CN109851662B

CN109851662B - 口蹄疫病毒重组蛋白及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN109851662B
Application number: CN201811580335.XA
Authority: CN
Inventors: 孙雨; 王传彬; 宋晓晖; 肖颖; 赵晓春; 杨林; 王睿男; 毕一鸣; 董浩; 李硕; 蒋菲; 马英; 韩焘; 李晓霞; 亢文华; 曲萍; 刘玉良; 张存瑞; 杨天意; 张晨
Original assignee: China Animal Disease Control And Prevention Center (agricultural Slaughter Technology Center)
Current assignee: China Animal Disease Control And Prevention Center (agricultural Slaughter Technology Center)
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2038-12-24
Also published as: CN109851662A

Abstract

本发明公开了口蹄疫病毒重组蛋白及其相关生物材料与应用。该口蹄疫病毒重组蛋白为下述任一种蛋白质：R1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，R2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第166‑282位的蛋白质，R3)在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1)或R2)相同活性的可溶性融合蛋白。本发明利用该口蹄疫病毒重组蛋白建立的抗体检测试剂盒敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对口蹄疫野毒感染血清抗体的快速大量筛选检测，为口蹄疫的防控和净化提供重要技术手段。

Description

口蹄疫病毒重组蛋白及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒重组蛋白及其相关生物材料与应用。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Virus，FMDV)引起的偶蹄动物急性、热性、高度接触传染性传染病。在口蹄疫防治工作中的主要措施是用口蹄疫灭活疫苗对易感动物进行免疫。但是这种措施同时也对口蹄疫免疫动物与感染动物鉴别诊断带来了困难。因此，开展口蹄疫的鉴别诊断技术研究在预防、控制、扑灭和净化该病具有非常重要的意义。病毒分离技术是OIE规定的诊断FMD的金标准，该方法虽然较为准确，但需要耗费约几天的时间才能获得结果，并且操作技术复杂，生物安全要求高，不适用于基层兽医快速诊断需求。反转录PCR和实时定量PCR已经广泛用于检测FMDV。但这两种方法需要专业人员在专业的实验室内开展，也给基层检测人员诊断FMD带来了一定的困难。目前对于FMDV野毒感染的血清学诊断方法来说，使用最为普遍的是基于FMDV非结构蛋白(Non Structure Protein)3ABC的ELISA技术。但是，3ABC蛋白由于自身氨基酸结构特征以及序列较长等因素，真核系统表达较为困难，原核表达后基本为蛋白的包涵体结构。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制抗原活性的主要制约因素。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是如何提高口蹄疫病毒的血清学抗体检测的灵敏度，并且降低漏检率和假阳性率，从而更灵敏、更准确地诊断口蹄疫。

为了解决上述技术问题，本发明提供了口蹄疫病毒重组蛋白。

本发明所提供的口蹄疫病毒重组蛋白为R1)、R2)或R3)的蛋白质：

R1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，

R2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第166-282位的蛋白质，

R3)在R1)或R2)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1)或R2)相同活性的可溶性融合蛋白。

上述蛋白质中，所述标签蛋白(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为Flag标签蛋白、His标签蛋白、MBP标签蛋白、HA标签蛋白、myc标签蛋白、GST标签蛋白和/或SUMO标签蛋白等。

上述蛋白质中，R1)的蛋白质名称为rtagP3AB1B2，R2)的蛋白质名称为rP3AB1B2。SEQ ID No.2由290个氨基酸残基组成。

上述蛋白质中，所述蛋白质可按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质，所述生物可为微生物、植物或非人动物。

上述蛋白质中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达可包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。

上述蛋白质中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)原核微生物，

C2)革兰氏阴性细菌，

C3)埃希氏菌属细菌，

C4)大肠杆菌BL21(DE3)。

上述蛋白质中，所述蛋白质的编码基因可为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列是SEQ ID No.1的的DNA分子，

2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子，

3)编码序列是SEQ ID No.1的第496-846位核苷酸的DNA分子，

4)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第496-846位核苷酸的DNA分子。

上述蛋白质中，所述重组微生物具体为将pET32a-3AB1B2导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2，所述pET32a-3AB1B2是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第490-852位的DNA替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体。

上述蛋白质中，所述表达可为诱导表达。

上述蛋白质中，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13小时。

与所述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的生物材料为下述任一种：

B1)编码所述的蛋白质的核酸分子，

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒，

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体，

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物，

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物，

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物，

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)-4)中任一所述的DNA分子：

1)编码序列是SEQ ID No.1的的DNA分子，

2)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子，

3)编码序列是SEQ ID No.1的第496-846位核苷酸的DNA分子，

4)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第496-846位核苷酸的DNA分子。

下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

P1、上述方法在制备口蹄疫诊断抗原中的应用；

P2、上述生物材料在制备口蹄疫诊断抗原中的应用；

P3、上述方法在制备口蹄疫诊断试剂盒中的应用；

P4、上述生物材料在制备口蹄疫诊断试剂盒中的应用；

P5、上述在制备检测口蹄疫病毒感染抗体试剂盒中的应用；

P6、上述生物材料在制备检测口蹄疫病毒感染抗体试剂盒中的应用。

本发明将FMDV的非结构蛋白3A片段、3B1和3B2通过连接肽连接在一起得到融合蛋白rP3AB1B2，将rP3AB1B2基因插入到pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间得到可以表达融合蛋白rtagP3AB1B2的重组表达载体pET32a-3AB1B2，将pET32a-3AB1B2导入大肠杆菌BL21(DE3)获得可溶性表达的rtagP3AB1B2。用可溶性表达的rtagP3AB1B2作为目的诊断抗原和/或检测抗原检测血清中的非结构蛋白抗体可以用来区分疫苗免疫动物与野毒感染动物；其次非结构蛋白不分血清型，用可溶性表达的rtagP3AB1B2作为目的诊断抗原和/或检测抗原建立的检测血清中的非结构蛋白抗体的ELISA和时间分辨免疫荧光分析法可以对口蹄疫的七种血清型进行检测。

本发明的rtagP3AB1B2不仅可溶性表达比例高，而且与3ABC全抗原相比，检测的敏感性相当，特异性更好，准确性更高：

1、本发明利用大肠杆菌表达的rtagP3AB1B2占菌体总蛋白的62％，95％为可溶。本发明利用大肠杆菌获得的可溶表达的rtag3AB1B2，为进一步开发鉴别口蹄疫野毒感染与疫苗免疫抗体检测试剂盒奠定了非常好的基础。

2、将可溶表达的rtag3AB1B2作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性与rtag3ABC作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性相当，但是明显高于采用rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性，也明显高于瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的敏感性。

3、将可溶表达的rtag3AB1B2作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体的方法与口蹄疫瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率显著高于分别以rtag3ABC、rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体的方法。

4、将可溶表达的rtag3AB1B2作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性与rtag3ABC作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性相当，但是明显高于采用rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性，也明显高于瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的敏感性。

5、将可溶表达的rtag3AB1B2作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体的方法与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率显著高于分别以rtag3ABC、rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体的方法。

本发明以可溶表达的rtagP3AB1B2为诊断抗原和/或检测抗原制备的抗体检测试剂盒敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对口蹄疫野毒感染血清抗体的快速大量筛选检测，为口蹄疫的防控和净化提供重要技术手段。

附图说明

图1为各菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。

图中，泳道Marker为蛋白质分子量标准，从上到下分别为90kDa、65kDa、50kDa、38kDa、26kDa、15kDa、10kDa，1为诱导表达的BL21(DE3)/pET30a全菌蛋白液体，2为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的全菌蛋白液体，3为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2含蛋白上清液，4为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2含蛋白沉淀，5为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3ABC的全菌蛋白液体，6为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3ABC含蛋白上清液，7为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3ABC含蛋白沉淀，8为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3B1B2的全菌蛋白液体，9为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3B1B2含蛋白上清液，10为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3B1B2含蛋白沉淀，11为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-P3A的全菌蛋白液体，12为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-P3A含蛋白上清液，13为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-P3A含蛋白沉淀，14为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的全菌蛋白液体，15为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A含蛋白上清液，16为诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A含蛋白沉淀，17为镍柱纯化的rtagP3AB1B2蛋白，18为分子筛纯化的rtagP3AB1B2蛋白。

图2为重组蛋白rtagP3AB1B2的分子筛纯化鉴定与结构鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰，横坐标标题为保留纯化柱的保留体积(升)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pET32a(+)为Novagen公司产品。铕标记元素(Eu3+)为广州达瑞生物技术股份有限公司产品。兔抗山羊二抗为Sigma公司产品。Auto-DELFIA 1235时间分辨荧光检测仪购自PerkinElmer股份有限公司。酶标板，购自美国Costar公司。下述实施例中的瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒为

FMDV NS Antibody ELISA test Kit(

FMDV NS FMDV Antibody test Kit，ELISA)，批号是F161101L，货号是7610770。

下述实施例中的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清为临床羊血清经瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒检测为阳性的血清，羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清为临床羊血清经瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒检测为阴性的血清。

实施例1、口蹄疫病毒重组蛋白r3AB1B2和rtag3AB1B2的可溶性表达

1、重组表达载体的构建

1.1口蹄疫病毒重组蛋白基因重组表达载体的构建

1.1.1口蹄疫病毒重组蛋白基因的设计

本申请设计了5种口蹄疫病毒重组蛋白基因，分别是SEQ ID No.1所示的rtagP3AB1B2基因、SEQ ID No.3所示的rtag3ABC基因(对照基因1)、SEQ ID No.5所示的rtag3B1B2基因(对照基因2)、SEQ ID No.7所示的rtagP3A基因(对照基因3)和SEQ ID No.9所示的rtag3A基因(对照基因4)。

1.1.1.1 rtagP3AB1B2基因(本发明基因)

SEQ ID No.1由873个核苷酸组成，其中，第1-873位为rtagP3AB1B2基因的CDS，第496-846位为rP3AB1B2基因的核苷酸序列，第1-495位和第847-873位为pET32a(+)的序列，第496-615位为口蹄疫病毒的3A蛋白片段的基因序列(GenBank:AY614501.1的第1-120位)，第661-729位为口蹄疫病毒的3B1蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第430-498位)，第775-846位为口蹄疫病毒的3B2蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第499-570位)。

1.1.1.2 rtag3ABC基因(口蹄疫病毒全长3ABC基因对照)

SEQ ID No.3由1803个核苷酸组成，其中，第1-1803位为rtag3ABC基因的CDS，第496-1776位为3ABC基因的核苷酸序列(该序列同GenBank:AY614501.1的第1-1281位)，第1-495位和第1777-1803位为pET32a(+)的序列，第496-924位为口蹄疫病毒的3A蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第1-429位)，第925-993位为口蹄疫病毒的3B1蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第430-498位)，第994-1065位为口蹄疫病毒的3B2蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第499-570位)，第1066-1137位为口蹄疫病毒的3B3蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第571-642位)，第1138-1776位为口蹄疫病毒的3C蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第643-1281位)。

1.1.1.3 rtag3B1B2基因(口蹄疫病毒3B13B2基因对照)

SEQ ID No.5由708个核苷酸组成，其中，第1-708位为rtag3B1B2基因的CDS，第496-681位为3B1B2基因的核苷酸序列，第1-495位和第682-708位为pET32a(+)的序列，第496-564位为口蹄疫病毒的3B1蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第430-498位)，第610-681位为口蹄疫病毒的3B2蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第499-570位)。

1.1.1.4 rtagP3A基因(口蹄疫病毒3A片段基因对照)

SEQ ID No.7由642个核苷酸组成，其中，第1-642位为rtagP3A基因的CDS，第496-615位为口蹄疫病毒的3A蛋白片段的基因序列(GenBank:AY614501.1的第1-120位)，第1-495位和第616-642位为pET32a(+)的序列。

1.1.1.5 rtag3A基因(口蹄疫病毒3A全长基因对照)

SEQ ID No.9由951个核苷酸组成，其中，第1-951位为rtag3A基因的CDS，第496-924位为口蹄疫病毒的3A蛋白的基因序列(GenBank:AY614501.1的第1-429位)，第1-495位和第925-951位为pET32a(+)的序列。

1.1.2重组表达载体的构建

1.1.2.1 rtagP3AB1B2基因重组表达载体(本发明的表达载体)的构建

用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第490-852位的DNA替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到rtagP3AB1B2基因重组表达载体，命名为pET32a-3AB1B2。pET32a-3AB1B2含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。pET32a-3AB1B2含有rtagP3AB1B2基因，rtagP3AB1B2基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，编码序列是SEQ ID No.1的第1-873位核苷酸，rtagP3AB1B2基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白质rtagP3AB1B2。

1.1.2.2 rtag3ABC基因重组表达载体(口蹄疫病毒全长3ABC基因表达载体对照)

用核苷酸序列是SEQ ID No.3的第490-1782位的DNA替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到rtag3ABC基因重组表达载体，命名为pET32a-3ABC。pET32a-3ABC含有核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子。pET32a-3ABC含有rtag3ABC基因，rtag3ABC基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3，编码序列是SEQ ID No.3的第1-1803位核苷酸，rtag3ABC基因编码SEQ ID No.4所示的蛋白质rtag3ABC。

1.1.2.3 rtag3B1B2基因重组表达载体(口蹄疫病毒3B13B2基因表达载体对照)

用核苷酸序列是SEQ ID No.5的第490-687位的DNA替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到rtag3B1B2基因重组表达载体，命名为pET32a-3B1B2。pET32a-3B1B2含有核苷酸序列是SEQ ID No.5的DNA分子。pET32a-3B1B2含有rtag3B1B2基因，rtag3B1B2基因的核苷酸序列是SEQ ID No.5，编码序列是SEQ ID No.5的第1-708位核苷酸，rtag3B1B2基因编码SEQ ID No.6所示的蛋白质rtag3B1B2。

1.1.2.4 rtagP3A基因重组表达载体(口蹄疫病毒3A片段基因表达载体对照)

用核苷酸序列是SEQ ID No.7的第490-621位的DNA替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到rtagP3A基因重组表达载体，命名为pET32a-P3A。pET32a-P3A含有核苷酸序列是SEQ ID No.7的DNA分子。pET32a-P3A含有rtagP3A基因，rtagP3A基因的核苷酸序列是SEQ ID No.7，编码序列是SEQ ID No.7的第1-642位核苷酸，rtagP3A基因编码SEQID No.8所示的蛋白质rtagP3A。

1.1.2.5 rtag3A基因重组表达载体(口蹄疫病毒3A全长基因表达载体对照)

用核苷酸序列是SEQ ID No.9的第490-930位的DNA替换pET32a(+)的BamH I和XhoI识别位点间的片段(包括BamH I识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET32a(+)的其它序列不变，得到rtag3A基因重组表达载体，命名为pET32a-3A。pET32a-3A含有核苷酸序列是SEQ ID No.9的DNA分子。pET32a-3A含有rtag3A基因，rtag3A基因的核苷酸序列是SEQ ID No.9，编码序列是SEQ ID No.9的第1-951位核苷酸，rtag3A基因编码SEQ IDNo.10所示的蛋白质rtag3A。

2、重组菌的构建

将步骤1构建的pET32a-3AB1B2、pET32a-3ABC、pET32a-3B1B2、pET32a-P3A、pET32a-3A这5种表达载体分别单独转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其均匀涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pET32a-3AB1B2的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2，将测序结果表明含有pET32a-3ABC的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET32a-3ABC，将测序结果表明含有pET32a-3B1B2的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET32a-3B1B2，将测序结果表明含有pET32a-P3A的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET32a-P3A，将测序结果表明含有pET32a-3A的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET32a-3A。同时将pET32a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)得到含有pET32a(+)的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET32a，作为空载体对照。

3、蛋白表达形式的分析与鉴定

将BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2、BL21(DE3)/pET32a-3ABC、BL21(DE3)/pET32a-3B1B2、BL21(DE3)/pET32a-P3A、BL21(DE3)/pET32a-3A和BL21(DE3)/pET32a这6个菌株分别单独接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入氨苄青霉素至氨苄青霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。上述6株菌的诱导表达均是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13小时(该诱导表达条件是经过对温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化得到的高效可溶性诱导表达条件)。

取上述诱导表达发酵液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取1mL发酵液置于1.5mL离心管中，做好标记，4℃条件下8500rpm/min离心45min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中18000rpm/min离心45min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μL PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μL 5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μL用于SDS-PAGE电泳分析，并且结合蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于NC膜，以抗His标签的羊抗鼠抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。

将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白(即可溶性目的蛋白)的含量进行定量分析。并用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。

3.1 BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的表达情况

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为31kDa的目的蛋白rtagP3AB1B2；诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的全菌蛋白液体中的目的蛋白rtagP3AB1B2占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的62％，诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的含蛋白上清液中的目的蛋白rtagP3AB1B2占诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的全菌蛋白液体中目的蛋白rtagP3AB1B2的95％，该95％的目的蛋白rtagP3AB1B2为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的含蛋白沉淀中的目的蛋白rtagP3AB1B2占诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的全菌蛋白液体中目的蛋白rtagP3AB1B2的5％，该5％的目的蛋白rtagP3AB1B2为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2的目的蛋白rtagP3AB1B2占菌体总蛋白的62％，BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2表达的目的蛋白rtagP3AB1B2中95％为可溶性蛋白，5％为不溶性包涵体蛋白(图1)。

3.2 BL21(DE3)/pET32a-3ABC的表达情况

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3ABC的全菌蛋白液体和含蛋白沉淀中均含有大小为66kDa的目的蛋白rtag3ABC，而诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3ABC的含蛋白上清液中不含有大小为66kDa的目的蛋白rtag3ABC。诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3ABC的全菌蛋白液体中的目的蛋白rtag3ABC占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的17％。说明BL21(DE3)/pET32a-3ABC表达的目的蛋白rtag3ABC为不溶性包涵体蛋白，BL21(DE3)/pET32a-3ABC不能表达可溶性目的蛋白(图1)。

3.3 pET32a-3B1B2的表达情况

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3B1B2的全菌蛋白液体和含蛋白上清液中均含有大小为25kDa的目的蛋白rtag3B1B2，而诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3B1B2的含蛋白沉淀中不含有大小为25kDa的目的蛋白rtag3B1B2。诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3B1B2的全菌蛋白液体中的目的蛋白rtag3B1B2占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的26％。说明BL21(DE3)/pET32a-3B1B2表达的目的蛋白rtag3B1B2为可溶性蛋白，BL21(DE3)/pET32a-3B1B2不能表达包涵体目的蛋白(图1)。

3.4 BL21(DE3)/pET32a-P3A的表达情况

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-P3A的全菌蛋白液体和含蛋白上清液中均含有大小为23kDa的目的蛋白rtagP3A，而诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-P3A的含蛋白沉淀中不含有大小为23kDa的目的蛋白rtagP3A。诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-P3A的全菌蛋白液体中的目的蛋白rtagP3A占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的14％。说明BL21(DE3)/pET32a-P3A表达的目的蛋白rtagP3A为可溶性蛋白，BL21(DE3)/pET32a-P3A不能表达包涵体目的蛋白(图1)。

3.5 BL21(DE3)/pET32a-3A的表达情况

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为35kDa的目的蛋白rtag3A；诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的全菌蛋白液体中的目的蛋白rtag3A占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的8％，诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的含蛋白上清液中的目的蛋白rtag3A占诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的全菌蛋白液体中目的蛋白rtag3A的62％，该62％的目的蛋白rtag3A为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的含蛋白沉淀中的目的蛋白rtag3A占诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的全菌蛋白液体中目的蛋白rtag3A的38％，该38％的目的蛋白rtag3A为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a-3A的目的蛋白rtag3A占菌体总蛋白的8％，BL21(DE3)/pET32a-3A表达的目的蛋白rtag3A中62％为可溶性蛋白，38％为不溶性包涵体蛋白(图1)。

3.6的表达情况BL21(DE3)/pET32a

结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET32a的全菌蛋白液体没有目的蛋白的表达。

3.1和3.2的结果说明虽然采用同一种表达载体pET32a(+)和同一种宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，不同的外源目的基因的表达情况相差很大，将rtagP3AB1B2基因通过pET32a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)可获得rtagP3AB1B2基因的高效可溶性表达，将rtag3ABC基因通过pET32a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中，rtag3ABC基因却不能获得可溶性表达。

另外，本发明的发明人在研发本发明的过程中，将相同的rP3AB1B2编码基因(SEQID No.1的第496-846位所示的DNA分子)插入pET32a(+)的EcoR I和XhoI识别位点间得到的重组原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中却表达不出融合蛋白。可见，将同一外源基因插入同一种原核表达载体的不同位置，也会影响该外源基因的表达结果。

另外，本发明的发明人在研发本发明的过程中，将相同的rP3AB1B2编码基因(SEQID No.1的第496-846位所示的DNA分子)插入pET30a(+)的Nde I和XhoI位点间得到的重组原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中虽然能获得可溶性表达的目的蛋白，但目的蛋白的可溶性表达量很低，大多为目的蛋白为包涵体，可溶性表达的目的蛋白占表达的目的蛋白总量的27％。可见，将同一外源基因插入不同的原核表达载体，也会影响该外源基因的表达结果。

4、rtagP3AB1B2的可溶性表达及纯化

将BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入氨苄青霉素至氨苄青霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16℃诱导13h。取IPTG诱导表达13h后的发酵液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2含蛋白上清液)，弃沉淀。将BL21(DE3)/pET32a-3AB1B2含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化的RtagP3AB1B2蛋白(镍柱纯化目的蛋白样品，图1中泳道17)。

将镍柱纯化的rtagP3AB1B2蛋白用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化，得到分子筛纯化的rtagP3AB1B2蛋白(图1中泳道18)。该分子筛纯化中的流动相使用上述溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，rtagP3AB1B2蛋白的结构为单体结构(图2)。收集单体结构的洗脱峰，得到分子筛纯化的rtagP3AB1B2蛋白(分子筛纯化目的蛋白样品)，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。

将分子筛纯化的rtagP3AB1B2蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明rtagP3AB1B2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5、对照蛋白质的表达及纯化

5.1 rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A的可溶性表达及纯化

参照步骤4的方法，利用BL21(DE3)/pET32a-3B1B2、BL21(DE3)/pET32a-P3A、BL21(DE3)/pET32a-3A进行诱导表达，分别得到分子筛纯化的如下对照蛋白质(可溶性蛋白质)：rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A。

5.2 rtag3ABC的表达及包涵体变性复性

将步骤3得到的BL21(DE3)/pET32a-3ABC接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D₆₀₀值(以含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16℃诱导13h。取IPTG诱导表达13h后的发酵液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集沉淀(命名为BL21(DE3)/pET32a-3ABC含蛋白沉淀)，弃上清液。将BL21(DE3)/pET32a-3ABC含蛋白沉淀用含有8M的尿素的缓冲液(20mM Tris、150mM NaCl、8M尿素、溶剂是水，pH8.0的溶液)溶解。溶解液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、8M尿素，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、8M尿素、50mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、8M尿素，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化的rtag3ABC包涵体蛋白。

实施例2、以rtag3AB1B2为抗原的诊断口蹄疫的酶联免疫试剂盒或检测口蹄疫病毒抗体的酶联免疫试剂盒

本实施例所提供的以rtag3AB1B2为抗原的诊断口蹄疫的酶联免疫试剂盒或检测口蹄疫病毒抗体的酶联免疫试剂盒包括包被抗原，包被抗原为实施例1中制备的分子筛纯化的rtag3AB1B2蛋白(以下简称rtag3AB1B2蛋白)。

该酶联免疫试剂盒还包括酶标二抗、包被缓冲液、洗涤液、二抗稀释液。

该酶联免疫试剂盒中，酶标二抗为HRP标记的兔抗山羊IgG。

包被缓冲液：0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na₂CO₃ 1.59g/L和NaHCO₃ 2.93g/L。

洗涤液为0.5％吐温洗涤液(PBST洗涤液)。0.5％吐温洗涤液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温20至吐温20的含量为5mL/L，得到0.5％吐温洗涤液。

封闭液为1％BSA封闭液。1％BSA封闭液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加10％的BSA溶液，至BSA的体积百分含量为1％，得到1％BSA封闭液。

二抗稀释液：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA至BSA的含量为1％(体积百分含量)，得到二抗稀释液。

其中，浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液的配制：8.5g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.59g NaH₂PO₄·2H₂O，1L去离子水。

1、经过优化实验建立了以rtag3AB1B2蛋白为包被抗原间接ELISA方法检测口蹄疫病毒抗体的优化实验方法(以下简称rtag3AB1B2优化间接ELISA方法)如下：

1.1包被：用包被缓冲液稀释实施例1中分子筛纯化的rtag3AB1B2蛋白(以下简称rtag3AB1B2蛋白)至rtag3AB1B2蛋白的浓度为1.0μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μL/孔加至酶标板，4℃孵育16h。

1.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用PBST洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。

1.3封闭：加入1％BSA封闭液，250μL/孔，37℃孵育2h。

1.4加样：

1.4.1样品孔

用包被缓冲液将羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清稀释50倍，得到待测血清。将100μL待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次。

1.4.2空白对照孔

与1.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。

1.5加酶标二抗：加入用二抗稀释液进行1:50000稀释的HRP标记兔抗山羊IgG，100μL/孔，37℃30min。

1.6显色：加入TMB，100μL/孔，反应10min。

1.7终止：加入0.2mol/L H₂SO₄溶液终止反应，100μL/孔。

1.8测定：用酶标仪读取各孔OD_450nm数值。

2、ELISA阴阳性临界值的确定

将400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清采用步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法(将1.4.1中的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清分别替换为该400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清，其它操作相同)进行间接ELISA检测，计算该400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清的平均值(X)和标准偏差(SD)。

判为阳性；

判为阴性。

结果表明，该400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清平均值

为0.178，SD为0.057，因此阴阳性临界值

为0.349。

3、特异性试验

利用步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法对各10份的羊副结核阳性血清、羊布病阳性血清、小反刍兽疫阳性血清和产气荚膜梭菌病阳性血清进行检测，观察与其它疾病有无交叉反应。其中，将1.4.1中的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清分别替换为上述血清，其它操作相同。结果表明该rtag3AB1B2优化间接ELISA方法对羊副结核阳性血清、羊布病阳性血清、小反刍兽疫阳性血清和产气荚膜梭菌病阳性血清进行检测，其OD₄₅₀值分别为：0.188、0.231、0.196、0.284，均小于临界值0.349，表明rtag3AB1B2与羊副结核阳性血清、羊布病阳性血清、小反刍兽疫阳性血清、产气荚膜梭菌病阳性血清均无交叉反应，步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法具有良好的特异性。

4、敏感性试验

将步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法中的rtag3AB1B2替换为rtag3ABC，其它操作不变，建立rtag3ABC优化间接ELISA方法。

将步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法中的rtag3AB1B2替换为rtag3B1B2，其它操作不变，建立rtag3B1B2优化间接ELISA方法。

将步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法中的rtag3AB1B2替换为rtagP3A，其它操作不变，建立rtagP3A优化间接ELISA方法。

将步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法中的rtag3AB1B2替换为rtag3A，其它操作不变，建立rtag3A优化间接ELISA方法。

将羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清进行倍比稀释，分别采用步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法、rtag3ABC优化间接ELISA方法、rtag3B1B2优化间接ELISA方法、rtagP3A优化间接ELISA方法和rtag3A优化间接ELISA方法进行检测，得出阳性临界值时的最大稀释度。

结果表明将羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清从1：4开始进行倍比稀释，采用步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法进行检测羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清的稀释度为1∶1024时仍呈阳性；采用瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒进行检测的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清的最大稀释度为1∶512；采用rtag3ABC优化间接ELISA方法、rtag3B1B2优化间接ELISA方法、rtagP3A优化间接ELISA方法和rtag3A优化间接ELISA方法进行检测进行检测，羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清的最大稀释度分别为1∶1024、1∶512、1∶512和1∶256。表明将rtag3AB1B2作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性与rtag3ABC作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性相当，但是明显高于采用rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性，也明显高于瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的敏感性。

5、重复性试验

采用步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法对6份羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(CV)。结果显示，批内重复变异系数在2％～8％之间，批间重复变异系数小于9％(表1)。结果表明，步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法具有良好的重复性。

表1.步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法重复性试验

6、符合性试验

使用瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒从中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存的羊血清挑选出了90份羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清与90份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清。对这180份羊血清分别采用步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法、步骤4的rtag3ABC优化间接ELISA方法、rtag3B1B2优化间接ELISA方法、rtagP3A优化间接ELISA方法和rtag3A优化间接ELISA方法进行检测，计算与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的符合率。

结果表明该180份羊血清，步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率为94.44％(阳性符合率为94.44％，阴性符合率为94.44％)，步骤4的rtag3ABC优化间接ELISA方法、rtag3B1B2优化间接ELISA方法、rtagP3A优化间接ELISA方法和rtag3A优化间接ELISA方法进行检测与口蹄疫瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒方法的总符合率分别为87.78％(阳性符合率为97.78％，阴性符合率为77.78％)、88.89％(阳性符合率为80％，阴性符合率为97.78％)、79.44％(阳性符合率为61.11％，阴性符合率为97.78％)、82.22％(阳性符合率为70％，阴性符合率为94.44％)(表2-表6)。

表2.rtag3AB1B2优化间接ELISA方法血清样品检测结果

通过表2结果可以得出，步骤1的rtag3AB1B2优化间接ELISA方法，检测出了85份阳性，85份阴性。检测结果不相符的样品为10份。两种方法的阳性符合率为94.44％，阴性符合率为94.44％，总符合率为94.44％(见表3)。

表3.rtag3ABC优化间接ELISA方法血清样品检测结果

通过表3结果可以得出，步骤4的rtag3ABC优化间接ELISA方法，检测出了108份阳性，72份阴性。检测结果不相符的样品为22份。两种方法的阳性符合率为97.78％，阴性符合率为77.78％，总符合率为87.78％(见表3)。

表4.rtag3B1B2优化间接ELISA方法血清样品检测结果

通过表4结果可以得出，步骤4的rtag3B1B2优化间接ELISA方法，检测出了74份阳性，106份阴性。检测结果不相符的样品为20份。两种方法的阳性符合率为80％，阴性符合率为97.78％，总符合率为88.89％(见表4)。

表5.rtagP3A优化间接ELISA方法血清样品检测结果

通过表5结果可以得出，步骤4的rtagP3A优化间接ELISA方法，检测出了57份阳性，143份阴性。检测结果不相符的样品为37份。两种方法的阳性符合率为61.11％，阴性符合率为97.78％，总符合率为79.44％(见表5)。

表6.rtag3A优化间接ELISA方法血清样品检测结果

通过表6结果可以得出，步骤4的rtag3A优化间接ELISA方法，检测出了68份阳性，112份阴性。检测结果不相符的样品为32份。两种方法的阳性符合率为70％，阴性符合率为94.44％，总符合率为82.22％(见表6)。

说明将rtag3AB1B2作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体的方法与口蹄疫瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率显著高于分别以rtag3ABC、rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的间接ELISA检测口蹄疫病毒抗体的方法。

实施例3、以rtag3AB1B2为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测口蹄疫病毒感染抗体

本实施例所提供的口蹄疫诊断抗原和检测口蹄疫病毒感染抗体的抗原均为实施例1中制备的分子筛纯化的rtag3AB1B2蛋白(以下简称rtag3AB1B2蛋白)。

本实施例提供了以rtag3AB1B2为抗原的诊断口蹄疫的时间分辨荧光免疫分析试剂盒或检测口蹄疫病毒抗体的时间分辨荧光免疫分析试剂盒包括包被抗原，包被抗原为实施例1中制备的分子筛纯化的rtag3AB1B2蛋白(以下简称rtag3AB1B2蛋白)。

该时间分辨荧光免疫分析试剂盒还包括铕标记二抗、包被缓冲液、洗涤液、二抗稀释液。

按照如下文献中的方法制备铕标记的兔抗山羊二抗(简称铕标记二抗)：EB病毒核抗原(NA1)IgA抗体和Zta蛋白IgA抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂的研制.南方医科大学2012级硕士学位论文。

洗涤液为PBST洗涤液。PBST洗涤液按照如下方法配制：在浓度为0.01M，pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温20至吐温20的含量为5mL/L，得到PBST洗涤液。

1、经过优化实验建立了以rtag3AB1B2蛋白为包被抗原的时间分辨荧光免疫分析方法检测口蹄疫病毒抗体的优化实验方法(以下简称rtag3AB1B2优化TRFIA方法)如下：

1.3封闭：加入1％BSA封闭液，250μL/孔，37℃孵育2h。

1.4加样：

1.4.1样品孔

1.4.2空白对照孔

1.5加铕元素标二抗：加入用二抗稀释液进行1:50000稀释的铕标记兔抗山羊IgG，100μL/孔，37℃30min。

1.6显色：加入TMB，100μL/孔，反应10min。

1.7终止：加入0.2mol/L H₂SO₄溶液终止反应，100μL/孔。

1.8测定：用时间分辨荧光免疫分析仪读取各孔荧光数值。

2、ELISA阴阳性临界值的确定

将400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清采用步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法(将1.4.1中的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清分别替换为该400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清，其它操作相同)进行TRFIA检测，计算该400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清的平均值(X)和标准偏差(SD)。

判为阳性；

判为阴性。

结果表明，该400份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清平均荧光值

为1207，SD为114，因此阴阳性临界荧光值

为1549。

3、特异性试验

利用步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法对各10份的羊副结核阳性血清、羊布病阳性血清、小反刍兽疫阳性血清和产气荚膜梭菌病阳性血清进行检测，观察与其它疾病有无交叉反应。其中，将1.4.1中的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清分别替换为上述血清，其它操作相同。结果表明该rtag3AB1B2优化TRFIA方法对羊副结核阳性血清、羊布病阳性血清、小反刍兽疫阳性血清和产气荚膜梭菌病阳性血清进行检测，其OD₄₅₀值分别为：879、1220、934、762，均小于临界值1549，表明rtag3AB1B2与羊副结核阳性血清、羊布病阳性血清、小反刍兽疫阳性血清、产气荚膜梭菌病阳性血清均无交叉反应，步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法具有良好的特异性。

4、敏感性试验

将步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法中的rtag3AB1B2替换为rtag3ABC其它操作不变，建立rtag3ABC优化TRFIA方法。

将步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法中的rtag3AB1B2替换为rtag3B1B2，其它操作不变，建立rtag3B1B2优化TRFIA方法。

将步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法中的rtag3AB1B2替换为rtagP3A，其它操作不变，建立rtagP3A优化TRFIA方法。

将步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法中的rtag3AB1B2替换为rtag3A，其它操作不变，建立rtag3A优化TRFIA方法。

将羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清进行倍比稀释，分别采用步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法、rtag3ABC优化TRFIA方法、rtag3B1B2优化TRFIA方法、rtagP3A优化TRFIA方法和rtag3A优化TRFIA方法进行检测，得出阳性临界值时的最大稀释度。

结果表明将羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清从1∶4开始进行倍比稀释，采用步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法检测羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清的稀释度为1∶2048时仍呈阳性；采用瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒进行检测的羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清的的最大稀释度为1∶512；采用rtag3ABC优化TRFIA方法、rtag3B1B2优化TRFIA方法、rtag3A优化TRFIA方法和rtagP3A优化TRFIA方法进行检测羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清的最大稀释度分别为1∶2048、1∶1024、1∶1024和1∶512。表明将rtag3AB1B2作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性与rtag3ABC作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性相当，但是明显高于采用rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体方法的敏感性，也明显高于瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的敏感性。

5、重复性试验

采用步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法对6份羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(CV)。结果显示，批内重复变异系数在2％～8％之间，批间重复变异系数小于9％(表7)。结果表明，步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法具有良好的重复性。

表7.步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法重复性试验

6、符合性试验

使用瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒从中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存的羊血清挑选出了90份羊FMDV非结构蛋白抗体阳性血清与90份羊FMDV非结构蛋白抗体阴性血清。对这180份羊血清分别采用步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法、步骤4的rtag3ABC优化TRFIA方法、rtag3B1B2优化TRFIA方法、rtagP3A优化TRFIA方法和rtag3A优化TRFIA方法进行检测，计算与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的符合率。

结果表明该180份羊血清，步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率为96.11％(阳性符合率为97.78％，阴性符合率为94.44％)，步骤4的rtag3ABC优化TRFIA方法、rtag3B1B2优化TRFIA方法、rtagP3A优化TRFIA方法和rtag3A优化TRFIA方法与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率分别为85％(阳性符合率为97.78％，阴性符合率为72.22％)、86.67％(阳性符合率为84.44％，阴性符合率为88.89％)、78.89％(阳性符合率为64.44％，阴性符合率为93.33％)和76.11％(阳性符合率为74.44％，阴性符合率为77.78％)(表8-表12)。

表8.rtag3AB1B2优化TRFIA方法血清样品检测结果

通过表8结果可以得出，步骤1的rtag3AB1B2优化TRFIA方法，检测出了93份阳性，87份阴性。检测结果不相符的样品为7份。两种方法的阳性符合率为97.78％，阴性符合率为94.44％，总符合率为96.11％(见表8)。

表9.rtag3ABC优化TRFIA方法血清样品检测结果

通过表9结果可以得出，步骤4的rtag3ABC优化TRFIA方法，检测出了113份阳性，67份阴性。检测结果不相符的样品为27份。两种方法的阳性符合率为97.78％，阴性符合率为72.22％，总符合率为85％(见表9)。

表10.rtag3B1B2优化TRFIA方法血清样品检测结果

通过表10结果可以得出，步骤4的rtag3B1B2优化TRFIA方法，检测出了86份阳性，94份阴性。检测结果不相符的样品为24份。两种方法的阳性符合率为84.44％，阴性符合率为88.89％，总符合率为86.67％(见表10)。

表11.rtagP3A优化TRFIA方法血清样品检测结果

通过表11结果可以得出，步骤4的rtagP3A优化TRFIA方法，检测出了64份阳性，116份阴性。检测结果不相符的样品为38份。两种方法的阳性符合率为64.44％，阴性符合率为93.33％，总符合率为78.89％(见表11)。

表12.rtag3A优化TRFIA方法血清样品检测结果

通过表12结果可以得出，步骤4的rtag3A优化TRFIA方法，检测出了87份阳性，93份阴性。检测结果不相符的样品为43份。两种方法的阳性符合率为74.44％，阴性符合率为77.78％，总符合率为76.11％(见表12)。

说明将rtag3AB1B2作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体的方法与瑞士PRIONICS口蹄疫NS抗体检测试剂盒的总符合率显著高于分别以rtag3ABC、rtag3B1B2、rtagP3A和rtag3A作为包被抗原建立的时间分辨荧光免疫分析检测口蹄疫病毒抗体的方法。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心）

<120> 口蹄疫病毒重组蛋白及其相关生物材料与应用

<130> GNCFH182285

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccatttc aatcccttcc cagaaggctg tgttgtactt tctcattgag 540

aagggccagc acgaagcagc aattgagttc ttcgagggta tggtccacga ctccatcaag 600

gaggagctcc ggcctggtgg cggtggaatc ggaggtggtg gaagcggagg aggtggaagc 660

ggaccctacg ctgggccact cgagcgtcag aaacctctta aagtgaaagc caggctgcca 720

caacaggagg gtggcggtgg aatcggaggt ggtggaagcg gaggaggtgg aagcggaccc 780

tacgccggcc caatggagag acagaaacca ctaaaggtga aagcaaaagt ccccgtcgtg 840

aaggaactcg agcaccacca ccaccaccac tga 873

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ala Val Leu Tyr

165 170 175

Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu

180 185 190

Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Gly Gly Gly

195 200 205

Gly Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Tyr Ala

210 215 220

Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Arg Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Glu Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys

260 265 270

Val Lys Ala Lys Val Pro Val Val Lys Glu Leu Glu His His His His

275 280 285

His His

290

<210> 3

<211> 1803

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccatttc aatcccttcc cagaaggctg tgttgtactt tctcattgag 540

aagggccagc acgaagcagc aattgagttc ttcgagggta tggtccacga ctccatcaag 600

gaggagctcc ggcctctcat ccagcagacc tcgtttgtac aacgcgcctt caagcgcctg 660

aaggagaact ttgagattgt agctctgtgt ttaaccctct tggcaaacat agtgattatg 720

ctccgccaag cgcgcaagag acgccagtcg gtggatgacc cactggacgg cgacataact 780

cttggcgacg cggaaaagga ccctctggag gcgcgtggcg ctagcgctgt cggtttcaga 840

gagagaccac ccaccgagca agagacgtgc gaagacgcga acgctgagcc tgtcgtgctc 900

gggagggaac aaccgcgagc tgaaggaccc tacgctgggc cactcgagcg tcagaaacct 960

cttaaagtga aagccaggct gccacaacag gagggaccct acgccggccc aatggagaga 1020

cagaaaccac taaaggtgaa agcaaaagtc cccgtcgtga aggaaggacc ttacgaggga 1080

ccggtgaaga aacctgtcgc tttgaaagtg aaagcaaaga acttgatagt cactgagagt 1140

ggtgcgccac cgaccgactt gcaaaagatg gtcatgggca acactaagcc ggtcgagctt 1200

atcctcgacg gcaagacggt ggccatctgt tgtgccaccg gagtgtttgg cactgcctac 1260

ctcgtgcctc gtcacctctt cgcggagaag tatgacaaga tcatgttgga cggtagagcc 1320

ttaacagaca gcgactacag agtgttcgag tttgagatta aagtaaaagg acaggacatg 1380

ctctcagacg ccgctctcat ggtgttgcac cgtgggaacc gcgtgcgcga tatcacgaaa 1440

cactttcgtg atgtggcgag aatgaagaag ggaacccccg tcgtcggtgt gatcaacaat 1500

gctgacgtag ggagactcat attctctggt gaagccctta cttacaagga catcgtcgtg 1560

tgtatggacg gagacaccat gcctgggctc ttcgcctaca gagcgtccac caaggcaggc 1620

tactgtggag gagccgtcct cgcaaaggac ggtgccgaga cgttcatcgt tggcactcac 1680

tccgcaggtg gtaacggtat aggatactgc tcctgcgtct cccgatcgat gctcatgaag 1740

atgaaggcac acatcgaccc cgaaccacac cacgagctcg agcaccacca ccaccaccac 1800

tga 1803

<210> 4

<211> 600

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ala Val Leu Tyr

165 170 175

Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu

180 185 190

Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln

195 200 205

Gln Thr Ser Phe Val Gln Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe

210 215 220

Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met

225 230 235 240

Leu Arg Gln Ala Arg Lys Arg Arg Gln Ser Val Asp Asp Pro Leu Asp

245 250 255

Gly Asp Ile Thr Leu Gly Asp Ala Glu Lys Asp Pro Leu Glu Ala Arg

260 265 270

Gly Ala Ser Ala Val Gly Phe Arg Glu Arg Pro Pro Thr Glu Gln Glu

275 280 285

Thr Cys Glu Asp Ala Asn Ala Glu Pro Val Val Leu Gly Arg Glu Gln

290 295 300

Pro Arg Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro

305 310 315 320

Leu Lys Val Lys Ala Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly

325 330 335

Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Val Pro Val

340 345 350

Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu

355 360 365

Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro Pro

370 375 380

Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val Glu Leu

385 390 395 400

Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr Gly Val Phe

405 410 415

Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp

420 425 430

Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Leu Thr Asp Ser Asp Tyr Arg Val

435 440 445

Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu Ser Asp Ala

450 455 460

Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp Ile Thr Lys

465 470 475 480

His Phe Arg Asp Val Ala Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro Val Val Gly

485 490 495

Val Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser Gly Glu Ala

500 505 510

Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp Thr Met Pro

515 520 525

Gly Leu Phe Ala Tyr Arg Ala Ser Thr Lys Ala Gly Tyr Cys Gly Gly

530 535 540

Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Glu Thr Phe Ile Val Gly Thr His

545 550 555 560

Ser Ala Gly Gly Asn Gly Ile Gly Tyr Cys Ser Cys Val Ser Arg Ser

565 570 575

Met Leu Met Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro His His Glu

580 585 590

Leu Glu His His His His His His

595 600

<210> 5

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccggacc ctacgctggg ccactcgagc gtcagaaacc tcttaaagtg 540

aaagccaggc tgccacaaca ggagggtggc ggtggaatcg gaggtggtgg aagcggagga 600

ggtggaagcg gaccctacgc cggcccaatg gagagacaga aaccactaaa ggtgaaagca 660

aaagtccccg tcgtgaagga actcgagcac caccaccacc accactga 708

<210> 6

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

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Ala Asp Ile Gly Ser Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys

165 170 175

Pro Leu Lys Val Lys Ala Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Gly Gly Gly

180 185 190

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Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Val Pro Val

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225 230 235

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

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ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccatttc aatcccttcc cagaaggctg tgttgtactt tctcattgag 540

aagggccagc acgaagcagc aattgagttc ttcgagggta tggtccacga ctccatcaag 600

gaggagctcc ggcctctcga gcaccaccac caccaccact ga 642

<210> 8

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ala Val Leu Tyr

165 170 175

Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu

180 185 190

Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Glu His

195 200 205

His His His His His

210

<210> 9

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccatttc aatcccttcc cagaaggctg tgttgtactt tctcattgag 540

aagggccagc acgaagcagc aattgagttc ttcgagggta tggtccacga ctccatcaag 600

gaggagctcc ggcctctcat ccagcagacc tcgtttgtac aacgcgcctt caagcgcctg 660

aaggagaact ttgagattgt agctctgtgt ttaaccctct tggcaaacat agtgattatg 720

ctccgccaag cgcgcaagag acgccagtcg gtggatgacc cactggacgg cgacataact 780

cttggcgacg cggaaaagga ccctctggag gcgcgtggcg ctagcgctgt cggtttcaga 840

gagagaccac ccaccgagca agagacgtgc gaagacgcga acgctgagcc tgtcgtgctc 900

gggagggaac aaccgcgagc tgaactcgag caccaccacc accaccactg a 951

<210> 10

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ala Val Leu Tyr

165 170 175

Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu

180 185 190

Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln

195 200 205

Gln Thr Ser Phe Val Gln Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe

210 215 220

Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met

225 230 235 240

Leu Arg Gln Ala Arg Lys Arg Arg Gln Ser Val Asp Asp Pro Leu Asp

245 250 255

Gly Asp Ile Thr Leu Gly Asp Ala Glu Lys Asp Pro Leu Glu Ala Arg

260 265 270

Gly Ala Ser Ala Val Gly Phe Arg Glu Arg Pro Pro Thr Glu Gln Glu

275 280 285

Thr Cys Glu Asp Ala Asn Ala Glu Pro Val Val Leu Gly Arg Glu Gln

290 295 300

Pro Arg Ala Glu Leu Glu His His His His His His

305 310 315

Claims

1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为R1）、R2）或R3）的蛋白质：

R1）氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质，

R2）氨基酸序列是SEQ ID No.2的第166-282位的蛋白质，

R3）在R1）或R2）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有与R1）或R2）相同活性的可溶性融合蛋白。

2.制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述蛋白质；所述受体微生物为埃希氏菌属细菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌BL21（DE3）。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下任一所述的DNA分子：

1）编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子，

3）编码序列是SEQ ID No.1的第496-846位核苷酸的DNA分子。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组微生物为将pET32a-3AB1B2导入大肠杆菌BL21（DE3）得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21（DE3）/pET32a-3AB1B2，所述pET32a-3AB1B2是用核苷酸序列是SEQID No.1的第490-852位的DNA替换pET32a（+）的BamH I和XhoI识别位点间的片段，保持pET32a（+）的其它序列不变，得到的重组表达载体。

6.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：

B1）编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子，

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒，

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体，

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：所述重组载体为含有B2）所述表达盒的重组载体。

8.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：所述重组微生物为含有B2）所述表达盒的重组微生物。

9.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：所述重组微生物为含有B3）所述重组载体的重组微生物。

10.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下任一所述的DNA分子：

1）编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子，

3）编码序列是SEQ ID No.1的第496-846位核苷酸的DNA分子。

11.权利要求6-10中任一所述的生物材料在制备口蹄疫诊断抗原中的应用。