CN110093356B

CN110093356B - 编码非洲猪瘟病毒抗原的dna序列、由其编码的抗原的组合物及其在免疫学检测中的应用

Info

Publication number: CN110093356B
Application number: CN201910401809.8A
Authority: CN
Inventors: 王延轶; 付辉; 冉勇; 朱海; 石正旺; 袁克湖; 张克山; 林季敏; 马涛; 易俊伟; 杨年松; 严义勇
Original assignee: SHENZHEN BIOEASY BIOTECHNOLOGY CO LTD; Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Shenzhen Love Doctor Biotechnology Co ltd; Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2039-05-14
Also published as: CN110093356A

Abstract

本发明提供了一种编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列、包含上述DNA序列的载体、包含上述载体的表达系统，由上述DNA序列编码的抗原的组合物、以及上述抗原组合物在检测非洲猪瘟病毒的免疫学检测方法中的应用。本发明通过消除稀有密码子等密码子优化的方法对编码非洲猪瘟病毒的主要膜蛋白和衣壳蛋白中的CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L、以及PB646L的DNA序列进行了优化，并且发现上述经密码子优化的核苷酸序列可以在合适的表达系统中高效地表达上述主要膜蛋白和衣壳蛋白，并且由此建立的免疫学检测方法可以快速、简便、大规模地检测非洲猪瘟病毒。

Description

编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列、由其编码的抗原的组合物及其在免疫学检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列、由其编码的抗原的组合物及该组合物在免疫学检测方法中的应用。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪和各种野猪引起的一种出血性、烈性传染病，可影响所有年龄的猪，引起出血热。非洲猪瘟有多种表现形式，从超急性、急性、亚急性到慢性和无明显症状。非洲猪瘟具有发病过程短，死亡率高的特点，生猪一旦感染，会在2-10日内死亡，并且死亡率可高达100％。此外，非洲猪瘟病毒的环境耐受力较强，在空气中能保持活性数日，在猪粪便中能保持活性数周，在被感染的冷冻肉制品中仍能存活数年，并且传播途径也较为广泛，可通过虫媒、排泄物或体液以及被污染的饲料等途径传播。非洲猪瘟的上述特点也决定了非洲猪瘟一旦爆发将会导致重大的经济损失，世界动物卫生组织将其列为“必须报告的动物疫病”，在我国规定为“一类动物疫病”。

目前，世界上尚无疫苗即血清用作主动或被动免疫。为防止疫病的传播，就需要实施严格的卫生和生物安全控制措施，而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。非洲猪瘟的检测一般利用核酸检测方法，如PCR、恒温扩增，或抗原检测。此外，目前非洲猪瘟病毒已经逐渐从开始的急性感染，向发病不明显，甚至不发病的亚急性感染和隐形感染变化，这就需要使用不同于急性感染以检测非洲猪瘟病毒抗原为主的方法。目前，大多数公司通过选取猪瘟病毒的部分片段或对选取的片段进行重组来进行抗原、抗体的开发，但是这种方法具有表达量低、准确率低以及假阴性现象较多的特点。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列，其能够在宿主系统中高度表达相应的非洲猪瘟病毒抗原，由此建立了检测非洲猪瘟病毒的方法。

因此，在第一方面，本发明提供了一种编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列，其中，所述DNA序列为SEQ ID No.7、8、9、10、11或12所示的DNA序列中的任一序列。

在第二方面，本发明提供了一种载体，包含本发明的第一方面所述的DNA序列。

在第三方面，本发明提供了一种表达系统，包含本发明的第二方面所述的载体。

在第四方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒抗原组合物，其中，所述抗原组合物包含非洲猪瘟病毒抗原组分CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L中的两种及更多种的组合；优选地，所述非洲猪瘟病毒抗原CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L分别具有SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列。

在第五方面，本发明提供了本发明的第四方面所述的非洲猪瘟病毒抗原组合物在检测非洲猪瘟病毒的免疫学检测方法中的应用。

本发明人发现，通过消除稀有密码子等密码子优化的方法对非洲猪瘟病毒的主要膜蛋白和衣壳蛋白亦即抗原CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L的DNA序列进行了优化，并且全人工合成了所述经密码子优化的DNA序列。通过将所述经密码子优化的DNA序列藉由合适的载体引入相应的宿主系统所得到的表达系统可以高效地表达这些抗原蛋白。

此外，本发明人还发现，包含非洲猪瘟病毒抗原CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L中的两种及更多种的组合的抗原组合物具有更低的检出限或者说更高的灵敏度。

本发明的经密码子优化的DNA序列以及本发明的抗原组合物可以间接地或者直接地建立检测非洲猪瘟病毒的免疫学检测方法，由此可以快速、简便、大规模地检测非洲猪瘟病毒，可以适应不同规模的猪场、动物疾病控制中心以及研究所对检测便利性、检测规模和检测速度的要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所涉及的附图作简单地介绍，其中：

图1A示出了DNA序列SEQ ID No.7藉由pET-28a载体在大肠杆菌中表达得到的抗原CP204L的SDS-PAGE电泳图；

图1B示出了DNA序列SEQ ID No.8藉由载体pET-Trx-His在大肠杆菌中表达得到的抗原PK205R的SDS-PAGE电泳图；

图1C示出了DNA序列SEQ ID No.8藉由载体pET-SUMO-His在大肠杆菌中表达得到的抗原PK205R的SDS-PAGE电泳图；

图1D示出了DNA序列SEQ ID No.10藉由载体pET-SUMO-His在大肠杆菌中表达得到的抗原CP530R的SDS-PAGE电泳图；

图1E示出了DNA序列SEQ ID No.11藉由载体pET-Trx-His在大肠杆菌中表达得到的抗原E183L的SDS-PAGE电泳图；

图2A示出了DNA序列SEQ ID No.7藉由pcDNA-FLAG载体在293细胞中表达得到的抗原CP204L的SDS-PAGE电泳图；

图2B示出了DNA序列SEQ ID No.8藉由pcDNA-mFc载体在293细胞中表达得到的抗原PK205R的SDS-PAGE电泳图；

图2C示出了DNA序列SEQ ID No.11藉由pcDNA-hFc载体在293细胞中表达得到的抗原E183L的SDS-PAGE电泳图；

图3A示出了DNA序列SEQ ID No.9藉由pQBD-FLAG载体在Sf9细胞中表达得到的抗原PB602L的SDS-PAGE电泳图；

图3B示出了DNA序列SEQ ID No.12藉由pQBD-FLAG载体在Sf9细胞中表达得到的抗原PB646L的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例以及说明书附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员能够获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的在于更高效地提供非洲病毒抗原，并将所述非洲病毒抗原以及其相应的抗体应用到非洲猪瘟病毒的免疫学检测中，以使得可以快速、简便、大规模地检测非洲猪瘟病毒。

因此，根据本发明的第一方面，提供了一种编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列，其中，所述DNA序列为SEQ ID No.7、8、9、10、11或12所示的DNA序列中的任一序列。

在本文中，“猪瘟病毒抗原”主要是指来源于非洲猪瘟病毒例如Georgia株的主要膜蛋白和衣壳蛋白CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L和PB646L，其对应的氨基酸序列可以是分别由SEQ ID No.1、2、3、4、5和6所示的氨基酸序列。

编码非洲猪瘟病毒的主要膜蛋白和衣壳蛋白的天然基因难以在异源环境例如原核或者真核表达环境中表达，或者表达甚微——如果有表达的话。然而，本发明人通过密码子优化设计出了编码这些氨基酸序列的DNA序列，并且这些DNA序列可以在原核和真核表达系统中高效表达。所述密码子优化可以包括消除稀有密码子、调整GC含量、增加mRNA的稳定性、优化mRNA二级结构等，但不限于此。

根据本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体包含SEQ ID No.7、8、9、10、11或12所示的DNA序列。

“载体”是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种具有自我复制能力的DNA分子。有三种最常用的载体，即质粒载体、噬菌体载体和动植物病毒载体。因此，在一个实施方案中，所述载体可以为质粒载体、噬菌体载体或动植物病毒载体。

载体需要与宿主相匹配，依据后续具体使用的宿主来进行选择。

例如，若后续拟选择原核细胞作为宿主细胞来构建相应的表达系统，则可以采用原核(细菌)表达载体，例如基于pET-28a的载体。可以直接使用载体pET-28a，也可以对其加以改造后再使用。已知在载体pET-28a中包含编码表达标签N端6*His的DNA序列以及编码纯化标签His的DNA序列。在本发明中，可以将所述表达标签改造为其他表达标签，例如N端GST、N端SUMO、N端人SOD、N端Trx、N端DsbA、N端DsbC，但不限于此。类似地，也可以将所述纯化标签改造为其他纯化标签例如GST，但不限于此。

若后续拟选择哺乳动物细胞作为宿主细胞来构建相应的表达系统，则可以采用哺乳动物表达载体，例如基于pcDNA 3.1的载体。可以对pcDNA3.1载体进行改造，例如将其表达标签改造为C端FLAG、C端小鼠Fc或者C端人Fc，但是不限于此。类似地，也可以将其中的纯化标签改造为FLAG、人Fc或者小鼠Fc，但不限于此。

若后续拟选择昆虫细胞作为宿主细胞来构建相应的表达系统，则可以采用昆虫表达载体，例如基于pQBD的载体。可以对该载体进行改造，例如将其表达标签改造为C端FLAG、C端小鼠Fc、C端人Fc，但不限于此。类似地，也可以将其中的纯化标签改造为FLAG、小鼠Fc、人Fc，但不限于此。

因此，在一个实施方案中，所述载体为基于pET-28a、pcDNA 3.1或pQBD的载体。

在一个具体实施方案中，所述基于pET-28a的载体可以为pET-GST、pET-SUMO-His、pET-SOD-His、pET-Trx-His、pET-DsbA-His、pET-DsbC-His，在此处的载体命名中，第一部分表示基础载体，第二部分表示表达标签，第三部分表示纯化标签，并且在仅第一部分和第二部分时，表示表达标签和纯化标签是相同的。

在另一个具体实施方案中，所述基于pcDNA 3.1的载体可以为pcDNA-FLAG、pcDNA-mFc、pcDNA-hFc，在此处的载体命名中，第一部分表示基础载体，第二部分表示表达标签和纯化标签，且此时表达标签和纯化标签是相同的。

在又一个具体实施方案中，所述基于pQBD的载体可以为pQBD-FLAG、pQBD-mFc、pQBD-hFc，在此处的载体命名中，第一部分表示基础载体，第二部分表示表达标签和纯化标签，且此时表达标签和纯化标签是相同的。

在本发明的第三方面中，提供了一种表达系统，所述表达系统包含根据本发明的第二方面所述的载体。

“蛋白表达”是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术，其在基因工程技术中占有核心地位。

蛋白表达系统是指由宿主、载体(包含外源基因)和辅助成分组成的体系，其可以实现外源基因在宿主中的表达。宿主是表达蛋白的生物体，其可以为原核细胞如细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)、酵母细胞、植物细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞)等。由于各生物体的特性不同，适合表达的蛋白的种类也不相同。载体包含外源基因片段，其种类需要与宿主相匹配。通过载体的介导，外源基因可以在宿主中表达。辅助成分是一些表达系统中包括的协助载体进入宿主的辅助成分，例如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。

因此，在一个实施方案中，所述表达系统可以为原核表达系统或真核表达系统。

在一个实施方案中，所述原核表达系统可以为细菌例如大肠杆菌。

在另一个实施方案中，所述真核表达系统可以包括哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统和酵母表达系统。

在一个进一步的实施方案中，所述哺乳动物细胞表达系统可以包括CHO细胞和293细胞，但不限于此。

在又一个进一步的实施方案中，所述昆虫细胞表达系统可以包括Sf9细胞或High5细胞，但不限于此。

本发明人发现，本发明的经密码子优化的非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列，即SEQ IDNo.7-12，可以藉由合适的载体在相应的宿主细胞中高效地表达，由此为非洲猪瘟病毒的检测提供了便利。

在第四方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒抗原组合物，其中，所述抗原组合物包含非洲猪瘟病毒抗原组分CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L和PB646L中的两种或者更多种(例如三种、四种、五种或者六种)的组合。

在一个优选的实施方案中，所述非洲猪瘟病毒抗原CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L分别具有SEQ ID NO.1-6所示的氨基酸序列。本领域技术人员可以理解，与所述氨基酸序列SEQ ID NO.1-6具有一定程度(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)同一性/同源性、且依然保留免疫原性的其同源序列或片段也在本发明范围内。

在一个优选的实施方案中，所述抗原组合物可以为包括非洲猪瘟病毒抗原组分的以下任一组合：CP204L+CP530R，优选地，以重量计，CP204L为40％-75％，CP530R为25％-60％；PK205R+E183L，优选地，以重量计，PK205R为25％-80％，E183L为20％-75％；PB602L+PB646L，优选地，以重量计，PB602L为25％-75％，PB646L为25％-75％；CP204L+PK205R+PB602L，优选地，以重量计，CP204L为20％-60％，PK205R为20％-60％，PB602L为10％-60％；CP204L+PK205R+CP530R，优选地，以重量计，CP204L为20％-60％，PK205R为20％-60％，CP530R为20％-35％；PK205R+PB602L+PB646L，优选地，以重量计，PK205R为20％-35％、PB602L为20％-60％，PB646L为20％-60％；PK205R+PB602L+CP530R+E183L，优选地，以重量计，PK205R为10％-25％、PB602L为10％-45％、CP530R为10％-25％，E183L为25％-50％；PB602L+CP530R+E183L+PB646L，优选地，以重量计，PB602L为10％-45％，CP530R为10％-45％，E183L为10％-20％，PB646L为25％-40％；CP204L+PB602L+CP530R+E183L，优选地，以重量计，CP204L为10％-45％，PB602L为10％-35％，CP530R为10％-45％，E183L为25％-40％；以及PK205R+PB602L+CP530R+PB646L，优选地，以重量计，PK205R为10％-60％，PB602L为10％-60％，CP530R为10％-60％，PB646L为10％-60％。

在另一个实施方案中，所述抗原组合物中包含的抗原组分CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L分别由本发明的第一方面所述的DNA序列SEQ ID No.7、8、9、10、11以及12编码。

如本发明的实施例部分所证实，本发明人意外地发现，通过将非洲猪瘟病毒的上述几种抗原组合在一起获得的非洲猪瘟病毒的抗原组合物，相对于单独的抗原组分具有更低的检出限，更高的灵敏度。由于这一特点，在将所述抗原组合物应用于各种检测例如免疫学检测中时，会进一步地提高这些检测方法的灵敏度。相应地，由此建立的免疫学检测方法可以快速、简便、大规模地检测非洲猪瘟病毒的存在与否或者其含量。

在第五方面，本发明涉及第四方面提供的非洲猪瘟病毒抗原组合物在检测非洲猪瘟病毒的免疫学检测方法中的应用。

在一个实施方案中，所述免疫学检测方法可以包括金标免疫层析法、荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法，但不限于此。任何采用抗原和/或抗体的检测方法均可以采用本发明的非洲猪瘟抗原组合物以及对应的抗体来进行。

金标免疫层析法(GICA)是20世纪90年代初发展起来的快速免疫分析技术。它是建立在免疫层析技术、单克隆抗体技术和金纳米晶标记技术基础上的一种固相检测技术。金纳米晶标记技术是以金纳米晶作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原-抗体反应的一种免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射同位素污染等问题，因此使定位更加精确。这项技术主要利用了金纳米晶具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可以用于定性或半定量的快速免疫检测。

荧光免疫层析法(FICA)是基于抗原、抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。

酶联免疫吸附法(ELISA)是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是：抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性或酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。

化学发光免疫分析法(CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额；免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。

下面结合附图以及实施例对本发明进行更为具体和详细的描述。需要注意，在本申请中未明确记载的方法/实验步骤均可以通过本领域的常规方法/实验步骤来进行，同时可以参考相应的实验工具书。

实施例

实施例1.非洲猪瘟病毒抗原的表达系统的构建

按照本领域的常规技术方法，将合成的编码非洲猪瘟病毒的主要膜蛋白和衣壳蛋白CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L的DNA序列SEQ ID No.7、8、9、10、11或12分别通过引物加上合适的酶切位点，并藉由该酶切位点连接至载体中。随后，将加入目标DNA序列的载体再导入相应的宿主细胞中，由此构建出用于表达上述蛋白的表达系统。在本发明中具体采用的载体、宿主细胞、表达标签、纯化标签和酶切位点的组合的实例如下表1所示。

表1.载体、宿主细胞、表达标签、纯化标签和酶切位点的组合实例

载体名称	宿主细胞	表达标签	纯化标签	酶切位点
					pET-28a	E.Coli	N端6*His	His	BamH I+Xho I
pET-GST	E.Coli	N端GST	GST	BamH I+Xho I
					pET-SUMO-His	E.Coli	N端SUMO	His	BamH I+Xho I
pET-SOD-His	E.Coli	N端人SOD	His	BamH I+Xho I
					pET-Trx-His	E.Coli	N端Trx	His	BamH I+Xho I
pET-DsbA-His	E.Coli	N端DsbA	His	BamH I+Xho I
					pET-DsbC-His	E.Coli	N端DsbC	His	BamH I+Xho I
pcDNA-FLAG	CHO/293	C端FLAG	FLAG	Hind III+BamH I
					pcDNA-mFc	CHO/293	C端小鼠Fc	小鼠Fc	Hind III+BamH I
pcDNA-hFc	CHO/293	C端人Fc	人Fc	Hind III+BamH I
					pQBD-FLAG	Sf9/High 5	C端FLAG	FLAG	Hind III+BamH I
pQBD-mFc	Sf9/High 5	C端小鼠Fc	小鼠Fc	Hind III+BamH I
					pQBD-hFc	Sf9/High 5	C端人Fc	人Fc	Hind III+BamH I

注：表1中使用的载体是以载体pET-28a(Novagen)、pcDNA 3.1(Thermo)或pQBD(陕西杆粒生物科技有限公司)为基础。表1中的载体命名，除了第一个完全使用其商业名外，后面的载体命名是根据其基础载体以及表达标签和纯化标签来作出的。

实施例2.非洲猪瘟病毒抗原在原核表达系统中的表达和纯化

一.实验方案：

1)将在实施例1中构建的原核表达系统即大肠杆菌(E.Coli)复苏，用相应抗性的LB培养基进行接种，37℃、200rpm摇床培养12-16h。

2)将复苏的菌液按照100:1的比例接种到相应抗性的TB培养基中，37℃、200rpm摇床培养3-4h。

3)在培养3-4h、细菌浓度OD600＝0.6-1.0时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM。然后在37℃、200rpm摇床培养4-6h(即诱导4-6h)。

4)诱导完成后，于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体。

5)用缓冲液A(20mM Tris pH＝8.5，100mM NaCl)重悬清洗菌体，并于4℃、8000rpm离心10min，收集菌体，随后再重复清洗一次。

6)将收集好的沉淀超声破碎，并将破碎后的菌液于4℃、10000rpm离心30min，取沉淀。

7)用30ml缓冲液A充分悬浮沉淀，加入20mg溶菌酶，搅拌混匀，室温下消化1h。

8)加入TritonX-100至终浓度2％，室温下搅拌混匀，超声破碎，无明显颗粒方可。于20℃、20000rpm离心10min，取沉淀。

9)沉淀用缓冲液B(20mM Tris pH＝8.5，100mM NaCl，0.5％TritonX-100)洗2次，把杂带洗掉。

10)将沉淀用10ml 8M尿素溶解，于20℃、20000rpm离心10min，取上清。

11)向包涵体溶解得到的上清加入1/4体积的5×上样缓冲液，混匀后用0.22μM过滤器过滤样品，并在100℃加热10min。

12)取2μL上清，用SDS-PAGE电泳检测，初步估算目的蛋白纯度，浓度。

13)制备大胶，每块胶(20cm×20cm)上样量为10mg，4℃条件下用85V电压跑15个小时左右(溴酚蓝跑完为止)。

14)在大胶上切出2cm左右的小胶用0.3M氯化铜染色5min，参照染色后的结果把目的蛋白切出来。

15)切出来的胶放到透析袋用120V的电压洗脱2h,共电洗脱3次。

16)收集电洗脱后的蛋白，测蛋白浓度，跑胶确认纯度后备用。

二.实验结果：

结果发现，经优化的本发明的DNA序列均可以藉由载体导入大肠杆菌表达系统内，并在其中高效表达。图1A至图1E代表性地示出了所述DNA序列在大肠杆菌中表达的情况。具体地，图1A示出了DNA序列SEQ ID No.7藉由pET-28a载体在大肠杆菌中表达得到的抗原CP204L的SDS-PAGE电泳图，图1B示出了DNA序列SEQ ID No.8藉由载体pET-Trx-His在大肠杆菌中表达得到的抗原PK205R的SDS-PAGE电泳图，图1C示出了DNA序列SEQ ID No.8藉由载体pET-SUMO-His在大肠杆菌中表达得到的抗原PK205R的SDS-PAGE电泳图，图1D示出了DNA序列SEQ ID No.10藉由载体pET-SUMO-His在大肠杆菌中表达得到的抗原CP530R的SDS-PAGE电泳图，图1E示出了DNA序列SEQ ID No.11藉由载体pET-Trx-His在大肠杆菌中表达得到的抗原E183L的SDS-PAGE电泳图。经检测发现，纯化后所有蛋白的纯度均可以达到90％以上。

实施例3.非洲猪瘟病毒抗原在293细胞中的表达及其纯化

一.实验方案：

1)在转染前一天，取对数生长期的293细胞按0.8×10⁶个细胞/mL密度进行传代。

2)准备2个无菌EP管，各加入200μL细胞无血清培养基，再分别加入20μg含有目的基因的表达载体DNA(见实施例1)和60μL PEI转染试剂，混匀之后室温孵育5min。

3)将PEI转染试剂稀释液快速加入含有目的基因的表达载体DNA稀释液中，用移液枪轻轻混匀，室温孵育15-20min。

4)将含有目的基因的表达载体DNA与转染试剂PEI的混合液快速加入细胞悬液。

5)待细胞活率降至60％左右时，离心收取细胞上清液并进行纯化。

6)FLAG标签蛋白用Sigma M2 Agarose柱子进行纯化，小鼠Fc(mFc)标签蛋白和人Fc(hFc)标签蛋白用GE Protein A Agarose柱子进行纯化(纯化步骤分别按照纯化柱说明书进行)，并将纯化的蛋白用PBS透析后备用。二.实验结果：

结果发现，经优化的本发明的DNA序列可以藉由载体导入293细胞中，并在其中高效表达。图2A至图2C代表性地示出了所述DNA序列在293细胞中表达的情况。具体地，图2A示出了DNA序列SEQ ID No.7藉由pcDNA-FLAG载体在293细胞中表达得到的抗原CP204L的SDS-PAGE电泳图，图2B示出了DNA序列SEQ ID No.8藉由pcDNA-mFc载体在293细胞中表达得到的抗原PK205R的SDS-PAGE电泳图，图2C示出了DNA序列SEQ ID No.11藉由pcDNA-hFc载体在293细胞中表达得到的抗原E183L的SDS-PAGE电泳图。经检测发现，纯化后所有蛋白的纯度均可以达到90％以上。

实施例4.非洲猪瘟病毒抗原在昆虫细胞中的表达及其纯化

一.实验方案：

1、准备转染DNA混合物

1)向无菌的1.5mL离心管中加入95μL ddH₂O(或无血清培养基)，再向离心管中加入5μL Promega FuGENE HD转染试剂，充分混匀。

2)向无菌的1.5mL离心管中加入92μL ddH₂O(或无血清培养基)，再向离心管中加入5μL Bacmid DNA，再向离心管中加入3μL含有目的基因的表达载体DNA(见实施例1)，充分混匀。

3)将1)中的溶液加入2)中的溶液，充分混匀，室温静置20-30min，由此得到转染DNA混合物。

2、将转染DNA混合物加入细胞

1)将转染DNA混合物逐滴均匀加入细胞培养皿，其中每个培养皿铺有1×10⁶个Sf9细胞(2mL)。

2)随后将Sf9细胞放置在28℃培养箱中静置培养4-6天。

3、收获P0代病毒

收集培养皿中的培养基(上清)，4℃避光保存。此即为P0代病毒。

4、收获P1代病毒

用20-200μL P0代病毒加到铺好Sf9细胞的六孔板(每个孔中铺1×10⁶个Sf9细胞(2mL))的一个孔中，并在28℃静置培养4天，收集培养皿中的培养基(上清)，300×g离心5min，以移除细胞碎片，获得P1代病毒，测定滴度(滴度的测定方法如下所述)，4℃避光保存。

5、病毒滴度测定

1)用昆虫培养基稀释High 5细胞悬液至细胞浓度约5×10⁴个/ml，将High 5细胞悬液滴加在96孔细胞培养板中，每孔100μl(即5×10³细胞/孔)。

2)将High 5细胞在27℃培养箱培养。为了防止脱水，用封口膜将培养板四周封上，然后套上自封袋，将培养板置于培养箱内培养。培养24h后细胞的汇合度约为30％～50％，此密度适合接种病毒。

3)在离心管中用培养基将Bacmid病毒液连续作10倍梯度稀释，从10^-1至10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12。

4)取稀释好的Bacmid病毒液50μl接种到含有100μl High 5细胞悬液的96孔微量培养板中，每一稀释度接种一行，共12孔。留一行作为阴性孔，每孔加入50μl培养基。

5)将接种有Bacmid病毒液的High 5细胞在27℃培养箱培养。为了防止脱水，用封口膜将培养板四周封上，然后套上自封袋，将培养板置于培养箱内培养。培养72h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞，连续观察2～3天记录结果，直至不再有新的感染孔出现。

6)检测每孔的病毒复制情况，在荧光显微镜能检测到荧光信号的即为感染阳性。不同稀释度条件下的病毒感染情况，则为该梯度下所有阳性感染数之和。

以相同方式统计未感染病毒数，获得病毒在不同稀释梯度下的感染率，从而获得感染率大于和小于50％最近的两个稀释度，即为病毒感染相关浓度。

7)按Reed-Muench两氏法计算病毒滴度

距离比例(PD)＝(高于50％感染率的百分数-50％)/(高于50％感染率的百分数-低于50％感染的百分数)

LogTCID50＝高于50％感染率的稀释度的对数-距离比例，获得TCID50，即病毒滴度。

6、P2代病毒

用10-100μL P1代病毒加到铺好High 5细胞的六孔板的一个孔中，28℃静置培养4天，收集培养皿中的培养基(上清)，300×g离心5min移除细胞碎片，获得P2代病毒，测定滴度，4℃避光保存。

7、蛋白表达

1)收集细胞活力至少在90-95％指数生长期的High 5细胞，以2.5～3×10⁶个/mL的细胞量放到1L的转瓶。

2)加入SFX-Insect MP培养基至200mL。

3)用P2代病毒以3MOI感染High 5细胞。

4)将培养物置于培养箱摇床中培养，温度为27℃，转速为110–120rpm。

5)观察细胞，当存活率为70～75％时停止感染，离心收取细胞上清液，并进行纯化。

6)FLAG标签蛋白用Sigma M2 Agarose柱子进行纯化，小鼠Fc(mFc)标签蛋白和人Fc(hFc)标签蛋白用GE Protein A Agarose柱子进行纯化(纯化步骤分别按照纯化柱说明书进行)。

7)纯化的蛋白用PBS透析后备用。

二.实验结果：

结果发现，经优化的本发明的DNA序列可以藉由载体导入Sf9或者High 5细胞中，并在其中高效表达。图3A至图3B代表性地示出了所述DNA序列在昆虫细胞中表达的情况。具体地，图3A示出了DNA序列SEQID No.9藉由pQBD-FLAG载体在Sf9细胞中表达得到的抗原PB602L的SDS-PAGE电泳图，图3B示出了DNA序列SEQ ID No.12藉由pQBD-FLAG载体在High 5细胞中表达得到的抗原PB646L的SDS-PAGE电泳图。

实施例5.抗原组合物的检出限/灵敏度测定

一、实验方案：

将抗原蛋白CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L和PB646L用抗原稀释液稀释成1mg/ml，并将上述六种抗原蛋白中的一种、以及多种(两种、三种和四种)的组合所组成的抗原组合物制成检测试剂卡，分别检测由缓冲液稀释的抗体蛋白样本(由兰州畜牧与兽药研究所赠送，原浓度为0.7mg/ml，纯度不低于95％)，其中，稀释度分别为1:10、1:50、1:500、1:1000、1:4000和1:6000(依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4、样本5和样本6)，确定检测试剂卡最低检出极限与灵敏度。其中，每组所使用的抗原总量相同，并且为了便于说明，我们将单独的抗原蛋白和抗原组合物进行编号，如下所示：

1)CP204L单独使用；

2)PK205R单独使用；

3)PB602L单独使用；

4)CP530R单独使用；

5)E183L单独使用；

6)PB646L单独使用；

7)CP204L、PK205R组合使用，体积比1:1；

8)CP204L、PB602L组合使用，体积比1:1；

9-0)CP204L、CP530R组合使用，体积比2:3；

9-1)CP204L、CP530R组合使用，体积比2:1；

9-2)CP204L、CP530R组合使用，体积比3:1；

10)CP204L、E183L组合使用，体积比1:2；

11)CP204L、PB646L组合使用，体积比1:1；

12)PK205R、PB602L组合使用，体积比2:1；

13)PK205R、CP530R组合使用，体积比1:1；

14-0)PK205R、E183L组合使用，体积比1:1；

14-1)PK205R、E183L组合使用，体积比2:1；

14-2)PK205R、E183L组合使用，体积比1:3；

14-3)PK205R、E183L组合使用，体积比4:1；

15)PK205R、PB646L组合使用，体积比1:1；

16)PB602L、CP530R组合使用，体积比1:1；

17)PB602L、E183L组合使用，体积比2:1；

18-0)PB602L、PB646L组合使用，体积比1:1；

18-1)PB602L、PB646L组合使用，体积比3:1；

18-2)PB602L、PB646L组合使用，体积比1:3；

19)CP530R、PB646L组合使用，体积比3:1；

20-0)CP204L、PK205R、PB602L组合使用，体积比2:4:1；

20-1)CP204L、PK205R、PB602L组合使用，体积比1:3:1；

20-2)CP204L、PK205R、PB602L组合使用，体积比3:1:1；

20-3)CP204L、PK205R、PB602L组合使用，体积比1:1:3；

21-0)CP204L、PK205R、CP530R组合使用，体积比1:1:1；

21-1)CP204L、PK205R、CP530R组合使用，体积比3:1:1；

21-2)CP204L、PK205R、CP530R组合使用，体积比1:3:1；

22-0)CP204L、PK205R、PB646L组合使用，体积比1:1:1；

22-1)CP204L、PK205R、PB646L组合使用，体积比2:1:1；

23)PK205R、PB602L、E183L组合使用，体积比1:1:1；

24-0)PK205R、PB602L、PB646L组合使用，体积比1:1:1；

24-1)PK205R、PB602L、PB646L组合使用，体积比1:3:1；

24-2)PK205R、PB602L、PB646L组合使用，体积比1:1:3；

25-0)PK205R、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比2:1:2:4；

25-1)PK205R、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比1:1:1:3；

25-2)PK205R、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比1:3:1:2；

26-0)PB602L、CP530R、E183L、PB646L组合使用，体积比3:1:1:2；

26-1)PB602L、CP530R、E183L、PB646L组合使用，体积比1:1:1:2；

26-2)PB602L、CP530R、E183L、PB646L组合使用，体积比1:3:1:2；

27-0)CP204L、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比1:1:1:2；

27-1)CP204L、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比1:2:1:2；

27-2)CP204L、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比1:1:3:2；

27-3)CP204L、PB602L、CP530R、E183L组合使用，体积比3:1:1:2；

28-0)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比1:1:1:1；

28-1)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比1:4:1:1；

28-2)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比1:1:4:1；

28-3)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比1:1:1:4；

28-4)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比4:1:1:1；

28-5)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比4:1:4:1；

28-6)PK205R、PB602L、CP530R、PB646L组合使用，体积比1:4:1:4。

二、实验结果：

上述抗原组合物的检出限/灵敏度测定的实验结果如下表2所示。

表2.抗原组合物的检出限/灵敏度测定的实验结果

注：上表中，“+”的数量表示颜色的深浅；“-”表示观察不到颜色。

关于上述单独抗原和抗原组合物的检出限和灵敏度，“+”越多或者读数越大表示颜色越深，说明相应抗原/抗原组合物的灵敏度也越高，“-”或读数为零表示观察不到颜色，说明在相应的稀释度下，检测不到相应样本中的抗体蛋白。通过对稀释度分别为1:10、1:50、1:500、1:1000、1:4000和1:6000的样本(样本1-6)进行测定，通过“+”至“-”的变化，可以得到相应抗原的检出限。

从上表中可以看出，抗原组合CP204L和CP530R(第9-0至9-2组)能够检测样本1和样本2中的抗体，并且其读数显著高于抗原组分CP204L、CP530R两者单独使用时所得到的读数的简单加和，这表明CP204L和CP530R组合使用具有协同增效作用，具有更高的灵敏度。另外，CP204L和CP530R能够检测1:50倍稀释的抗体蛋白(样本2)，相比于抗原组分CP204L、CP530R单独使用时具有更低的检出限。

同样地，抗原组合PK205R和E183L(第14-0至14-3组)能够检测样本1和样本2中的抗体，并且其读数显著高于抗原组分PK205R、E183L两者单独使用时所得到的读数的简单加和，这表明PK205R和E183L组合使用具有协同增效作用，特别是第14-2组。这表明将PK205R和E183L组合使用具有更高的灵敏度。另外，PK205R和E183L能够检测1:50倍稀释的抗体蛋白(样本2)，相比于抗原组分PK205R和E183L单独使用时具有更低的检出限。

同样地，抗原组合PB602L+PB646L(第18-0至18-2组)能够检测样本1-4中的抗体，并且其读数显著高于抗原组分PB602L、PB646L单独使用时所得到的读数的简单加和，这表明PB602L+PB646L组合使用具有协同增效作用，具有更高的灵敏度。另外，PB602L+PB646L能够检测1：1000倍稀释的抗体蛋白(样本4)，相比于抗原组分PB602L、PB646L单独使用时具有更低的检出限。

此外，抗原组合CP204L+PK205R+PB602L(第20-0至20-3组)能够检测样本1-5中的抗体，并且其读数显著高于抗原组分CP204L、PK205R、PB602L单独使用时所得到的读数的简单加和，其中第20-0组(抗原组分CP204L、PK205R、PB602L相应的体积比/重量比为2:4:1)和第20-1组(抗原组分CP204L、PK205R、PB602L相应的体积比为1:3:1)的抗原组合物的读数具有更进一步的显著提高。以上数据表明，抗原组合CP204L+PK205R+PB602L具有协同增效作用，具有更高的灵敏度。另外，抗原组合CP204L+PK205R+PB602L能够检测1：4000倍稀释的抗体蛋白(样本5)，相比于抗原组分CP204L、PK205R、PB602L单独使用时具有更低的检出限。

此外，抗原组合CP204L+PK205R+CP530R(第21-0至21-2组)、PK205R+PB602L+CP530R+E183L(第25-0至25-2组)、PB602L+CP530R+E183L+PB646L(第26-0至26-2组)和CP204L+PB602L+CP530R+E183L(第27-0至27-3组)相比于其各自的抗原组分单独使用具有更高的灵敏度和更低的检出限。抗原组合PK205R+PB602L+PB646L(第24-0至24-2组)获得的读数没有其各组分单独使用时的总和大，但是具有更低的检出限。

此外，抗原组合PK205R+PB602L+CP530R+PB646L(第28-0至28-6组)能够检测样本1-5中的抗体，并且其读数显著高于抗原组分PK205R、PB602L、CP530R、PB646L单独使用时所得到的读数的简单加和，这表明PK205R+PB602L+CP530R+PB646L组合使用具有协同增效作用，具有更高的灵敏度。另外，PK205R+PB602L+CP530R+PB646L能够检测1:4000倍稀释的抗体蛋白(样本5)，相比于PK205R、PB602L、CP530R、PB646L单独使用时具有更低的检出限。

以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市易瑞生物技术股份有限公司

中国科学院武汉病毒研究所

<120> 编码非洲猪瘟病毒抗原的DNA序列、由其编码的抗原的组合物及其在免疫学检测中的应用

<141> 2019-05-14

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 1

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Ile Ser Phe Tyr Leu Thr Tyr Ile

195 200

<210> 2

<211> 205

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 2

Met Val Glu Pro Arg Glu Gln Phe Phe Gln Asp Leu Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Asp Gln Gln Met Asp Thr Val Lys Asn Asp Ile Lys Asp Ile Met Lys

20 25 30

Glu Lys Thr Ser Phe Met Val Ser Phe Glu Asn Phe Ile Glu Arg Tyr

35 40 45

Asp Thr Met Glu Lys Asn Ile Gln Asp Leu Gln Asn Lys Tyr Glu Glu

50 55 60

Met Ala Ala Asn Leu Met Thr Val Met Thr Asp Thr Lys Ile Gln Leu

65 70 75 80

Gly Ala Ile Ile Ala Gln Leu Glu Ile Leu Met Ile Asn Gly Thr Pro

85 90 95

Leu Pro Ala Lys Lys Thr Thr Ile Lys Glu Ala Met Pro Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Asn Thr Asn Asn Glu Gln Thr Ser Pro Pro Ala Ser Gly Lys Thr

115 120 125

Ser Glu Thr Pro Lys Lys Asn Pro Thr Asn Ala Met Phe Phe Thr Arg

130 135 140

Ser Glu Trp Ala Ser Ser Asn Thr Phe Arg Glu Lys Phe Leu Thr Pro

145 150 155 160

Glu Ile Gln Ala Ile Leu Asp Glu Gln Phe Ala Asn Lys Thr Gly Ile

165 170 175

Glu Arg Leu His Ala Glu Gly Leu Tyr Met Trp Arg Thr Gln Phe Ser

180 185 190

Asp Glu Gln Lys Lys Met Val Lys Glu Met Met Lys Lys

195 200 205

<210> 3

<211> 530

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 3

Met Ala Glu Phe Asn Ile Asp Glu Leu Leu Lys Asn Val Leu Glu Asp

1 5 10 15

Pro Ser Thr Glu Ile Ser Glu Glu Thr Leu Lys Gln Leu Tyr Gln Arg

20 25 30

Thr Asn Pro Tyr Lys Gln Phe Lys Asn Asp Ser Arg Val Ala Phe Cys

35 40 45

Ser Phe Thr Asn Leu Arg Glu Gln Tyr Ile Arg Arg Leu Ile Met Thr

50 55 60

Ser Phe Ile Gly Tyr Val Phe Lys Ala Leu Gln Glu Trp Met Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Lys Pro Thr His Thr Thr Lys Thr Leu Leu Ser Glu Leu Ile

85 90 95

Thr Leu Val Asp Thr Leu Lys Gln Glu Thr Asn Asp Val Pro Ser Glu

100 105 110

Ser Val Val Asn Thr Ile Leu Ser Ile Ala Asp Ser Cys Lys Thr Gln

115 120 125

Thr Gln Lys Ser Lys Glu Ala Lys Thr Thr Ile Asp Ser Phe Leu Arg

130 135 140

Glu His Phe Val Phe Asp Pro Asn Leu His Ala Gln Ser Ala Tyr Thr

145 150 155 160

Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Met Cys Ala Asp Thr

165 170 175

Asn Val Asp Thr Cys Ala Ser Met Cys Ala Asp Thr Asn Val Asp Thr

180 185 190

Cys Ala Ser Thr Cys Thr Ser Thr Glu Tyr Thr Asp Leu Ala Asp Pro

195 200 205

Glu Arg Ile Pro Leu His Ile Met Gln Lys Thr Leu Asn Val Pro Asn

210 215 220

Glu Leu Gln Ala Asp Ile Asp Ala Ile Thr Gln Thr Pro Gln Gly Tyr

225 230 235 240

Arg Ala Ala Ala His Ile Leu Gln Asn Ile Glu Leu His Gln Ser Ile

245 250 255

Lys His Met Leu Glu Asn Pro Arg Ala Phe Lys Pro Ile Leu Phe Asn

260 265 270

Thr Lys Ile Thr Arg Tyr Leu Ser Gln His Ile Pro Pro Gln Asp Thr

275 280 285

Phe Tyr Lys Trp Asn Tyr Tyr Ile Glu Asp Asn Tyr Glu Glu Leu Arg

290 295 300

Ala Ala Thr Glu Ser Ile Tyr Pro Glu Lys Pro Asp Leu Glu Phe Ala

305 310 315 320

Phe Ile Ile Tyr Asp Val Val Asp Ser Ser Asn Gln Gln Lys Val Asp

325 330 335

Glu Phe Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asp Gln Ile Phe Ser Glu Val Ser Ser

340 345 350

Ile Gln Leu Gly Asn Trp Thr Leu Leu Gly Ser Phe Lys Ala Asn Arg

355 360 365

Glu Arg Tyr Asn Tyr Phe Asn Gln Asn Asn Glu Ile Ile Lys Arg Ile

370 375 380

Leu Asp Arg His Glu Glu Asp Leu Lys Ile Gly Lys Glu Ile Leu Arg

385 390 395 400

Asn Thr Ile Tyr His Lys Lys Ala Lys Asn Ile Gln Glu Thr Gly Pro

405 410 415

Asp Ala Pro Gly Leu Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Phe His Thr Asp Ser

420 425 430

Gly Ile Lys Gly Leu Leu Ser Phe Lys Glu Leu Lys Asn Leu Glu Lys

435 440 445

Ala Ser Gly Asn Ile Lys Lys Ala Arg Glu Tyr Asp Phe Ile Asp Asp

450 455 460

Cys Glu Glu Lys Ile Lys Gln Leu Leu Ser Lys Glu Asn Leu Thr Pro

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Asp Glu Glu Ser Glu Leu Ile Lys Thr Lys Lys Gln Leu Asp Asn Ala

485 490 495

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530

<210> 4

<211> 464

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 4

Met Pro Ser Asn Met Lys Gln Phe Cys Lys Ile Ser Val Trp Leu Gln

1 5 10 15

Gln His Asp Pro Asp Leu Leu Glu Ile Ile Asn Asn Leu Cys Met Leu

20 25 30

Gly Asn Leu Ser Ala Ala Lys Tyr Lys His Gly Val Thr Phe Ile Tyr

35 40 45

Pro Lys Gln Ala Lys Ile Arg Asp Glu Ile Lys Lys His Ala Tyr Ser

50 55 60

Asn Asp Pro Ser Gln Ala Ile Lys Thr Leu Glu Ser Leu Ile Leu Pro

65 70 75 80

Phe Tyr Ile Pro Thr Pro Ala Glu Phe Thr Gly Glu Ile Gly Ser Tyr

85 90 95

Thr Gly Val Lys Leu Glu Val Glu Lys Thr Glu Ala Asn Lys Val Ile

100 105 110

Leu Lys Asn Gly Glu Ala Val Leu Val Pro Ala Ala Asp Phe Lys Pro

115 120 125

Phe Pro Asp Arg Arg Leu Ala Val Trp Ile Met Glu Ser Gly Ser Met

130 135 140

Pro Leu Glu Gly Pro Pro Tyr Lys Arg Lys Lys Glu Gly Gly Gly Asn

145 150 155 160

Asp Pro Pro Val Pro Lys His Ile Ser Pro Tyr Thr Pro Arg Thr Arg

165 170 175

Ile Ala Ile Glu Val Glu Lys Ala Phe Asp Asp Cys Met Arg Gln Asn

180 185 190

Trp Cys Ser Val Asn Asn Pro Tyr Leu Ala Lys Ser Val Ser Leu Leu

195 200 205

Ser Phe Leu Ser Leu Asn His Pro Thr Glu Phe Ile Lys Val Leu Pro

210 215 220

Leu Ile Asp Phe Asp Pro Leu Val Thr Phe Tyr Leu Leu Leu Glu Pro

225 230 235 240

Tyr Lys Thr His Gly Asp Asp Phe Leu Ile Pro Glu Thr Ile Leu Phe

245 250 255

Gly Pro Thr Gly Trp Asn Gly Thr Asp Leu Tyr Gln Ser Ala Met Leu

260 265 270

Glu Phe Lys Lys Phe Phe Thr Gln Ile Thr Arg Gln Thr Phe Met Asp

275 280 285

Ile Ala Asp Ser Ala Thr Lys Glu Val Asp Val Pro Ile Cys Tyr Ser

290 295 300

Asp Pro Glu Thr Val His Ser Tyr Ala Asn His Val Arg Thr Glu Ile

305 310 315 320

Leu His His Asn Ala Val Asn Lys Val Thr Thr Pro Asn Leu Val Val

325 330 335

Gln Ala Tyr Asn Glu Leu Glu Gln Thr Asn Thr Ile Arg His Tyr Gly

340 345 350

Pro Ile Phe Pro Glu Ser Thr Ile Asn Ala Leu Arg Phe Trp Lys Lys

355 360 365

Leu Trp Gln Asp Glu Gln Arg Phe Val Ile His Gly Leu His Arg Thr

370 375 380

Leu Met Asp Gln Pro Thr Tyr Glu Thr Ser Glu Phe Ala Glu Ile Val

385 390 395 400

Arg Asn Leu Arg Phe Ser Arg Pro Gly Asn Asn Tyr Ile Asn Glu Leu

405 410 415

Asn Ile Thr Ser Pro Ala Met Tyr Gly Asp Lys His Thr Thr Gly Asp

420 425 430

Ile Ala Pro Asn Asp Arg Phe Ala Met Leu Val Ala Phe Ile Asn Ser

435 440 445

Thr Asp Phe Leu Tyr Thr Ala Ile Pro Glu Glu Lys Val Gly Gly Asn

450 455 460

<210> 5

<211> 184

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 5

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr

20 25 30

Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu

35 40 45

Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

50 55 60

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

65 70 75 80

Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

85 90 95

Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

100 105 110

Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

115 120 125

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala

130 135 140

His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser

145 150 155 160

Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr

165 170 175

His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

180

<210> 6

<211> 646

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 6

Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala

1 5 10 15

Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn

20 25 30

Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr

35 40 45

Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe

50 55 60

Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His

65 70 75 80

Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln

85 90 95

Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala

100 105 110

Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met

115 120 125

Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp

130 135 140

Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro

145 150 155 160

Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu

165 170 175

Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg

180 185 190

Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr

195 200 205

Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr

210 215 220

Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro

225 230 235 240

Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro

245 250 255

Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn

260 265 270

Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln

275 280 285

Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu

290 295 300

Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro

305 310 315 320

Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp

325 330 335

Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe

340 345 350

Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val

355 360 365

Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly

370 375 380

Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly

385 390 395 400

Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn

405 410 415

Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg

420 425 430

Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn

435 440 445

Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu

450 455 460

Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn

465 470 475 480

Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala

485 490 495

Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp

500 505 510

Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val

515 520 525

Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala

530 535 540

His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser

545 550 555 560

Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp

565 570 575

Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr

580 585 590

Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile

595 600 605

Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val

610 615 620

Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala

625 630 635 640

Val Leu Arg Tyr Ser Thr

645

<210> 7

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggacttta ttctgaacat ctccatgaag atggaggtga tctttaagac agacctgagg 60

tcctccagcc aggtggtctt ccatgccggc tccctgtaca actggttctc cgtggagatc 120

atcaactccg gacggatcgt gaccaccgcc atcaagacac tgctgtccac cgtcaagtat 180

gacatcgtga agtccgctcg gatctatgct ggacaaggct acacagagca ccaagcccaa 240

gaggaatgga acatgatcct gcacgtcctg tttgaagagg agaccgagtc ctccgccagc 300

tccgagaaca tccacgagaa gaacgacaac gagaccaacg agtgtacatc cagcttcgag 360

accctctttg agcaggagcc ctcctccgag gtgcccaagg actccaagct ctacatgctg 420

gcccagaaga ccgtgcagca catcgagcag tacggcaagg cccctgactt caacaaggtc 480

attcgggccc acaacttcat ccagaccatc tacggcaccc ccctgaagga ggaagaaaag 540

gaggtcgtcc ggctgatggt gatcaagctg ctgaagaaga tttcctttta cctgacctac 600

atc 603

<210> 8

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggttgaac cgcgtgaaca gttcttccaa gacctgctgt ctgcggttga ccagcaaatg 60

gacaccgtaa aaaacgacat caaagacatc atgaaagaga aaaccagctt catggtgtct 120

tttgaaaact ttatcgaacg ttacgacacg atggagaaga atatccagga cctgcagaac 180

aaatatgagg agatggcggc gaacctgatg accgtgatga ctgacacgaa aattcaactg 240

ggcgcgatca tcgcgcagct ggagattctg atgattaacg gcactccgct gccagcgaag 300

aagaccacca ttaaagaggc gatgccactg ccatcttcta acactaacaa cgaacagact 360

tctccgcctg cgtctggtaa aacctctgaa accccgaaga aaaacccgac caatgctatg 420

ttcttcactc gctctgaatg ggcatccagc aacacgttcc gtgaaaagtt cctgaccccg 480

gaaatccaag cgattctgga tgagcagttt gctaacaaaa cgggcattga gcgtctgcat 540

gccgaaggcc tgtatatgtg gcgtacccag ttctctgacg agcaaaaaaa gatggttaaa 600

gaaatgatga aaaaa 615

<210> 9

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcggaat ttaacattga tgagctgctg aaaaacgtcc tggaggaccc ttccactgag 60

atcagcgagg aaacgctgaa gcagctgtat cagcgcacca atccgtataa acagttcaag 120

aacgactctc gtgtagcatt ctgttctttt acgaacctgc gtgagcagta catccgtcgt 180

ctgattatga cgagcttcat cggttacgtt ttcaaagccc tgcaagaatg gatgccgtct 240

tactctaaac cgactcacac tactaaaact ctgctgagcg agctgattac cctggtagac 300

actctgaaac aggagaccaa cgacgttccg tctgaatctg ttgtcaatac tattctgtct 360

atcgccgact cctgcaaaac ccaaactcag aagtccaagg aagctaaaac caccatcgac 420

tctttcctgc gcgaacactt cgtcttcgat ccaaatctgc acgctcagtc tgcctacact 480

tgtgccgaca ctaatgttga tacgtgtgcc tctatgtgcg cggacacgaa cgtagatacc 540

tgtgcttcca tgtgtgcgga taccaacgtg gacacgtgcg cgagcacctg cacctccacg 600

gagtacaccg acctggctga cccagagcgt attccgctgc acatcatgca gaagaccctg 660

aacgtcccta acgagctgca ggctgatatc gacgccatca ctcagacgcc gcaaggctac 720

cgtgccgctg cccacatcct gcagaacatc gaactgcatc agtccattaa gcacatgctg 780

gagaaccctc gtgcgttcaa gcctatcctg ttcaacacca aaatcacccg ttacctgtct 840

caacatatcc ctccgcagga cactttctac aagtggaact actatattga agacaactac 900

gaagaactgc gtgcggcgac ggaatctatt tacccggaga agccggacct ggagttcgcc 960

tttatcatct acgatgtggt ggattcctct aaccagcaga aagtagacga attttactac 1020

aaatacaagg accaaatttt ctccgaagtt agctctatcc aactgggtaa ttggacgctg 1080

ctgggttcct ttaaggcaaa tcgcgagcgc tataactact ttaaccagaa taatgaaatt 1140

atcaaacgta tcctggatcg ccatgaggaa gatctgaaaa tcggtaagga gattctgcgt 1200

aacaccattt accacaagaa ggctaaaaac atccaagaga ctggtccgga tgcccctggt 1260

ctgagcatct acaattctac ctttcacacc gattctggca ttaagggcct gctgtccttc 1320

aaggaactga agaatctgga aaaggcctct ggtaacatca aaaaagcgcg tgaatacgac 1380

ttcattgacg attgcgaaga aaagatcaag caactgctgt ctaaggaaaa cctgacgccg 1440

gatgaggagt ctgaactgat taaaactaag aaacagctgg acaacgccct ggaaatgctg 1500

aatgtccctg atgatacgat ccgtgtagac atgtgggtta acaacaataa caaactggag 1560

aaggaaatcc tgtataccaa ggccgaactg 1590

<210> 10

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgccgtcta acatgaaaca gttctgcaaa attagcgttt ggctgcaaca gcacgacccg 60

gatctgctgg aaattatcaa caacctgtgc atgctgggta acctgtctgc ggcgaagtac 120

aaacacggtg ttaccttcat ctatccgaaa caggcgaaaa tccgtgacga aatcaaaaaa 180

cacgcgtact ctaacgatcc gtctcaggcg atcaaaaccc tggaatctct gatcctgccg 240

ttctacatcc cgaccccggc tgagttcacc ggcgaaattg gttcttacac tggcgtgaaa 300

ctggaagttg aaaaaaccga agcgaacaag gttatcctga aaaatggtga ggcggttctg 360

gttccagcgg cggatttcaa accgttcccg gaccgccgtc tggcggtttg gatcatggag 420

tccggttcta tgcctctgga gggtccgcca tataaacgta aaaaagaagg tggtggtaac 480

gatccgccgg ttccgaaaca catctctccg tacaccccgc gtacccgtat tgcgatcgaa 540

gttgaaaaag cgttcgacga ctgcatgcgt cagaactggt gctctgttaa taacccgtac 600

ctggctaagt ctgtttccct gctgtctttc ctgtctctga accacccgac cgagttcatt 660

aaagttctgc cgctgatcga tttcgacccg ctggttacct tctacctgct gctggagccg 720

tataaaaccc acggcgacga tttcctgatc ccagaaacca tcctgtttgg tcctaccggt 780

tggaacggta cggacctgta ccagtctgcc atgctggaat ttaagaagtt tttcacccag 840

atcacccgcc agaccttcat ggatatcgcc gactctgcga ccaaagaggt ggacgttccg 900

atctgctatt ctgaccctga aactgttcac tcttacgcca accacgttcg caccgaaatc 960

ctgcaccaca acgcggttaa caaagttacc acgccgaatc tggtagttca agcgtataac 1020

gagctggaac agaccaacac catccgtcac tacggtccaa tcttccctga atccaccatt 1080

aacgctctgc gcttctggaa aaaactgtgg caggatgagc agcgtttcgt tatccacggc 1140

ctgcatcgta ccctgatgga ccagccgact tatgaaacct ctgaatttgc ggagatcgtt 1200

cgtaacctgc gtttctctcg tccgggcaac aactacatca acgaactgaa catcacctct 1260

ccggcgatgt atggtgacaa acacaccacc ggcgacatcg cgcctaacga ccgtttcgca 1320

atgctggttg cgttcatcaa ctctaccgac tttctgtaca ccgcaattcc ggaggaaaaa 1380

gttggtggta at 1392

<210> 11

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggactctg agtttttcca acctgtgtac ccacgccact acggtgaatg cctgtctccg 60

gtgactaccc cgtctttctt ctctacccac atgtatacca tcctgatcgc catcgttgtt 120

ctggttatta tcatcatcgt tctgatctac ctgttctctt ctcgtaagaa aaaagctgcc 180

gcgattgaag aagaggacat ccagttcatc aacccgtacc aggatcagca gtgggttgaa 240

gttaccccgc agccgggtac ctctaaaccg gcaggcgcga ccaccgcgtc tgttggtaaa 300

ccagttactg gtcgtcctgc aaccaaccgt ccggcgacca acaagcctgt tacggacaac 360

ccggttaccg atcgtctggt aatggcgacg ggtggtcctg ccgcagcacc tgcggctgct 420

tctgctccag cgcatccggc ggaaccgtac accaccgtta cgactcagaa taccgcgagc 480

cagaccatgt ctgcaatcga gaatctgcgt cagcgtaaca cctacaccca caaagatctg 540

gaaaactctc tg 552

<210> 12

<211> 1938

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggcttccg gcggagcttt ttgtctgatc gccaatgacg gcaaggccga caagattatc 60

ctggcccaag acctgctgaa tagccggatc tccaacatca agaatgtgaa taagtcctat 120

ggaaagcccg accccgaacc taccctgagc cagattgagg agacccatct cgtgcacttc 180

aacgcccact ttaagcccta cgtgcccgtg ggattcgagt acaacaaggt gaggccccat 240

accggcacac ctacactggg caataagctg accttcggca ttccccagta cggcgatttc 300

tttcacgata tggtgggaca ccacatcctg ggcgcctgcc actcctcctg gcaggacgcc 360

cccatccagg gcaccagcca aatgggagcc catggccaac tccagacctt ccctaggaac 420

ggctacgact gggacaacca aacacctctc gagggcgctg tctacacact cgtggacccc 480

ttcggaaggc ccattgtgcc tggcaccaag aacgcctacc ggaatctcgt ctactactgc 540

gagtaccccg gagagcggct gtatgaaaac gtcaggttcg atgtcaacgg caattccctc 600

gacgaatact ccagcgatgt gaccacactg gtccggaagt tttgcattcc tggagataag 660

atgacaggat acaagcacct cgtcggccaa gaagtctccg tggagggaac ctccggcccc 720

ctgctgtgca acattcatga cctccataag ccccaccagt ccaagcccat cctgaccgac 780

gaaaacgaca cccaaaggac atgctcccac accaatccta agtttctcag ccaacacttc 840

cccgaaaact cccataacat ccaaaccgct ggcaagcagg acatcacccc tatcaccgac 900

gctacctacc tggacattag gaggaacgtc cactactcct gcaatggccc ccaaaccccc 960

aagtactacc agccccccct cgccctgtgg attaagctgc ggttctggtt caacgagaac 1020

gtgaacctgg ctatccccag cgtgtccatt ccctttggcg agcggttcat taccatcaag 1080

ctggcctccc agaaggacct cgtgaacgag ttccctggcc tgtttgtgcg gcagagccgg 1140

tttatcgccg gcaggcccag caggcggaat atccggttca agccctggtt tattcccgga 1200

gtgatcaatg aaatctccct gaccaacaac gaactgtaca ttaacaatct cttcgtcacc 1260

cccgagatcc acaacctgtt cgtgaagcgg gtccggtttt ccctcatccg ggtgcacaag 1320

acccaagtca cacatacaaa taacaaccac cacgacgaga agctcatgtc cgccctcaag 1380

tggcctatcg aatacatgtt catcggcctc aagcctacat ggaacatctc cgaccagaat 1440

cctcaccaac accgggattg gcacaagttc ggccatgtcg tgaatgccat catgcagccc 1500

acccatcacg ccgaaatcag cttccaagac agggatacag ctctccccga tgcctgtagc 1560

agcattagcg atattagccc cgtcacatac cctattaccc tgcccatcat taagaatatc 1620

agcgtcaccg cccacggaat taacctgatc gacaagtttc ccagcaagtt ctgcagctcc 1680

tacatcccct tccactatgg cggcaacgct atcaagacac ccgacgaccc tggagctatg 1740

atgatcacct tcgctctgaa gcctcgggag gaataccaac ctagcggaca catcaatgtc 1800

agccgggcta gggagttcta catttcctgg gataccgact acgtcggaag catcacaacc 1860

gccgatctgg tggtcagcgc ctccgccatc aattttctgc tcctccaaaa cggcagcgcc 1920

gtgctccggt actccaca 1938

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒抗原组合物，其中，所述抗原组合物为：

CP204L + CP530R，以重量计，CP204L为40%-75%，CP530R为25%-60%；

PK205R + E183L，以重量计，PK205R为25%-80%，E183L为20%-75%；

PB602L + PB646L，以重量计，PB602L为25%-75%，PB646L为25%-75%；

CP204L + PK205R + PB602L，以重量计，CP204L为20%-60%， PK205R为20%-60%，PB602L为10%-60%；

CP204L + PK205R + CP530R，以重量计，CP204L为20%-60%，PK205R为20%-60%，CP530R为20%-35%；

PK205R + PB602L + PB646L，以重量计，PK205R为20%-35%、PB602L为20%-60%，PB646L为20%-60%；

PB602L + CP530R + E183L + PB646L，以重量计，PB602L为10%-45%，CP530R为10%-45%，E183L为10%-20%，PB646L为25%-40%；

CP204L + PB602L + CP530R + E183L，以重量计，CP204L为10%-45%，PB602L为10%-35%，CP530R为10%-45%，E183L为25%-40%；或

PK205R + PB602L + CP530R + PB646L，以重量计，PK205R为10%-60%，PB602L为10%-60%，CP530R为10%-60%，PB646L为10%-60%；

其中，所述非洲猪瘟病毒抗原CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L分别为SEQ ID NO. 1-6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原组合物，其中，所述抗原组合物中包含的抗原组分CP204L、PK205R、PB602L、CP530R、E183L以及PB646L分别由所对应的DNA序列SEQ IDNo. 7、8、9、10、11以及12编码。

3.权利要求1-2任一项所述的非洲猪瘟病毒抗原组合物在检测非洲猪瘟病毒的非诊断目的的免疫学检测方法中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述免疫学检测方法为金标免疫层析法、荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法。

5.权利要求1-2任一项所述的非洲猪瘟病毒抗原组合物在制备用于检测非洲猪瘟病毒的制剂中的应用，其中，所述检测通过免疫学检测方法进行。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述免疫学检测方法为金标免疫层析法、荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法。