CN110146697B - 一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条 - Google Patents

一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条 Download PDF

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Abstract

一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条，由样品垫、胶体金探针垫、纤维素膜和吸水垫组成，其中胶体金上含有胶体金标记抗体，纤维素膜上设有三条检测线、一条质控线。所述胶体金探针垫包含由胶体金标记的特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体和胶体金标记的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体两种胶体金探针组成。所述三条检测线包括特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体、特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体、特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。本发明一次检测即可区分恶性疟、间日疟和三日疟/卵形疟，具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种胶体金免疫层析试纸条，具体来说是一种基于检测循环抗原的可以快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的疫试纸条。
背景技术
疟疾是严重危害人类健康的寄生虫病之一，是世界卫生组织列为的全球三大公共卫生问题之一。2016年，全球仍有91个国家和地区流行疟疾，有2.16亿新发病例，约44.5万人死于疟疾。我国一直以来都是疟疾流行区，自2010年国家启动消除疟疾行动计划以来，本地感染疟疾病例数呈持续下降趋势，至2016 年，全国本地感染病例数仅有3例。2011～2016年我国报告的输入性疟疾病例数累计近2万例，平均每年3000例以上。非洲和东南亚是我国输入性疟疾的主要来源地，输入性病例虫种多样，4种人体疟原虫(间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫)均有发现。输入性疟疾不仅严重危害我国人民的身体健康和生命安全，同时存在很大的继发传播风险，对我国的消除疟疾行动工作提出了挑战。
利用免疫层析技术发展起来的免疫层析试纸条(Immunochromatographic trips；ICT，又简称Dipstick)，优点是操作简便，耗时短，判断直观明确，不依赖专门仪器设备和专业技术经验。目前已有多种疟疾诊断的免疫试纸条产品问世并广泛在实验室和现场使用，如CareStart、Wondfo、Binax NOW等。但这些产品都只能区分恶性疟和非恶性疟，不能区分其他三种人体疟原虫(间日疟、卵形疟、三日疟)，给基层现场的诊断带来了不便，不利于病人的对症治疗和流行病控制策略的及时制定和实施。
发明内容
本发明的目的在于提出一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条，所述的这种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条要解决现有疟疾快诊技术不能有效区分疟疾感染各病原体种属的技术问题。
本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17412。
本发明还提供了上述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体。
本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17410。
本发明还提供了上述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合四种疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。
本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17411。
本发明还提供了上述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体。
本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17408.
本发明还提供了上述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶同时不与卵形疟和三日疟原虫乳酸脱氢酶特异性结合的单克隆抗体。
本发明提供了一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17409。
本发明还提供了上述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合四种疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。
本发明还提供了上述的一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条，包括一个样品垫、纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫和纤维素膜的一侧之间设置有一个胶体金探针垫，所述的胶体金探针垫和样品垫、纤维素膜之间紧密连接，所述的纤维素膜的另外一侧设置有吸水垫，所述的纤维素膜的另外一侧和所述的吸水垫紧密连接，所述的胶体金探针垫上设置有胶体金标记探针，所述胶体金探针是由胶体金标记的特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体和胶体金标记的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体组成，胶体金标记的特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.17412的小鼠杂交瘤细胞产生，胶体金标记的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.17410的小鼠杂交瘤细胞产生，所述纤维素膜上从靠近胶体金探针垫的一端开始依次设置有三条检测线，所述的三条检测线上分别设置有特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体、特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体、特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体，所述特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体由保藏号为 CGMCC No.17411的小鼠杂交瘤细胞产生；所述的特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.17408的小鼠杂交瘤细胞产生；所述的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.17409的小鼠杂交瘤细胞产生，在第三检测线和吸水垫之间的纤维素膜上设置一条质控线，所述的质控线由可以结合胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。
具体的，所述的检测线上抗体的顺序可以任意调整。
进一步的，所述的免疫层析试纸条背面设置一个起支撑作用的背板。
进一步的，将所述带有背板的免疫层析试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有加样孔，所述的盒体对应于检测线和质控线的部位设有观测窗以及检测线和质控线的位置标识。
具体的，所述纤维素膜可以是硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜或混合膜；所述胶体金探针垫为玻璃纤维膜或聚脂纤维膜；所述样品垫可以是玻璃纤维或聚酯纤维或混合纤维；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。
具体的，所述纤维素膜宽度控制在20～30mm；所述吸水垫可宽度为20～40mm，所述胶体金探针垫的宽度为5～10mm；所述样品垫宽度为10～40mm。
进一步的，第一、第二和第三检测线的单克隆抗体工作浓度为0.1～ 2.0mg/mL，喷涂量为0.5～1μL/cm；质控线二抗或链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白的工作浓度为0.1～2.0mg/mL，喷涂量为0.5～1μL/cm；胶体金标记探针单克隆抗体的工作浓度(以蛋白浓度计)：8～40μg/mL，喷涂量为40～50 μL/cm。
进一步的，所述的免疫层析试纸条背面背板材料的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。
进一步的，将所述带有背板的免疫层析试纸条切成3～5mm宽，装入一个检测卡的盒体中。
本发明分别采用胶体金标记的特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体和特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体作为检测探针，附着于胶体金探针垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记探针可以与受试者血样中的疟原虫抗原特异性结合，形成抗原探针复合物。
本发明分别将特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体、特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体、特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体固定在纤维素膜上，形成第一、第二和第三检测线。当受试者血样流过检测线时，抗原探针复合物会被固定的特异性抗体捕获，形成肉眼可见的沉淀线(色带)。若血样中含有恶性疟原虫，那么第一、第二和第三检测线都会显色；若血样中含有间日疟原虫，那么第二和第三检测线会显色；如果若血样中含有三日疟原虫或卵形疟原虫，那么仅第三检测线会显色。
本发明将可与检测探针特异性结合的二抗抗体固定在纤维素膜上作为质控线。胶体金标记探针是特异性结合疟原虫抗原的单克隆小鼠抗体，相应的质控线采用羊抗小鼠IgG的抗抗体。无论待检样品中是否含有疟原虫抗原，本发明的诊断试纸条质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常和诊断试纸条是否变质的标准。
与胶体金标记探针特异性结合的质控线不限于使用羊抗鼠IgG，也可采用金黄色葡萄球菌A蛋白,链球菌G蛋白，或者采用其他动物如兔抗鼠IgG抗体的单抗或多抗，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都知晓的。
本发明中的细胞株C6H11，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17412。
本发明中的细胞株C6E9，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17411。
本发明中的细胞株A3G9，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17410。
本发明中的细胞株A3B6，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17409。
本发明中的细胞株A2H4，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17408。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明的免疫层析试纸条具有以下优点：
(1)一次可以同时检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟；
(2)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试纸条检测恶
性疟敏感性为92％，检测间日疟敏感性为94％，检测卵形疟/三日疟敏感性为85％，特异性为96％；
(3)检测方法简单快速，结果判断直观明确，不需要专门仪器和专业技术经验，非专业技术人员按照说明书即可操作，很适合现场和基层使用；
(4)稳定性好，易于保存。成本低廉，易于进行工业化生产，适于临床和现场使用。
附图说明
图1是本发明的一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条的正面、纵截面的结构示意图。其中：1为样品垫；2为胶体金探针垫；3为纤维素膜；4为吸水垫；5为第一检测线；6为第二检测线；7为第三检测线； 8为质控线；9为背板。
图2是本发明的一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条的检测卡结果判读示意图。其中：11为试纸条检测卡；12为观测窗；13为加样孔；14(T1)为检测卡上第一检测线的位置标识；15(T2)为检测卡上第二检测线的位置标识；16(T3)为检测卡上第三检测线的位置标识；17(C)为检测卡上第质控线的位置标识。图中检测卡A判为阴性；检测卡B判为三日疟或者卵形疟阳性单一感染或混合感染；检测卡C判为间日疟原虫感染阳性；检测卡D 判为恶性疟原虫感染阳性；检测卡E判为无效检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ抗原的制备
富组蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein-Ⅱ，HRP-Ⅱ)为红内期恶性疟原虫合成的一种水溶性糖蛋白,由于其含有大片段连续串联排列的氨基酸重复序列, 因而是理想的诊断靶分子。
根据已发表的恶性疟原虫HRP-Ⅱ基因保守序列(GenBank登录号: FJ871325.1)和引物设计原则设计合成一对引物：
P1:5’-actcaagcacatgtagatgatg-3’；
P2:5’-taatggcgtaggcaatgtgtg-3’。
以恶性疟原虫感染者抗凝全血作为PCR扩增模板：取20μL全血加200μL 红细胞裂解液(50mmol/L NaCl，0.015％皂素，1mmol/L乙二胺四乙酸)震荡混匀，室温置10min以充分溶解红细胞，10000×g室温离心10min，再用250μL 缓冲液(10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2， 0.01％明胶)将沉淀物洗2次，所得沉淀物即作为PCR扩增模板。PCR：高保真聚合酶PfuPCR扩增试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司)，按50μL反应体积在上述沉淀物中加49.5μL PCR反应液(含200μ mol/LdATP/dTTP/dGTP/dCTP，200pmol/L引物)，加封石蜡油50μL后置沸水煮沸10min，立即置已热启动的PCR仪进行扩增。条件为：94℃变性3min，此时加0.5μL Pfu聚合酶(5U/μL)，再按94℃、30s，60℃、45s，72℃、1min 的条件循环35次，随后72℃再延长10min。反应结束后取5μL反应液用1％琼脂糖凝胶电泳检查。
扩增的PCR产物按DNA纯化试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司)说明纯化后用平端方法与经Sma I酶切的pGEX-3X表达载体DNA连接，连接物转化大肠埃希菌DH5a感受态细胞，在选择平板上挑取白色菌落接种LB培养基进行培养，收集菌体，用碱裂解法抽提质粒并进行酶切鉴定，大小符合的重组质粒进行测序。序列符合且克隆方向正确的重组质粒再转化大肠埃希菌BL221细胞，转化的细胞接种于LB液体培养基，28℃下用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒表达。收集细菌，用10％胶对重组蛋白进行十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。取经SDS-PAGE鉴定证明能正确表达重组蛋白的BL21细菌按上述方法进行大量培养并进行诱导表达。诱导表达结束后，3000×g离心20min，收集细菌，用磷酸盐缓冲液(PBS) 洗3次。按沉淀物压积体积20倍的量加入PBS重悬菌体并超声裂解。超声处理后加入TritonX-100至终浓度1％，置冰上搅拌1h。随后4℃，12000×g离心 30min，取上清，按试剂盒说明用Glutathione Sepharose4B柱(丹麦Amersham 公司)亲和纯化回收表达的融合蛋白，即获得恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的重组抗原，并进行SDS-PAGE分析和蛋白含量测定。该重组抗原用于制备针对恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体。
实施例2恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ单克隆抗体的制备
免疫：每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100μg上述(实施例1)纯化的恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ重组融合蛋白+福氏完全佐剂的混悬液，以后每隔1月注射100 μg纯化的重组融合蛋白+福氏不完全佐剂的混悬液1次，共2次，并于杀鼠取脾进行细胞融合的前3d经尾静脉直接注射抗原加强免疫1次。
杂交瘤细胞的产生与筛选SP2/0瘤细胞与免疫鼠脾细胞的融合及杂交瘤细胞的克隆按本领域常规方法进行。以上述纯化的恶性疟原虫疟原虫富组蛋白Ⅱ重组融合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白分别包板对杂交瘤细胞培养上清进行常规ELISA检测抗体分泌以筛选杂交瘤细胞株，只选择保留仅对重组融合蛋白反应同时对GST不反应的克隆。
单克隆抗体(McAb)免疫球蛋白亚类鉴定：经浓缩的杂交瘤细胞培养上清液使用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒(洛阳佰奥通实验材料中心)按其说明书操作鉴定McAb免疫球蛋白亚类。
腹水生产与腹水效价决定：每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106杂交瘤细胞， 1周后随时观察并取腹水。以纯化的重组融合蛋白包被酶标板，腹水进行倍比稀释，第1稀释度为1：1000，用常规ELISA法确定腹水效价。
免疫印迹实验：取培养纯化的恶性疟原虫和10份云南发热病人红细胞经处理后进行SDS-PAGE电泳，而后转移至硝酸纤维薄膜上。转移完毕后硝酸纤维素膜用含5％脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭1h，用PBS含0.5％TritonX-100(PBS-T) 洗涤3次，按1：20000稀释度加入待筛选的单克隆抗体，4℃过夜，用PBS-T 洗涤3次，加入用PBS稀释1：5000的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体室温摇 2h，同法洗涤3次，再用PBS洗涤1次，用二氨基联苯胺(DAB)底物系统(DAB 50mg，PBS 100ml，30％H2O2 10μL)显色。
筛选得到1对特异性结合恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体：
由细胞株C6H11生产的抗体mAbC6H11属于IgG1亚类，与重组抗原反应效价1： 51200，用于标记胶体金探针；
由细胞株C6E9生产的抗体mAbC6E9属于IgG1亚类，与重组抗原反应效价1： 51200，用于在硝酸纤维素膜上包被。
将含恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ单克隆抗体的小鼠腹水，使用G蛋白层析柱(美国GenScript产品)按产品说明书纯化单克隆抗体。
本发明中的细胞株C6H11，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17412。
本发明中的细胞株C6E9，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17411。
实施例3疟原虫乳酸脱氢酶抗原的制备
寄生在人体的疟原虫共有4种，即间日疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫和卵形疟原虫。早期研究发现，疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)与宿主乳酸脱氢酶在电泳特性、酶动力学特性、免疫学特性方面有很大差别。抗LDH抗体对疟原虫有属的特异性，某些抗LDH抗体与来自不同种的疟原虫乳酸脱氢酶抗原存在一定的交叉反应，而和哺乳动物的3种LDH同工酶(A4、B4和C4)无交叉反应。因此，疟原虫乳酸脱氢酶是理想的诊断靶分子。
根据已发表的疟原虫LDH基因保守序列(GenBank:KX885921.1)和引物设计原则设计合成一对引物：
P1：5’-atggcaccaaaagcaaaaatcgt-3′
P2：5’-ttaagctaatgccttcattctct-3′
以恶性疟原虫感染者抗凝全血作为PCR扩增模板：取20μL全血加200μL红细胞裂解液(50mmol/L NaCl，0.015％皂素，1mmol/L乙二胺四乙酸)震荡混匀，室温置10min以充分溶解红细胞，10000×g室温离心10min，再用250μL缓冲液(10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2， 0.01％明胶)将沉淀物洗2次，所得沉淀物即作为PCR扩增模板。PCR：高保真聚合酶PfuPCR扩增试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司)，按50μL反应体积在上述沉淀物中加49.5μL PCR反应液(含200μ mol/LdATP/dTTP/dGTP/dCTP，200pmol/L引物)，加封石蜡油50μL后置沸水煮沸10min，立即置已热启动的PCR仪进行扩增。条件为：94℃变性3min，此时加0.5μL Pfu聚合酶(5U/μL)，再按94℃、30s，60℃、45s，72℃、1min的条件循环35次，随后72℃再延长10min。反应结束后取5μL反应液用1％琼脂糖凝胶电泳检查。
扩增的PCR产物按DNA纯化试剂盒(上海申能博彩生物技术有限公司)说明纯化后用平端方法与经Sma I酶切的pGEX-3X表达载体DNA连接，连接物转化大肠埃希菌DH5a感受态细胞，在选择平板上挑取白色菌落接种LB培养基进行培养，收集菌体，用碱裂解法抽提质粒并进行酶切鉴定，大小符合的重组质粒进行测序。序列符合且克隆方向正确的重组质粒再转化大肠埃希菌BL21细胞，转化的细胞接种于LB液体培养基，28℃下用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒表达。收集细菌，用10％胶对重组蛋白进行十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。取经SDS-PAGE鉴定证明能正确表达重组蛋白的BL21细菌按上述方法进行大量培养并进行诱导表达。诱导表达结束后，3000×g离心20min，收集细菌，用磷酸盐缓冲液(PBS) 洗3次。按沉淀物压积体积20倍的量加入PBS重悬菌体并超声裂解。超声处理后加入TritonX-100至终浓度1％，置冰上搅拌1h。随后4℃，12000×g离心 30min，取上清，按试剂盒说明用Glutathione Sepharose4B柱(丹麦Amersham 公司)亲和纯化回收表达的融合蛋白，即获得疟原虫乳酸脱氢酶抗原，并进行SDS-PAGE分析和蛋白含量测定。该重组抗原用于制备针对疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。
实施例4疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备
免疫：每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100μg，上述(实施例3)纯化的恶性疟原虫疟原虫富组蛋白Ⅱ重组融合蛋白+福氏完全佐剂的混悬液，以后每隔1 月注射100μg纯化的重组融合蛋白+福氏不完全佐剂的混悬液1次，共2次，并于杀鼠取脾进行细胞融合的前3d经尾静脉直接注射抗原加强免疫1次。
杂交瘤细胞的产生与筛选：SP2/0瘤细胞与免疫鼠脾细胞的融合及杂交瘤细胞的克隆按本领域常规方法进行。以上述纯化的恶性疟原虫疟原虫富组蛋白Ⅱ重组融合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白分别包板对杂交瘤细胞培养上清进行常规ELISA检测抗体分泌以筛选杂交瘤细胞株，只选择保留仅对重组融合蛋白反应同时对GST不反应的克隆。
单克隆抗体(McAb)免疫球蛋白亚类鉴定：经浓缩的杂交瘤细胞培养上清液使用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒(洛阳佰奥通实验材料中心)按其说明书操作鉴定McAb免疫球蛋白亚类。
腹水生产与腹水效价决定：每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106杂交瘤细胞， 1周后随时观察并取腹水。以纯化的重组融合蛋白包被酶标板，腹水进行倍比稀释，第1稀释度为1：1000，用常规ELISA法确定腹水效价。
免疫印迹实验：取恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫的感染者抗凝血经处理后进行SDS-PAGE电泳，而后转移至硝酸纤维薄膜上。转移完毕后硝酸纤维素膜用含5％脱脂奶粉的PBS溶液室温封闭1h，用PBS含0.5％ TritonX-100(PBS-T)洗涤3次，按1：20000稀释度加入待筛选的单克隆抗体， 4℃过夜，用PBS-T洗涤3次，加入用PBS稀释1：5000的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体室温摇2h，同法洗涤3次，再用PBS洗涤1次，用二氨基联苯胺 (DAB)底物系统(DAB 50mg，PBS 100ml，30％H2O2 10μL)显色。
筛选得到2对特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体：
其中由细胞株A3B6生产的抗体mAbA3B6属于IgG2亚类，与四种人体疟原虫都特异性结合，与重组抗原反应效价1：51200，用于标记胶体金探针；
由细胞株A3G9生产的抗体mAbA3G9属于IgG2亚类，与四种人体疟原虫都特异性结合，与重组抗原反应效价1：51200，用于在硝酸纤维素膜上包被；
由细胞株A2H4生产的抗体mAbA2H4属于IgG1亚类，与恶性疟原虫和间日疟原虫特异性结合，不与三日疟原虫和卵形疟原虫结合，与重组抗原反应效价1： 102400，用于在硝酸纤维素膜上包被。
将含各株疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的小鼠腹水，使用G蛋白层析柱(美国GenScript产品)按产品说明书纯化单克隆抗体。
本发明中的细胞株A3G9，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17410。
本发明中的细胞株A3B6，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17409。
本发明中的细胞株A2H4，属于小鼠杂交瘤细胞，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2019年03月21日，保藏号为CGMCC No：17408。
实施例5一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条的制备
1.抗恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ单克隆抗体由实施例2制备所得；抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体由实施例4制备所得。
2.羊抗鼠IgG由购买获得(Cohesion Biosciences公司)。
3.疟原虫特异性单抗胶体金探针溶液的制备
(1)用柠檬酸还原法制备胶体金：
将质量百分比浓度为0.01％的HAuCl4(上海国药集团化学试剂有限公司)
水溶液煮沸，搅拌下加入2mL质量百分比浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，
继续煮沸，直到液体呈深红色，得到胶体金溶液。
(2)免疫胶体金探针垫的制备：
a.用0.1M K2CO3溶液调节pH值至7.5，每100mL胶体金溶液加入抗恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ单克隆抗体mAbC6H11至终浓度为6μg/mL，搅拌30min，再加入PEG20000至终浓度为0.05％，搅拌30min，10000rpm离心30min，弃上清，用10mM，pH7.5的HEPES缓冲液洗涤沉淀，并将其复溶于15mL 含15％蔗糖的10mM，pH7.5的HEPES缓冲液中，得到恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ单抗mAbC6H11胶体金探针溶液。
b.用0.1M K2CO3溶液调节pH值至7.5，每100mL胶体金溶液加入抗四种人体疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体mAbA3B6至终浓度为4μg/mL，搅拌30min，再加入PEG20000至终浓度为0.05％，搅拌30min，10000rpm离心30min，弃上清，用10mM，pH7.5的HEPES缓冲液洗涤沉淀，并将其复溶于15mL 含15％蔗糖的10mM，pH7.5的HEPES缓冲液中，得到疟原虫乳酸脱氢酶单抗mAbA3B6胶体金探针溶液。
上述恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ单抗胶体金探针溶液和疟原虫乳酸脱氢酶单抗胶体金探针各取650μL混合，喷涂到长300mm、宽80mm的玻璃纤维垫 (Ahlstrom公司)上，37℃下干燥0.5小时，得到免疫胶体金探针垫。
4.快速诊断免疫试纸条的包被和装配
如图1所示，为检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试纸条的正面/纵截面结构图，试纸条由样品垫1、胶体金探针垫2、硝酸纤维素膜3 和吸水垫4四部分粘贴在PVC背板9上组成；硝酸纤维素膜上设有三条检测线5、 6、7和一条质控线8。该试纸条的制备方法包括以下步骤：
(1)硝酸纤维素膜的包被：选择长300mm、宽20mm的硝酸纤维素膜(PALL公司)。将与恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ特异性结合的单克隆抗体mAbC6E9用10mM，pH7.4 的磷酸缓冲液(PBS)配制到0.5mg/mL，用BIODOT公司XZ1000点样机包被于硝酸纤维素膜靠底边Y＝5.5mm处，形成第一检测线5；将与恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶特异性结合不与三日疟原虫和卵形疟原虫结合的单克隆抗体mAbA2H4用10mM，pH7.4的磷酸缓冲液配制到0.5mg/mL，用点样机包被于硝酸纤维素膜靠底边Y＝8.0mm处，形成第二检测线6；将与四种人体疟原虫乳酸脱氢酶特异性结合的单克隆抗体mAbA3G9用10mM，pH7.4的磷酸缓冲液配制到0.5mg/mL，用点样机包被于硝酸纤维素膜靠底边Y＝10.5mm处，形成第三检测线7；将羊抗鼠IgG用10mM，pH7.4的磷酸缓冲液配制到0.3mg/mL，用点样机包被于硝酸纤维素膜靠底边Y＝13.0mm处，形成一条质控线8；包被好的硝酸纤维素膜置37℃下干燥2小时。
(2)检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试纸条的制备：用一块单面涂了不干胶的PVC底板，中间粘贴上处理好的上述硝酸纤维素膜；膜靠近质控线的一端紧密粘贴吸水垫(MILLIPORE公司)；膜靠近第一检测线 5的一端紧密粘贴胶体金探针垫；胶体金探针垫另一端紧密粘贴样品垫 (MILLIPORE公司)；样品垫、胶体金探针垫和硝酸纤维素膜的连接处表面粘贴隐形贴纸；按需要切割试纸条，宽3.7mm，长7.8mm。将免疫层析试纸条装入定制的试纸条检测卡盒体中(如图2)，该盒体10对应于试纸条的样品垫的部位设有加样孔13，对应于试纸条的检测线和质控线的部位设有观测窗12，第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线的位置分别依次标识T1(14)、T2(15)、T3(16)、T4(17)，再加干燥剂后密封单包装保存。
5.检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试剂盒的制备
检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试剂盒由试纸条、溶胞液、采血管、说明书共同组成。
溶胞液：含有50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1％TritonX-100，0.5％脱氧胆酸钠，pH8.5；
毛细采血管：容量5μL的自吸式微量吸管(上海白洋仪表有限公司)；
实施例6检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试纸条的实验室和现场检测评价
1.检测方法
样本要求：检测样本为全血，使用采血针采集末梢血(现场)或使用已采集的静脉抗凝血(实验室)。样本采集后应尽快进行检测，若不能及时检测，采集的全血样本需加入抗凝剂，在2～8℃可以保存3天，如果需要长期保存，需在 -20℃以下保存，避免反复冻融。样本需要在含干冰的保温瓶或其它装置条件下运输。
检测方法：用毛细采血管吸取待测血样标本至刻度线(5μL)，放入试纸条检测卡的加样孔中，缓慢滴加4滴(120～200μL)溶胞液， 10分钟后观察观测窗里硝酸纤维素膜上的显色情况，观察超过30分钟无效。
结果判定：如图2所示
(1)仅在质控线C显色，检测线T1、T2、T3均不显色，判为阴性，提示没有疟原虫感染(图2-A)；
(2)质控线显C色，检测线T3显色，检测线T1、T2不显色，判为卵形疟或三日疟的单一或混合感染(图2-B)；
(3)质控线C显色，检测线T2、T3显色，检测线T1不显色，判为间日疟原虫感染(图2-C)；
(4)质控线C显色，同时检测线T1、T2、T3显色，判为恶性疟原虫感染(图 2-D)；
(5)质控线C不显色，无论检测线T1、T2、T3是否显色，表明不正确的操作过程或者试剂盒已变质失效(图2-E)。
2.实验结果
用本发明的检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试纸条进行实验室和现场检测考核结果
如表1所示，由表1可以看出本发明的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试纸条对恶性疟的敏感性为92.3％，对间日疟敏感性为94.2％，对卵形疟/三日疟的敏感性为84.8％，特异性可达96.2％。上述检测结果表明本发明的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试剂盒可以用于疟疾的快速检测。
表1本发明检测恶性疟、间日疟、三日疟/卵形疟的快速诊断免疫试纸条实验室现场检测结果
血样来源 实验例数 阳性例数(P％)
恶性疟患者 65 60(92.3％)
间日疟患者 86 81(94.2％)
卵形疟/三日疟患者 33 28(84.8％)
健康人 78 3(3.8％)
黑热病患者 20 0
血吸虫病患者 20 0
肺吸虫病患者 12 0
肝吸虫病患者 12 0
包虫病患者 20 0
弓形虫病患者 12 0

Claims (13)

1.一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17412。
2.权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体。
3.一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17410。
4.权利要求3所述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。
5.一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17411。
6.权利要求5所述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体。
7.一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17408。
8.权利要求7所述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。
9.一种小鼠杂交瘤细胞，其保藏号为CGMCC No.17409。
10.权利要求9所述的小鼠杂交瘤细胞产生的可以特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体。
11.一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条，包括一个样品垫、纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫和纤维素膜的一侧之间设置有一个胶体金探针垫，所述的胶体金探针垫分别和样品垫、纤维素膜之间紧密连接，所述的纤维素膜的另外一侧设置有吸水垫，所述的纤维素膜的另外一侧和所述的吸水垫紧密连接，所述的胶体金探针垫上设置有胶体金标记探针，其特征在于：所述胶体金探针是由胶体金标记的特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体和胶体金标记的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体组成，胶体金标记的特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No .17412的小鼠杂交瘤细胞产生，胶体金标记的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No .17410的小鼠杂交瘤细胞产生，所述纤维素膜上从靠近胶体金探针垫的一端开始依次设置有三条检测线，所述的三条检测线上分别设置有特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体、特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体、特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体，所述特异性结合恶性疟原虫的富组蛋白Ⅱ的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No .17411的小鼠杂交瘤细胞产生；所述的特异性结合恶性疟和间日疟疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.17408的小鼠杂交瘤细胞产生；所述的特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No .17409的小鼠杂交瘤细胞产生，在第三检测线和吸水垫之间的纤维素膜上设置一条质控线，所述的质控线由特异性结合所述胶体金标记探针的二抗或链球菌G蛋白或金黄色葡萄球菌A蛋白组成。
12.如权利要求11所述的一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条，其特征在于：所述的免疫试纸条背面设置一个起支撑作用的背板。
13.如权利要求12所述的一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条，其特征在于：将带有背板的免疫试纸条装入一个盒体中，所述的盒体对应于样品垫的部位设有加样孔，所述的盒体对应于检测线和质控线的部位设有观测窗以及检测线和质控线的位置标识。
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