JP5467228B2 - 便中のカンピロバクターの迅速検出方法 - Google Patents
便中のカンピロバクターの迅速検出方法 Download PDFInfo
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Description
Lu P et al. Int J Food Microbiol. 37(1): 87-91 (1997) Brooks BW et al. Immunol Invest. 27(4-5):257-265 (1998) Steele M et al. J Clin Microbiol. 40(3): 1080-1082 (2002) Hindiyeh M et al. J Clin Microbiol. 38(8):3076-3079 (2000)
(1)モノクローナル抗体4B4と便試料とを接触させることを特徴とする、便中のカンピロバクターの検出方法;
(2)(a)検出可能な標識を付したモノクローナル抗体4B4を便試料と反応させて複合体を形成させること、次いで、
(b)(a)で得られた複合体を、固相上に固定化されたモノクローナル抗体4B4と反応させて、形成されたさらなる複合体を該標識を用いて検出すること
を特徴とする(1)記載の方法;
(3)工程(b)がイムノクロマトグラフィー法またはELISA法を用いて行われる(2)記載の方法;
(4)モノクローナル抗体4B4と便試料とを接触させる前に、便試料を界面活性剤で処理する工程を含む(1)ないし(3)のいずれかに記載の方法;
(5)モノクローナル抗体4B4を必須構成成分として含む、便中のカンピロバクターを検出するためのキット;
(6)イムノクロマトグラフィー法またはELISA法を用いるものである(5)記載のキット;
(7)便試料がヒトから得られたものである(1)ないし(4)のいずれかに記載の方法、あるいは(5)または(6)記載のキット;
(8)独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受領番号FERM AP−21368を付与されたハイブリドーマ;
(9)(8)記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体4B4
を提供するものである。
(I)菌体抽出抗原の調製
下記手順により細菌を培養し、抗原を抽出した。
(1)寒天培地シャーレ1枚分の培養細菌をリン酸緩衝食塩水(PBS)1mlに懸濁した。
(2)15000rpmで5℃、5分間遠心した。
(3)上清を捨てた後、沈渣をPBS 1mlに再度懸濁した。
(4)15000rpmで5℃、5分間遠心した。
(5)上清を捨てた後、沈渣をB-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(PIERCE, Rockford, IL)1mlに懸濁した。
(6)懸濁液を室温で15分間攪拌した。
(7)15000rpmで5℃、5分間遠心し、その上清を菌体抽出抗原とした。
下記手順によりカンピロバクター抽出抗原を用いてマウスを免疫した。
(1)C. jejuni(Lior血清型7)の臨床分離株を使って調製した菌体抽出抗原(蛋白濃度1.2mg/ml)とFreund's complete adjuvantの等容量混合乳濁液を5匹のBALB/cマウス(SPF−grade,雌、8週齢)のそれぞれの腹腔内に0.1ml接種した。
(2)3、5、7及び11週間後、同じ菌体抽出抗原とFreund's incomplete adjuvant等容量混合乳濁液をそれぞれのマウスの腹腔内に0.1ml追加免疫した。
(3)最後の追加免疫から2週間後、それぞれのマウスの眼底静脈叢から採血し、血清抗体の力価を、酵素免疫測定法(ELISA、詳細は(III)に後記)により測定し、高度免疫されたマウスを選抜した。
(4)細胞融合3日前に、最も高いELISA抗体価を示した免疫マウスの腹腔内に、菌体抽出抗原のみを0.5ml(0.6mg)を最終免疫した。
上で得られたマウスの血清抗体価を、以下の手順により測定した。
(1)免疫抗原(C. jejuni(Lior血清型7)の臨床分離株を使って調製した菌体抽出抗原)を0.05M炭酸バッファー pH9.6で0.01mg/mlに希釈して、マイクロタイタープレートのウエルに0.1ml分注し、4℃で一夜放置した。
(2)抗原液をプレートから除去した後、ブロッキング液(20%馬血清を含むPBS)を0.15ml加えて室温1時間反応させた。
(3)ブロッキング液を除去した後、洗浄液(0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄した。
(4)血清試料の10倍階段希釈液(マウス血清を、20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで希釈したもの)を0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(5)洗浄液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで1000倍に希釈したものを0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(6)洗浄液で4回洗浄後、酵素基質(1-Step Ultra TMB-ELISA:PIERCE)を0.1ml加えて、室温10分間反応させた後、反応停止液(1M硫酸)を0.1ml加えてから、吸光度の自動計測装置を用いて450nmにおける吸光度を計測した。
下記手順に従って、免疫マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞を融合させた。
(1)最終免疫から3日後、マウスから脾臓を取り出し、Pre-Fusion Medium(StemCell Technology, Vancouver, BC, Canada)を入れたシャーレに置き、洗浄した。
(2)洗浄後の脾臓をPre-Fusion Mediumの入った別のシャーレに移し、ピンセットでホモジナイズした。
(3)脾臓のホモジナイズ液をナイロンメッシュで濾過し、均一な細胞懸濁液を得た。
(4)マウスリンパ球比重分離液(日本抗体研究所)を使って赤血球を除去した後、Pre-Fusion Mediumで3回遠心洗浄した(1600rpm,6分×3回)。
(5)3回洗浄後に、Fusion Medium(StemCell Technologies)25mlに懸濁し、それをPBSで10倍希釈したものの細胞数を測定した。(1匹の免疫マウスより、約1×108個の脾臓細胞が得られた)
(6)脾臓細胞懸濁液(約1×108個の脾臓細胞をFusion Mediumの25mlに懸濁したもの)に2×107個のミエローマ細胞(P3−X63−Ag8.U1)を加えた(細胞比;脾臓細胞:ミエローマ細胞=5:1)後、遠心した(1600rpm,6分)。
(7)遠心後、血清成分を完全に除去するために、予め37℃に保温したFusion Medium 25mlで3回遠心洗浄した(1600rpm,6分)。
(8)細胞沈渣をFusion Medium 10mlに浮遊させ、10ml丸底チューブに移して1600rpm,6分遠心した。
(9)遠心後、上清を完全に除去した。
(10)細胞をタッピングで十分にほぐした後、1mlの40%PEG溶液(40gのPEG−4000を50mlのPBSに溶解後、10mlのDMSOと1mlのポリ−L−アルギニン塩酸塩水溶液(1mg/ml)を加えて、最後に1N HClを加えてpHを約7.8に調製したもの)をピペットの先端で細胞を緩やかに攪拌しながら1分間かけて添加した。
(11)更に1分間、細胞を攪拌した。
(12)Fusion Medium 1mlをピペットの先端で細胞を緩やかに攪拌しながら1分間かけて添加した。
(13)Fusion Medium 1mlをピペットの先端で細胞を緩やかに攪拌しながら1分間かけて添加した。
(14)Fusion Medium 7mlをピペットの先端で細胞を緩やかに攪拌しながら(1mlずつ7回に分けて)3分間かけて添加した。
(15)1000rpm,5分遠心し上清を捨てた。
(16)細胞をタッピングで優しくほぐした後、Pre-Fusion Medium 10mlに懸濁し1000rpm,5分遠心した。
(17)1000rpm,5分遠心し上清を捨てた。
(18)細胞をタッピングで優しくほぐした後、Hybridoma Recovery Medium(StemCell Technologies)10mlに懸濁する。
(19)懸濁液10mlをHybridoma Recovery Mediumが40ml入った中フラスコに移した。
(20)37℃で18時間培養した。
上で得られた融合細胞を、下記手順にてり選択培養し、クローニングを行った。
(1)37℃で18時間培養した融合細胞懸濁液(50ml)を1600rpm,6分遠心した。
(2)細胞沈渣をタッピングで優しくほぐした後、Hybridoma Recovery Mediumの10mlに懸濁した。
(3)懸濁液10mlをHybridoma Selection Medium(ヒポキサンチン・チミジン・アミノプテリン添加軟寒天培地、StemCell Technologies)が90ml入ったボトルに移し、なるべく泡立たないようにして、ボトルを数回逆さに反転させながら中身を完全に混ぜ合わせた。
(4)ボトルの蓋を完全に閉めて、37℃に15分間静置した。
(5)25枚の60mmペトリデイッシュのそれぞれに4mlずつ分注した。
(6)37℃、5%CO2で10〜13日間培養した。
上で得られた融合細胞のコロニーを採取し、ELISAにて陽性クローンを検出し、再クローニングした。手順は下記のとおり。
(1)培養開始後10〜14日の間に、各ペトリデイッシュから融合細胞コロニーを採取した。
(2)20μlにセットした20μlピペットマンを使って融合細胞コロニーを採取し、Hybridoma Groth Medium(ヒポキサンチン・チミジン添加培地、StemCell Technologies)が200μl/ウエル入った96ウエルマイクロプレートのウエルに移した。
(3)最終的に、融合細胞を培養した25枚のペトリデイッシュから、計1714個の融合細胞コロニーを採取し、Hybridoma Growth Mediumが200μl/ウエル入った96ウエルマイクロプレートの各ウエルにそれぞれ移した。
(4)37℃、5% CO2で4〜6日間培養した。
(5)培養後、各培養上清に含まれる免疫抗原に対する抗体価をELISA(詳細は(VII)に後記)で測定した。
(6)ELISAで陽性であった55ウエルの細胞懸濁液のそれぞれをHybridoma Growth Mediumが1ml/ウエル入った24ウエルプレートの各ウエルに移し37℃、5% CO2で3〜4日間培養した。
(7)培養後、各培養上清に含まれる抗体の各種菌由来の菌体抽出抗原に対する反応性をELISA(詳細は(8)に後記)を用いて検討した。
(8)ELISAの結果、培養上清がC. jejuni及びC. coliから調製された菌体抽出抗原には陽性反応を示したが、その他の菌種から調製された菌体抽出抗原には反応を示さなかった12ウエルについて、その中の融合細胞(ハイブリドーマ)を再クローニングした。
上で得られたハイブリドーマ培養上清中の抗体価を、下記手順にて測定した。
(1)免疫抗原(C. jejuni(Lior血清型7)の臨床分離株を使って調製した菌体抽出抗原)を0.05M炭酸バッファー pH9.6で0.01mg/mlに希釈して、マイクロタイタープレートのウエルに0.1ml分注し、4℃で一夜放置した。
(2)抗原液をプレートから除去した後、ブロッキング液(20%馬血清を含むPBS)を0.15ml加えて室温1時間反応させた。
(3)ブロッキング液を除去した後、洗浄液(0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄した。
(4)培養上清の10倍希釈液(マウス血清を、20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで希釈したもの)を0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(5)洗浄液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで1000倍に希釈したものを0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(6)洗浄液で4回洗浄後、酵素基質(1-Step Ultra TMB-ELISA:PIERCE)を0.1ml加えて、室温10分間反応させた後、反応停止液(1M硫酸)を0.1ml加えてから、吸光度の自動計測装置を用いて450nmにおける吸光度を計測した。
上記ハイブリドーマ培養上清中の抗体の各種細菌由来の抗原に対する反応性を、下記手順にて調べた。
(1)C. jejuni 3株(Lior血清型2,7及び9)、C. coli 1株、Aeromonas hydrophira、Enterobacter aerogenes、Proteus vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Salmonella enteritidis及びVibrio cholera各1株からそれぞれ菌体抽出抗原を調製した。それぞれの菌体抽出抗原を0.05M炭酸バッファー pH9.6で0.01mg/mlに希釈して、マイクロタイタープレートのウエルに0.1ml分注し、4℃で一夜放置した。
(2)抗原液をプレートから除去した後、ブロッキング液(20%馬血清を含むPBS)を0.15ml加えて室温1時間反応させた。
(3)ブロッキング液を除去した後、洗浄液(0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄した。
(4)培養上清の10倍希釈液(マウス血清を、20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで希釈したもの)を0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(5)洗浄液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで1000倍に希釈したものを0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(6)洗浄液で4回洗浄後、酵素基質(1-Step Ultra TMB-ELISA:PIERCE)を0.1ml加えて、室温10分間反応させた後、反応停止液(1M硫酸)を0.1ml加えてから、吸光度の自動計測装置を用いて450nmにおける吸光度を計測した。
上記ELISAにて選抜した12個のクローンにつて、培養規模を拡大して培養を行った。手順は下記のとおり。
(1)ELISA(詳細は(VIII)に前記)の結果により選抜された12ウエル中のそれぞれのハイブリドーマクローンについて、細胞数を測定し、Pre-Fusion Mediumを使って、細胞濃度300個/mlの細胞懸濁液を調整した。
(2)その0.5ml(細胞数150個)をHybridoma Selection Medium 9.5mlと混合し、37℃、5% CO2に15分間静置した。
(3)それを2枚の60mmペトリデイッシュに4ml/ペトリデイッシュで泡立たないようにして分注し、残りは捨てた。
(4)37℃、5% CO2で10〜14日間培養した。
(5)10〜14日間後、各ペトリデイッシュのコロニーを肉眼で観察した。
(6)20μlにセットした20μlピペットマンを使って各コロニーを採取し、Hybridoma Growth Mediumが200ul/ウエル入った96ウエルマイクロプレートの各ウエルに移す。コロニーは、1クローン(ペトリデイッシュ2枚)につき大きいものから順に計24個採取した。
(7)37℃、5% CO2で3〜4日間培養した。
(8)上清を採取し、ELISA(詳細は(7)に前記)で抗体価を測定した。
(9)培養上清のELISA抗体価高く、かつ細胞の増殖状態の良いものを、1クローンにつき1ウエル選抜し、Hybridoma Growth Mediumが1ml/ウエル入った24ウエルプレートのウエルに移し37℃、5% CO2で3〜4日間培養した。
(10)培養後、適当量のHybridoma Growth Mediumに懸濁(細胞濃度1〜2×105個/mlに調整)して培養規模を拡大し、37℃、5% CO2で2日間培養した。
(11)培養後、適当量のHybridoma Growth Mediumに懸濁(細胞濃度1〜2×105個/mlに調整)して培養規模を拡大し、37℃、5% CO2で2日間培養した。
(12)培養後、Hybridoma Expantion Medium(StemCell Technologies)/Hybridoma Growth Mediumの50%混合液の適当量に懸濁(細胞濃度1〜2×105個/mlに調整)して、37℃、5% CO2で2日間培養した。
(13)Hybridoma Expantion Mediumを用いて順次、培養規模を拡大し、適当な時期に、細胞を凍結保存した。
(注)Hybridoma Expantion Mediumは、20% FCS、2mM グルタミン、0.05mM 2−メルカプトエタノール、トランスフェリン 0.006mg/ml、インスリン 0.02mg/ml及び抗生物質(ペニシリン 100単位/ml、ストレプトマイシン 0.1mg/ml、アンフォテリシンB 0.00025mg/ml)を含むイスコフ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)でも代用可能である。
下記手順により、再クローニング後の12クローンを大量培養して、モノクローナル抗体を得た。
(1)再クローニング後の12クローンのそれぞれを、Hybridoma Expantion Mediumを用いて大量培養し、Fusion Mediumで2回洗浄して細胞浮遊液(2×107個/ml)を調製した。
(2)24匹の8週齢の雄性BALB/cマウスにプリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン,Aldrich Chemicals)0.5mlを腹腔内注射し、一週間後更に0.5mlを腹腔内注射した。
(3)約3日後に前記の細胞浮遊液を1ml腹腔内注射した(1クローンにつき、2匹のマウスに注射した)。
(4)約7〜12日間で腹水が貯留して腹部が肥大したので、注射器により腹水採取した。こうしてマウス1匹当り5〜10mlの腹水が得られた。
(5)得られた腹水を冷凍遠心分離(4℃、3000rpm、10分)して上清を集め、この上清に等容量の飽和硫酸アンモニア溶液(アンモニア水でpH7.4に調製)を滴下して塩析を行った。
(6)高速遠心分離(4℃、14,000rpm:10,000xG,30分)して上清を除去し、塩析沈殿物を適当量のPBS(−)に溶解した。
上で大量調製されたモノクローナル抗体を、下記手順により精製した。
(1)塩析した抗体試料は、Protein A-Agaroseカラムクロマトグラフィーにより精製を行った。
(2)Protein A-Agarose充填カラム(ゲル5ml:Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を5ベット容量の結合緩衝液(pH9.0:BioRad)で洗浄した。
(3)タンパク濃度約10mg/mlの抗体試料を前記結合緩衝液と等容量の割合で混合し、その5mlを前記のカラムにアプライした。
(4)15ベット容量の結合緩衝液によりカラムを洗浄した後、5ベット容量の溶出緩衝液(pH3.0:BioRad)によりマウスIgG画分を溶出した。溶出液のpHを中性に中和する目的で、溶出液1ml当り0.3mlの1M Tris−HCl緩衝液(pH9.0)を予め受器に入れておいた。
(5)精製抗体画分は分子篩(分子量:30,000)を用いる限外濾過により濃縮した後、PD−10カラム(アマシャム)を用いるゲル濾過により溶媒をPBSに置換した。
(6)得られた精製抗体溶液のタンパク濃度を5mg/mlに調製した後、凍結保存した。
上で大量調製したモノクローナル抗体からイムノクロマト法に使用可能な抗体を選別し、そのアイソタイプを決定した。手順は下記のとおり。
(1)大量調製した12種類のモノクローナル抗体のそれぞれを用いて、12種類の抗体固相化メンブレン(作製法は後記)と12種類の金コロイド標識抗体(作製法は後記)を作製した。
(2)144通りの抗体固相化メンブレンと金コロイド標識抗体の組み合わせのそれぞれについて、C. jejuni (Lior血清型7)の菌体抽出抗原を検出対象にしてイムノクロマト法を実施した。
(3)その結果、144通りの組み合わせの中で、1通りのみ(抗体固相化メンブレンも金コロイド標識抗体も、共に同じ抗体の組み合わせ)が陽性反応を示した。この抗体を4B4抗体と命名した。4B4抗体をカンピロバクターの迅速検出法に使用することにした。
(1)4B4抗体のアイソタイプは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット(IsoStrip; Roche Diagnostics, Indianapolis)を使用した。
(2)その結果、4B4抗体のアイソタイプはIgG1(k)サブクラスであった。
(I)4B4抗体が認識する抗原のELISAによる解析
4B4モノクローナル抗体がどのような抗原を認識するのかを、下記手順にて調べた。
(1)4B4抗体が認識する抗原が、菌体表面に存在するかどうかを、C. jejuni(Lior血清型7)の生菌体を固相化抗原として用いたELISA法により、以下の手順で調べた。
(2)生菌体を0.05M炭酸バッファー pH9.6で約1×107個/mlに希釈して、マイクロタイタープレートのウエルに0.1ml分注し、4℃で一夜放置した。
(3)抗原液をプレートから除去した後、ブロッキング液(20%馬血清を含むPBS)を0.15ml加えて室温1時間反応させた。
(4)ブロッキング液を除去した後、洗浄液(0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄した。
(5)4B4抗体希釈液(精製4B4抗体を、20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで0.01mg/mlに希釈したもの)を0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(6)洗浄液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを20%馬血清と0.05% Tween20を含むPBSで1000倍に希釈したものを0.1ml加えて、室温1時間反応させた。
(7)洗浄液で4回洗浄後、酵素基質(1-Step Ultra TMB-ELISA:PIERCE)を0.1ml加えて、室温10分間反応させた後、反応停止液(1M硫酸)を0.1ml加えてから、吸光度の自動計測装置を用いて450nmにおける吸光度を計測した。
(8)4B4抗体希釈液を添加したウエルは、高い吸光度(2.811)を示したので、4B4抗体は、菌体の表面に存在する抗原に結合することがわかった。
下記手順により、4B4抗体が認識する菌体抗原の分子量を調べた。
(1)免疫抗原(C. jejuni(Lior血清型7)の臨床分離株を使って調製した菌体抽出抗原)にSDS−PAGEサンプルバッファー(62.5mM Tris−HCl pH6.8,2% SDS,1% 2−メルカプトエタノール,10%グリセロール,0.01%ブロモフェノールブルー)を4倍量加えたものを100℃3分間加熱して、SDS−PAGEサンプルとした。
(2)上記サンプルについて、2枚のゲル(15%分離ゲル)を使ってSDS−PAGEを実施し、1枚をPVDFメンブレンに転写し、残りの1枚をCoomassie染色した。
(3)転写後のメンブレンは0.1% Tween20を含むトリス塩酸緩衝食塩水(タカラバイオ)で洗浄後、ブロックエース(雪印)を使ってブロッキングした。
(4)洗浄後のメンブレンに、4B4抗体希釈液(精製4B4抗体を、0.1% Tween20を含むトリス塩酸緩衝食塩水で0.02mg/mlに希釈したもの)で室温1時間反応させた。
(5)洗浄後のメンブレンに、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを0.1% Tween20を含むトリス塩酸緩衝食塩水で4000倍に希釈したものを、室温1時間反応させた。
(6)洗浄後のメンブレンに、酵素基質(TMB Membrane Peroxidase Substrate:フナコシ)を、室温5分間反応させた。
(7)メンブレンを大量の蒸留水で洗浄後、出現したバンドの位置を分子量マーカー(BioRad)及びCoomassie染色したゲルと比較した。その結果、4B4抗体は、分子量約15キロダルトンの菌体タンパク質を認識することが示された(図1参照)。
下記手順に従って、本発明のモノクローナル抗体4B4を用いたイムノクロマト法の感度を調べた。
(I)被検菌原液の調整及びそこに含まれる菌数の測定
(1)患者から分離される頻度の高い9種類の血清型(Lior血清型1,2,4,7,11,27,28,36及び50)を含む18種類の血清型から成る18菌株と血清型別不能な5株、計23株のC. jejuniを用いた。
(2)血液寒天培地シャーレ1枚分の培養菌をリン酸緩衝食塩水(PBS)1mlに懸濁し、被検菌原液とした。
(3)被検菌原液を、PBSを用いて10段階希釈した。
(4)菌原液に含まれる菌数を算出するため、各段階希釈液の0.01mlを血液寒天培地に接種し、培養後のコロニーをカウントした。
(5)カウントしたコロニー数から菌原液に含まれる菌数を算出した。
(1)被検菌原液及びその段階希釈液に、B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(PIRCE, Rockford, IL)を等量添加した。
(2)ボルテックスで1分間攪拌した。
(3)15000rpmで5℃、5分間遠心し、その上清を被検液とした。
(4)96ウエルマイクロプレートのウエル内で、被検液0.03mlと金コロイド標識4B4抗体希釈液(−20℃保存した金コロイド標識4B4抗体溶液を1.0% BSA、2% TritonX100を含む0.1M トリス塩酸緩衝液 pH10.5で10倍希釈したもの)0.03mlを混合した。
(5)そのウエル内の混合液の中に、抗体固相化メンブレンの先端を浸漬した。
(6)15分後、明瞭なバンドが認められた場合、陽性とした。
(7)陽性反応が認められた最終希釈菌液に含まれる菌数(最小検出菌数)を、菌原液に含まれる菌数を最終希釈液の希釈倍数で割ることにより算出した。
本発明のモノクローナル抗体4B4を用いたイムノクロマト法の特異性について、下記手順により調べた。
(I)被検菌原液の調整及びそこに含まれる菌数の測定
(1)カンピロバクター属の5菌種(計8株)とカンピロバクター属以外の26菌種(計26株)を用いた。
(2)寒天培地シャーレ1枚分の培養菌をリン酸緩衝食塩水(PBS)1mlに懸濁し、被検菌原液とした。
(3)被検菌原液を、PBSを用いて段階希釈した。
(4)菌原液に含まれる菌数を算出するため、各段階希釈液の0.01mlを寒天培地に接種し、培養後のコロニーをカウントした。
(5)カウントしたコロニー数から菌原液に含まれる菌数を算出した。
(1)被検菌原液及びその段階希釈液に、B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(PIRCE, Rockford, IL)を等量添加した。
(2)ボルテックスで1分間攪拌した。
(3)15000rpmで5℃、5分間遠心し、その上清を被検液とした。
(4)96ウエルマイクロプレートのウエル内で、被検液0.03mlと金コロイド標識4B4抗体希釈液(−20℃保存した金コロイド標識4B4抗体溶液を1.0% BSA、2% TritonX100を含む0.1M トリス塩酸緩衝液 pH 10.5で10倍希釈したもの)0.03mlを混合した。
(注)カンピロバクター属以外の26菌種については、菌原液から調製された被検液でのみイムノクロマト法を実施した。
(5)そのウエル内の混合液の中に、抗体固相化メンブレンの先端を浸漬した。
(6)15分後、明瞭なバンドが認められた場合、陽性とした。
(7)陽性反応が認められた最終希釈菌液に含まれる菌数(最小検出菌数)を、菌原液に含まれる菌数を最終希釈液の希釈倍数で割ることにより算出した。
C. jejuni, C. coli, C. lariは、血液寒天培地(Blood Agar Base No.2 [Oxoid Ltd., Basingstoke, United Kingdom] に無菌馬脱繊血を7%の割合で加えたもの)上において、42℃、微好気下(アネロパック微好気、三菱ガス化学製を使用)で培養した。Campylobacter fetus subsp. fetus, Campylobacter fetus subsp. venerealis, C. upsaliensisi, Arcobacter butzleri, Arcobacter skirrowii, Helicobacter pyloriは、血液寒天培地上において、37℃、微好気下で培養した。Arcobacter cryaerophilusは、血液寒天培地上において、30℃で、微好気下で培養した。その他の菌種は、brain heart infusion寒天培地(brain heart infusion[Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD.]にBacto agar[Becton Dickinson]を1.5%の割合で加えたもの)上において、37℃で培養した。他の細菌の培養については常法により行った。
先ず、タンパク質抽出剤(B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(PIERCE)、50%)を含有する水に患者大便試料を懸濁して乳剤を得た。この操作により、試料中にカンピロバクターが存在する場合には、カンピロバクター菌体表面の4B4抗原タンパク質が遊離される。乳剤を遠心分離して菌体を沈降させて上清を得た。上清中に4B4抗原タンパク質の大部分が存在する。上清を本発明のモノクローナル抗体4B4(金コロイド標識したもの)と反応させて複合体を形成させた。このようにして得られた複合体を含む上清を、常法によりイムノクロマトにかけた。イムノクロマトの固相にも4B4抗体をバンド状に固定化しておいた(物理的吸着法により固定化)。約15分置くと、上記複合体と固相の4B4抗体との間でさらなる複合体が形成され、上記標識により検出可能となったバンドが出現した。このバンドの出現により試料中にカンピロバクターが存在すること(陽性であること)がわかった。この実験の手順の概略を図2に示す。
Claims (10)
- 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM P−21368を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体4B4と便試料とを接触させることを特徴とする、便中のカンピロバクターの検出方法。
- (a)検出可能な標識を付したモノクローナル抗体4B4を便試料と反応させて複合体を形成させること、次いで、
(b)(a)で得られた複合体を、固相上に固定化されたモノクローナル抗体4B4と反応させて、形成されたさらなる複合体を該標識を用いて検出すること
を特徴とする請求項1記載の方法。 - 工程(b)がイムノクロマトグラフィー法またはELISA法を用いて行われる請求項2記載の方法。
- モノクローナル抗体4B4と便試料とを接触させる前に、便試料を界面活性剤で処理する工程を含む請求項1ないし3のいずれか1項記載の方法。
- 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM P−21368を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体4B4を必須構成成分として含む、便中のカンピロバクターを検出するためのキット。
- イムノクロマトグラフィー法またはELISA法を用いるものである請求項5記載のキット。
- 便試料がヒトから得られたものである請求項1ないし4のいずれか1項記載の方法。
- 便試料がヒトから得られたものである請求項5または6記載のキット。
- 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM P−21368を付与されたハイブリドーマ。
- 請求項9記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体4B4。
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