CN1858062A - 猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及口蹄疫病毒非结构蛋白3AB在大肠杆菌表达系统中的克隆和表达，及其表达产物在口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断方面的应用。利用本发明的检测试剂盒，可高效、特异性地对口蹄疫易感动物猪、牛等作感染与免疫抗体的鉴别诊断。本发明试剂盒特异性强，使用方便，价格低廉。

Description

猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及口蹄疫病毒非结构蛋白3AB在大肠杆菌表达系统中的克隆和表达，及其表达产物与其它相关试剂组成的试剂盒在口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断方面的应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是家畜和野生偶蹄动物的烈性传染病。一旦爆发则迅速传播，可引起大范围的易感动物感染发病，造成巨大的经济损失。自从Burrows(1966年)和Van Bekkum(1966年)等从临床健康牛的食道-咽部分泌物(O-P液)中分离出口蹄疫病毒以来，口蹄疫康复动物隐性带毒，可能成为口蹄疫爆发的潜在疫源的问题引起了世界各国的高度重视，并相继进行了大量研究。鉴于我国防制口蹄疫的主要措施是实行免疫接种，对牛、羊、猪等易感畜群每年定期注苗2-3次。因此，建立准确、快捷的区分感染活病毒(发病或注射弱毒疫苗)和注射灭活疫苗动物的诊断方法在检测和防制FMD的发生、活畜检疫等方面都是十分必要和迫切需要的。近年来，英、美、荷兰等国学者对口蹄疫病毒的非结构蛋白(NSP-)2C、3A、3B、3ABC等片段作了大量细致的研究，建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)，适用于鉴别诊断感染和注苗动物。

本研究采用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达口蹄疫非结构蛋白3AB，并以此重组蛋白作为检测抗原和阳性对照血清制备用抗原，制备ELISA检测试剂盒，用于猪/牛口蹄疫非结构蛋白抗体的检测，由检测结果判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。现已完成上万头份中试生产和推广，应用结果证明，试剂盒是有效的，可用于口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断。

本项目所研制的试剂盒被用于口蹄疫易感动物猪/牛的注苗与感染抗体的鉴别诊断，为我国防制并最终消灭口蹄疫提供技术保障，减少、甚至减除畜牧业生产因口蹄疫所带来的损失。同时，该项技术的使用，将全面提升我国畜牧业生产及加工产品的国际地位，加速我国畜牧业产品走向国际市场的进度。

另外，本项目所研制的试剂盒可望替代进口同类产品，为国家节省大量外汇，更重要的是一旦我们拥有自主知识产权，可使我国的口蹄疫诊断检疫技术达到世界先进水平。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的用于鉴别诊断口蹄疫注苗与感染动物的技术和相关试剂盒。

附图说明

图1显示了3AB基因RT-PCR扩增结果及重组载体pET3AB的双酶切结果。其中各泳道是：3AB的RT-PCR扩增产物(泳道4)，用BamH I和Hind III消化的pET3ABC(泳道2)，DNA标准物DL15000(泳道1，Takara公司)，DNA标准物DL2000(泳道3，Takara公司)。

图2显示了rNS-3AB融合蛋白IPTG诱导表达SDS-PAGE电泳(12％)，目的蛋白rNS-3AB纯化结果SDS-PAGE电泳(12％)，及免疫印迹反应结果。其中各泳道是：PET3AB未诱导(泳道1)，PET3AB IPTG诱导(泳道2，3，4，6)，蛋白分子量标准(泳道5，7，Biolabs)，PET3ABC表达产物纯化结果(泳道8，9，10)，Western印迹结果(泳道12)，一抗是FMDV感染的牛血清，二抗是偶联有辣根过氧化物酶的蛋白A/G(Pierce公司)，预染的蛋白质梯级标准物(泳道11，Gibco BRL公司)。

具体实施方式

本发明人经过多年深入而广泛的研究，已经成功构建了表达口蹄疫病毒非结构蛋白3AB的表达载体，该载体经转化大肠杆菌后，可得到表达3AB蛋白的重组表达菌株，且表达的目的蛋白rNS-3AB对宿主细胞无毒害，不影响细菌的正常繁殖。对表达的目的蛋白rNS-3AB经变性、纯化、复性处理后，得到的最终产物作为检测抗原，建立间接酶联免疫吸附法(I-ELISA)对口蹄疫感染与注苗动物进行鉴别诊断试验，已有的试验结果显示，本发明所获得的rNS-3AB蛋白可作为口蹄疫注苗与感染动物鉴别诊断的有效的、高特异性的检测抗原。在此基础上完成了本发明。

本发明的检测试剂盒，可对口蹄疫易感动物猪、牛等作鉴别诊断。该试剂盒特异性强，使用方便，价格低廉。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB表达和纯化

1.口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因序列的扩增

用上海生工试剂盒从细胞培养的猪、牛口蹄疫病毒中提取总RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。以提取得到的总RNA为模板，进行反转录PCR，反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，产品名：Reverse Transcriptase XL(AMV)。cDNA第一条链的合成引物为Oligo(dT)，目标cDNA的合成，引物由上海生工合成，引物序列：5’端引物：5’-GGATCCATCTCAATTCCTTCTC-3’，3’端引物：5’-AAGCTTCTCAGTGACAATCAGG-3’，设计引物时分别在5’端和3’端引入BamH I及Hind III酶切位点。PCR扩增按常规方法进行，1％Agarose凝胶电泳，观察结果。同时PCR产物送上海生工生物技术公司测序。

结果，以口蹄疫病毒基因组RNA为模板，RT-PCR扩增得到了3ABC DNA序列(图1)，序列长度约0.66kb，与文献报道长度一致。

2  pET3AB表达质粒的构建

2.1  T-3AB重组质粒的构建

3AB PCR扩增片段经1％低融点Agrose凝胶纯化后，与T载体连接。T载体购自上海生工生物技术服务有限公司，产品名：T-Vector PCR Product ClongingKit，连接酶为大连宝生物工程有限公司产品，产品名：DNA Ligation Kit Ver.2。重组质粒T-3AB转化DH5α宿主菌。抽提质粒(上海生工UNIQ-10柱离心式质粒抽提试剂盒)，BamH I/Hind III双酶切鉴定，同时进行测序(由上海生工测序部完成)。

结果，得到重组了T-3AB质粒，BamH I、Hind III双酶切鉴定确认重组载体中包含3AB片段。

2.2  pET3AB表达质粒的构建

载体pET32a及宿主菌BL21(DE3)plysS均购自Novagen公司。重组T-3AB质粒和载体pET32a分别用BamH I、Hind III双酶切，酶切产物3AB片段及载体pET32a酶切大片段经1％低融点Agrose凝胶纯化后连接，得到重组质粒pET3AB，转化宿主菌BL21(DE3)plysS，涂布含氨卞青霉素的LB平板，得到重组克隆菌落PET3AB。从重组菌落中提取质粒，BamH I/Hind III双酶切，1％ Agrose凝胶电泳鉴定，同时，由上海申友生物技术有限公司测序。

质粒酶切结果如图1所示。对测序结果进行计算机分析，表明重组3ABC序列与文献报道序列符合率大于90％，插入位置阅读框正确。

3.目的蛋白3AB的表达

克隆菌落在含100μg/mL氨苄青霉素的LB发酵液中培养，待OD值达到0.5左右时，加入IPTG诱导，IPTG浓度为1mmol/L，诱导时间3-4h，收菌后取少量样品SDS-PAGE电泳观察结果。

重组菌诱导表达产物经12％SDS-PAGE电泳确定，表达的融合蛋白分子量约为45KD(图2)。该目的蛋白被命名为rNS-3AB。其氨基酸序列与核酸序列如图3所示。

4.表达蛋白3AB的Western印迹鉴定

参照《分子克隆》中所述方法进行。电转移条件为100V电泳1小时，封闭液为5％脱脂奶粉，100mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，0.9％NaCl，0.1％Tween 20，一抗为口蹄疫病毒感染的牛血清，二抗为辣根过氧化物酶标记蛋白A/G，底物为DAB。

Western印迹检测表明，表达的蛋白能与口蹄疫病毒感染的动物血清发生免疫反应(图2)。

5.表达产物的纯化

发酵液经5000rpm，4℃，15分钟离心，去上清，沉淀用1/20发酵体积NTA0缓冲液(20mmol/L Tris.HCl，100mmol/L NaCl，10％甘油)悬浮，超声波处理，13500rpm，4℃，20分钟离心，去上清，沉淀用GuNTA0(含6M盐酸胍的NTA0)溶液溶解，4℃过夜变性。将Ni²⁺NTA柱与FPLC(高压液相层析)系统连接，用2至3倍体积NTA0平衡柱，上样，用NTA0洗柱至杂蛋白峰值为0时，在洗脱液中加入GuNTA500(含500mmol/L咪唑的GuNTA0)，使GuNTA500在洗脱液的比例为20-30％，洗脱目的蛋白rNS-3AB，当监视计算机屏幕上出现洗脱峰时收集洗脱液。洗脱液在4℃条件下透析复性。取小样SDS-PAGE检测。

表达产物rNS-3AB经Ni²⁺NTA柱纯化后(图2)，将纯化产物作为抗原，经间接ELISA检测实验结果证明，该蛋白可作为检测抗原，用于口蹄疫易感动物的注苗与感染动物的鉴别诊断。

实施例2

猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA检测方法的建立

1检测方法的建立

1.1检测方法

在本实施例中，应用实施例1中获得的口蹄疫病毒(FMDV)重组表达非结构蛋白rNS-3AB鉴别口蹄疫猪/牛感染动物与免疫动物，该方法为间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)。

1.2检测抗原的工作浓度

确定试剂盒ELISA板包被的纯化抗原蛋白rNS-3AB浓度为0.1μg/孔。

1.3非特异性反应的排除

利用基因重组技术获得的口蹄疫非结构蛋白rNS-3AB，经纯化的表达产物中仍有少量的载体蛋白及宿主菌蛋白。而大肠杆菌抗体普遍存在于动物血清中，因此，利用该表达产物作为诊断抗原，必然会引发非特异性反应。为了排除这些非特异性反应，选用阻断剂并作筛选试验。多次试验结果比较后确定：

(1)用3％明胶和5％脱脂奶粉封闭抗原包被孔。

(2)被检血清样品用如下稀释液稀释：0.01mol/L PBST(pH7.2～7.4)中含5％脱脂奶粉，0.1％12小时培养的大肠杆菌裂解产物。

1.4被检血清稀释浓度

被检血清用上述稀释液按1∶40稀释。

2检测结果

本试验结果以ELISA实验的OD值表示。

2.1阴性对照

使用无口蹄疫感染抗体的正常猪或牛血清作为试剂盒阴性对照血清。

2.2阳性对照

以rNS-3AB作为免疫原，免疫新西兰大耳兔，制备的高免血清作为试剂盒阳性对照血清。

2.3判断标准

按下列公式计算被检血清S/P值，并确定被检血清是否阳性。

S/P＝(X- N)/( P- N)

X：被检血清OD₄₅₀值； N：阴性血清算术平均值； P：阳性血清算术平均值。

2.4正常牛血清样品

未发病、未接种疫苗的猪、牛血清抗体，200份血清S/P值均小于0.10。

2.5FMDV感染血清样品

试验猪、牛经人工攻毒感染后1周至12个月，采集血清，该血清被作为阳性对照血清。检测结果显示，73份被检血清的S/P值均＞0.25。

2.6接种FMD灭活疫苗后的猪、牛血清

2000余份被检血清S/P值均小于0.25。

结果表明，本发明所提供的试剂盒，可用于对口蹄疫注苗与感染动物的鉴别诊断。该方法与VIAA-AGID(病毒感染相关抗原-琼脂糖凝胶免疫扩散试验)比较，特异性和灵敏性有明显提高。

实施例3

猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒组成

(1)ELISA板：重组rNS-3AB以0.1μg/孔包被ELISA板，用封闭液封闭(封闭液：PBS，pH7.2，含3％明胶，5％脱脂奶粉)；

(2)样品稀释液：12mL(PBS，pH7.2，其中含1％明胶，5％脱脂奶粉，0.1％大肠杆菌提取物)；

(3)酶结合物：200μL(蛋白A/G，用含50％甘油的PBS保存液以一定比例稀释)；酶结合物稀释液：12mL(PBS PBS，pH7.2)；

(4)TMB A液：6mL(TMB溶解于0.1mol/L柠檬酸缓冲液，终浓度0.2mg/mL，pH5.0)；

(5)TMB B液：6mL(过氧化氢尿溶解于0.1mol/L柠檬酸缓冲液，终浓度0.2％，pH5.0)；

(6)终止剂：12mL(2M H₂SO₄)。

实施例4

猪、牛口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒检测方法

(1)取出试剂盒中抗原包被板，和样品稀释液，将样品稀释液37℃孵育3～5分钟。

(2)每孔中加入100μL样品稀释液，A1、B1两孔中各加入5μL阴性对照血清，C1、D1两孔中各加入5μL阳性对照血清，其余各孔加入检测样品，每孔一个样品，5μL/孔。

(3)用封板膜封板后置37℃孵育60分钟(±1分钟)。

(4)洗涤工作液配制：按需要量，用去离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。

(5)用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔200～300μL，洗涤6次，拍干。

(6)酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。

(7)每孔加入100μL酶结合物工作液，用封板膜封板后置37℃孵育30分钟(±1分钟)。

(8)重复步骤1.9.5。

(9)TMB底物工作液配制：将TMB底物A液和TMB底物B液等量混合，现配现用。

(10)每孔加入100μL TMB底物工作液，37℃孵育15分钟。

(11)每孔加入100μL终止液，并轻轻振荡混匀。

(12)在15分钟内用酶标读数仪测定在450nm波长下的OD值。

本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。重组蛋白rNS-3AB的DNA序列和氨基酸序列如下：

----→Trx·TagTM硫氧还蛋白

atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat      48

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1               5                   10                  15

gta ctc aaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg      96

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

            20                  25                  30

tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac     144

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

        35                  40                  45

gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac     192

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

    50                  55                  60

cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg     240

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65                  70                  75                  80

ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct     288

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

                85                  90                  95

aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt     336

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

            100                 105                 110

               ----→His·Tag                         ----→凝血酶

tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca     384

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

        115                 120                 125

cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag     432

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

    130                 135                 140

                                ----→肠激酶

cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg     480

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145                 150                 155                 160

            BamH I----→3A

gct gat atc gga tcc atc tca att cct tct caa aag gct gtg ctg tac     528

Ala Asp Ile Gly Ser Ile Ser Ile Pro Ser Gln Lys Ala Val Leu Tyr

                165                 170                 175

ttt ctc att gag aag ggt cag cac gaa gca gca att gaa ttc ttt gag     576

Phe Leu Ile Glu Lys Gly Gln His Glu Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu

            180                 185                 190

ggg atg gtg cat gac tcc atc aag gag gag ctc cgg cct ctc atc caa     624

Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Glu Glu Leu Arg Pro Leu Ile Gln

        195                 200                 205

cag acc tca ttc gtg aag cgc gct ttt aag cgc ctg aag gaa aac ttt     672

Gln Thr Ser Phe Val Lys Arg Ala Phe Lys Arg Leu Lys Glu Asn Phe

    210                 215                 220

gag ata gtt gcc ctg tgt ttg act ctt ttg gca aac ata gtg atc atg     720

Glu Ile Val Ala Leu Cys Leu Thr Leu Leu Ala Asn Ile Val Ile Met

225                 230                 235                 240

cta cgc gaa gcg cgc aag agg cgc cag tca gtg gat gac tca ctg gat     768

Leu Arg Glu Ala Arg Lys Arg Arg Gln Ser Val Asp Asp Ser Leu Asp

                245                 250                 255

gac gac gcg gct ctt gac gat gcg gaa aag aac cct cta gag gcg agt     816

Asp Asp Ala Ala Leu Asp Asp Ala Glu Lys Asn Pro Leu Glu Ala Ser

            260                 265                 270

ggc gcc agc gcc gtt ggt ttc aga gag aga tcc ccc atc gag caa aag     864

Gly Ala Ser Ala Val Gly Phe Arg Glu Arg Ser Pro Ile Glu Gln Lys

        275                 280                 285

acg tgc gac gac gtg aac act gag ccc gtt gtg ccc ggg agg gaa caa    912

Thr Cys Asp Asp Val Asn Thr Glu Pro Val Val Pro Gly Arg Glu Gln

    290                 295                 300

               ----→3B

ccg cga gct gaa gga ccc tac gcc ggg cca ctc gaa cgt cag aaa cct    960

Pro Arg Ala Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro

305                 310                 315                 320

ctt aaa gtg aaa gcc agg ttg cca caa caa gag gga cct tac gcc ggt   1008

Leu Lys Val Lys Ala Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly

                325                 330                 335

ccc atg gag cgg cag aaa ccg ctg aaa gtg aaa gca aaa gcc ccc gtc   1056

Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val

            340                 345                 350

gtg aag gaa gga ccc tac gag ggg ccg gtg aaa aag cct gtc gct ttg   1104

Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu

        355                 360                 365

                                            Hind III

aaa gtg aaa gca aag aac ttg att gtc act gag aag ctt gtc gag aag   1152

Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Lys Leu Val Glu Lys

    370                 375                 380

tac tag

Tyr*

385

Claims (10)

1.一种蛋白，其特征在于，它包含3所示的氨基酸序列。

2.一种DNA序列，其特征在于，它编码包含3所示氨基酸序列的蛋白。

3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，它包含3所述的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的DNA序列。

5.一种生物工程菌，其特征在于，它含有权利要求4所述的表达载体。

6.如权利要求5所述的生物工程菌，其特征在于，它是大肠杆菌。

7.一种产生蛋白质的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的生物工程菌；

(b)从培养物中分离出表达蛋白，所述的表达蛋白包含说明书所示的氨基酸序列。

8.一种检测口蹄疫的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的蛋白。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，它还含有阳性对照、阴性对照及其它相关试剂。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，可用于对口蹄疫注苗与感染动物(猪或牛)的鉴别诊断。

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