또 각 시험에어서 소 타액의 대신에, PBS를 첨가한 대조시험을 실시하고, 소 타액을 첨가한 시험과의 반응성의 차이를 비교했다.
그 결과, 특히 계란, 밀, 구제역의 검출용 면역크로마토그래피에서는 타액에 의해 거의 100% 가까운 반응성의 저하가 관찰되었다. 또, 「O157」의 검출용 면역크로마토그래피에서는 약 40% 가까운 반응성의 저하가 되었다. 이것으로부터 실시예(1-1)에서 검토한 소 타액은 IgG, 세균, 알레르겐 단백, 바이러스 등 폭넓은 항원에 대해서 반응 저해를 나타내는 것을 알 수 있었다(표 3).
Figure 112019089693739-pct00003
(1-4) 타액성분에 의한 반응 저해에의 희석에 의한 영향
인간의 진단 키트 등에서는 검체로의 타액의 혼입에 의한 반응 저해를 회피하기 위해서 검체를 희석하는 것이 추천되고 있는 예가 있다.
그래서, 실시예(1-3)에서 사용한 것과 같은 타액 시료를 사용하고, 캄필로박터 검출 면역크로마토그래피(NH 면역크로마토그래피 캄필로박터)에서의 테스트 라인 및 컨트롤 라인의 소실이, 희석에 의해 회복하는지의 여부, 또 몇배 희석으로 회복하는지를 검토하기 위해서, 희석율을 바꾸어서 복수 회 실시했다.
그 결과, 테스트 라인, 컨트롤 라인 모두 5배 희석으로 약간 회복했지만, 50배까지 희석해도 반응은 완전하게는 회복하지 않았다. 테스트 라인에 대해서는 50배 희석에 의해서도 56% 정도밖에 회복하지 않았다(도 2).
( 실시예 2) 면역반응 저해 억제제의 스크리닝
(2-1) 계면활성제로부터의 스크리닝
우선, 면역반응 저해 억제제의 후보로서, 종래, 타액 등 체액 중의 면역반응 저해물질의 억제에 효과가 있다고 여겨진 각종 계면활성제를 시험했다.
계면활성제로서 특허문헌 1에서 타액 중의 뮤신의 가용화 효과가 확인된 각종 비이온성 계면활성제 및 양성 계면활성제를 사용해서 음성시험 및 양성시험을 실시했다.
음성시험 및 양성시험은 실시예(1-2) 등과 동일하게, 타액 시료(G)를 사용하고, 실시예(1-1)과 동일한 조건으로 NH 면역크로마토그래피 캄필로박터 및 캄필로박터 희석액을 사용해서 실시했다.
그 결과, 대부분의 계면활성제에서 충분한 효과를 확인할 수 없었다(data not shown). 비교적 효과가 높았던 것을 표 4에 나타낸다.
음이온 계면활성제의 타우로콜산 나트륨 수화물(농도 2%)의 경우, 컨트롤 라인은 회복했지만, 테스트 라인이 회복하지 않았다. 같이 음이온 계면활성제인 데옥시콜산(농도1∼5%), 및 라우로일사르코신(농도1∼5%)의 경우도 동일하게, 컨트롤 라인은 회복했지만, 테스트 라인의 회복이 충분하지 않았다(표 4). 도데실 황산나트륨(SDS)의 경우에는 테스트 라인도 약간 회복했지만, 검체에 첨가하고 있는 캄필로박터 균체량으로부터 생각하면 라인 강도는 충분하지 않고 반응은 회복 하고 있지 않다고 판단했다.
결국, 컨트롤 라인과 함께 테스트 라인도 회복하고, 동시에 음성양성 반응도 나타내지 않는 충분한 계면활성제를 찾아낼 수는 없었다.
Figure 112019089693739-pct00004
(2-2) 칼럼 수지로부터의 스크리닝
이어서, 특허문헌 2에서 인두 유래 검체의 전처리에 사용해서 인플루엔자 바이러스 검출에 효과가 있었던 설폰산기 또는 카복실기를 가지는 양이온 교환수지 등 각종 칼럼 수지로부터의 스크리닝을 실시했다.
6종의 강산성 양이온 교환수지, 2종의 약산성 양이온 교환수지, 8종의 강염기성 음이온 교환수지, 4종의 약염기성 음이온 교환수지 외에, 2종의 킬레이트 수지 및 4종의 합성 흡착제의 칼럼, 합쳐서 26종류에 대해서, 각각의 회복율을 측정했다. 그때, 양성 컨트롤로서는 PBS에 현탁한 캄필로박터 균액의 반응성을 100%로 하고, 그 회복율을 측정했다.
상세하게는, 소 타액 2.36㎖에 1% BSA 함유 붕산 완충액(pH 8.0) 21.24㎖를 첨가한 타액 희석액에 캄필로박터 사균 750㎕를 첨가한 시료를 준비하고, 상기의 각 수지를 약 0.5㎖씩 채워 넣은 칼럼에 대해서 시험용 시료 500㎕를 통액했다.
수득된 각 칼럼 통과액을 캄필로박터 검출 면역크로마토그래피(NH 면역크로마토그래피 캄필로박터(NH Foods Ltd)에 제공하고, 테스트 라인 및 컨트롤 라인에서의 반응성을 측정했다(표 5).
그 때, 저해 제거의 양성 컨트롤로서 PBS 23.6㎖에 상기 캄필로박터 사균 750㎕을 현탁한 액을 NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에 제공했을 때의 반응성을 100%로 하고, 기타의 칼럼을 통액시켰을 때의 테스트 라인 값으로부터 회복율을 산출했다.
Figure 112019089693739-pct00005
이것들의 칼럼에 의한 제1회째의 결과(표 5)에서는 강산성 양이온 교환수지 및 강염기성 음이온 교환수지 중에, 회복 효과가 높은 결과를 나타내는 수지가 복수 발견되었지만, 재차 추시를 실시하면 실험의 재현성이 부족하고, 안정된 효과가 수득되지 않았다.(Data not shown)
이온교환 수지 등을 칼럼에 채워 넣은 후, 방치 상태에서의 시간 경과와 함께 수지의 건조가 진행되어버리지만, 그 진행방법은 칼럼으로 채워 넣는 법, 그 때의 실내환경 등 다양한 요인에 따라 일정하지 않다. 그러한 칼럼 내의 수지의 건조 상태 불균일이 결과가 안정되지 않는 원인이라고 생각되었다.
(2-3) 강산성 양이온 교환수지의 안정성
이하의 실험에서는 (2-2)의 실험 중에서 가장 효과가 높았던 설폰산기를 가지는 강산성 양이온 교환수지 No.5(Mitsubishi Chemical Corporation.의 PK220)을 일단 면역 저해 억제제 후보로서 선택하고, 그 안정성을 시험했다.
강산성 양이온 교환수지의 경우, 칼럼에 채워 넣은 후 방치해 두면, 시간의 경과와 함께 수지가 건조해버린다. 그러한 칼럼 내의 수지의 건조 상태 격차(불균일)에 의해, 결과가 안정되지 않는 경향이 있었다. 거기에서, 강산성 양이온 교환수지 PK220(Mitsubishi Chemical Corporation.제)을 0.1% BSA 함유 붕산완충액에 현탁하고, 내경 약 0.8cm, 길이 약 1.0cm의 원추형의 칼럼에 0.3g 채워 넣고, 밀봉 혹은 봉하지 않고 1주일 통상의 실험실 환경에 방치하고, 그 안정성을 시험했다. 구체적으로는 타액 시료(R)을 10배 희석한 희석 타액 시료를 제작하고, 이에 대해서 구제역 바이러스(O/JPN/2010주)를 104TCID50/㎖가 되도록 혼화한 시료 60㎕를 구제역 항원검출 면역크로마토그래피에 제공했다. 그 결과, 표 6에 나타나 있는 바와 같이 수지의 건조에 의해 타액 중의 구제역 바이러스로의 반응성이 저하되는 것이 밝혀졌다.
Figure 112019089693739-pct00006
(2-4) 강산성 양이온 교환수지의 세정액에서의 저해 억제 효과
수지의 건조 상태의 불균일을 균일화하는 것을 당초가 목적으로 하고, 강산성 양이온 교환수지 PK220(Mitsubishi Chemical Corporation.) 6g을, 면역크로마토그래피용 0.1% BSA 함유 붕산 완충액 18㎖에 현탁해서 4℃에서 하룻밤 방치한 후의 수지를 세정 후의 수지로 해서 그 성능을 확인했다. 또 세정 후의 상청액을 회수했다. 세정 후의 수지와 함께, 비교예로서 세정 후의 상청에서의 타액 검체에 대한 구제역 항원검출 면역크로마토그래피의 컨트롤 라인의 반응성을 계측했다.
그 결과, 놀랍게도, 세정 후의 상청 쪽이 세정 후의 수지에 10배 가까운 강한 반응성을 나타냈다(표 7).
세정 후의 상청 쪽이 높은 저해 제거 활성을 나타낸 원인으로서는 저해 제거 물질이 수지 칼럼에 포함되는 0.1% BSA 함유 붕산 완충액에 가용인 것이었던 것이 추측되었다. 이것으로부터 설폰산기를 가지는 강산성 양이온 교환수지에 의한 면역 저해가 높은 억제효과는 강산성 양이온 교환수지 제조과정에서 생성되어 불순물로서 혼재하고 있었던 설폰산기를 가지는 저분자 화합물에 의한 것이었을 가능성이 높다.
Figure 112019089693739-pct00007
( 실시예 3) 설폰산기를 가지는 화합물의 면역반응 저해의 억제 효과 검토
(3-1) 타액검체에 의한 반응성 저해의 회복 효과
실시예(2-4)의 결과로부터 면역반응 저해의 억제효과가 높을 것이 기대되는 직쇄 알킬기를 가지는 각종 설폰산기 함유 저분자 화합물에 대해서, 실시예 1(1-1)에서 사용한 구제역 항원검출 면역크로마토그래피에서의 소 타액 검체에 의한 컨트롤 라인의 반응성으로의 저해가 회복하는지의 여부를 관찰했다.
그 결과, 가장 저농도에서 컨트롤 라인의 반응 저해를 회복시킨 것이, 직쇄 도데실벤젠설폰산염이었다. 이 때문에, 직쇄 도데실벤젠설폰산이 가장 저해 제거 효과가 높다고 추측되었다(표 8).
또, 직쇄 도데실벤젠설폰산염 이외의 각종 알킬설폰산염에서는 직쇄 알킬기의 탄소 수가 클 수록 저농도에서 효과를 나타내고, 그 효과가 높은 것을 확인할 수 있었다. 직쇄 알킬설폰산나트륨에서는 탄소 수 5 이상에서 컨트롤 라인이 회복했다. 직쇄 알킬벤젠설폰산 나트륨에서는 탄소 수 8 및 11의 알킬기를 가지는 경우에 컨트롤 라인이 회복하는 것을 확인할 수 있었다(표 8).
Figure 112019089693739-pct00008
(3-2) 최적의 첨가 농도의 검토
그래서, 직쇄 도데실벤젠설폰산염을 함유하는 면역크로마토그래피용 전개액에 대해서, 구제역 바이러스(O/JPN/2010주)를 106TCID50/㎖가 되도록 첨가한 타액을 첨가하고, 교반했다. 이 시험액을 구제역 항원 검출용 면역크로마토그래피에 제공했다.
직쇄 도데실벤젠설폰산염의 첨가 농도를 변화시켜서 검토한 바, 직쇄 도데실벤젠설폰산염의 첨가 농도는 0.05∼1.0(w/V)%의 범위라면 소 타액 중의 구제역 바이러스의 검출이 가능해서, 0.1∼0.8(w/V)%의 범위가 바람직한 것을 알 수 있었다(표 9).
Figure 112019089693739-pct00009
( 실시예 4) 지방족 또는 방향족 알킬설폰산염에 의한 면역반응 저해 억제 효과
(4-1) 구제역 바이러스의 검출 효과-1
저해 활성이 강한 소 타액을 사용하고, 본 발명의 설폰산나트륨 화합물에 의한 저해의 억제효과를 조사했다.
상세하게는, 소 타액검체 10㎕에 구제역 바이러스(O/JPN/2010주)를 106TCID50/㎖가 되도록 첨가 후, 통상 조성(Triton X-100 함유)의 전개액, 또는 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨 0.3(w/V)% 혹은 옥탄설폰산 나트륨 2.5w/V%를 첨가한 전개액에 10배 희석이 되도록 현탁하고, 실시예 1(1-1)에서 사용한 구제역 항원 검출 면역크로마토그래피에 의해 측정했다.
그 결과, 전개액만의 경우, 구제역 바이러스는 타액에 의한 저해 때문에 육안으로 검출할 수 없고, 테스트 라인의 리더 측정값으로도 0.0을 나타낸 것에 대해, 본 발명의 설폰산 나트륨 화합물을 타액 검체 중에 첨가해 두는 것으로 저해 작용이 억제되고, 육안으로도, 리더 측정값으로도 검출 가능하게 되었다(표 10).
또, 아울러서, 구제역 바이러스 함유 타액 검체를 포함하지 않을 경우에, 허위양성이 되지 않는 것도 확인했다(표 10).
이 결과는, 동시에, 전개액 중의 비이온성 계면활성제인 Triton X-100에는 면역 활성 저해가 강한 경우에는 억제효과가 거의 기대할 수 없다는 것을 나타내고 있다.
Figure 112019089693739-pct00010
(4-2) 구제역 바이러스의 검출 효과-2
이 실험에서는, 실시예 1(1-1)과 동일한 타액의 검체 수를 늘리고, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨을 첨가해서 실시하고, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨의 면역 저해 억제효과를 확인한다.
구체적으로는, 구제역 음성의 소 49마리로부터 채취한 타액을 Japan Bio Serum.에서 구입하고, 0.1% BSA 함유 붕산 완충액(pH 8.0)으로 10배 희석한 전개액을 작성하고, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨을 0.3(w/V)% 첨가했다. 이어서, 구제역 바이러스(O/JPN/2010주)를 104TCID50/㎖가 되도록 첨가하고, 교반했다. 각 140㎕를 구제역 항원 검출 면역크로마토그래피에 적하하고, 육안 및 리더에 의해 측정했다(도 3). 또, 검체 번호는 도 1과는 일치하지 않고 있다.
그 결과, 47/49 검체에서 올바르게 양성으로 판정할 수 있고, 실시예1-1에서 올바르게 판정할 수 있었던 것은 4/17 검체만인 것부터 보아, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨의 면역 저해 억제효과를 확인할 수 있었다.
(4-3 )알킬 벤젠 술폰산염에 의한 허위양성의 개선
본 실시예에서는 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨의 허위양성 억제효과를 확인한다.
구체적으로는, (4-2)에서 채취한 소 타액 가운데 구제역 음성에도 불구하고 구제역 항원 검출 면역크로마토그래피에서 양성이 되는 허위양성을 나타내는 타액을, 통상 전개액으로 10배에 희석한 것, 및 당해 희석액에 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨을 0.3(w/V)% 첨가한 것에 각각 첨가하고, 실시예 1(1-1)과 동일한 구제역 항원 검출 면역크로마토그래피로 측정했다.
그 결과, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨의 사용으로, 반응 저해뿐만 아니라 허위양성도 억제되는 것을 확인했다(표 11).
Figure 112019089693739-pct00011
( 실시예 5) 알레르겐 단백 항원의 검출 효과
본 실시예에서는 실시예 1(1-3)에서 타액 검체에 의해 거의 100%의 저해 활성이 관찰된 밀 단백질 검출 면역크로마토그래피(FASTKIT 슬림 밀, NH Foods Ltd)를 사용하고, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨에 의해, 반응성이 회복하는지의 여부를 확인한다.
그 결과, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨을 사용함으로써, 육안으로도, IC 리더 결과에서도, 검출 가능하는 정도로 회복하였다(표 12).
Figure 112019089693739-pct00012
( 실시예 6) 식중독 세균 O157의 검출
본 실시예에서는, 실시예 1(1-2)에서 타액 검체에 의해 40% 가까운 저해 활성이 관찰된 장관 출혈성 대장균 O157의 검출 면역크로마토그래피(NH 면역크로마토그래피 O157, NH Foods Ltd)를 사용하고, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨에 의해, 반응성이 회복하는지의 여부를 확인한다.
그 결과, 식중독 세균 O157 검출용 면역크로마토그래피에 대해서도, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨의 사용에 의해, 반응이 회복하고, 반응 저해 억제효과를 확인할 수 있었다(표 13).
Figure 112019089693739-pct00013
( 실시예 7) 제4 급 암모늄염의 스크리닝
설폰산나트륨이 타액에 의한 저해나 허위양성을 방지하는 것이 분명하게 되었기 때문에, 본 실시예에서는 설폰산 나트륨염과 전하나 구조의 점에서 유사하기 때문에 주목한 제4 급 암모늄염에 대해서 타액에 의한 저해나 허위양성 방지 효과가 없는지 검토했다.
구체적으로는, 하기 표14의 (1) 내지 (14)로 나타난 제4 급 암모늄염에 대해서, 실시예(3-1)과 동일하게, 실시예(1-1)에서 선택한 가장 저해 작용이 높은 소 타액을 사용하고, 1% BSA 함유 붕산 완충액(pH 8.0)으로 10배 희석한 전개액에 각 화합물을 첨가하고, 캄필로박터 검출용 면역크로마토그래피(NH 면역크로마토그래피 캄필로박터)에 의해 음성시험 및 양성시험을 실시했다.
Figure 112019089693739-pct00014
그 결과, (5)의 라우릴트리메틸 암모늄=클로라이드, (8)의 테트라부틸암모늄=플루오라이드, (11)의 3불화 2수소 테트라부틸암모늄, (13)의 도데실트리메틸암모늄=브로마이드, 및 (14)의 메틸트리옥틸 암모늄=클로라이드가 테스트 라인 및 컨트롤 라인 모두 회복시키고 있으므로, 본 발명의 면역 저해 억제제의 후보로 했다.
이어서, 가장 회복 효과가 높았던 (14)의 메틸트리옥틸암모늄=클로라이드에 관한 농도 조건의 검토를 실시했다.
그 결과, 메틸트리옥틸암모늄=클로라이드의 경우, 2.5∼5.0(V/w)%에서 캄필로박터 균을 검출 가능하게 되는 것이 밝혀졌다(Data not shown).
( 실시예 8) 제4 급 암모늄염의 면역반응 저해 효과
(8-1) 소ㆍ돼지 타액의 허위음성 해소에 관한 효과
실시예(1-2)에 있어서 컨트롤 라인이 저해되고, 허위음성이 된다고 생각되었던 소 타액 BS-K16에 캄필로박터 균액을 108CFU/㎖가 되도록 첨가(캄필로박터 첨가 타액)했다.
캄필로박터 첨가 타액을 제4 급 암모늄염을 PBS로 용해한 용액, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염을 PBS로 용해한 용액으로 10배 희석하고, NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에 제공했다.
또, 각 시약을 PBS에 용해하는 농도는 캄필로박터에 대한 반응성을 저해하지 않는 범위에서 가장 진한 농도를 선택했다.
그 결과, 라우릴트리메틸암모늄=클로라이드, 도데실트리메틸암모늄=브로마이드, 미리스틸트리메틸암모늄=브로마이드 등 C12∼C14의 알킬쇄를 가지는 제4 급 암모늄염이 타액에 의한 허위음성의 해소에 대해서 높은 효과를 나타냈다(표 15).
Figure 112019089693739-pct00015
(8-2) 소ㆍ돼지 타액의 허위양성 해소에 관한 효과
(8-1)에 있어서 허위양성을 나타낸 소ㆍ돼지 타액 검체를, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염을 PBS로 용해한 용액, 또는 직쇄 알킬 제4 급 암모늄염을 PBS로 용해한 용액으로 10배 희석하고, NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에 제공했다.
그 결과, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨과 마찬가지로, 라우릴트리메틸암모늄클로라이드 및 도데실트리메틸암모늄=브로마이드 모두 타액 유래의 허위양성을 억제하는 것이 확인되었다(표 16).
이상의 것으로부터, 제4 급 암모늄염에 대해서도, 각종 병원균 항원의 측정 시에 문제가 되는 면역 저해에 대해서, 직쇄 알킬기를 가지는 설폰산 화합물과 동일한 억제효과가 기대할 수 있음을 알 수 있다.
Figure 112019089693739-pct00016
( 실시예 9) O157 검출용 면역크로마토그래피에서의 타액의 저해 억제 효과
(9-1) 소ㆍ돼지 타액의 허위음성 해소에 대한 효과
우선, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 및 복수의 제4 급 암모늄염에 대해서, 각각 PBS로 용해한 1(w/V)% 용액을 NH 면역크로마토그래피 O157에 제공한 바, 표 17에 나타나 있는 바와 같이, 검토한 모든 화합물에서 음성이었으므로 이하의 실험에 사용했다.
Figure 112019089693739-pct00017
실시예(1-2)의 NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에서의 검토의 결과, 허위음성이 된다고 생각되었던 소 타액 BS-K16을 사용하고, O157 균액을 107CFU/㎖가 되도록 첨가(O157 첨가 타액)했다.
이어서 O157 첨가 타액을, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 또는 각제4 급 암모늄염을 PBS로 용해한 용액으로 10배 희석하고, NH 면역크로마토그래피 O157에 제공했다.
그 결과, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨, 및 라우릴트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄=브로마이드 및 미리스틸트리메틸암모늄=브로마이드 모두 타액 유래의 허위음성 해소에 유효한 것을 확인했다(표 18).
Figure 112019089693739-pct00018
(9-2) 소ㆍ돼지 타액의 허위양성 해소에 대한 효과
실시예(1-2)의 NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에서의 검토의 결과, 허위양성을 나타낸 타액(SS-K44)을, (9-1)과 동일하게, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 또는 제4 급 암모늄염을 PBS로 용해한 용액으로 10배 희석하고, NH 면역크로마토그래피 O157에 제공했다.
그 결과, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨, 및 라우릴트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄=브로마이드 및 미리스틸트리메틸암모늄=브로마이드 모두 타액 유래의 허위양성 해소에 유효한 것을 확인했다(표 19).
Figure 112019089693739-pct00019
( 실시예 10) 낙화생 알레르겐 검출용 면역크로마토그래피에서의 허위음성의 해소 효과
(10-1) 소ㆍ돼지 타액의 허위음성 해소에 대한 효과
실시예(1-2)의 NH 면역크로마토그래피 캄필로박터에서의 검토의 결과, 허위음성이 된다고 생각되었던 소 타액 BS-K16에 낙화생 단백을 1㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 낙화생 단백 첨가 타액 검체를 작성했다.
우선, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 또는 제4 급 암모늄염을 PBS로 용해한 용액이 사용 농도에서 허위양성을 나타내지 않는 것을 미리 확인했다(표 20).
Figure 112019089693739-pct00020
이어서, 낙화생 단백 첨가 타액 검체를, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 또는 제4 급 암모늄염을 PBS로 용해한 용액으로 10배 희석하고, FASTKIT 슬림 낙화생에 사용했다.
그 결과, 직쇄 도데실벤젠설폰산나트륨, 라우릴트리메틸암모늄클로라이드 및 미리스틸트리메틸암모늄=브로마이드에 의해 반응성을 회복할 수 있고, 타액 유래의 허위음성 해소에 유효한 것을 확인했다(표 21).
Figure 112019089693739-pct00021
( 실시예 11) 각종 알레르겐 검출용 면역크로마토그래피에서의 허위음성의 해소 효과
실시예 10 등에서 제4 급 암모늄염이 타액에 의한 허위음성의 해소에 유효한 것이 나타났기 때문에, 각종 알레르겐 키트에 대해서 이것들의 물질이 유효한지를 확인했다.
구체적으로는, 저해 활성이 강한 소 타액에 대해서 각종 알레르겐 단백을 첨가하고, 그 타액을 제4 급 암모늄염을 첨가한 전개액에 10배 희석함으로써 시료액을 제작하고, 이 시료액을 각종 알레르겐 검출용 면역크로마토그래피에 제공했다. 알레르겐 검출용 면역크로마토그래피로서는 계란, 밀, 낙화생, 갑각류를 사용했다.
그 결과, 복수의 제4 급 암모늄염으로 면역반응 저해 억제효과를 확인할 수 있었다(표 22).
Figure 112019089693739-pct00022
( 실시예 12) 캄필로박터 검출용 ELISA
본 실시예에서는 ELISA에서도 타액에 의한 허위양성이 있는지, 또 당해 허위양성이 면역크로마토그래피와 마찬가지로 본 발명의 제4 급 암모늄염 화합물로 해소되는지를 확인한다.
구체적으로는, 오사카 공중위생연구소에서 분여된 항 캄필로박터 모노클로널 항체(4B4: 일본 공개특허공보 2009-77658호 참조)를 5㎍/㎖의 농도로 플레이트에 고정화하고, 고상 플레이트를 작성했다.
이어서, 고상 플레이트에 캄필로박터를 107CFU/㎖ 포함하되도록 PBS 또는 각종 제4 급 암모늄염 화합물 함유PBS를 사용해서 10배 희석한 타액을 첨가하고, 1시간 인큐베이션하고, 세정했다. 다음에, 비오틴 표지 4B4를 2차 항체로서 1.6㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 1시간 인큐베이션하고, 세정했다.
계속해서, 스트렙타아비딘-HRP를 첨가하고, 30분간 인큐베이션하고, 세정 후, HRP 기질을 첨가해서 20분간 인큐베이션하고, 희석 황산액을 첨가하고, 반응을 정지시켰다.
그 후에 450nm 흡광도를 측정(reference 파장 620nm)했다.
그 결과, 표 23에 나타나 있는 바와 같이, ELISA에서도 제4 급 암모늄염의 첨가에 의해 타액에 의한 면역반응 저해가 회복하는 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112019089693739-pct00023
( 실시예 13) 알레르겐 검출 ELISA 키트에서의 타액에 의한 저해 억제 효과의 검증
각종 알레르겐 검출용 ELISA에서 타액에 의한 저해에서의 허위음성이 관찰되는지, 또, 면역크로마토그래피의 경우와 마찬가지로 본 발명의 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 또는 제4 급 암모늄염에 의해 회복하는지를 확인한다.
구체적으로는, 낙화생 알레르겐 검출용 ELISA 키트로서 「FASTKIT ELISA 낙화생(NH Foods Ltd)」을 사용하고, 소 타액 BS-K16 또는 PBS를 5㎕ 첨가한 낙화생 알레르겐 단백 50ng/㎖ 또는 25ng/㎖을 50㎕를, 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염 또는 제4 급 암모늄염의 PBS 용해 용액 45㎕로 희석하고, ELISA 키트에 제공했다.
그 결과, 타액을 첨가하면 반응성 저하가 보여지고, ELISA에서도 타액에 의한 저해가 확인되었다. 그리고 반응 용액 중에 제4 급 암모늄염의 라우릴트리메틸암모늄=클로라이드, 도데실트리메틸암모늄=브로마이드 또는 미리스틸트리메틸암모늄=브로마이드를 첨가함으로써 반응성이 회복하는 것을 확인했다(표 24).
Figure 112019089693739-pct00024
다른 알레르겐 단백질, 구체적으로는 밀, 참깨, 대두 알레르겐 단백질에 대해서, 각각의 알레르겐 검출용 ELISA 키트인 「FASTKIT ELISA 밀(NH Foods Ltd)」, 「FASTKIT ELISA 참깨(NH Foods Ltd)」, 「FASTKIT ELISA 콩(NH Foods Ltd)」를 사용해서 낙화생 알레르겐의 경우와 동일한 검사를 실시했다.
그 결과, 다른 알레르겐 단백질에서도 낙화생 알레르겐 단백질의 경우와 마찬가지로, 복수의 제4 급 암모늄염 또는 직쇄 도데실벤젠설폰산 나트륨염이 타액에 의한 면역반응 저해를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다(data not shown: 표 25).
Figure 112019089693739-pct00025

Claims (16)

  1. 면역 측정법에서의 시료 중의 생체 점막 유래의 체액에 유래하는 항원항체 반응에서의 허위양성 또는 허위음성 또는 이들 둘 다를 억제하는 면역반응 저해 억제제로서,
    이하의 (1) 및 (2)의 어느 하나의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 저해 억제제;
    (1) 「R1-SO3H」의 설폰산 화합물 또는 그 염,
    (2) 「N+-R2R3R4R5」의 제4급 암모늄이온 또는 그 염.
    상기 식에서, R1은 직쇄상의 C5∼C30알킬기, 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기로 치환된 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 직쇄상의 C5∼C30알킬기를 적어도 1개 가지는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있고,
    R2∼R5는 각각 독립해서 직쇄상의 C1∼C30알킬기, 또는 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C30알킬기에 의해 치환되어 있는 탄소환식 방향족기를 나타내고, 이것들의 기는 치환기를 가지고 있을 수도 있다.
  2. 제 1항에 있어서,
    (1)의 식에서, R1은 미치환의 직쇄상 C5∼C20의 알킬기이거나, 직쇄상의 C5∼C20의 알킬기를 가지는 페닐기로 치환된 직쇄상의 C1∼C20알킬기이거나, 또는 직쇄상의 C5∼C20의 알킬기로 치환된 페닐기인 면역반응 저해 억제제.
  3. 제 1항에 있어서,
    (2)의 식에서, R2∼R5는 각각 독립해서, 탄소환식 방향족기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C1∼C20알킬기, 또는 적어도 하나의 직쇄상의 C5∼C20알킬기로 치환되어 있는 탄소환식 방향족기인 면역반응 저해 억제제.
  4. 제 1항에 있어서,
    (2)의 식에서, R2∼R5는 각각 독립해서, 미치환 혹은 페닐기로 치환되어 있는 직쇄상의 C1∼C20알킬기, 또는 직쇄상의 C5∼C20알킬기로 치환되어 있는 페닐기인 면역반응 저해 억제제.
  5. 제 4항에 있어서,
    (2)의 식에서, R2∼R5가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나의 경우인 면역반응 저해 억제제;
    (a) R2∼R5 중 어느 1개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기이고, 다른 3개가 메틸기 혹은 에틸기인 경우,
    (b) R2∼R5 중 어느 1개가 메틸기 혹은 에틸기이고, 다른 3개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기인 경우,
    (c) R2∼R5의 전부가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기인 경우,
    (d) R2∼R5 중 어느 1개가 벤질기이고, 다른 3개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C3∼C20알킬기인 경우, 또는
    (e) R2∼R5 중 어느 2개가 메틸기 혹은 에틸기이고, 다른 2개가 페닐기로 치환될 수도 있는 직쇄상의 C6∼C20알킬기인 경우.
  6. 제 5항에 있어서,
    (2)의 식에서, R2∼R5가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나의 경우인 면역반응 저해 억제제;
    (a) R2∼R5 중 어느 1개가 직쇄의 C3∼C16알킬기이고, 다른 3개의 R2가 메틸기인 경우,
    (b) R2∼R5 중 어느 1개가 메틸기이고, 다른 3개가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우,
    (c) R2∼R5의 전부가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우,
    (d) R2∼R5 중 어느 1개가 벤질기이고, 다른 3개가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우, 또는
    (e) R2∼R5 중 어느 2개가 메틸기이고, 다른 2개가 직쇄의 C3∼C12알킬기인 경우.
  7. 제 1항에 있어서,
    (2)가 암모늄이온의 염으로서, 할로겐화 수소, 질산, 헥사플루오로 인산, 3불화 2수소, 및 과염소산인 그룹에서 선택된 화합물과의 염인 면역반응 저해 억제제.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 면역반응 저해 억제제를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역 측정방법.
  9. 피험체의 생체 점막 유래의 체액을 함유하는 시료 중의 피검물질을 측정하는 ELISA, 면역크로마토그래피법, 웨스턴 블롯법, 면역 블롯법, 면역 침강법, 및 라텍스 응집법에서 선택된 어느 하나의 면역 측정법에 있어서, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 면역반응 저해 억제제를 사용하는 것을 포함하는 항원항체 반응에서의 허위양성 또는 허위음성 또는 이들 둘 다가 억제된 면역 측정방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    피험체의 생체 점막 유래의 체액을 함유하는 시료가 타액, 객담, 인두 면봉, 비강 면봉, 비강 흡인액, 및 각결막 면봉으로부터 선택된 생체 점막 유래의 체액을 적어도 1종 함유하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    피검물질이 병원체, 병원 미생물, 호르몬, 염증 관련 물질, 프로스타글란딘, 및 메타볼릭 신드롬 관련 물질로 이루어지는 그룹에서 선택된 물질인 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 병원체 또는 병원 미생물이 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노 바이러스, RS 바이러스, 코로나 바이러스, 광견병 바이러스, 백일해균, 용혈성 연쇄구균, 대장균, 식중독 세균, 클라미디아ㆍ트라코마티스 및 마이코플라즈마로부터 선택된 병원체 또는 병원 미생물인 방법.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 면역반응 저해 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 측정용 키트.
  14. 제 13항에 있어서,
    면역 측정용 키트가 ELISA, 면역크로마토그래피법, 웨스턴 블롯법, 면역 블롯법, 면역 침강법, 및 라텍스 응집법에서 선택된 어느 하나의 면역 측정법을 위한 키트인 키트.
  15. 피험체가 병원성 질환에 이환하고 있는지의 여부를 피험체의 생체 점막 유래의 체액을 사용해서 면역반응에 의해 진단하기 위한 키트로서,
    피검체액 시료의 희석제, 전개액, 블록킹액의 적어도 하나에 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 기재된 면역반응 저해 억제제가 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  16. 제 15항에 있어서,
    병원성 질환이 구제역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노 바이러스, RS 바이러스, 코로나 바이러스, 광견병 바이러스, 백일해균, 용혈성 연쇄구균, 대장균, 식중독 세균, 클라미디아ㆍ트라코마티스 및 마이코플라즈마로부터 선택된 병원체 또는 병원성 미생물에 의해 발생되는 질환인 것을 특징으로 하는 키트.
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