CN1786165A

CN1786165A - 重组金黄色葡萄球菌肠毒素c2的制备方法

Info

Publication number: CN1786165A
Application number: CN 200510061253
Authority: CN
Inventors: 陈枢青; 应跃斌; 薛乔; 李丹曦
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-10-25
Filing date: 2005-10-25
Publication date: 2006-06-14

Abstract

本发明提供重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的制备方法，通过以下步骤实现：SEC2基因的扩增制备；SEC2基因与原核表达质粒的连接；重组质粒转化至表达宿主进行高效表达；重组SEC2的纯化。本发明方法对重组SEC2进行了高效表达，表达强度占全菌蛋白的20％左右，且为可溶性表达，不产生包涵体，便于后续分离纯化。本发明方法具有步骤简单，纯化速度快的特点；纯化产物的纯度比离子交换层析或分子筛层析等方法所得到的产物都要高。融合蛋白经肠激酶高效切割后，所得到的重组蛋白与相应的天然蛋白相比，具有相似的超抗原活性和免疫学活性。

Description

重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程手段制备重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的方法，具体的说，涉及利用来源于金黄色葡萄球菌的SEC2基因与一种质粒载体重组，并将其转化于表达宿主，表达并分离纯化重组SEC2的方法。

背景技术

超抗原(Superantigen，SAg)是一组细菌或病毒编码的蛋白分子，可不需要经抗原提呈细胞(APC)处理，以完整的蛋白质分子形式直接与APC膜上的MHCII分子抗原结合槽外侧结合；并且超抗原与大多数MHC II类分子的等位基因产物结合，而不象普通抗原仅与有限的特异性的MHC II类等位基因产物结合，导致带有特异性V_β节段T细胞大量活化增殖，其活化的T细胞数是普通抗原的数千倍乃至数万倍。

被SAg激活的CD₈阳性的抑制性T细胞/细胞毒T细胞和CD₄阳性的辅助性/杀伤性T细胞产生SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用。细胞毒T细胞与MHC-II类分子阳性的肿瘤细胞相偶联后产生“TCR-V_β-超抗原-MHC-II类分子”三分子结合物，产生强烈的杀瘤作用，而杀伤性T细胞具有直接杀伤表达MHC-II类分子的肿瘤细胞的功能。超抗原活化的CD₄ ⁺T细胞能分泌多种且足量的细胞因子，包括TNF-α、TNF-β、INF-γ、IL-2、IL-6和IL-12等，它们不仅直接或间接地杀伤肿瘤细胞，而且可以增加肿瘤细胞表达MHC抗原分子，增强癌细胞刺激宿主免疫系统的能力，另一方面，这些细胞因子又刺激T细胞进一步增殖分化，而增殖分化的T细胞又将产生更多的细胞因子与细胞毒作用共同导致肿瘤细胞的破坏溶解。体外和临床研究均证实SAg在治疗肿瘤的应用中具有非常良好的前景。

目前研究与应用的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)，它有多个血清型，分别是A型(SEA)、B型(SEB)、C1型(SEC1)、C2型(SEC2)、C3型(SEC3)、D型(SED)、E型(SEE)、G型(SEG)、H型(SEH)、I型(SEI)、M型(SEM)、N型(SEN)、O型(SEO)和毒性休克综合症1型毒素(TSST-1)、毒性休克综合症2型毒素(TSST-2)等。其中的SEA、SEB、SECs是研究的热点，并且已有临床用药被确证其主要作用成分为SECs。

常规获得葡萄球菌肠毒素超抗原的方法是从金葡菌发酵液中提取，包括产毒培养和分离纯化两个步骤。但由于天然毒素产毒量低(多低于100微克/毫升)，发酵液中存在大量杂质等原因，后期纯化步骤复杂，难以得到大量纯品。已经有人利用基因工程手段制备葡萄球菌肠毒素超抗原，如姜永强等将SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220中，在大肠杆菌中经热激诱导获得表达，但是这些方法中纯化步骤均采用了离子交换的方法，存在吸附选择特异性差的弱点。徐明恺等将SEC2基因克隆至pET-28a中表达，但表达的重组产物比天然蛋白多出36个氨基酸，抗原决定簇变化的可能性及产物活性改变的可能性均较大。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程手段制备重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的方法：将目标蛋白融合了GST亲和标签，并在工程菌内高效表达，利用亲和方法纯化该目标重组蛋白，使得目标重组蛋白在量与纯度两方面都有了很大的提高。重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2具有序列标志符6的蛋白质氨基酸序列及相应的核苷酸序列。

本发明方法通过以下步骤实现：

(1)先通过设计引物：5’-aca ccc aac gta tta gca gag ag-3’和5’-ggc aagcac cga agt act tac ct-3’，提取金黄色葡萄球菌FRI 1230基因组作为模板，按照常规方法进行PCR扩增，获得超抗原重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因的DNA片段，将其连入pGEM-T质粒载体，构建成功pGEM-SEC2质粒。基因测序表明所获得的目的基因与GenBank数据库中的相同蛋白基因(登记号：AY450554)比较有1个碱基差异：No.6T＞C。该差异不影响氨基酸序列。

(2)设计一对分别带有EcoR I和Xho I酶切位点的引物：5’-gta gaa ttc gagagc caa cca gac cc-3’和5’-gga ctc gag tta tcc att att tgt tgt a-3’，以pGEM-SEC2质粒为模板做PCR扩增，获得一条末端带有酶切位点的SEC2基因，将该基因片段用相应内切酶切割后连接至用相同内切酶处理后的pGEX-4T-1构成表达质粒pGEX-4T-SEC2，将此表达质粒转化大肠杆菌，按照常规方法进行诱导表达，收获并重悬菌体，破碎之，离心收集上清。

(3)将由pGEX-4T-SEC2作为载体而获得的破碎菌体上清与含有能特异结合GST的亲和填料充分混合，用洗脱液洗脱并收集相应蛋白峰，将该收集到的产物与凝血酶在合适温度下充分反应，反应后的混合物再次与能特异结合GST的亲和填料充分混合，分离并收集液体，取样进行蛋白质电泳，获得电泳纯的纯化产物，将该纯化产物脱盐后冷冻干燥即得重组SEC2冻干粉。

本发明方法的特点是：(1)使用含有由pGEX-4T-1和序列标志符5所示核苷酸构建而成的表达质粒的工程菌，表达产物带有GST标签，并使用含有能特异结合GST的亲和填料来纯化该产物；(2)提供了一种含有SEC2基因的重组表达质粒pGEX-4T-SEC2，该质粒由pGEX-4T-1和序列标志符5所示核苷酸融合构建而成，可转化于合适的表达宿主，它含有强启动子，在诱导剂诱导下可高效表达带有GST标签的重组SEC2，见图5；(3)提供了一种工程菌，该菌株含有由pGEX-4T-1和序列标志符5所示核苷酸构建而成的表达质粒pGEX-4T-SEC2，在合适的诱导剂作用下可高效表达带有GST标签的重组SEC2；(4)提供了一种重组SEC2，该蛋白质在未被凝血酶切割前带有GST标签，适合亲和纯化，经凝血酶处理后的该蛋白质氨基酸序列及相应的核苷酸序列见序列标志符6所示序列(见序列表)，与相应的天然蛋白相比，该重组蛋白在N端多出5个氨基酸残基。

本发明方法对重组SEC2进行了高效表达，表达强度占全菌蛋白的20％左右，且为可溶性表达，不产生包涵体，便于后续分离纯化。本发明方法采用亲和层析对目的蛋白进行纯化，具有步骤简单，纯化速度快的特点；由于亲和层析的原理是层析填料上的活性基团只与目的蛋白结合，所以纯化产物的纯度比离子交换层析或分子筛层析等方法所得到的产物都要高。融合蛋白经肠激酶高效切割后，所得到的重组蛋白与相应的天然蛋白相比，只在N端多出5个氨基酸，经体外刺激脾淋巴细胞增殖实验和体外肿瘤杀伤实验，均证明本目的蛋白具有典型的超抗原活性。

在本说明书上下文中，除非特别指明，否则所引用的任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明的实验方法是按照常规实验方法进行或按照供应商所建议的操作说明进行。

附图说明

图1为PCR扩增所得SEC2基因琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1：核酸Marker；泳道2：SEC2基因PCR产物。

图2为PCR扩增后所测SEC2基因序列图。

图3为pGEX-4T-SEC2质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1：核酸Marker；泳道2：pGEX-4T-SEC2双酶切产物。

图4为pGEX-4T-SEC2质粒示意图(重组SEC2表达质粒构建图谱)。

图5为克隆至pGEX-4T-1后的重组SEC2核苷酸及氨基酸序列。

图6为重组SEC2在BL21中诱导表达SDS-PAGE电泳图，其中泳道1：未经诱导的表达菌体总蛋白；泳道2：经诱导的表达菌体总蛋白；泳道3：经诱导的表达菌体破碎后的上清蛋白溶液；泳道4：经诱导的表达菌体破碎后的蛋白沉淀；泳道5：蛋白质Marker。

图7为重组SEC2纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1：蛋白质Marker；泳道2：纯化后的GST-SEC2融合蛋白；泳道3：Thrombin切割后的GST、SEC2混合溶液；泳道4：纯化后的重组SEC2。

图8为重组SEC2对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用(48h)，与空白对照组相比：^***：P＜0.001，^*：P＜0.05。

图9为重组SEC2对瘤细胞K562的抑制作用(48h)，与空白对照组相比：^***：P＜0.001。

图10为重组SEC2对瘤细胞B16的抑制作用(48h)，与空白对照组相比：^***：P＜0.001。

具体实施方式

以下实施例提供了实现本发明的优选实施方案。本领域技术人员可以理解的是，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。下面的实施例中所公开的技术表示由本发明人所发现的技术，这些技术能有效实施本发明。不过，本领域技术人员可以理解，在不超出本发明的构思的前提下，可以对这些具体实施方案进行多种改变，仍然能获得相似或类似的结果。

实施例1：含重组SEC2基因的表达质粒pGEX-4T-SEC2的构建

SEC2基因序列的PCR扩增：设计如下一对引物序列，上游引物5’-aca cccaac gta tta gca gag ag-3’，下游引物5’-ggc aag cac cga agt act tac ct-3’。以Shphylococcus aureus FRI 1230全菌基因组作为模板，按照常规方法进行PCR扩增，扩增获得792bp的DNA片段，参见图1。

含重组SEC2基因的pGEM-T-SEC2质粒的构建：将PCR扩增所得的DNA片段克隆入pGEM-T质粒，转化至大肠杆菌DH5α中扩增。提取该重组质粒，Nde I酶切鉴定后送测序，结果显示该序列与GenBank数据库中的相同蛋白基因(登记号：AY450554)比较有一个碱基差异：No.6T＞C，该差异不影响蛋白质序列。该基因测序结果参见图2。

含内切酶位点的SEC2基因序列的PCR扩增：设计如下一对引物序列，上游引物5’-gta gaa ttc gag agc caa cca gac cc-3’，下游引物5’-gga ctc gag ttatcc att att tgt tgt a-3’。以含重组SEC2基因的pGEM-T-SEC2质粒作为模板，按照常规方法进行PCR扩增，扩增获得738bp的DNA片段。

含重组SEC2基因的pGEX-4T-SEC2表达质粒的构建：用EcoR I和Xho I分别酶切PCR所得DNA片段和pGEX-4T-1质粒。回收各自酶切产物的大片段，并将两者连接，成功构建了表达质粒pGEX-4T-SEC2。将该重组质粒转入大肠杆菌DH5α中扩增并提取，用EcoR I和Xho I酶切鉴定，结果表明目的基因已插入载体质粒，参见图3。pGEX-4T-SEC2质粒示意图参见图4；目的基因在pGEX-4T-SEC2质粒上的详细序列参见图5。

实施例2：重组SEC2的表达

重组SEC2表达菌株的构建：提取pGEX-4T-SEC2表达质粒并将其转化至大肠杆菌BL21中，构建成功一株可以诱导表达SEC2的工程菌。

重组SEC2的表达：从斜面上挑取上述工程菌单菌落接种于10ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养6h，作为种子液。将该种子液以1-5％的接种量接种于含氨苄青霉素的2×YT培养基中，37℃振荡培养4h，按0.01％-0.1％的体积比加入0.1mol/L IPTG诱导表达4h。

实施例3：重组SEC2的纯化

样品的预处理：将收获的菌液在4℃下10000rpm离心15min，弃去上清。沉淀用10倍于湿菌体量的PBS重悬后置FRENCH细胞破碎仪中，于700psi下破碎至粘稠状。于匀浆中加入少量DNase，4℃保温30～60min，或用超声破碎仪处理使核酸降解，体系粘度降低。再加入1％体积量的20％Triton X-100，混匀，冰上放置30min。菌体裂解液在4℃下15000rpm离心10min，吸取上清，低温保存待用。取样用SDS-PAGE检验，在60000分子量左右有一很浓的条带，通过Qauntity One软件分析，该蛋白占菌体总蛋白的20％左右，参见图6。

融合蛋白的纯化：取1ml处理好的蛋白溶液，用0.45μm膜过滤后上样至预平衡的1ml Sepharose 4B柱子中，轻轻混匀，结合30min后放去液体。用1mlPBS冲洗柱子3次，再加入0.2ml洗脱液，轻轻混匀。反应20min后收集蛋白溶液，用紫外分光光度计测蛋白浓度。重复上步的洗脱直至蛋白浓度低于0.1mg/ml停止收集，结果显示各洗脱液中蛋白浓度呈正态分布。将各收集组分上SDS-PAGE检验纯度与浓度，为单一条带，参见图7。

融合蛋白的切割：将上步纯化收集物中浓度的各组分合并，每1ml蛋白溶液加入0.6mol/L的NaCl缓冲液0.5ml，10mmol/L的CaCl₂缓冲液0.5ml，20mg/ml凝血酶5μl-10μl，25℃反应24h，取样电泳，检测反应程度，见图7。

重组SEC2的纯化：将反应完全的蛋白溶液于10000截留分子量的透析袋中对PBS透析过夜，或超滤换液法将酶切反应体系置换成PBS。上样1ml至预平衡的Sepharose 4B柱子中，轻轻混匀，结合20min后收集液体。SDS-PAGE检验纯度与浓度。结果显示切下的GST已被去除，在30000分子量左右有单一条带，参见图7。将纯化后的蛋白溶液脱盐后冻干保存。

实施例4：MTT法测定重组SEC2对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用

以ICR小鼠的脾淋巴细胞为靶细胞，将其悬浮于含10％小牛血清的RPMIM1640培养液中，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，每孔100μl铺于96孔板中，设调零孔(仅含培养基)、空白孔(脾淋巴细胞+培养基)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+五个不同浓度梯度的重组SEC2)，每种设四个复孔。其中，Con A终浓度为10μg/ml，重组SEC2终浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml。于铺板后44h在待测孔中加入10μl/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培养箱中继续培养4h后，小心吸除上清，并加入120μl/孔的DMSO，吹打助溶后培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，作图分析作用肠毒素对淋巴细胞的增殖作用，并用student t检验做统计分析。

各孔的吸光度与对照组相比，阳性对照Con A和0.1-1μg/ml重组SEC2在作用48h后小鼠脾淋巴细胞均有极显著增加(P＜0.05)，0.001μg/ml和0.01μg/ml重组SEC2在作用48h后小鼠脾淋巴细胞有显著增加(P＜0.05)，同时随着药物浓度的增加作用效果也更显著，参见图8。

实施例5：MTT法测定重组SEC2的体外抑瘤活性

设调零孔(仅含培养基)、肿瘤细胞对照孔(培养基+肿瘤细胞)、淋巴细胞本底释放孔[含空白孔(培养基+脾淋巴细胞)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+Con A)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+五个不同浓度梯度的重组SEC2)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞)、阳性对照孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞+ConA)和实验孔(培养基+脾淋巴细胞+肿瘤细胞+五个不同浓度梯度的重组SEC2)]，每种设三个复孔。其中，ConA终浓度为10μg/ml，重组SEC2终浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml，本底释放孔中5×10⁶个/ml脾淋巴细胞以100μl/孔加入，肿瘤作用孔中5×10⁶个/ml脾淋巴细胞和2.5×10⁵个/ml B16/K562肿瘤细胞的混合悬液以100μl/孔加入到实验孔中，最后按实验中加药要求用10％FCSRPMI 1640培养基稀释药物至要求浓度，50μl/孔加入各孔，并小心吹打混匀。

铺板后44h在待测孔中加入15μl/孔的MTT溶液，小心吹打混匀后，培养箱中继续培养4h后，小心吸除上清，并加入120μl/孔的DMSO，吹打助溶后培养箱中放置10min，酶标仪双波长法(570nm为测定波长，630nm为参考波长)测定各孔OD570nm-OD630nm值，仅含培养基的调零孔调零。按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴细胞本底释放孔)/肿瘤细胞对照孔]×100，作图分析作用肠毒素对肿瘤细胞的抑制作用，并用student t检验做统计分析。

MTT法测定rSEC2体外抑瘤活性实验(各三只小鼠)，重组SEC2以B16、K562作靶细胞，与不加药的抑瘤空白对照孔相比，阳性对照Con A和0.001-10μg/ml的肠毒素在作用48h后抑瘤率均有极显著的增高(P＜0.001＝，同时随着药物浓度的增加作用效果也更显著参见图9、图10。

序列表

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>从金黄色葡萄球菌基因组中克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因所用的上游引物

<440>1 aca ccc aac gta tta gca gag ag

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>从金黄色葡萄球菌基因组中克隆金黄色葡萄球菌肠毒索C2基因所用的下游引物

<440>2 ggc aag cac cga agt act tac ct

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>向金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因两端添加酶切位点所用的上游引物

<440>3 gta gaa ttc gag agc caa cca gac cc

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>向金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因两端添加酶切位点所用的下游引物

<440>4 gga ctc gag tta tcc att att tgt tgt a

<210>5

<211>717

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(717)

<223>克隆所得金黄色葡萄球菌肠毒素C2

<440>5

gag agc caa cca gac cct acg cca gat gag ttg cac aaa gcg agt 45

Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ala Ser

1 5 10 15

aaa ttc act ggt ttg atg gaa aat atg aaa gtt tta tat gat gat 90

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp

20 25 30

cat tat gta tca gca act aaa gtt aag tct gta gat aaa ttt ttg 135

His Tyr Val Ser Ala Thr Lys Val Lys Ser Val Asp Lys Phe Leu

35 40 45

gca cat gat tta att tat aac att agt gat aaa aaa ctg aaa aat 180

Ala His Asp Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn

50 55 60

tat gac aaa gtg aaa aca gag tta tta aat gaa ggt tta gca aag 225

Tyr Asp Lys Val Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Ala Lys

65 70 75

aag tac aaa gat gaa gta gtt gat gtg tat gga tca aat tac tat 270

Lys Tyr Lys Asp Glu Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr

80 85 90

gta aac tgc tat ttt tca tcc aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca 315

Val Asn Cys Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr

95 100 105

ggt ggc aaa act tgt atg tat gga gga ata aca aaa cat gaa gga 360

Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly

110 115 120

aac cac ttt gat aat ggg aac tta caa aat gta ctt ata aga gtt 405

Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu Gln Asn Val Leu Ile Arg Val

125 130 135

tat gaa aat aaa aga aac aca att tct ttt gaa gtg caa act gat 450

Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser Phe Glu Val Gln Thr Asp

140 145 150

aag aaa agt gta aca gct caa gaa cta gac ata aaa gct agg aat 495

Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Ile Lys Ala Arg Asn

155 160 165

ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt aac agt tca cca 540

Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro

170 175 180

tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac ggc aat act 585

Thr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn Gly Asn Thr

185 190 195

ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc gat aag ttt gac caa 630

Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gln

200 205 210

tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat tct 675

Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp Ser

215 220 225

aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca aag aat gga 717

Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly

230 235

<210>6

<211>732

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(732)

<223>含表达凝血酶酶切位点序列的重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2

<440>6

gga tcc ccg gaa ttc gag agc caa cca gac cct acg cca gat gag 45

Gly Ser Pro Glu Phe Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu

1 5 10 15

ttg cac aaa gcg agt aaa ttc act ggt ttg atg gaa aat atg aaa 90

Leu His Lys Ala Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys

20 25 30

gtt tta tat gat gac cat tat gta tca gca act aaa gtt aag tct 135

Val Leu Tyr Asp Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Lys Val Lys Ser

35 40 45

gta gat aaa ttt ttg gca cat gat tta att tat aac att agt gat 180

Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp

50 55 60

aaa aaa ctg aaa aat tat gac aaa gtg aaa aca gag tta tta aat 225

Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val Lys Thr Glu Leu Leu Asn

65 70 75

gaa ggt tta gca aag aag tac aaa gat gaa gta gtt gat gtg tat 270

Glu Gly Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu Val Val Asp Val Tyr

80 85 90

gga tca aat tac tat gta aac tgc tat ttt tca tcc aaa gat aat 315

Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Asn

95 100 105

gta ggt aaa gtt aca ggt ggc aaa act tgt atg tat gga gga ata 360

Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Ile

110 115 120

aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta caa aat 405

Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu Gln Asn

125 130 135

gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct ttt 450

Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser Phe

140 145 150

gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca gct caa gaa cta gac 495

Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp

155 160 165

ata aaa gct agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag 540

Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu

170 175 180

ttt aac agt tca cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa 585

Phe Asn Ser Ser Pro Thr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu

185 190 195

aat aac ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc 630

Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly

200 205 210

gat aag ttt aac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat 675

Asp Lys Phe Asn Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn

215 220 225

aaa acg gtt gat tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca 720

Lys Thr Val Asp Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr

230 235 240

aca aag aat gga 732

Thr Lys Asn Gly

Claims

1.重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备方法，其特征在于：从金黄色葡萄球菌FRI 1230菌株中PCR扩增得到表达SEC2的基因片断，将该基因片断通过PCR添加酶切位点后克隆至pGEX-4T-1质粒，再将该重组质粒转化至合适的大肠杆菌表达宿主，使重组SEC2在分泌之初带有谷胱甘肽转移酶标签，并使用亲和填料纯化该目标重组蛋白，具有SEQ NO 6的蛋白质氨基酸序列及相应的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备方法，其特征在于：其中扩增金黄色葡萄球菌肠毒素C2的基因所用的上下游引物分别为：5’-aca ccc aac gta tta gca gag ag-3’和5’-ggc aag cac cga agt act tac ct-3’。

3.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备方法，其特征在于：其中添加酶切位点所用的上下游引物分别为：5’-gta gaa ttc gag agccaa cca gac cc-3’和5’-gga ctc gag tta tcc att att tgt tgt a-3’。

4.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备方法，其特征在于：合适的大肠杆菌表达宿主是指适合pGEX-4T-1质粒表达的大肠杆菌表达宿主，优选大肠杆菌BL21。

5.根据权利要求1所述的重组金黄色葡萄球菌肠毒素C2的制备方法，其特征在于：其中的亲和填料是指能特异结合GST的亲和填料，优选偶联有谷胱甘肽的Sepharose 4B。