CN111521816B - 牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法，属于生物检验技术领域。所述试纸条的结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有间隔开的检测线(6)和质控线(7)，所述检测线上包被有重组多表位抗原，所述质控线上包被有兔抗山羊IgG二抗，所述重组多表位抗原由七个肽段拼接而成(命名为Eg‑H1)。本发明的试纸条具有操作简便、敏感性和准确性良好的优点，可以替代ELISA、胶体金等诊断方法无法在现场操作且准确性低的弊端，同时还具有良好的特异性，为牛细粒棘球蚴病的流行病学调查和该疾病的诊断提供了一种快速的诊断方法，并且此方法具有广阔的应用前景。

Description

牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备 方法
技术领域
本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法。
背景技术
细粒棘球蚴病(包虫病)为一种严重的全球性的人畜共患病，人或反刍动物主要通过误食了细粒棘球绦虫排出的虫卵而发病，被称为“虫癌”。截止到现在，我国依旧将该病列为重点防控和主要防护的动物疫病之一。
目前，关于细粒棘球蚴病诊断技术的研究投入较少，最常用的诊断方法就是解剖查看虫体检查。随着分子技术和免疫技术的发展，现在有分子诊断，比如LAMP，免疫学诊断，如ELISA试剂盒法、胶体金等，但从临床应用发现，这些检测方法的准确性不高、方便性不强，无法便于基层工作者操作检测。
虽然，细粒棘球蚴病在人类诊断方面已有很多研究，但在诊断动物方面的研究甚少，且动物在自然感染该病时，抗体反应不明显，易导致诊断错误。因此建立一种高效、准确、特异性好且简便的动物细粒棘球蚴的免疫诊断技术至关重要。
最近，基于表位的抗原具有高敏感性和特异性捕获机体所产生的抗体的能力，已经成功应用于各种疾病，例如利什曼病、锥体虫病、钩端螺旋体病和弓形虫病。并且，随着生物信息学的发展，为此类抗原的设计提供了新的策略。且这些重组蛋白具有新的抗原性特征。
一种成功的诊断方法的建立，不仅需要免疫原性高的抗原，而且需要一种高效诊断方法。因此本发明采用了时间分辨荧光免疫层析技术，该技术结合了免疫标记和免疫层析的特点，以时间分辨荧光微球作为示踪物，制备免疫层析试纸条，克服了胶体金免疫层析(胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种免疫标记技术)灵敏度相对偏低，且只能用于定性或半定量检测的缺点；也克服了其他免疫学方法(如ELISA法)的不方便性、不准确性。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法，通过对antigenB subunit 1、antigen B subunit 2、antigen B subunit4、EG95、antigenprotein、Ag5、EPC1的B细胞表位和二级结构的结果进行生物信息学分析，截取部分肽段，使用linker重新拼接成重组蛋白质(命名为Eg-H1)作为试纸条的检测线，在检测牛体内感染的细粒棘球蚴的应用中，具有操作简单、快速诊断、灵敏度高、特异性强、定性准确的优点。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供了一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，包括PVC底板、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有间隔开的检测线和质控线，检测线上包被有重组多表位抗原，质控线上包被有兔抗山羊IgG二抗，
其中，所述重组多表位抗原由以下七个肽段顺次拼接而成：
B1：DDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQK；
B2：KDEPKAHMGQVVKKRWGELRDFFRND；
B3：LGEIRDFFRSDPLGQKLVALGRDLTAI；
B4：KGMGVETRTTETPLRKHFNLTPVGSQGI；
B5：TGNCDQGKAQSANVTG；
B6：ECSPHTCLEHRYRRCVD；
B7：GKISCAELKSALQSCSA。
进一步地，所述重组多表位抗原是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，编码所述重组多表位抗原的基因是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述重组多表位抗原的制备方法包括：构建含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的目的基因的重组表达载体，转入BL21(DE3)表达感受态中，进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，进行蛋白大量诱导表达，利用不同梯度的咪唑洗脱与蛋白结合后的Ni-Agarose，进而获得高纯度的重组多表位抗原。
根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供了一种上述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1结合垫的制备：用山羊抗牛IgG抗体对时间分辨荧光微球进行标记，然后添加4倍体积的荧光工作液进行稀释，混合均匀，喷涂在结合垫上，烘干；
S2硝酸纤维素膜的制备：将上述的重组多表位抗原稀释成1mg/mL喷涂于检测线所在位置，兔抗山羊IgG二抗稀释成2mg/mL喷涂于质控线所在位置，烘干；
S3试纸条的组装：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸从左到右顺次搭接安装在PVC底板上。
进一步地，所述山羊抗牛IgG抗体的标记量为50μg/mL；所述荧光工作液是0.02MTris-HCl、0.4％BSA，调至pH＝7.5。
进一步地，S1和S2的喷涂步骤中，包被参数均为0.75μL/cm。
进一步地，采用0.1M Na2B4O7·10H2O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN3，调至pH＝9.3的样品垫处理液对样品垫进行处理。
根据本发明实施例的第三方面，本发明实施例提供了一种上述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的使用方法，血清与样品缓冲液按体积比1:2稀释后得到血清待检样本，取75μL血清待检样本，滴加在样品垫上，15min后，用紫外灯照射试纸条观察结果，如果检测线和质控线均显色，证明该样品为阳性；如果检测线不显色，质控线显色，证明该样品为阴性。
进一步地，所述样品缓冲液为pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3。
本发明的试纸条基于间接免疫层析法，根据特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术，检测牛包虫病抗体。在硝酸纤维素膜上的检测区包被基因工程重组蛋白，结合垫(玻璃纤维垫)上有荧光标记的抗牛IgG抗体。检测时，如果样品内含有包虫IgG抗体，样品中的IgG抗体与试纸条结合垫中的“荧光-抗体”结合，形成免疫复合物，复合物由于层析作用沿膜移动，免疫复合物与基因工程重组蛋白进行反应并固定在检测区形成一条荧光线，利用荧光免疫分析仪，测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度。光源照射到检测卡的检测区和质控区域，激发附着的荧光物质，发射光被收集并转化为电信号，电信号的强弱和荧光分子数量严格相关，分析仪自动扫描并计算出待测样本中被分析物的含量。
本发明实施例具有如下优点：
本发明的试纸条在用于牛包虫病抗体的检测中，具有操作简便、敏感性和准确性良好的优点，可以替代ELISA、胶体金等诊断方法无法在现场操作且准确性低的弊端，同时还具有良好的特异性，为牛细粒棘球蚴病的流行病学调查和疾病的诊断提供了一种快速的诊断方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的结构示意图，其中，1、PVC底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。
图2为本发明的pET-28a-Eg-H1重组质粒的双酶切验证结果图。
图3为本发明的Eg-H1-His重组蛋白质的SDS-PAGE和Western-blot验证，其中，左：Eg-H1-His重组蛋白质SDS-PAGE；右：Eg-H1-His重组蛋白质Western-blot鉴定。
图4为本发明的试纸条的特异性检测结果，其中，1、猪旋毛虫病阳性血清，2、牛肝片吸虫病阳性血清，3、牛脑包虫病阳性血清，4、牛细粒棘球蚴病阳性血清。
图5为本发明的试纸条的灵敏度检测结果，其中，1-4：血清依次按1:250，1:500，1:1000，1:2000稀释，5：样品稀释液。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。
实施例1
重组多表位抗原(命名为Eg-H1)的制备
选择的肽段如下：
B1(antigen B subunit 1)：DDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQK；
B2(antigenB subunit 2)：KDEPKAHMGQVVKKRWGELRDFFRND；
B3(antigenB subunit4)：LGEIRDFFRSDPLGQKLVALGRDLTAI；
B4(EG95)：KGMGVETRTTETPLRKHFNLTPVGSQGI；
B5(antigenprotein)：TGNCDQGKAQSANVTG；
B6(Ag5)：ECSPHTCLEHRYRRCVD；
B7(EPC1)：GKISCAELKSALQSCSA。
通过串联方式，使用连接子GGGGSGGGGSGGGGS将上述各肽段连接在一起。作为优选，将上述各肽段顺次连接在一起，其氨基酸序列为：
MDDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQKGGGGSGGGGSGGGGSKDEPKAHMGQVVKKRWGELRDFFRNDGGGGSGGGGSGGGGSLGEIRDFFRSDPLGQKLVALGRDLTAIGGGGSGGGGSGGGGSKGMGVETRTTETPLRKHFNLTPVGSQGIGGGGSGGGGSGGGGSTGNCDQGKAQSANVTGGGGGSGGGGSGGGGSECSPHTCLEHRYRRCVDGGGGSGGGGSGGGGSGKISCAELKSALQSCSA(SEQ ID NO.1)。
上述重组多表位抗原的基因序列为：
ATGGATGATGGCCTCACCTCGACGTCGAGGAGTGTGATGAAAATGTTTGGCGAAGTGAAGTACTTCTTCGAACGTGATCCGTTGGGTCAGAAAGGGGSGGGGSGGGGSAAAGATGAGCCAAAAGCACACATGGGGCAAGTGGTAAAAAAAAGATGGGGTGAACTTCGAGACTTCTTTAGAAATGATGGGGSGGGGSGGGGSTTGGGCGAAATTCGGGACTTCTTTAGAAGTGATCCACTGGGTCAAAAACTTGTTGCTCTTGGCAGGGACCTGACTGCCATCGGGGSGGGGSGGGGSAAAGGAATGGGCGTAGAGACAAGGACAACAGAGACTCCGCTCCGTAAACACTTCAATTTGACTCCTGTGGGTTCTCAGGGCATTGGGGSGGGGSGGGGSACTGGCAATTGTGATCAAGGAAAAGCACAAAGTGCCAATGTGACAGGAGGGGSGGGGSGGGGSGAGTGTTCCCCCCATACCTGCCTCGAACATCGCTATCGTCGCTGTGTGGACGGGGSGGGGSGGGGSTCAGCAGAGCCTCTCGATGACGACCATGTGAGGGCTTTCTTAGATAAGCTCTGA(SEQ ID NO.2)。
上海生工生物工程股份有限公司构建含有上述SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的目的基因的重组表达载体pET-28a-Eg-H1，经双酶切和测序正确后，转入BL21(DE3)表达感受态细胞，经诱导、表达获得重组蛋白Eg-H1。具体步骤如下：
一、双酶切验证
(1)将pET-28a-Eg-H1重组表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min；
(2)用50μL无菌ddH2O溶解冻干粉，之后用涡旋仪轻轻混匀，掌上离心机瞬离30s；
(3)用NANODROP测浓度；
(4)用限制性内切酶双酶切表达载体质粒pET-28a-Eg-H1，反应体系如表1所示，反应条件为37℃/10min。
表1表达质粒双酶切体系
Figure BDA0002460333500000071
本实施例的pET-28a-Eg-H1重组表达质粒，目的基因为579bp，用BamHI/XhoI限制性内切酶，其双酶切验证结果如图2所示。
二、重组蛋白质的表达纯化
1、双酶切验证过后，将重组质粒转化表达感受态
(1)取50μL冰浴完毕的BL21(DE3)放入1.5mL无菌离心管中，置于冰盒中融化(切勿用手搓化)，用移液器吸取5μL表达质粒加入其中，在冰上静置30min；
(2)冰浴后，用浮漂将离心管放入水浴锅42℃热激45s，然后，将管转移到冰上，冰浴2min；
(3)在无菌超净台内，在每个离心管中加400-500μL无菌液体LB培养基，220rpm，在37℃摇床培养1h；
(4)先将对应抗性的LB固体平皿置于37℃预热，待平皿内的水蒸气完全挥发后取出备用；
(5)根据实验需求，吸取适量转化之后的感受态细胞，呈散点似的滴加在预热好的平皿中，均匀涂布感受态细胞，放入37℃培养箱；
(6)在37℃恒温培养箱中过夜培养；
2、pET-28a-Eg-H1的His标签重组蛋白质的小量诱导表达
(1)用无菌白枪头挑取转化后BL21(DE3)的单个菌落，PCR鉴定正确后，接种于10mL含有相应抗性的液体LB培养基，200rpm/37℃恒温培养箱，过夜培养；
(2)次日，在无菌操作台中保菌后，用移液器吸取100μL的菌液接种于10mL含有相对抗性的液体LB培养基中，200rpm/37℃条件下培养，当菌液OD600nm＝0.6-0.8时，可加入IPTG诱导；
(3)加蛋白诱导剂前，在无菌操作台中，吸100μL未诱导全菌，作为阴性对照。之后，加入0.1M IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.1mM、0.3mM、0.6mM，在不同的温度进行诱导(16℃、22℃、32℃)；
(4)吸取16℃低温培养22h、22℃低温培养18h、32℃恒温培养8h的菌液，收集好的菌液置于15mL除酶管中，在4℃离心机4000rpm离心15min，弃掉上清，菌体沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取50μL菌液作为诱导后全菌样品，余下的菌液用小型超声破碎仪破碎，仪器的破碎功率为25w，超声2s，停歇3s，观察菌体清澈即可(部分菌液在破碎时，清澈度越来越低，可能该蛋白为包涵体，属正常现象)，破碎后的菌液置于1.5mL EP管中，在4℃离心机中5000rpm离心10min，取100μL上清(诱导后上清)后，弃掉上清，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取100μL作为诱导后沉淀；
(5)将不同温度和不同IPTG浓度下的上清、沉淀、全菌，分别加入20μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10min后，取出备用；
(6)将制备好的不同温度和不同IPTG浓度的全菌、上清、沉淀的蛋白样品，各取10μL(同一温度不同的IPTG浓度的蛋白样品依次上样，以便后续观察)加样于10％SDS-PAGE蛋白胶电泳中，蛋白电泳槽的设置功率为：电压150V，时间50min；
(6)将切好的蛋白胶放入预先倒入G250-考马斯亮蓝染色液的蛋白染色盒中，在水平摇床上摇晃20min；
(7)将染色完毕的蛋白胶，放入脱色液中，过夜脱色后，用照胶仪观察重组蛋白的表达情况，同时确定转入表达感受态目的基因是否表达、表达量以及表达形式为可溶性存在于上清中还是包涵体存在于沉淀中；
3、pET-28a-Eg-H1的His标签重组蛋白质的大量表达与纯化
(1)预先从-20℃冰箱取出带有His标签重组蛋白质的菌液，放入4℃冰箱中，待菌液完全融化后，在无菌超净台中，用接种环挑取适量菌液，在Kana抗性培养板采取交叉划线法快速划线后，将培养皿放于37℃恒温培养箱，培养10h；
(2)次日取出培养皿，用白枪头挑取形态圆润的1-2mm的单菌落，接种于20mL Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床中200rpm，过夜培养；
(3)在无菌操作台中，吸取5mL过夜培养的菌液，加入500mL含有Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床，200rpm摇3h后，测量菌液的OD值；
(4)若分光光度计的OD值为0.6-0.8之间，证明该菌液以达到生长曲线的峰值，根据该蛋白在小量诱导表达时优化完毕的条件，进行培养；
(5)将摇好的菌液从锥形瓶中分到若干个无菌50mL离心管中，在低温离心机中，4000rpm离心15min，将上清弃到废液缸中，每管再加入5mL PBS将沉淀用涡旋器重悬，集入到两个无菌50mL离心管中，同样条件下再次离心，最后用每管菌液再加入30mL PBS重悬洗涤后，在4℃离心机中4000rpm离心20min后，弃掉上清；
(6)提前30min将冷却机设置为3℃预冷，启动高压破碎仪，等待气压缓冲完毕后，用75％酒精、ddH2O、His Binding Buffer依次通过破碎管，两遍后，排气、排废液；
(7)根据菌体沉淀量，加入适量的PBS，用涡旋器将菌体沉淀完全重悬，倒入高压破碎管中反复破碎3-4次后，用超高速4℃离心机，12000rpm离心5min，留取上清备用；
(8)将空纯化柱，先用His Binding Buffer润洗两遍，留有少量的His BindingBuffer，根据上清液的量，吸取适量的Ni-Agarose，缓缓加入纯化柱中，待Ni-珠子完全下沉到底部时，打开底部开关，排出废液后，在使用适量的His Binding Buffer过柱洗涤填料；
(9)将步骤(7)收集的上清加入处理完毕后的Ni-Agarose填料中，置于水平旋转仪上，在4℃展柜中，缓慢感作3h；
(10)将结合完毕后的上清与Ni-Agarose的混合物倒入纯化柱中，待Ni-Agarose完全沉淀后，打开底部开关，调整流速，待Ni-Agarose完全在纯化柱内时，过柱完毕；
(11)第一次摸索His重组蛋白纯化的条件时，先用从低到高浓度的咪唑洗脱：bingding buffer、20、40、60、80、100、250、500mM，每次2mL依次洗脱并用2mL无菌离心管收集，暂时储存在冰盒内；
(12)将不同梯度的咪唑洗脱下来的蛋白、过柱液、以及最后一遍洗脱后的Ni-Agarose Resin，分别制取样品，进行蛋白凝胶电泳，用蛋白照胶仪观测目的条带后，决定该蛋白的洗杂和洗脱浓度。
4、pET-28a-Eg-H1的His标签重组蛋白质的Western-blot鉴定
(1)SDS-PAGE电泳跑胶；
(2)根据蛋白胶的大小，裁剪适当大小的PVDF膜，并用甲醇激活2min，将定性滤纸(3层为一个)剪成合适大小，浸泡在转膜液中，赶出滤纸与滤纸间的气泡，转膜时，夹子的黑面水平放在下面，上面依次为吸水网-3层定性滤纸-蛋白胶-PVDF膜-3层定性滤纸-吸水网，确保无气泡后，将夹子合上，放入转膜槽内，并且夹子的黑面对转膜槽的黑面，夹子的透明面对转膜槽的红面，检查好正负极，开始转膜，设置的功率为：电流200mA，时间为85min；
(3)转膜后，将PVDF膜放入提前配制完毕的含有封闭液(5％脱脂奶)的塑料盒中，放入37℃培养箱中，摇床上摇动封闭1h；
(4)用含有His-tag单抗(1:10000)的5％脱脂奶封闭，4℃孵育过夜；
(5)PBST洗膜，每次5min，洗4次；
(6)用PBST稀释AP山羊抗小鼠IgG 1:15,000稀释，37℃孵育50min；
(7)重复步骤(5)；
(8)配取适量的BCIP/NET显色试剂，进行避光显色2-3min，观察结果并扫描。
三、Eg-H1重组蛋白质的验证
纯化的蛋白质经SDS-PAGE和免疫印迹验证，结果见图3，和预期蛋白大小相同，其重组蛋白质大小为24KDa，且该蛋白以可溶性上清形式表达。
实施例2
如图1所示，本实施例的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条包括PVC底板1、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，结合垫3上包被有时间分辨荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，硝酸纤维素膜4上设有间隔开的检测线6和质控线7，检测线6上包被有重组多表位抗原Eg-H1，质控线7上包被有兔抗山羊IgG二抗。
其制备方法包括以下步骤：
S1结合垫的制备：用标记量为50μg/mL的山羊抗牛IgG抗体对时间分辨荧光微球进行标记，然后按体积1:4的比例添加荧光工作液(0.01M磷酸盐缓冲液)进行稀释，即添加4倍体积的荧光工作液，混合均匀，以0.75μL/cm的包被量喷涂在结合垫上，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干8h备用；
S2硝酸纤维素膜的制备：将实施例1制得的重组多表位抗原稀释成1mg/mL，以0.75μL/cm的包被量喷涂于检测线所在位置，兔抗山羊IgG二抗稀释成2mg/mL，以0.75μL/cm的包被量喷涂于质控线所在位置，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干16h备用；
S3试纸条的组装：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸从左到右顺次搭接安装在PVC底板上。
其中，山羊抗牛IgG抗体标记时间分辨荧光微球的步骤：
取100μL荧光微球，按照8g/L的浓度添加碳二亚胺(EDC)，放置于涡旋振荡仪振荡混匀后，室温孵育30min。所需用量的山羊抗牛IgG抗体，用0.01M磷酸盐缓冲液定容至500μL，混合均匀后加入处理好的荧光微球中，立即振荡混均，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。上述反应完成后，加入2％BSA，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h，12000rpm离心20min，去除上清，得到的浓缩的山羊抗牛IgG抗体，加入适量的荧光微球工作液，放入4℃密封避光保存。
本实施例的试纸条的使用方法：血清与样品缓冲液按体积比1:2稀释后得到血清待检样本，取75μL血清待检样本，滴加在样品垫上，15min后，用紫外灯照射试纸条观察结果，如果检测线和质控线均显色，证明该样品为阳性；如果检测线不显色，质控线显色，证明该样品为阴性，其中，样品缓冲液为pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3。
实施例3
为了提高牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条检测时的准确性，摸索了以下条件：
优化时间分辨荧微球免疫层析试纸条的前提条件：其他条件不变，每次只改变其中一个变量。反应条件为：阳性样本和阴性样本(均采集于若尔盖县屠宰场)的加样量均为75μL(血清与样品缓冲液的体积比例为1:2)，其反应时间均为15min。其包被参数为0.75μL/cm喷洒参数在硝酸纤维素膜上进行抗原或者抗体的包被，形成检测线(T)和质控线(C)。
C线包被量的确定：用三维喷金划膜仪在T线喷涂1mg/mL的Eg-H1，分别制备成两组，每组为三张层析试纸条，即阳性样本组和阴性样本组。其C线分别喷涂1mg/mL、2mg/mL和3mg/mL的兔抗山羊IgG二抗。以相同的包被参数在硝酸纤维素膜上进行包被，形成检测线(T)和质控线(C)，放入温度45±1℃湿度≤35％的烘箱中烘干16h。搭配结合垫和样品垫，制备小样。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的抗原抗体包被量。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表1，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当兔抗山羊IgG二抗浓度为2.0mg/mL时，是最适包被量。
表1包被量的检测结果
Figure BDA0002460333500000131
标记抗原浓度的确定：以相同标记方法，用处理好的荧光微球分别标记不同量的山羊抗牛IgG抗体，标记量分别为：25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL。分别以4倍的稀释度对其稀释制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表2，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当山羊抗牛IgG抗体浓度为50μg/mL时，是最适的结合垫标记浓度。
表2标记抗原浓度的检测结果
Figure BDA0002460333500000132
荧光标记溶液稀释比例的确定：将标记好的荧光微球分别作2倍、4倍、8倍，3种稀释度稀释。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的荧光标记溶液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表3，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当荧光标记溶液稀释比例为4倍时，为最佳的荧光标记溶液最适稀释比例。
表3荧光标记溶液稀释比例的检测结果
Figure BDA0002460333500000133
Figure BDA0002460333500000141
荧光工作液的确定：按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取合适的荧光微球悬浮液，其分为三组：第一组为：0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.01M磷酸盐缓冲液；第三组为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Tween20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表4，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。
表4荧光工作液检测结果
Figure BDA0002460333500000142
样品垫处理液的确定：为了使样品中的抗体能更好的与结合垫中荧光微球标记的抗原结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100、0.02mol/L的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1M Na2B4O7·10H2O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN3，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备小样，搭配包被片材和结合垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表5，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。
表5样品垫处理液检测结果
Figure BDA0002460333500000151
反应时间的确定：用移液器吸取75μL样本加入到150μL样品缓冲液内，充分混匀30s-1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到样品垫上，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表6，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现层析试纸条最佳反应时间为15min。
表6反应时间的检测结果
Figure BDA0002460333500000152
样品缓冲液的确定：为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02MTris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3；第二组：pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
结果见表7，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。
表7样品缓冲液的检测结果
Figure BDA0002460333500000161
样品稀释比例的确定：样本与样品缓冲液，分别按照下表8的比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。
表8样本与样品缓冲液稀释比例
Figure BDA0002460333500000162
结果见表9，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现样本与样品缓冲液最适的稀释比例为1:2。
表9样品稀释液的检测结果
Figure BDA0002460333500000163
Figure BDA0002460333500000171
时间分辨荧光微球层析试纸条特异性的评定：对猪旋毛虫病阳性血清、牛肝片吸虫病阳性血清、牛脑包虫病阳性血清样本进行检测，除牛细粒棘球蚴病的阳性血清外，在荧光免疫分析仪下，其他非牛细粒棘球蚴病原体的血清在T线均没有检测到信号，只有C线有出现一条带，即为阴性，结果如图4。
时间分辨荧光微球层析试纸条灵敏度的评定：阳性血清倍比稀释后，分别将稀释好的样本滴加到样品垫中，15min后在荧光免疫层析下观测T线的荧光强度。结果显示当阳性血清稀释比例为1:1000时，可以清晰的看见T、C线，当阳性血清稀释比例为1:2000时，T线的亮度很微弱，但C线依旧亮度明显，证明检测结果有效。结果如图5。
时间分辨荧光层析试纸条准确性的评定：为了进一步验证时间分辨荧光免疫层析法检测的有效性，用两种商品化ELISA试剂盒和该方法分别检测了50份牛细粒棘球蚴病的阳性血清和和50份健康牛血清，结果如表10，发现基于时间分辨荧光免疫层析试纸条的检出准确率更高。
表10时间分辨荧光免疫层析试纸条与两种商业化ELISA试剂盒的比较结果
Figure BDA0002460333500000172
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002460333500000181
Figure BDA0002460333500000191
Figure BDA0002460333500000201
Figure BDA0002460333500000211
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法
<130> 2020
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Asp Asp Gly Leu Thr Ser Thr Ser Arg Ser Val Met Lys Met Phe
1 5 10 15
Gly Glu Val Lys Tyr Phe Phe Glu Arg Asp Pro Leu Gly Gln Lys Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asp
35 40 45
Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val Lys Lys Arg Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gly Glu Ile Arg Asp Phe Phe Arg
85 90 95
Ser Asp Pro Leu Gly Gln Lys Leu Val Ala Leu Gly Arg Asp Leu Thr
100 105 110
Ala Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg
130 135 140
Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Asn Cys
165 170 175
Asp Gln Gly Lys Ala Gln Ser Ala Asn Val Thr Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Cys Ser Pro His
195 200 205
Thr Cys Leu Glu His Arg Tyr Arg Arg Cys Val Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Ile Ser Cys
225 230 235 240
Ala Glu Leu Lys Ser Ala Leu Gln Ser Cys Ser Ala
245 250
<210> 2
<211> 579
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggatgatg gcctcacctc gacgtcgagg agtgtgatga aaatgtttgg cgaagtgaag 60
tacttcttcg aacgtgatcc gttgggtcag aaaggggsgg ggsggggsaa agatgagcca 120
aaagcacaca tggggcaagt ggtaaaaaaa agatggggtg aacttcgaga cttctttaga 180
aatgatgggg sggggsgggg sttgggcgaa attcgggact tctttagaag tgatccactg 240
ggtcaaaaac ttgttgctct tggcagggac ctgactgcca tcggggsggg gsggggsaaa 300
ggaatgggcg tagagacaag gacaacagag actccgctcc gtaaacactt caatttgact 360
cctgtgggtt ctcagggcat tggggsgggg sggggsactg gcaattgtga tcaaggaaaa 420
gcacaaagtg ccaatgtgac aggaggggsg gggsggggsg agtgttcccc ccatacctgc 480
ctcgaacatc gctatcgtcg ctgtgtggac ggggsggggs ggggstcagc agagcctctc 540
gatgacgacc atgtgagggc tttcttagat aagctctga 579

Claims (7)

1.一种牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括PVC底板（1）、以及依次设置在所述PVC底板上的样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水垫（5），所述结合垫上包被有时间分辨荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有间隔开的检测线（6）和质控线（7），检测线上包被有重组多表位抗原，质控线上包被有兔抗山羊IgG二抗，
其中，所述重组多表位抗原由以下七个肽段连接而成：
B1：DDGLTSTSRSVMKMFGEVKYFFERDPLGQK；
B2：KDEPKAHMGQVVKKRWGELRDFFRND；
B3：LGEIRDFFRSDPLGQKLVALGRDLTAI；
B4：KGMGVETRTTETPLRKHFNLTPVGSQGI；
B5：TGNCDQGKAQSANVTG；
B6：ECSPHTCLEHRYRRCVD；
B7：GKISCAELKSALQSCSA；
所述重组多表位抗原是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，编码所述重组多表位抗原的基因是如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，所述重组多表位抗原的制备方法：构建含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的目的基因的重组表达载体，转入BL21(DE3)表达感受态中，进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，进行蛋白大量诱导表达，利用不同梯度的咪唑洗脱与蛋白结合后的Ni-Agarose，进而获得高纯度的重组多表位抗原。
4.一种权利要求1所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1结合垫的制备：用山羊抗牛IgG抗体对时间分辨荧光微球进行标记，然后添加4倍体积的荧光工作液进行稀释，混合均匀，喷涂在结合垫上，烘干；
S2硝酸纤维素膜的制备：将所述重组多表位抗原稀释成1 mg/mL喷涂于检测线所在位置，兔抗山羊IgG二抗稀释成2 mg/mL喷涂于质控线所在位置，烘干；
S3试纸条的组装：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸从左到右顺次搭接安装在PVC底板上。
5.根据权利要求4所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述山羊抗牛IgG抗体的标记量为50 μg/mL；所述荧光工作液是0.01M磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求4所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，S1和S2的喷涂步骤中，包被参数均为0.75 μL/cm。
7.根据权利要求4所述的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，采用0.1M Na2B4O7·10H2O、1%PVP、0.2%Casein-Na、1%Triton-X100、1%Tetronic 1307、0.2%NaN3，调至pH=9.3的样品垫处理液对样品垫进行处理。
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