CN113388039B - Sars-cov-2冠状病毒的抗原模拟表位和免疫层析试纸条 - Google Patents

Sars-cov-2冠状病毒的抗原模拟表位和免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示SARS‑COV‑2的抗原模拟表位及其应用，以及SARS‑COV‑2冠状病毒检测免疫层析试纸条，包括顺次相互搭接地粘结在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的抗人IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被抗原模拟表位或其融合蛋白的检测线和包被人IgG抗体的质控线。本发明通过用噬菌体展示肽库技术，从来源于COVID‑19康复者的尿液中的SARS‑COV‑2抗体在肽库中筛选出能与SARS‑COV‑2抗体特异性结合的多肽。根据筛选到的SARS‑COV‑2抗原模拟表位，制备得到特异性高、灵敏度好的新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，具有操作简便、快速的优点。

Description

SARS-COV-2冠状病毒的抗原模拟表位和免疫层析试纸条
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒(SARS-COV-2)的抗原模拟表位和免疫层析试纸条。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-COV-2,或称为2019新型冠状病毒(2019-nCoV)具有极强的传染性，且对人易致患新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。和2003年的SARS冠状病毒以及2012年的MERS冠状病毒同属于冠状病毒科β属。2019-nCoV与2003年"非典"SARS CoV比对，有约70％序列相似性，与MERS CoV有40％的序列相似性。有效地甄别新型冠状病毒感染者是控制疫情蔓延发展的重要前提和手段。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测方法，具有特异性强、灵敏度高以及操作简单等优点，可以不需要复杂的仪器设备，在短时间内(15-30分钟)完成对样品的检测，在医学诊断领域发挥着重要的作用。对新型冠状病毒感染者的免疫学检测方法既包括针对待测人体内病毒抗原的直接免疫分析，也包括对待测人体内产生的特异性针对新型冠状病毒的抗体检测来判断待测人是否被新型冠状病毒感染。其中，特别是免疫层析试纸条因其操作简便，对实验室设备和操作人员的专业要求较低，检测快速，非常适合门诊的初步检测或疑是患者的自检。
对于基于新型冠状病毒抗体的免疫检测方法而言，其最重要的是制备检测抗原。一般而言，可以直接用分离纯化的新型冠状病毒或在解析新型冠状病毒基因组序列的基础上，设计病毒的某些特异性抗原片段，通过基因合成的方法构建新型冠状病毒的重组表达抗原，将其作为检测抗原来应用于新型冠状病毒抗体的检测。直接使用病毒本身作为检测抗原具有一定的传染性风险。重组抗原的制备虽然是比较成熟的方法，但是仍然存在着制备复杂、表达的重组抗原活性低、与天然的新型冠状病毒抗体结合能力、亲和力和特异性低等问题。
噬菌体展示肽库技术的主要特点是可快速有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种SARS-COV-2的抗原模拟表位。
实现上述目的技术方案如下。
一种SARS-COV-2的抗原模拟表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，其序列组成如SEQ ID NO.2所示或其反向互补序列。
本发明的另一目的是提供上述抗原模拟表位或者含有上述抗原模拟表位的噬菌体或SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白在制备SARS-COV-2新型冠状病毒免疫学检测试剂盒中的应用。
在其中一个实施例中，所述免疫学检测试剂盒的检测方法为酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、或免疫斑点杂交法。
一种SARS-COV-2新型冠状病毒免疫学检测试剂盒，包括有上述SARS-COV-2的抗原模拟表位或者含有上述SARS-COV-2抗原模拟表位的噬菌体或SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
本发明的另一目的是提供一种SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条。
实现上述目的的技术方案如下。
一种SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，包括顺次相互搭接地粘结在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的抗人IgG抗体标记物，所述硝酸纤维素膜上设有包被上述SARS-COV-2的抗原模拟表位或者含有上述SARS-COV-2抗原模拟表位的噬菌体或SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白的检测线和包被人IgG抗体的质控线，所述检测线和质控线之间相互间隔。
在其中一些实施例中，所述所述硝酸纤维素膜上设有权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位与MBP标签的融合蛋白的检测线，所述权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位与MBP标签的融合蛋白的浓度为0.5-1.5mg/mL，优选为1-1.2mg/mL，用量为0.8-1ul/mm。
在其中一些实施例中，所述胶体金标记的抗人IgG抗体的浓度为5-15μg/mL，优选为10～15μg/mL。
在其中一些实施例中，所述包被的人IgG抗体的浓度为0.5-1.0mg/mL，优选为0.6-0.8mg/mL，用量为0.8-1ul/mm。
在其中一些实施例中，所述质控线与检测线的间隔为3-5mm，优选4mm。
本发明通过用成熟的噬菌体展示肽库技术，从来源于COVID-19康复者的尿液中的SARS-COV-2抗体在肽库中筛选出能与靶分子(SARS-COV-2抗体)特异性结合的多肽(抗原模拟表位)，该抗原模拟表位具有与天然SARS-COV-2相似的特异性结合抗SARS-COV-2抗体的特性，通过获得的SARS-COV-2抗原模拟表位，以代替SARS-COV-2病毒或传统的SARS-COV-2重组表达抗原，由于其具有很好的特异性，可作为检测抗原应用于抗SARS-COV-2抗体的免疫学检测。
本发明进一步根据筛选到的SARS-COV-2抗原模拟表位，再经过优化各制备参数，制备得到特异性高、灵敏度好的新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，其对操作简便，仅需15分钟左右即可完成检测，而且，检测样品为病人的尿液即可，样品来源简单、相对其他检测样本(痰咽子和血液)不受采样约束，并且检测结果可以目视化。本发明所述检测试纸条可适合于家庭自检，社区自检以及重要的交通路口例如火车站、机场、学校等人流密集场所的快速筛查，而且可以用于基因检测的快速辅助检测，对于SARS-COV-2新型冠状病毒的检测以及指导治疗具有很好的作用。
附图说明
图1是实施例1中通过间接ELISA法对SARS-COV-2抗原模拟表位的鉴定的结果示意图。
图2是实施例4所述的试纸条检测卡的示意图。
附图标记说明：1、样本孔，2、检测线；3、质控线。
具体实施方式
本发明为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本申请实施例的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本文中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明提及的SARS-COV-2抗原模拟表位(多肽)可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有SARS-COV-2抗原模拟表位(多肽)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有SARS-COV-2抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子。化学合成是指依据SARS-COV-2抗原模拟表位的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码SARS-COV-2抗原模拟表位的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行SARS-COV-2抗原模拟表位的大量制备。
本发明以SARS-COV-2抗体(其来源于COVID-19康复者的尿液)为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入噬菌体随机展示十二肽库，进行亲和淘选，获得了一种SARS-COV-2的抗原模拟表位，其氨基酸序列如下：
P-S-W-T-T-S-R-A-P-G-F-L。
本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，对应为：CCT TCTTGG ACT ACT TCTCGTGCTCCTGGTTTT TTG。
本发明还涉及所述OTA抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
本发明SARS-COV-2抗原模拟表位(P-S-W-T-T-S-R-A-P-G-F-L)在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有P-S-W-T-T-S-R-A-P-G-F-L抗原模拟表位(多肽)的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将OTA抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替
P-S-W-T-T-S-R-A-P-G-F-L来进行免疫学检测分析。
本发明的一个实施例中，所述SARS-COV-2抗原模拟表位可以以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。
本发明的一个实施例中还涉及到一种SARS-COV-2新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，该试纸条包括顺次相互搭接地粘结在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的抗人IgG抗体标记物，所述硝酸纤维素膜上设有包被上述SARS-COV-2的抗原模拟表位或者含有上述SARS-COV-2抗原模拟表位的噬菌体或SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白的检测线和包被人IgG抗体的质控线，所述检测线和质控线之间相互间隔。
以下实施例所用溶液的组成如下：
PBST缓冲液：溶剂为水，溶质为NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4和吐温-20，溶质NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4在PBST缓冲液中的浓度分别为8.0g/L、0.2g/L、0.2g/L和1.15g/L，吐温-20在PBST缓冲液中的体积百分含量为0.05％，pH值为7.4。
封闭液：溶剂为PBST缓冲液，溶质为明胶，在封闭液中的浓度为3g/L。
TMB储存液：溶剂为无水乙醇，溶质为四甲基联苯胺(TMB)，溶质TMB在TMB储存液中的浓度为2mg/mL，4℃避光保存。
TMB底物稀释液：溶剂为水，溶质为Na2HPO4和柠檬酸，溶质Na2HPO4和柠檬酸在TMB底物稀释液中的浓度分别为18.27g/L和4.665g/L，PH值为5.5。
底物显色液：含TMB储存液0.5mL，TMB底物稀释液10mL，H2O2 32μL。
终止液：浓度为2M的硫酸水溶液。
样品垫缓冲液：1％BSA，2％TritonX-100，2％PVP 40，20mM Tris-HCl，50mM NaAc。
实施例1.SARS-COV-2抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定
1)SARS-COV-2抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用COVID-19康复者的尿液(其内含有SARS-COV-2抗体)，包被96孔酶标板，37℃孵育5小时。用TBST缓冲液洗涤5次后，加入300μl封闭液4℃孵育1小时。1小时后弃封闭液，用TBST缓冲液洗涤15次，每孔加入100μl噬菌体肽库(噬菌体展示十二肽库，购自NEB公司，用TBS 10倍稀释噬菌体原液，约1.0×1010pfu)，22-26℃振荡反应15分钟。弃去未结合的噬菌体，用TBST缓冲液洗涤10次，结合上的噬菌体用0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)洗脱，并立即用15μl 1M Tris-HCl(pH9.1)中和。取10μl洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coli ER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。
在第二的淘选过程中，包被用生理盐水稀释100倍的COVID-19康复者的血液(内含SARS-COV-2抗体)，所用的TBST浓度为0.25％和0.5％，其余步骤同上。第三轮包被COVID-19康复者的尿液(其内含有SARS-COV-2抗体)，其余步骤同上。
2)SARS-COV-2抗原模拟表位的鉴定：采用间接ELISA的方法进行OTA抗原模拟表位的鉴定，具体方法为：用COVID-19康复者的尿液(内含SARS-COV-2抗体)、正常人尿液、乙肝病毒康复者尿液、3％BSA、正常人血清分别包被酶标板，4℃孵育过夜；第二天用PBST(10mMPBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3％脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100μl噬菌斑扩增上清克隆(1.0×1010pfu)(用10mM PBS(pH 7.4)稀释分别按照2000倍、1000倍、500倍、250倍、125倍稀释)，37℃孵育1小时；加入1:4000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100μl，37℃孵育1小时；加入100μl TMB底物液，避光显色5min，加入终止液。读取OD450，仅结合COVID-19康复者尿液的噬菌体，鉴定为SARS-COV-2的抗原模拟表位。结果请见图1，SARS-COV-2抗原表位重组蛋白的特异性很好，可与SARS-COV-2抗体发生特异结合反应。
实施例2.SARS-COV-2抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
将经过间接ELISA鉴定展示有SARS-COV-2抗原模拟表位的噬菌体进行扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将800μl含噬菌体上清转入一新离心管。加入200μl PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀重悬于100μl碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,4M NaI)，加入250μl无水乙醇沉淀DNA，离心后再用70％乙醇洗涤沉淀(DNA测序模板)。沉淀最终重悬于20μl灭菌水，取2μl进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5μL噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII测序引物为：
5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。依据DNA测序结果及密码子表，经过筛选获得一段SARS-COV-2抗原模拟表位的氨基酸序列。它的氨基酸序列如下：P-S-W-T-T-S-R-A-P-G-F-L(SEQ ID NO.1)，编码该抗原模拟表位的核酸序列为CCT TCT TGG ACT ACT TCTCGT GCT CCT GGT TTT TTG(SEQ ID NO.2)。
实施例3SARS-COV-2抗原模拟表位的大量制备
(1)以噬菌体扩增的方式
将展示有SARS-COV-2抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738的培养物中，37度220rpm振荡培养4.5h。将培养物转入另一离心管中，4℃10000rpm离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃下静置120min。4℃10000rpm离心PEG/NaCL静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入1mL TBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。
(2)以SARS-COV-2抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备
A.PCR扩增SARS-COV-2抗原模拟表位的外源编码基因
PCR反应体系：(50μL)
10×Pyrobest Buffer(Mg2+plus)5μLM13KE insert extension primer(10mM)1μL
-96gIII sequencing primer(10mM)1μL
噬菌体DNA模板1μLPyrobest DNA Polymerase 0.5μL
灭菌ddH2O 37.5μL
PCR反应条件：95℃5min，接着95℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，72℃10min共30cycles。
采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。本发明SARS-COV-2抗原模拟表位的编码基因序对应为CCT TCT TGG ACT ACT TCTCGT GCT CCT GGT TTT TTG：
B.外源编码基因及表达载体的双酶切
分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体(pMAl-pIII,NEB公司，可表达MBP融合蛋白)进行双酶切。
C.酶切后产物的连接及转化
将质粒pMal-PIII和目的片段以1∶10(摩尔比)混匀，于16℃水浴连接12h,取10μL连接产物加至100μL感受态细胞TB1中，充分混匀。冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μL LB液体培养液，37℃，200rpm培养1h，10000rpm离心2min，吸去上清留取约200μL，涂布于LB-A固体(Ampr)培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。
D.SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达
将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0.2％蔗糖中，37℃，220r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-A，0.2％蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37℃，220r/min振荡培养，当培养物细菌浓度OD600达到0.6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，220r/min振荡培养，将诱导物(PEG溶液)于4℃，4000g，离心20min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400mL 30mM Tris-HCl，20％蔗糖，pH 8.0(80mL/g细胞湿重)，加入EDTA至1mM，室温下震荡5-10min，8000g，4℃，离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mM MgSO4，冰上震荡10min，8000g，4℃，离心20min，保留上清，向上清液中加入8mL1M Tris-HCl,pH 7.4，获得SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白。
实施例4SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白制备的免疫层析试纸条
一种SARS-COV-2新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，包括顺次相互搭接地粘结在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的抗人IgG抗体标记物，所述硝酸纤维素膜上设有包被SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白的检测线和包被人IgG抗体的质控线，所述检测线对照线之间相互间隔。
所述SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白制备的免疫层析试纸条的制备包括以下步骤：
将样品垫(玻璃纤维素膜，上海金标生物科技有限公司)浸泡于样品垫缓冲液中浸泡30min后取出，并置于37℃烘干，4℃干燥条件下保存备用。
将结合垫(上海金标生物科技有限公司)先浸泡于封闭液中30min后取出，置于37℃烘干，用喷膜机按常规方法将标记好的浓度为10μg/mL金标记的抗人IgG抗体(Sigma)均匀喷撒在结合垫上，然后37℃干燥备用。
金标记的抗人IgG抗体的制备：用0.1M碳酸钾溶液将胶体金的pH调整至8.2，按10～15μg抗体/mL胶体金的量加入抗人IgG抗体，磁力搅拌1h，加入终浓度为0.5％的BSA，静置1h。4℃保存备用。
3、硝酸纤维素层析膜的包被
用PBS缓冲液稀释SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白至1.2mg/mL，用量为1ul/mm，人IgG抗体(Sigma)稀释至0.8mg/mL，用量为1ul/mm，通过定量喷膜仪均匀地喷散在硝酸纤维素膜(Whatman)上，分别形成检测线(T)和质控线(C线)，质控线与检测线的间隔为4mm，于25℃，湿度10～30％，烘干过夜处理，得到包被膜。
4、在底板(PCV胶板)上依次相互交错的黏贴上样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫(滤纸纤维)，其中吸水垫与硝酸纤维膜、硝酸纤维膜与结合垫、结合垫与样品垫相互叠置，使其紧密接触，保证检测过程中液流顺利，使检测线与胶体金结合垫的连接硝酸纤维素膜的一端距离2mm。最后，组装好的试纸条通过免疫层析试纸切割机切割成4mm大小，得到检测试纸条，加装上、下塑料盒盖，组装成使用方便的快速检测试纸条得到SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白制备的免疫层析试纸条检测卡，参见图2。
检测时，将病人的尿液样品2-4滴滴加到免上述免疫层析试纸条检测卡的样品孔1(对应到样品垫，参见图2)，通过毛细管作用将样本输送到结合垫，当尿液样本中含SARS-COV-2新冠病毒特异性抗体(主要是IgG)时，其与结合垫中的胶体金标记的抗人IgG抗体形成胶体金-抗抗体-抗体复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达包被SARS-COV-2抗原模拟表位-MBP融合蛋白的检测线处，形成胶体金-抗抗体-抗体-抗原复合物，聚集在检测线2处，显示出红色的检测线2。胶体金-抗抗体-抗体复合物继续前行，到达质控线3时，与人IgG抗体结合并聚集，形成红色的质控线3。整个反应在10分钟左右内完成。
在检测线和质控线位置分别出现两条明显的红色反应带时，结果为阳性；如检测线处肉眼可见，但是颜色相对质控线较弱时，为弱阳性；在检测线位置无红色反应带而在质控线位置出现一条红色的反应带时，结果为阴性；如在质控线位置无反应带出现，则表示结果无效。
实施例5临床样本检测
来源于某医院的经临床和基因检测确诊SARS-COV-2新型冠状病毒感染的病人的尿液20例，以健康人尿液样本(身体无任何临床症状，无传染病接触史、感染史，肺部CT检测正常)20例做阴性对照，26例疑是患者(与确诊患者密切接触者，临床上暂未有明显表现如发烧、肺部CT未有明显病变出现)的尿液样本用实施例4所述检测试纸条和基因检测—荧光定量PCR(痰咽式子)进行检测。
表1确诊病例检测结果
检测/样本 阳性 阴性
试纸条 19 21
临床+基因检测 20 20
表2疑是患者检测结果
检测/样本 阳性 阴性
试纸条 2 24
基因检测 5 21
通过上述检测结果可以看出，本发明所述检测试纸条，对于已经临床有症状的患者，且经历了一定时间的病程的患者的检测率比较高，达95％。对于临床症状不明显，或者处于带菌健康期时的检测率也有40％的检测率。因为还处于试验阶段，阳性样本量偏少，只能预评估。总体而言，本发明所述SARS-COV-2新型冠状病毒检测试纸条的特异性很好，未出现假阳性结果，而且，对发病后的病人的检测率较高，适合临床快速筛查。
实施例6敏感性实验
从某医院的经临床和基因检测确诊的SARS-COV-2新型冠状病毒感染的病人的从有临床症状起算约3天时的尿液样本1例(标记COV1)，以及从有临床症状起算约10天时的尿液样本1例(标记COV2)、从有临床症状起算约18天时的尿液样本1例(标记COV3)、以及从有临床症状起算约25天时的尿液样本1例(标记COV4)，共4例样本，用生理盐水分别稀释2、4、8、16，用实施例4所述的检测试纸条进行检测。检测结果如下。
标本/稀释度 1 2 4 8 16
COV1 阳性 阳性 弱阳性 阴性 阴性
COV2 阳性 阳性 弱阳性 阴性 阴性
COV3 阳性 阳性 阳性 弱阳性 阴性
COV4 阳性 阳性 阳性 弱阴性 阴性
病程不同阶段，以及个体差异，产生的抗体的浓度也不会不同，在新型冠状病人中，特异性抗体IgM是最初体液免疫应答中最早出现的抗体，约一周出现，特异性抗体IgG是再次免疫应答产生的主要抗体，于2-4周达到高峰。尿液中的抗体相对与组织液和血液的量会偏少，但是依然存在特异抗体。本发明通过从新冠状病毒患者康复后的尿液中筛选到的SARS-COV-2抗原模拟表位所制备的免疫层析试纸条，具有很好的灵敏度。具有很好的临床的实用性，不需要特殊试验条件，结果客观，肉眼易于判断。所以本发明所述检测试纸条是一项很有前途的技术，非常适宜在广大基层单位推广和应用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 佳贺斯（浙江）生物医药科技有限公司
<120> SARS-COV-2冠状病毒的抗原模拟表位和免疫层析试纸条
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Ser Trp Thr Thr Ser Arg Ala Pro Gly Phe Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttcttgga ctacttctcg tgctcctggt tttttg 36

Claims (13)

1.一种SARS-COV-2的抗原模拟表位肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述抗原模拟表位肽的核苷酸序列，其碱基组成如序列表中SEQ IDNO.2所示或其反向互补序列。
3.权利要求1所述的SARS-COV-2的抗原模拟表位肽或者含有权利要求1所述的SARS-COV-2的抗原模拟表位肽的噬菌体或权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位肽与MBP标签的融合蛋白在制备SARS-COV-2冠状病毒免疫学检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测试剂盒的检测方法为酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、或免疫斑点杂交法。
5.一种SARS-COV-2冠状病毒免疫学检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1所述的抗原模拟表位肽或者含有权利要求1所述的抗原模拟表位肽的噬菌体或权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位肽与MBP标签的融合蛋白。
6.一种SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，包括顺次相互搭接地粘结在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的抗人IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被有权利要求1所述的抗原模拟表位肽或者含有权利要求1所述的抗原模拟表位肽的噬菌体或权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位肽与MBP标签的融合蛋白的检测线和包被人IgG抗体的质控线，所述检测线和质控线之间相互间隔。
7.根据权利要求6所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设有权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位肽与MBP标签的融合蛋白的检测线，权利要求1所述的SARS-COV-2抗原模拟表位肽与MBP标签的融合蛋白的浓度为0.5-1.5mg/mL，用量为0.8-1ul/mm。
8.根据权利要求7所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述融合蛋白的浓度为1-1.2mg/mL，用量为0.8-1ul/mm。
9.根据权利要求6所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗人IgG抗体的浓度为5-15μg/mL。
10.根据权利要求9所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗人IgG抗体的浓度为10～15μg /mL。
11.根据权利要求6-10任一项所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被的人IgG抗体的浓度为0.5-1.0mg/mL，用量为0.8-1ul/mm。
12.根据权利要求6-10任一项所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述质控线与检测线的间隔为3-5mm。
13.根据权利要求12所述的SARS-COV-2冠状病毒检测免疫层析试纸条，其特征在于，所述质控线与检测线的间隔为4mm。
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