CN112834745A - 一种非洲猪瘟病毒的间接elisa抗体鉴别检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、固体洗液、终止液、用于加样的加样槽、封板膜和用于血清稀释的血清稀释板，本发明应用间接ELISA免疫技术，基于间接法原理对以检测非洲猪瘟病毒抗体为基础，进一步对非洲猪瘟病毒野毒感染和接种疫苗产生抗体进行鉴别检测，得以实现对非洲猪瘟病毒野毒感染抗体和疫苗免疫抗体的区分，敏感性和特异性好，便于实现高通量检测，检测效率和检测速度得到了极大提高。

Description

一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，属于病毒检测技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swinefevervirus，ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、高度接触性传染病，临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为主要特征，一般发病后2～10d死亡，严重时死亡率可达100％。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求必须报告的A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟在非洲、欧洲和美洲的数十个国家流行，造成巨大的经济损失且已蔓延至与欧洲接壤的多个亚洲国家。

非洲猪瘟疫情这些年在世界范围内大面积爆发，给养殖业及相关行业带来的直接或间接 损失不可估量，国外非洲猪瘟疫情给我国非洲猪瘟的防控形成了严峻挑战。目前关于非洲猪 瘟检疫技术主要涉及非洲猪瘟红细胞吸附试验荧光抗体试验、聚合酶链式反应和Taqman探 针荧光PCR、间接荧光抗体试验和免疫印迹试验，但这些检测方法只能检测猪群是否感染非 洲猪瘟，并不能区别非洲猪瘟病毒的感染抗体和免疫抗体。

间接ELISA免疫分析（Indirect ELISA enzyme linked immunosorbent assayimmunoassay）是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体的免疫测定技术。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术。间接ELISA免疫分析法的原理是免疫反应中的酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接的标记上酶，加入底物后反应的颜色深浅代表待测抗体的量。由此可建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量，其具有灵敏度高，操作简便、快速、易标准化的特点。目前市面上只存在检测非洲猪瘟感染抗体的试剂盒或检测卡，无法同时实现对非洲猪瘟感染抗体与免疫抗体的鉴别。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测非洲猪瘟感染抗体的试剂盒或检测卡结构简单，无法实现对非洲猪瘟感染抗体与免疫抗体的鉴别，敏感性和特异性不佳，不便于实现高通量检测，检测效率和检测速度无法满足要求的缺陷和不足，提供一种结构合理，使用方便，能够实现对非洲猪瘟感染抗体与免疫抗体的鉴别，敏感性和特异性好，便于实现高通量检测，检测效率和检测速度得到了极大提高的一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒。

为实现上述发明目的，本发明的技术解决方案是：一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、固体洗液、终止液、用于加样的加样槽、封板膜和用于血清稀释的血清稀释板，其特征在于：所述包被板上包被两种P54蛋白抗原和CD2v蛋白抗原，P54蛋白抗原和CD2v蛋白抗原分别独立地包被在所述被板上的孔内，每升样品稀释液中含有磷酸氢二钠2.9 g、磷酸二氢钾 0.2 g、氯化钠8 g、氯化钾0.2 g、BSA 10 g、PROCLIN-300 500 µL、吐温-20 1mL和0.1‰的果绿色素，所述酶结合物为HRP标记的羊抗猪二抗，所述阳性对照为野毒感染抗体，所述阴性对照来源于未感染非洲猪瘟的样本，所述显色液A为所述显色液A为pH 3.0的乙酸钠溶液，其中包含柠檬酸、过氧化脲、乙酸钠，所述显色液B为pH 3.0的TMB溶液，其中包含TMB、甲醇、乙酸钠。

进一步的，所述包被板为96孔板，在所述96孔板的第1、3、5、7、9、11列包被P54蛋白；在第2、4、6、8、10、12列包被CD2v蛋白；所述P54蛋白和CD2v蛋白的包被浓度均为1 µg/mL。

进一步的，所述显色液A的制备方法为：称量柠檬酸5.76g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化脲0.5g、乙酸钠6.21g使其完全溶解，加入Proclin-300 0.5mL，再加入双蒸水定容至1000mL，2~8℃保存。

进一步的，所述显色液B的制备方法为：称取TMB 0.2g加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸5.76g，带起完全溶解后，加入Proclin-300 0.5mL，用量筒量取双蒸水定容至1000mL，2~8℃保存。

本发明的有益效果是：

1．本发明应用间接ELISA免疫技术，基于间接法原理对以检测非洲猪瘟病毒抗体为基础，进一步对非洲猪瘟病毒野毒感染和接种疫苗产生抗体进行鉴别检测，得以实现对非洲猪瘟病毒野毒感染抗体和疫苗免疫抗体的区分。其中，利用原核表达出P54蛋白、CD2v蛋白，对其进行包被，另对羊抗猪二抗进行酶标记；由此筛选出间接ELISA试剂盒的最佳反应体系，以此为基础制备的试剂盒具有良好的敏感性和特异性，与非洲猪瘟病毒抗体有很好的反应性，并且与常见的其他猪类病毒如猪瘟、猪蓝耳等均不发生反应，特异性强。

2．本发明针对当前行业发展，具有以下优势：

A、目前市面上只存在检测非洲猪瘟感染抗体的试剂盒或检测卡，而本发明可以实现对非洲猪瘟感染抗体与免疫抗体的鉴别；

B、本发明利用间接ELISA免疫技术，比之血清抗体方法检测准确，稳定性好，特异性强、灵敏度高的特点；比之PCR检测病毒，可实现高通量检测，同样能够保证其准确性、稳定性；

C、本发明利用非洲猪瘟病毒抗体鉴别试剂盒检测非洲猪瘟病毒抗体，依托试剂盒的组成作为基本框架，设置复孔，可同时检测44个样本，可实现高通量、快速的目的。

附图说明

图1是ASFV包被板上对照和样品添加模式图。

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

参见图1，本发明的一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、固体洗液、终止液、用于加样的加样槽、封板膜和用于血清稀释的血清稀释板，其特征在于：所述包被板上包被两种P54蛋白抗原和CD2v蛋白抗原，P54蛋白抗原和CD2v蛋白抗原分别独立地包被在所述被板上的孔内，每升样品稀释液中含有磷酸氢二钠2.9 g、磷酸二氢钾 0.2 g、氯化钠8 g、氯化钾0.2 g、BSA 10 g、PROCLIN-300 500 µL、吐温-20 1mL和0.1‰的果绿色素，所述酶结合物为HRP标记的羊抗猪二抗，所述阳性对照为野毒感染抗体，所述阴性对照来源于未感染非洲猪瘟的样本，所述显色液A为所述显色液A为pH 3.0的乙酸钠溶液，其中包含柠檬酸、过氧化脲、乙酸钠，所述显色液B为pH 3.0的TMB溶液，其中包含TMB、甲醇、乙酸钠。

所述包被板为96孔板，在所述96孔板的第1、3、5、7、9、11列包被P54蛋白；在第2、4、6、8、10、12列包被CD2v蛋白；所述P54蛋白和CD2v蛋白的包被浓度均为1 µg/mL。

所述显色液A的制备方法为：称量柠檬酸5.76g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化脲0.5g、乙酸钠6.21g使其完全溶解，加入Proclin-3000.5mL，再加入双蒸水定容至1000mL，2~8℃保存。

所述显色液B的制备方法为：称取TMB 0.2g加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸5.76g，带起完全溶解后，加入Proclin-300 0.5mL，用量筒量取双蒸水定容至1000mL，2~8℃保存。

P54蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，所述CD2v蛋白的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，

本发明的检测试剂盒包括包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、固体洗液、终止液、用于加样的加样槽、封板膜和用于血清稀释的血清稀释板。显色液A为称量柠檬酸5.76g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化脲0.5g、乙酸钠6.21g使其完全溶解，加入Proclin-300 0.5mL，而后使用纯化水定容，2～8℃保存；所述显色液B为称取TMB 0.2g加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸5.76g，带起完全溶解后，加入Proclin-300 0.5mL，而后加纯化水定容，2～8℃保存。阴阳性稀释液的配方为：已高压纯化水 1000.0 g，十二水合磷酸氢二钠1.930 g，二水合磷酸二氢钠 0.3860 g，氯化钠 8.20 g，测PH值(标准要求: 7.0土0.2)，牛血清白蛋白 15.0g（含量≥95% ），P-300 2.0 mL。固体洗液的成分为：NaCl 4.0 g，KCl 0.1g，KH₂PO₄ 0.1 g，NaH₂PO₄·12H₂O 1.45 g，Tween-20 0.25mL。

加样槽为加样用的塑料槽，封板膜是在反应过程中粘在反应板上的膜，起到避光，防止其它东西落进去的作用。血清稀释板用于在此板上进行血清稀释。在检测时，同一份样本检测2次，使样本先后分别与P54抗原和CD2v抗原发生反应，所以在包被板上第1、3、5、7、9、11列包被P54重组蛋白，第2、4、6、8、10、12列包被CD2v重组蛋白。其包被浓度均为1 µg/mL，以100ul/孔的量加入包被板内。包被板的包被过程为将两种包被抗原加入包被板中，加入包被液，置4℃包被22 h。弃去包被液，用洗涤液洗涤板孔，洗板2次。每孔加入封闭液，置于37℃封闭2 h。弃去封闭液，置于37℃温箱干燥3 h后，装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于2℃～8℃保存备用。

包被液为碳酸盐溶液，其中含有Na₂CO₃ 1.59 g/L、NaHCO₃ 2.93 g/L，调pH为9.4～9.6；所述封闭液为含有BSA10 g、蔗糖50 g 、400 µL PROCLIN-300、1 mL Tween-20的PBS溶液。样品稀释液其中含有磷酸氢二钠2.9 g、磷酸二氢钾 0.2 g、氯化钠8 g、氯化钾0.2 g，BSA 10 g，PROCLIN-300 500 µL、吐温-20 1mL，0.1%的果绿色素。

本发明P54重组蛋白的制备方法步骤如下：

步骤一：P54基因的合成：根据 GenBank中非洲猪瘟病毒减毒株BA71V 的P54基因全长序列，合成P54基因 (上海生工)，插入到PET32a载体。

步骤二：P54蛋白的表达：将PET32a-P54载体转化至大肠埃希菌 BL21(DE3)感受态细胞挑取单菌落至 LB液体培养基中，37℃过夜培养，以1:100(体积比)的比例将培养菌液加至LB液体培养基中，37℃振荡培养至 OD_600nm值为0.4-0.6，加入IPTG，16℃诱导６h，收集菌体超声破碎后，取上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达情况。

步骤三：P54蛋白的纯化：Ni-NTA 装柱，1.6×20cm，柱床体积为 10 mL；用缓冲液1平衡 2~5个床体积，流速为 2 mL/min；将 20 mL 细胞破碎液（50 mM PBS，pH7.4，0.5 mol/L NaCl）0.45µm 滤膜过滤，上样，流速为 1 mL/min；用缓冲液1再洗 2~5 个床体积，流速为2 mL/min；用分别含 10、50、100、200、300 mmol/L 咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度；用纯水流洗5个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为 2mL/min，柱子置于低温环境中保存。

所述的缓冲液1的配制方法如下：使用量取0.5 mol/L的NaH₂PO₄ 19 mL，0.5 mol/L的Na₂HPO₄ 81 mL，使用分析天平称取NaCl 29.3 g，加适量水溶解定容至1 L；

所述的不同浓度咪唑缓冲液3配制如下：10 mmol/L: 98 ml缓冲液1，2 mL缓冲液2；50 mmol/L: 90 ml缓冲液1，10 mL缓冲液2；100 mmol/L: 80 ml缓冲液1，20 mL缓冲液2；200 mmol/L: 60 ml缓冲液1，40 mL缓冲液2；300 mmol/L: 40 ml缓冲液1，60 mL缓冲液2

所述的缓冲液2配制方法如下：使用量取0.5 mol/L的NaH₂PO₄ 19 mL、0.5 mol/L的Na₂HPO₄ 81mL，使用分析天平称取NaCL 29.3 g、咪唑34 g，加适量水溶解定容至1L；

进一步地，CD2v蛋白的制备方法：

步骤一：培上养生产用假病毒：将状态良好的 sf9 细胞以2×10⁶个/ml的密度接种于6孔无菌培养板上贴壁培养2h，按照每孔4μg质粒进行首次转染，其中，表达质粒与线性化DNA的总量比为20∶1，而后将足量的表达质粒、线性化DNA与8 μL转染试剂cellfectinⅡ进行混合，混合后进行共转染，当细胞转染4～6 h后更换新鲜培养基，27℃培养箱培养7日后获得假病毒；

步骤二：CD2v重组蛋白在Hi 5细胞中分泌表达： 将Hi 5细胞培养至2×106个/ml，按1/1000（V/V）比例滴加病毒，27℃表达72 h后，以5000 r/min离心15min收集细胞培养液；

步骤三：CD2v重组蛋白的纯化：重组蛋白的浓缩和纯化： 使用Ni介质富集蛋白，使用分液漏斗截留介质，按20mmol/L Hepes，150mmol/L NaCl，5%甘油，500mmol/L咪唑，比例制备含有咪唑的buffer，并将pH值调节至7.5，使用制备成功的buffer将目的蛋白从Ni介质上洗脱下来。使用30kDa的浓缩管、3800r/min、4℃浓缩洗脱液和millipore收集并浓缩洗脱液，而后以500µl体积上样进行凝胶过离子色谱柱（Q HP）纯化，成功获得CD2v抗原。

本发明试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

步骤一：将待检样本按照40倍进行稀释，稀释后样本加样量为50 µL/孔，每次稀释量需保证够转2次用量，震荡混匀；

步骤二：取出ASFV包被板，设置对应阴阳对照孔，对照两孔平行50μl/孔；稀释后，转入样品孔各50μl/孔；包被板上阴、阳性对照和血清样品添加模式如图1所示。

步骤三：置37℃恒温培养箱中培育30分钟（±1分钟）；

步骤四：取出包被板，每孔加入300 μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次；

步骤五：每孔加入酶结合物50 μL。之后重复步骤三与步骤四；

步骤六：每孔加入50μL的显色液A和50μl的显色液B，震荡混匀；

步骤七：在室温（37℃）条件下避光孵育30分钟；

步骤八：每孔加入50mL的终止液终止显色反应；

步骤九：用酶标仪读取450nm波长处的发光值。

该使用方法的判定标准为：

试验成立条件：S/P=样品/阳性对照平均值。若S/P≥0.4，样品判定为抗体阳性（代表符号为“+”）；若S/P＜0.4，样品判定为抗体阴性（代表符号为“-”）；

若包被P54、CD2v抗原均显示为“+”，则该样本为感染抗体阳性；若包被CD2v抗原显示“-”，包被P54抗原显示“+”，则为免疫抗体阳性；若包被P54、CD2v抗原均显示为“-”，则该样本为抗体阴性。

实例2、非洲猪瘟病毒的鉴别ELISA 抗体检测方法的主要指标

敏感性

将阳性质控血清按1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048进行稀释，采用非洲猪瘟病毒的鉴别ELISA抗体检测试剂盒对上述稀释后的血清进行检测，数据如下表所示：

表1 非洲猪瘟病毒的鉴别ELISA抗体检测方法敏感性试验

试验结果表明，三次重复试验数据一致，P54的最小检出量可达1:128，CD2v的最小检出量可达1:256。

特异性

将2份特异性质控血清，分别用3批非洲猪瘟的鉴别ELISA抗体检测试剂盒进行检测，验证产品的特异性。

表2 非洲猪瘟病毒的鉴别ELISA抗体检测方法特异性试验

试验结果表明，非洲猪瘟病毒的鉴别ELISA抗体检测试剂盒对2份特异性血清的检测结果全部为阴性。说明其特异性良好。

重复性

根据临床试验方案，对此次临床样品中筛选的5份阳性血清和5份阴性血清进行批内重复性试验，对筛选的10份血清（5份阳性，5份阴性）进行批间重复性试验。

表3 非洲猪瘟病毒的鉴别ELISA抗体检测方法批内重复性试验

试验结果表明，批内重复性试验结果见表3，该批次批内最大变异系数为9%，符合批内重复性要求。

核苷酸序列表

<210> 1

<211> 560

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

ttacaaggag ttttccaggt ctttgtgtgt ataggtgctt ctttgccgta gagcttcaac 60

agccggcatt gtttgtgaag cagtgttctg agtagtggct gttgtataaa gctcatccga 120

aggagcactt gcggccgctg gccctccagt tgccatgatt agtctgtccg taactgggtt 180

gttcataact ggcctgtccg cgaccgagct gttcgtaact ggcctattca tggcaactgg 240

cctgtctgta attggcttgc ctacgttgcc tgtagtggct ccagccggtt tagaggtacc 300

tggttgtgga gtggctcctg cccactgctg atcttgataa ggatttataa actgtatatc 360

ttcctcctca atagcggggg cagcagcttt tttctttctt gaagaaaaca gataaattag 420

aacgatgata ataatgatta agaccacgat agcaacgaga atagtacaca tatgtgtgga 480

gaagaagctc ggtgtagagg ttggtgacaa acattcgcca taatgccgcg gataaacggg 540

ttgaaaaaat tcagaatcca 560

<210> 2

<211> 522

<212> DNA

<213> Hi 5细胞

<400> 2

gatgataaaa tttttaatac gatgtttcag ataatatatt taactaataa aattaattat 60

acaatacgat ggttacaacc tgttgatccc ccaaatattt catttaatga tagtaattct 120

ttaataaaat gtgaaaaaaa taatggaaca aatactaaaa tctatttata tttaaataat 180

acatttatta ataatactaa tgaaaatgat cttaaatatt attggaattg tagcgagtta 240

aattataata ttacagctac atgtattatt aataatacac ttaattcggc aaataccaca 300

aaagttataa attgcactaa tctattgtta aaatctgacc aaaattattt tcttaaaaat 360

attcatacat tattttatat cataattttt attgtgggtg ggacattaat aagtattatt 420

atatcaatca taactttttt atctttacga aaaagaaaaa aacatgttga agaaatagaa 480

agtccaccac ctgaatctaa tgaagaagaa caatgtcagc at 522

以上内容是结合具体实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认为本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做出的简单修改和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、固体洗液、终止液、用于加样的加样槽、封板膜和用于血清稀释的血清稀释板，其特征在于：所述包被板上包被两种P54蛋白抗原和CD2v蛋白抗原，P54蛋白抗原和CD2v蛋白抗原分别独立地包被在所述被板上的孔内，每升样品稀释液中含有磷酸氢二钠2.9 g、磷酸二氢钾 0.2 g、氯化钠8 g、氯化钾0.2g、BSA 10 g、PROCLIN-300 500 µL、吐温-20 1mL和0.1‰的果绿色素，所述酶结合物为HRP标记的羊抗猪二抗，所述阳性对照为野毒感染抗体，所述阴性对照来源于未感染非洲猪瘟的样本，所述显色液A为所述显色液A为pH 3.0的乙酸钠溶液，其中包含柠檬酸、过氧化脲、乙酸钠，所述显色液B为pH 3.0的TMB溶液，其中包含TMB、甲醇、乙酸钠。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，其特征在于：所述包被板为96孔板，在所述96孔板的第1、3、5、7、9、11列包被P54蛋白；在第2、4、6、8、10、12列包被CD2v蛋白；所述P54蛋白和CD2v蛋白的包被浓度均为1 µg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，其特征在于：所述显色液A的制备方法为：称量柠檬酸5.76g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化脲0.5g、乙酸钠6.21g使其完全溶解，加入Proclin-300 0.5mL，再加入双蒸水定容至1000mL，2~8℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的间接ELISA抗体鉴别检测试剂盒，其特征在于：所述显色液B的制备方法为：称取TMB 0.2g加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸5.76g，带起完全溶解后，加入Proclin-300 0.5mL，用量筒量取双蒸水定容至1000mL，2~8℃保存。

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