CN102762739A - 肽的高效生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产肽的方法和由此生产的肽。与现有技术方法生产肽相比，根据本发明生产肽可以更高效。本发明的生产方法具有产率、纯度和/或价格上的优势。还公开了营销肽的方法。

Description

肽的高效生产

与相关申请的交叉引用

本申请要求2009年11月9日提交的美国临时申请61/259,367的优先权，该临时申请的完整内容在此全部引用作为参考。

技术领域

本发明涉及肽的生产方法及由此生产的肽。与现有技术方法生产肽相比，根据本发明生产肽可以更高效。本发明的生产方法具有产率、纯度和/或价格上的优势。还公开了营销肽的方法。

背景技术

肽在基础研究及临床实践中变得越来越有用。对肽的兴趣可归因于它们在许多生物途径中作为介质的作用以及它们独特的固有性质。例如，许多肽对于其靶标具有高度特异性，而与非靶标分子的非特异性结合低，因而药物-药物相互作用最小化，而且许多肽显示随时间推移在组织中的积累很少，因而减少了副作用。而且，肽通常在体内分解为构成它们的氨基酸，从而减少了有毒代谢中间产物带来的并发症的危险。

肽的市场价值在生命科学领域通常可归为五大类：细胞因子、酶、激素、单克隆抗体和疫苗。根据2008年的Frost&Sullivan市场调查报告，这些大类在美国可进一步细分为疫苗(34％)、单克隆抗体(30％)、重组激素和蛋白质(10％)、基因治疗(6％)、细胞治疗(4％)、反义(3％)、干扰素(3％)、白介素(2％)、生长因子(1％)以及其它(7％)。这些类别的每一项都保持高速增长。例如，从2004年至2007年，仅单克隆抗体市场一项其收益就几乎翻倍，从63亿美元增加至126亿美元。另外，几项新产品，包括

(艾塞那肽LAR，用于治疗糖尿病；Amylin/Eli Lilly)、

(干扰素β-1b，用于治疗多发性硬化症；Novartis)以及Simponi^TM(戈利木单抗，用于治疗类风湿和银屑病关节炎；Centocor)，最近已被FDA批准。

此外，肽市场很有可能会继续增长。例如，在2008年开发的633种药物中，几乎一半是肽。分析师估计未来五年的混合年增长率为百分之八，使得2013年的收益可能达到200亿美元，这几乎占了预测的生物医药市场总收益的百分之十五。肽作为基础研究及诊断平台的试剂也存在更多的机会。

虽然肽科学领域的进步已经导致了令人瞩目的商业增长，但仍有几项障碍需要克服。例如，与传统小分子治疗剂相比，肽常常具有递送和稳定性的问题。为解决这些问题，尝试了包括经口、经鼻及肺部的递送。然而，这些尝试通常需要更高的肽剂量或者会产生不希望的药物代谢动力学特征。

增加肽应用的一个最大的障碍是肽本身的成本，它通常比生产小分子治疗剂的成本高的多。例如，Nutropin

是由Genentech生产的一种形式的重组人生长激素，用来给予青春期生长缺陷的患者，其花费为每年30,000美元。当肽用于研究目的时，高价格成为获得肽的更大障碍。例如，β-淀粉样蛋白(1-42)肽是一种研究用肽，它与阿尔茨海默病的发病强烈相关。一项对各个肽生产商的价格调查表明，研究级别的β-淀粉样蛋白(1-42)的价格区间从$225/mg(21st CenturyBiochemicals)至$1,490/mg(Sigma-Aldrich)，其中普遍价格为$300-$320/mg(AnaSpec，California Peptide，Innovagen，rPeptide)(2009年估计价格取自商品目录)。

由于肽的重要性及其高价格，一直以来都存在期盼已久但尚未满足的降低肽成本的需要。肽的工业及医药应用产生了对改进生产及纯化手段的需要，这些改进可以是效率、价格和/或产品质量的改进。因此，本发明涉及肽的生产方法，以及生产的肽。也公开了营销肽的方法。

发明内容

在多个实施方案中，本发明涉及生产目标肽的方法。根据本发明的方法，生产包含亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合肽，其后，该融合肽与亲和材料结合，裂解该融合肽以释放出目标肽；从亲和材料上移除目标肽。通常，在融合肽与亲和材料结合后，洗涤亲和材料以去除未结合的物质。此外，在从亲和材料上移除目标肽之后，目标肽可进一步修饰或包装以供分发。

对目标肽没有限制，可包括多种肽。例如，在多个实施方案中，所述目标肽选自由淀粉样蛋白β、降钙素、恩夫韦肽、依泊汀、依泊汀δ、红细胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖脑苷脂酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、胰岛素、胰岛素A、胰岛素B、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、干扰素、利拉鲁肽、促生长素抑制素、特立帕肽和组织纤溶酶原激活物(TPA)组成的组。在多个实施方案中，目标肽选自淀粉样蛋白β、恩夫韦肽、艾塞纳肽、胰岛素和特立帕肽。

融合肽可通过多种方法生产。在一个实施方案中，该融合肽在细菌表达系统例如大肠杆菌表达系统中产生。在替代实施方案中，表达系统是酵母表达系统或哺乳动物表达系统。

在多个实施方案中，根据本发明的融合肽进一步含有包涵体指引肽。在这样的实施方案中，在融合肽与亲和材料结合之前，可通过将包涵体与表达系统中细胞的其余部分分离而从表达系统中分离该融合肽。在最初的分离之后，可溶解融合肽以便进一步处理。在多个实施方案中，该包涵体指引肽选自：为类固醇异构酶(ketosteroidisomerase)的包涵体指引肽、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段、或BRCA2的包涵体指引功能同系物。

在多个实施方案中，亲和标记物选自由聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸组成的组。此外，可裂解标记物可选自由Trp、His-Met、Pro-Met以及非天然氨基酸组成的组。在融合肽含有一个以上的可裂解标记物时，各个可裂解标记物可以是正交的(orthogonal)，也就是说，它们对于任一特定的裂解剂有着不同的反应性。在多个实施方案中，裂解步骤由选自由NBS、NCS和Pd(H₂O)₄组成的组的试剂执行。

根据本发明的方法还涉及评估目标肽的商业市场，包括：a)根据本文描述的方法生产目标肽；b)使样品量的目标肽可无成本或以最低成本获得；以及c)测量在一段时间内对目标肽的需求数量。

除以上方法之外，本发明还涉及根据本发明生产的目标肽，尤其是纯度大于99％的目标肽。另外，还涉及在根据本发明生产目标肽的表达系统中使用的载体。例如，根据本发明的载体可以包含编码亲和标记物的核苷酸序列；编码可裂解标记物的核苷酸序列；以及编码目标肽的核苷酸序列；其中这些核苷酸以可操作的组合排列，进一步地其中该可操作组合表达产生含有亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合蛋白。本发明另外的实施方案涉及包含本文所述载体的细胞以及根据本文所述方法生产的融合蛋白。

附图说明

本发明的各种特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考以下阐述，利用本发明原理的说明性实施方案的详述和附图，将获得对本发明的特征及优势的更好的理解，在附图中：

图1显示修饰形式的商业可得的pET-19b载体(pET-19bmhb1)。这样的载体可用来生产在两侧有两个NcoI限制酶切位点的KSI序列和在两侧有两个XhoI限制酶切位点的组氨酸标记物-色氨酸-β-淀粉样蛋白(1-42)序列。

图2显示通过添加L-阿拉伯糖激活商业可得的pBAD启动子的转录。阿拉伯糖与AraC(图中为“C”)结合，并使蛋白质释放O₂位点并与紧邻I₁位点的I₂位点结合。这释放出DNA环并使得转录开始。第二水平的控制存在于cAMP激活蛋白(CAP)-cAMP复合物中，该复合物与DNA结合并刺激AraC与I₁和I₂的结合。基础表达水平可通过向生长培养基中引入葡萄糖来抑制，这降低了cAMP水平并因此降低了CAP的结合，从而降低了转录激活。

图3显示在诱导前及诱导后2、4、6和16小时，从细胞培养物中采集的样品的凝胶电泳的典型数据。当诱导培养物并生长过夜时发生最佳的融合蛋白合成。

图4A-D显示类固醇异构酶的氨基酸序列的四个实施方案。

图5显示类固醇异构酶的核酸序列的一个实施方案。

图6显示通过对用高功率超声处理裂解的细胞进行凝胶电泳来制备包涵体的各阶段的典型数据。裂解的物质用一系列含有不同浓度的Tris、NaCl、PMSF、Triton-X100和尿素的缓冲液洗涤并收集上清液。21kD带在连续步骤过程中消失及21kD带在溶解包涵体后重现(泳道10)，表明包涵体已被正确制备。

图7显示与蛋白质上6×His标记物结合的固定化Ni-NTA树脂的一个实施方案。

图8显示在Ni-NTA亲和色谱之后的凝胶电泳的典型数据。将包涵体上样至已平衡的Ni-NTA柱上，用同样的缓冲溶液冲洗，并收集流通液(泳道1)。该柱体然后用50％EtOH冲洗，以使得它与裂解缓冲液平衡(泳道2)。用3×NBS在室温进行30分钟柱上裂解，并收集流通液(泳道3)。用300mM咪唑冲洗柱体，以洗掉所有剩下的融合蛋白并收集流通液(泳道4)。

图9显示用NBS(N-溴代琥珀酰亚胺)选择性裂解色氨酸肽键的一种可能的机理。根据该机理，活化溴离子将色氨酸残基的吲哚环卤化，接着通过一系列水解反应自发脱卤化。这些反应导致可促进分裂反应的羟吲哚衍生物的形成。在图9中，Z-Trp-Y在Trp残基的羧基端裂解，以获得修饰的Z-Trp和在Y上的自由氨基(即H₂N-Y).

图10显示9个不同NBS裂解反应的凝胶电泳的典型数据。进行反应，将样品在18％丙烯酰胺凝胶上电泳并进行银染色。泳道(1)：包涵体储备液；泳道(2)：0×NBS，0分钟；泳道(3)：1×NBS，30分钟；泳道(4)：1×NBS，60分钟；泳道(5)：3×NBS，0分钟；泳道(6)：3×NBS，30分钟；泳道(7)：3×NBS，60分钟；泳道(8)：6×NBS，0分钟；泳道(9)：6×NBS，30分钟；泳道(10)：6×NBS，60分钟。

图11显示与3×NBS反应30分钟，然后被N-乙酰甲硫氨酸猝灭的包涵体的凝胶电泳的典型数据。同样的样品从10至25μl以递增的量上样，以显示5kD裂解产物的出现。

图12显示多种非天然氨基酸的化学结构，这些氨基酸已通过细胞系统的遗传修饰被细胞系统引入多肽和蛋白质中。参见Wang等，(2009)Chem Biol.16(3)：323-36。

图13显示对所用直接材料的估计生产成本分析。基于5克/升的平均包涵体制备、50％的裂解成功率和纯化过程中的产品损失，用来合成β-淀粉样蛋白(1-42)的材料仅花费0.11美元/毫克。

具体实施方式

本发明提供生产能够纯化并裂解成所需肽的融合肽的方法，以及根据该方法生产的肽。在多个实施方案中，本发明的方法包括诱导、包涵体分离、亲和柱纯化和化学裂解。在多个实施方案中，本发明利用表达载体来制备根据本发明的肽。在某些方面，通过将使用遗传可塑性微生物如大肠杆菌细胞来合成目的肽的分子表达技术与表达后分离和修饰相组合，能够快速而有效地合成所需的肽。在多个实施方案中，本发明涉及融合肽的生产，该融合肽可通过亲和分离纯化并用化学试剂裂解以释放目标肽。

在多个实施方案中，本发明涉及一种载体，其编码包涵体靶向序列，有助于纯化的亲和标记物，以及有助于选择性化学裂解的特定的氨基酸序列。在多个方面，包涵体靶向氨基酸序列包含类固醇异构酶蛋白质的1至125个氨基酸。亲和标记物序列可包含聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸或聚谷氨酸。在一个实施方案中，载体还包含位于亲和标记物序列的5’端的表达启动子。在一个实施方案中，本发明涉及一种编码特定序列的载体，该序列有助于选择性化学裂解以在纯化后产生感兴趣的肽。这样的可化学裂解的氨基酸序列包括Trp、His-Met或Pro-Met。

在一个实施方案中，本发明涉及一种肽表达载体，其包含：a)编码亲和标记物的氨基酸序列的第一核苷酸序列；b)编码包涵体靶向氨基酸序列的第二核苷酸序列；c)编码可化学裂解的氨基酸序列的第三核苷酸序列；以及d)与第一、第二及第三核苷酸序列可操作组合的启动子。

在一个实施方案中，本发明涉及一种生产具有商业或治疗意义的肽的方法，该方法包括以下步骤：a)用限制性内切酶切割载体以产生酶切载体；b)将切割位点连接至一个或多个核酸，其中该核酸编码所需的肽，在每一末端具有至少一个碱基突出端，该碱基突出端配置并排列以便与酶切载体连接，以产生适合表达融合肽的第二载体；c)将该第二载体转化至合适的宿主细胞中；d)在适合表达融合肽的条件下培养该宿主细胞；e)从该宿主细胞中分离包涵体；f)溶解包涵体并从包涵体中提取融合肽；g)融合肽与合适的亲和材料结合；h)洗涤结合的融合肽以除去杂质；和i)裂解融合肽以释放所述目标肽。

通过本发明方法生产的肽可具有明显更低的成本和/或其他有益的特征。这些可能较低的成本不仅可能是由于合成需要的原材料较便宜，还可能是因为与传统固相肽合成法相比，该方法产生更少的化学废物，又或是在更高效的加工中达到特定的纯度，因此降低了材料成本。此外，没有大量废物生成也可对环境特别有益。在多个实施方案中，根据本发明的方法提供了高产率、高纯度的肽。在多个实施方案中，根据本发明生产的肽可为R&D级肽或临床级治疗剂。

定义

除非另外定义，所有在本文应用的技术及科学术语均与本领域普通技术人员通常理解的意思一致。

如此处所用，术语“肽”的意思是任何包含由肽键连接的氨基酸的聚合物。术语“肽”意在包括用核糖体装配的聚合物以及用酶装配的聚合物(即，非核糖体肽)以及用合成法装配的聚合物。在多个实施方案中，术语“肽”可被认为与“蛋白质”或“多肽”同义。在多个实施方案中，术语“肽”可被局限于多于50个氨基酸的聚合物，或者可替代地，50个或更少的氨基酸的聚合物。在多个实施方案中，术语“肽”意在仅包括氨基酸作为聚合物的单体单元；而在多个实施方案中，术语“肽”包括对氨基酸骨架附加的成分和/或修饰。例如，在多个实施方案中，术语“肽”可用于氨基酸的核心聚合物以及该核心聚合物的衍生物，例如带有悬垂聚乙二醇基团的核心聚合物或在氨基酸链的氨基端或羧基端带有酰胺基团的核心聚合物。

如此处所用，“基本由...组成”可能不包括那些此处未列出的，将会改变发明的操作的特征。然而，短语“基本由...组成”的使用不排除那些不改变所需成分的操作的特征。

术语“聚合物”是包含由共价化学键连接的重复结构单元的分子(或大分子)。

将用本发明的组合物处理的术语“患者”、“个体”或“宿主”可意为人或非人的动物。术语“哺乳动物”是本领域公知的，且典型的哺乳动物包括人类、灵长类、牛类、猪类、犬类、猫类及啮齿类(例如，小鼠及大鼠)。

I.目标肽1

本发明的方法适用于众多的肽，如分离的产物，其可被称为目标肽。根据本发明的方法生产的肽可以是天然存在的肽，非天然存在的肽，或具有非天然置换、缺失或添加的天然存在的肽。在多个实施方案中，目标肽可在分离后用化学或生物学方法修饰以获得目标肽的衍生物，例如一个或多个甲酰胺基团代替自由羧基的目标肽。

在多个实施方案中，所述肽选自：疫苗、抗体、重组的激素及蛋白质、干扰素、白介素以及生长因子。在某些实施方案中，目标肽含有50个或更少的氨基酸。在某些实施方案中，目标肽含有多于50个氨基酸。

本发明进一步的非限制性实施方案包括选自下组的肽及其类似物：血管紧张素、精氨酸加压素(AVP)、AGG01、糊精(IAPP)、淀粉样蛋白β、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhAS B；戈硫酯酶)、禽胰多肽(APP)、B型利尿钠肽(BNP)、降钙素肽、降钙素、粘菌素(多粘菌素E)、粘菌素共聚物1(Cop-1)、环孢菌素、促红血球生成素(darbepoetin)、PDpoetin、阿法链道酶、依来多新、β-内啡肽、恩夫韦肽、脑啡肽五肽、依泊汀、依泊汀δ、红细胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、促卵泡激素(FSH)、α-半乳糖苷酶A(Fabrazyme)、生长激素释放激素1-24(GHRH 1-24)、β-珠蛋白、胰高血糖素、葡糖脑苷脂酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长激素、乙型肝炎病毒包膜蛋白、人生长激素(hGH)、胰岛素、胰岛素A、胰岛素B、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、干扰素、肛褶蛙肽、α-L-艾杜糖苷酸酶(rhIDU；拉罗尼酶)、乳三肽(lactotripeptides)、瘦素、利拉鲁肽(NN2211，VICTOZA)、促黄体激素释放激素、甲氧基聚乙二醇依泊汀β(MIRCERA)、肌红蛋白、神经激肽A、神经激肽B、NN9924、NPY(神经肽Y)、奥曲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、甲状旁腺素(PTH)、肽组氨酸异亮氨酸27(PHI 27)、阿黑皮素原(POMC)肽、强啡肽原肽、多粘菌素、多粘菌素B、胰多肽(PPY)、肽YY(PYY)、胰泌素、促生长素抑制素、P物质、特立帕肽(FORTEO)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、血小板反应蛋白(TSP)、泛素、尿抑胃素、血管活性肠肽(VIP或PHM27)以及病毒包膜蛋白。在多个实施方案中，目标肽选自淀粉样蛋白β、降钙素、恩夫韦肽、依泊汀、依泊汀δ、红细胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖脑苷脂酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、胰岛素、胰岛素A、胰岛素B、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、干扰素、利拉鲁肽、促生长素抑制素、特立帕肽以及组织纤溶酶原激活物(TPA)。在多个实施方案中，目标肽选自淀粉样蛋白β和胰岛素。

在多个实施方案中，目标肽是激素。例如，在多个实施方案中，目标肽选自：激活蛋白、抑制素、脂连蛋白、脂肪衍生的激素、促肾上腺皮质激素、阿法诺肽、野灰蛋白信号传递肽、抑咽侧体神经肽、糊精、血管紧张素、心房钠尿肽、牛促生长素、缓激肽、脑神经营养因子、CJC-1295、降钙素、睫状神经营养因子、促肾上腺皮质激素释放素、促皮质素(Cosyntropin)、内皮素、肠高血糖素、促卵泡激素、胃泌素、肠抑肽(Gastroinhibitory peptide)、胰高血糖素、胰高血糖素激素家族、胰高血糖素样肽-1、促性腺素、粒细胞集落刺激因子、促生长素、生长激素释放激素、铁调素(Hepcidin)、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、肠降血糖素、胰岛素、甘精胰岛素(Insulin glargine)、赖脯胰岛素(Insulinlispro)、门冬胰岛素(Insulin aspart)、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子、瘦素、利拉鲁肽、黄体生成素、黑皮质素、促黑激素、美拉诺坦(Melanotan)II、小胃泌素(Minigastrin)、脑钠肽的N端激素原、神经生长因子、神经营养蛋白-3、NPH胰岛素、胰岛素、肥胖抑制素(Obestatin)、食欲肽、骨钙蛋白、胰腺激素、甲状旁腺激素、YY肽、肽类激素、血浆肾素活性、普兰林肽、前激素原、Proislet淀粉样多肽、促乳素、松弛素、肾素、降钙素(Salcatonin)、促胰液素、辛卡利特(Sincalide)、硬骨鱼瘦素、促甲状腺素、促甲状腺释放因子、尿皮素(Urocortin)、尿皮素II、尿皮素III、血管活性肠肽和卵黄生成素。

在多个实施方案中，目标肽已可以通过不同于本发明方法的生产方法可从市场上购得。尽管不希望受理论所限制，相信根据本发明生产的肽将含有来自生产过程的不同程度的残余成分。例如，与根据传统的重组方法生产的具有相同序列的肽相比，可以预计根据本发明生产的肽在初始纯化后将具有较少的残余细胞污染物。或者，与根据传统的合成方法生产的具有相同序列的肽相比，可以预计根据本发明生产的肽在初始纯化后将具有较少的残余化学污染物。各种可商业购得的肽可在纸质目录或在线目录上找到，例如，Sigma-Aldrich(sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/peptides-and-proteins.html)，California Peptide(californiapeptide.com/peptide_catalog_table)，CPCScientific(cpcscientific.com/products/browseCatalog.asp)，以及Bachem(shop.bachem.com/ep6sf/index.ep)，其中每一项的内容都在此引用作为参考。

在多个实施方案中，目标肽在其序列中不包括色氨酸。

II.包涵体指引肽

包涵体由不溶性及变性形式的肽组成，其直径约为5-1.3μm。这些稠密且多孔的聚集物可帮助简化重组蛋白生产，因为他们具有高均一性的表达的蛋白质或肽，导致表达的蛋白质或肽的降解较低，因为其对细胞蛋白酶的蛋白水解攻击具有更高的抗性，同时由于其与其他细胞成分相比在密度和大小上不同，易于从细胞的其他成分中分离出来。在多个实施方案中，由于蛋白质或肽在被隔离在包涵体内后毒性降低，包涵体的存在允许产生浓度提高的表达的蛋白质或肽。一旦分离，可以溶解该包涵体以允许进一步的操作和/或纯化。

包涵体指引肽是一种氨基酸序列，其可以帮助指引新翻译的蛋白质或肽进入宿主细胞内的不溶性聚集物。在最终分离之前，在本发明的多个实施方案中，目标肽作为融合肽产生，该融合肽包括作为其氨基酸序列一部分的包涵体指引肽。本发明的方法适用于多种不同的作为表达的融合蛋白或肽的组分的包涵体指引肽。

在多个实施方案中，包涵体指引肽是类固醇异构酶(KSI)序列、其功能片段或其功能同系物。

在多个实施方案中，包涵体指引肽是BRCA-2序列、其功能片段或其功能同系物。

III.亲和标记物肽

根据本发明，可以使用众多的亲和标记物。根据本发明有用的亲和标记物可对于阳离子、阴离子、金属或任何其他适合于亲和柱的材料是特异性的。在一个实施方案中，任何不具有亲和标记物的肽将被从亲和柱上洗脱，通过亲和标记物留下与亲和柱接合的所需融合肽。

根据本发明的特异性亲和标记物可包括聚赖氨酸、聚组氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸肽。例如，亲和标记物可以是5-10个赖氨酸、5-10个组氨酸、5-10个谷氨酸或5-10个精氨酸。在多个实施方案中，亲和标记物是6个组氨酸的序列、6个赖氨酸的序列、6个谷氨酸的序列、或6个精氨酸的序列。或者，也可使用HAT-标记物(Clontech)。在多个实施方案中，亲和标记物是Ni-亲和标记物His-Trp。

不希望被理论所局限，相信聚组氨酸标记物的组氨酸残基与Ni-NTA或TALON树脂以高亲和力结合。这两种树脂皆含有二价阳离子(Ni-NTA树脂包含Mg²⁺；TALON树脂包含Co²⁺)，该二价阳离子可以与His标记物形成高亲和力配位。

在多个实施方案中，亲和标记物的pI(等电点)与目标肽的pI相差至少一个pH单位。该差异可以是在目标肽的pI之上或之下。例如，在多个实施方案中，目标肽具有高pI，而亲和标记物的pI至少低1个pH单位，至少低2个pH单位，至少低3个pH单位，至少低4个pH单位，至少低5个pH单位，至少低6个pH单位，或至少低7个pH单位。或者，目标肽具有低pI，而亲和标记物的pI至少高1个pH单位，至少高2个pH单位，至少高3个pH单位，至少高4个pH单位，至少高5个pH单位，至少高6个pH单位，或至少高7个pH单位。在一个实施方案中，目标肽的pI值约为10而亲和标记物的pI值约为6。

在多个实施方案中，亲和标记物包含在包涵体指引肽的天然序列内。或者，将包涵体指引肽修饰为包含亲和标记物。例如，在一个实施方案中，亲和标记物是KSI或BRCA2序列被修饰后所包括的额外的组氨酸、额外的赖氨酸、额外的精氨酸或额外的谷氨酸。

在多个实施方案中，可使用如FLAG(Eastman Kodak)或myc(Invitrogen)的表位及其抗体对。

IV.可裂解标记物

本发明的方法适用于多种不同的可裂解标记物。

在多个实施方案中，可裂解标记物是在目标肽的氨基端的色氨酸。在用裂解剂裂解后，用来连接色氨酸与目标肽的酰胺键断裂，目标肽从亲和柱上释放出来。

在多个实施方案中，可裂解标记物是目标肽的氨基端的色氨酸，其中该可裂解标记物在色氨酸的局部环境中包括具有带电侧链的氨基酸，所述色氨酸的局部环境例如是色氨酸上游(即氨基)或下游(即羧基)侧的5个氨基酸以内。在多个实施方案中，在色氨酸氨基端5个氨基酸之内存在氨基酸侧链，这允许选择性裂解可裂解标记物的色氨酸而不裂解其他任何可能存在于融合肽中的色氨酸(例如，作为包涵体指引肽的一部分或目标肽的一部分的色氨酸)。例如，在多个实施方案中，具有带正电荷的侧链的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸，距可裂解标记物的色氨酸在5、4、3或2个氨基酸单位以内，或在氨基端与可裂解标记物的色氨酸相邻。在多个实施方案中，谷氨酸在距可裂解标记物的色氨酸的5、4、3或2个氨基酸单位以内，或在氨基端与可裂解标记物的色氨酸相邻。

在多个实施方案中，可裂解标记物为His-Met或Pro-Met。

在多个实施方案中，可裂解标记物是非天然氨基酸。已经可以修饰细胞以使得该细胞能够产生含有非天然氨基酸的肽。例如，Wang等，(2001)Science 292：498-500描述了对大肠杆菌的蛋白质生物合成机制的修饰，该修饰允许响应于琥珀终止密码子(TAG)，位点特异性地引入非天然氨基酸-O-甲基-L-酪氨酸。Wang等(2009)Chem Biol.16(3)：323-36提供了对大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞的蛋白质中位点特异性引入大量非天然氨基酸的综述。不希望被理论所限制，相信引入一个或多个非天然氨基酸可以提供额外的裂解选择性，从而在融合肽的非天然氨基酸处裂解而不在融合肽的其它位点处非特异性裂解。在多个实施方案中，非天然氨基酸选自图12中的化合物1-27。

在某些方面，本发明包括含有非天然氨基酸的融合肽的生产。在某些方面，蛋白质生物合成机制被修饰的原核细胞产生这样的融合肽。这样的原核细胞的例子包括大肠杆菌。在某些方面，该修饰包括加入正交的tRNA/合成酶对。在某些方面，4个碱基密码子编码新的氨基酸。在某些方面，大肠杆菌允许响应于包括在表达载体中的琥珀终止密码子(TAG)，位点特异性地向肽内引入非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸。

V.融合肽的合成

许多肽生产方法可适用于本发明。各种方法在此处详细描述。

A.核糖体合成

在多个实施方案中，可通过核糖体合成来生产肽，该方法利用转录和翻译的基础方法来表达肽。核糖体合成通常通过操纵多种表达系统的遗传密码子来进行。某些肽可以在真核宿主例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)内以其原始形式表达。动物细胞培养可能需要较长的生长时间以达到最大的细胞密度，而且可能会比原核细胞培养达的细胞密度低(参见Cleland，J.(1993)ACS Symposium Series 526，Protein Folding：In Vivo and In Vitro，American Chemical Society)。细菌宿主表达系统例如大肠杆菌可能比动物细胞培养具有更高的生产能力，且对于打算治疗使用的肽而言可能具有较少的管理上的障碍。有许多关于重组蛋白的普通细菌表达的美国专利，包括美国专利4,565,785。

在一个实施方案中，表达系统是微生物表达系统。例如，在一个实施方案中，该方法使用大肠杆菌细胞。

1.载体的构建

在多个实施方案中，本发明的方法包括DNA载体的构建，该DNA载体包括某些选择性标记(例如在大肠杆菌情况下的抗生素抗性)，该选择性标记使得能够针对不包含带有目的基因的构建载体的细胞进行选择性筛选。根据本发明的载体可包含杂合启动子和用于引入不同基因的多克隆位点。不同的表达载体可包括pET系统和pBAD系统。

pET系统在标准pET载体上包括超过40种不同的变异。在多个实施方案中，pET系统采用可以被T7RNA聚合酶特异性识别的T7启动子。该聚合酶可以比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍地转录DNA，从而允许转录水平增高。在多个实施方案中，大肠杆菌是蛋白酶缺陷的。

在一个实施方案中，载体被设计成带有编码融合肽的序列，该融合肽包含包涵体指引肽、亲和标记物肽、可裂解的肽和目标肽。例如，在一个实施方案中，载体为pET-19b载体，其被修饰为包括类固醇异构酶(KSI)序列作为包涵体指引肽。因此，在切割诸如NcoI限制酶切位点的限制位点和插入KSI序列之后，KSI序列两侧有两个NcoI限制酶切位点。此外，这样的载体可被修饰为包含组氨酸标记物序列作为编码亲和标记物的序列，该序列邻近作为编码可裂解肽序列的色氨酸编码性标记物序列，后者进一步邻近编码目标肽的序列，例如β-淀粉样蛋白(1-42)序列。如果XhoI限制酶切位点用来作为插入点，新插入序列的两侧为两个XhoI限制酶切位点。图1显示了修饰的pET-19b(pET-19bmhb1)载体的一个实施方案，其可用来产生在两侧有两个NcoI限制酶切位点的KSI序列，以及在两侧有两个XhoI限制酶切位点的组氨酸标记物-色氨酸-β-淀粉样蛋白序列(1-42)序列。

这样，根据本发明的载体，例如修饰的pET-19b载体，包含具有四部分序列的所需融合肽：KSI序列或功能片段，将合成的融合蛋白隔离到包涵体内；亲和标记物，诸如六组氨酸；裂解标记物，诸如色氨酸；以及目标肽。

2.接种及诱导或激活

在构建适当的载体后，该载体可按照任何方法引入宿主细胞内，且所需融合肽的表达可通过本领域中的任何方法诱导或激活。

在一些实施方案中，根据本发明的载体一旦构建，就将其接种或将其转化入感受态细胞中。在多个实施方案中，感受态细胞可以是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞，或微生物细胞，例如大肠杆菌细胞。举例来说，所述细胞可从市场上购得，例如DH5-ot大肠杆菌细胞(可从Invitrogen购得)。

在多个实施方案中，已转化的细胞可以涂布到含有抗菌剂的琼脂上，以防止任何不含有抗性基因的细胞的生长，从而选择那些已被转化的细胞。在某些实施方案中，将已转化的大肠杆菌细胞涂布到含有氨苄青霉素的琼脂上，以阻止任何不含构建的pET-19b载体的大肠杆菌菌株的生长，并且选择一个菌落以备进一步扩增。

从平板培养法得到的菌落可根据标准细胞培养技术在起子培养物或肉汤中生长。例如，在某些实施方案中，从琼脂平板上选取的一个菌落在肉汤起子培养液中生长，其可任选地包含抗菌剂。典型地，细胞生长到预先选择的光密度，然后进一步加工以获得融合肽。例如，细胞可生长至光密度(OD)为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9，所有的数值均为大约值。在某些实施方案中，细胞生长至光密度(OD)大约为0.5。

在细菌表达系统中，一旦含有载体的细菌细胞被分离出来，就可以利用诱导型转录来生产所需的融合肽。例如，在大肠杆菌细胞中，lac操纵子可作为在特定环境条件下激活的诱导型启动子。大肠杆菌总是能够代谢单糖葡萄糖。然而，为了代谢二糖乳糖，该细胞需要一种叫作β-半乳糖苷酶的酶。因此，细胞外的低葡萄糖浓度和高乳糖浓度诱导lac操纵子，β-半乳糖苷酶的基因被转录。相应地，在多个实施方案中，诸如lac操纵子的诱导型启动子位于编码融合肽序列的上游。在诱导lac操纵子后，发生编码所需融合肽的序列的转录。

术语“激活”指的是去除阻抑蛋白。阻抑蛋白通常是变构的，意指当其被诱导物分子结合后会改变形状并从启动子上解离下来。这种解离允许转录复合物在DNA上装配，并启动启动子下游的任何基因的转录。因此，通过将在体外产生的基因剪接到细菌基因组中，人们可以控制新型基因的表达。在处理包涵体时，如果包涵体的产生及积累变得足够有毒性而杀死大肠杆菌，则可有利地利用该特性。例如，可以推迟所需融合肽的表达，直到培养出足够的细胞群体，然后可以诱导启动子以通过去除阻抑蛋白从而表达大量的融合肽。因此，L-阿拉伯糖操纵子可根据本发明激活，以便在所需时间点增加蛋白质表达。具体地，可通过将阿拉伯糖加入生长培养基中和加入IPTG来激活L-阿拉伯糖操纵子，IPTG是作为激活剂从操纵基因DNA上解离阻抑蛋白的分子。图2显示一个实施方案，通过加入L-阿拉伯糖来激活pBAD载体中的转录。不希望被理论所限制，相信L-阿拉伯糖与AraC二聚体结合，使蛋白质释放DNA上的O₂位点，并与I₂位点结合。这些步骤用于释放DNA环并使其能够转录。此外，cAMP激活蛋白(CAP)复合物刺激AraC与I₁和I₂的结合-由IPTG启动的过程。

3.将表达的肽靶向至包涵体

在某些情况下，只表达具有亲和标记物、可裂解标记物及目标肽的融合肽的细胞不能产生大量融合肽。低产率的原因可能不一。例如，融合肽可能对于细菌来说有毒性，因此导致细菌在产生一定量的融合肽后死亡。或者，目标肽可能表达较差或在细菌系统中迅速降解。在各种情况下，目标肽可能被宿主细胞修饰，包括诸如糖基化的修饰。为解决一些或全部的这些问题，所需融合肽可被引导至包涵体中，从而在物理上将目标肽与细胞胞质中的降解因子隔离开来。或者，在目标肽对宿主有毒性诸如肽抗生素的情况下，在物理上隔离目标肽以避免对宿主的毒性效应。此外，通过在包涵体中物理聚集融合肽，接下来可以更容易和高效地从宿主细胞的成分及培养基(即细胞培养基或肉汤)中分离融合肽。

目标肽可通过下列方法被引导至包涵体：产生作为融合肽一部分的目标肽，其中目标肽直接地或经由中间肽间接地与包涵体指引肽连接。在多个实施方案中，除没有包涵体指引肽外都相同的融合肽在表达系统中没有或具有最低的被引导进入包涵体的趋势。或者，除没有包涵体指引肽外都相同的融合肽在表达系统中具有一定的被引导入包涵体的趋势，但是通过产生带有包涵体指引肽的融合肽增加了包涵体的数量、体积或重量。在多个实施方案中，当目标肽自身可将本发明的融合肽引导至包涵体时，可不包括单独的包涵体指引肽。

任何包涵体指引肽可根据本发明的方法使用。例如，已经描述了允许在大肠杆菌中合成稳定形式的α-人心房钠尿肽(α-hANP)的方法。合成的α-hANP基因的8个拷贝串联连接，由编码含4个氨基酸的连接体的密码子隔开，该连接体具有赖氨酸残基，该赖氨酸残基位于含28个氨基酸的激素的真正N端和C端的侧翼。然后该序列与片段的3’端相连，该片段包含lac启动子及编码β-半乳糖苷酶的前7个N端氨基酸的前导序列。表达的多区域蛋白在细胞内积累进入稳定的包涵体内，并通过尿素提取不溶性细胞成分而纯化。纯化的蛋白质通过用蛋白内切酶lys C消化而裂解为单体，并进行修整以通过羧肽酶B消化而暴露真正的C-端。参见Lennick等.，“High-level expression ofα-human atrial natriuretic peptide from multiple joined genes inEscherichia coli，”Gene，61：103-112(1987)，在此引入作为参考。

在多个实施方案中，通过产生作为融合肽的一部分的目标肽将目标肽引导至包涵体可导致更高的肽产量。例如，在多个实施方案中，所需融合肽以大于100mg/L的浓度产生。在多个实施方案中，所需融合肽以大于约200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L、500mg/L、550mg/L、600mg/L、650mg/L、700mg/L、750mg/L、800mg/L、850mg/L、900mg/L、950mg/L和1g/L的浓度产生，所有数字前都冠以“大于约”。在多个实施方案中，所需融合肽的产率大于约1.5g/L，大于约2g/L，或大于约2.5g/L。在多个实施方案中，所需融合肽的产率在约500mg/L至约2g/L之间，或约1g/L至约2.5g/L之间。在一个实施方案中，所需融合肽的产率等于或大于500mg/L培养基。

在一个实施方案中，包涵体指引肽是类固醇异构酶(KSI)或其包涵体指引功能性片段。在某些实施方案中，包涵体指引功能性片段含有至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个氨基酸。也包括类固醇异构酶的同系物。这样的同系物与类固醇异构酶的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列一致性。在多个实施方案中，表达系统对于具有类固醇异构酶的功能片段或同系物的融合肽所产生的包涵体量为同一表达系统对于含有完整类固醇异构酶肽序列的融合肽所产生的包涵体量的至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于100％。

B.固相蛋白质合成

在一个实施方案中，所需融合肽通过固相肽合成法(SPPS)制备。SPPS包括将短肽共价连接至不溶性聚合物上，该聚合物为肽的伸长提供了结构支持。为达到肽伸长的目的，操作者施行一系列的重复循环：将氨基酸的化学反应部分脱保护，将脱保护的自由末端胺(N)连接至一个N-保护的氨基酸，将新加入的残基的N-端胺脱保护，并重复该过程直至所需肽已建立。对于长度约为50个或更多氨基酸的肽，可能需要附加措施。

在一个实施方案中，固相肽合成法使用Fmoc保护基团。Fmoc保护基团使用碱不稳定的α-氨基保护基团。在一个替代实施方案中，固相肽合成法使用Boc保护基团。Boc保护基团是酸不稳定的α-氨基保护基团。每种方法可包括独特的树脂添加，氨基酸侧链保护，以及随之而来的裂解/脱保护步骤。通常，Fmoc化学法比Boc化学法产生更高质量和更高产率的肽。Boc-合成的肽中的杂质主要归结于裂解问题、脱水及叔丁基化。一旦在固体支持物上装配，使用强酸条件，通常使用三氟乙酸(TFA)，将该肽从树脂上切下。然后使用反相高压液相色谱法或RP-HPLC纯化，RP-HPLC是这样一个过程，其中，样品通过紧密填充的柱挤出，并记录不同样品通过该柱所花费的时间长度(称为保留时间)。于是，根据较小的肽通过柱的保留时间较短而反之亦然的原理从样品中分离出杂质。因此，纯化的蛋白质以与样品中其他杂质不同的特有的保留时间洗脱，从而获得所需蛋白质的分离。

固相肽合成通常可提供高产率，因为可使用过量的试剂推动反应完成。可溶性副产物的分离通过在合成中将肽与不溶性支持物连接而得到简化。由于在整个过程中在同一容器中发生合成，原料的机械损耗较低。

在多个实施方案中，可不包括包涵体指引肽。或者，可包括包涵体指引肽以提供有益的折叠性质和/或可溶性/聚集性质。

C.非核糖体合成

在多个实施方案中，肽可通过非核糖体合成产生。这样的肽包括环肽和/或缩肽(depsipeptide)。

非核糖体肽通过一种或多种非核糖体肽合成酶(NRPS)合成。这些酶独立于信使RNA。非核糖体肽通常具有环状的和/或分支的结构，可以包含非蛋白质氨基酸(包括D-氨基酸)，带有诸如N-甲基和N-甲酰基的修饰，或被糖基化、酰化、卤化或羟基化。通常相对肽骨架将氨基酸环化，形成噁唑啉和噻唑啉；它们可进一步被氧化或还原。有时，可对丝氨酸进行脱水反应以获得脱氢丙氨酸。

NRPS的酶被组织在负责引入一个额外氨基酸的模块中。每个模块由几个具有限定功能的结构域组成，这些结构域由大约15个氨基酸的短间隔区分开。虽然不期望被理论所限制，认为一个典型的NRPS模块如下组织：起始模块，一个或多个延长模块，和终止模块。针对某种肽的NRPS基因通常在细菌中被组织在一个操纵子中或在真核生物中被组织在基因簇中。

在多个实施方案中，可不包括包涵体指引肽。或者，可包括包涵体指引肽以提供有益的折叠性质和/或可溶性/聚集性质。

VI.融合肽从生成培养基中的分离

在产生所需融合肽后，需要从生产培养基中将其分离。任选地，在分离后，可浓缩所需融合肽及载体以去除过量的液体。许多从生成培养基中分离融合肽及后续处理的方法可适用于本发明。在此详述几种方法。

A.靶向包涵体的融合肽

在多个实施方案中，可裂解用来生产所需融合肽的细胞以释放融合肽。例如，当所需融合肽聚集在包涵体中时，可以裂解细胞，然后将包涵体从生产培养基及细胞碎屑中分离出来。根据本发明可使用任何细胞裂解方法。

在多个实施方案中，用大功率超声处理，在裂解缓冲液中破坏细胞。例如，在裂解前可加入含有Tris、氯化钠、甘油及蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。在一个实施方案中，可在裂解前加入含有大约25mMTris pH 8.0、大约50mM NaCl、大约10％甘油和蛋白酶抑制剂1000×PMSF的裂解缓冲液。不可溶的包涵体可通过使用一个或多个洗涤步骤和离心步骤进行收集。洗涤缓冲液可包含任何用来稳定和分离蛋白质的试剂。例如，在多个实施方案中，使用含有不同浓度的Tris pH8.0、NaCl和Triton X100的洗涤缓冲液。

在本发明的一个实施方案中，将所需融合肽靶向至包涵体可在细胞裂解后形成较高的起始纯度。例如，在一个实施方案中，裂解细胞和通过诸如离心分离的物理手段分离包涵体，可导致所需融合肽的起始纯度大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％或大于约95％。

在一些实施方案中，细胞裂解后，包涵体形成小球并保持在小球而不是上清夜内直到溶解步骤。在多个实施方案中，将小球清洗干净，去除其余的细胞成分，将不可溶的包涵体溶解于缓冲液中以便进一步处理。溶解缓冲液可包含尿素或任何其他溶解融合肽必需的离液剂。不期望被理论所限制，相信溶解步骤包括将包涵体溶于离液剂中，该离液剂通过干扰任何稳定的分子内相互作用来破坏肽。

在多个实施方案中，溶解缓冲液包含尿素、胍盐或有机溶剂。例如，溶解缓冲液可包含约25mM Tris pH 8.0，约50mM NaCl，约0.1mM PMSF，以及约8M尿素。在某些实施方案中，当加入8M尿素作为唯一的离液剂而排除其他离液剂时，包涵体溶解。或者，溶解缓冲液可不包含尿素或胍盐。例如，在一个实施方案中，溶解缓冲液不包含胍盐以避免干扰在离子交换柱上进一步的加工。作为一个附加的例子，在一个实施方案中，不包含诸如约8M尿素的高浓度尿素以避免使可能包括在溶解缓冲液内的蛋白酶变性。

在多个实施方案中，使用最少量的溶解缓冲液。当存在过量的溶解缓冲液时，可加工该溶液以便在进一步纯化前移除过量的溶剂。

B.非靶向包涵体的融合肽

在多个实施方案中，融合肽并未被引导至包涵体内。在这样的实施方案中，融合肽可保留在细胞的胞质溶胶中，或者根据本发明的融合肽可从细胞中分泌出来。可溶性的融合肽可通过任何方法分离，例如离心分离、凝胶电泳、pH或离子交换色谱法、大小排阻色谱法、反向色谱法、透析、渗透、过滤和萃取。

VII.通过亲和色谱法纯化

在细胞裂解并初始分离和溶解本发明的融合肽后，通过亲和色谱法进一步纯化融合肽，这是一个高度选择性的过程，它依赖于固定化的固定相与将要被纯化的融合肽之间的生物相关的相互作用。在多个实施方案中，固定化的固定相是树脂或基质。不希望被理论所限制，认为亲和色谱法是通过将来自混合物的所需成分与固定化的固定相选择性结合，然后洗涤固定相以去除任何未结合的材料来进行的。

根据本发明，可使用多种亲和色谱法系统。例如，聚组氨酸以高亲和力和特异性与镍结合，因此镍的亲和柱，例如QIAGEN镍柱，可用于纯化。参见，例如，Ausubel等.，eds.，Current Protocols inMolecular Biology 10.11.8(John Wiley&Sons 1993)。或者，可使用Ni-NTA亲和色谱树脂(可从Invitrogen购得)。图7提供了与蛋白质上的6×His标记物相结合的固定化Ni-NTA树脂的一个实例的示意图。金属亲和色谱已用作蛋白质分离的基础。参见Arnold，“Metal AffinitySeparations：A New Dimension In Protein Processing”Bio/Technology，9：151-156(1991)。还可参见Smith等，“Chelating Peptide-immobilizedMetal Ion Affinity Chromatography”J.Biol.Chem.，263：7211-7215(1988)，此文描述了蛋白质NH₂末端上的特异性金属螯合肽，其可通过固定的金属离子亲和色谱法来纯化。

根据本发明，亲和柱用缓冲液平衡，该缓冲液可以与溶解融合肽的缓冲液相同。接下来向该柱装入溶解的融合肽，并在缓冲液流过柱体时收集缓冲液。在多个实施方案中，相继冲洗该柱以去除尿素和/或其他杂质如内毒素、多糖和来自细胞表达系统的残余污染物。

VIII.通过裂解从亲和柱中移除目标肽

从亲和柱上裂解融合肽的多种方法可适用于本发明。通常，通过引入裂解剂进行裂解步骤，该裂解剂与融合肽的裂解标记物相互作用，导致融合肽的裂解和目标肽的释放。在裂解后，可冲洗亲和柱以洗脱目标肽，而含有亲和标记物的融合肽部分仍与亲和柱结合。在目标肽洗脱后，洗脱溶液可浓缩至所需浓度。目标肽可进一步处理和/或包装以供分发或销售。

可通过化学选择性控制裂解反应。例如，裂解标记物可包括独特的化学部分，该部分不存在于融合肽的其他部分，因此裂解剂与裂解标记物的独特的化学部分选择性相互作用。

在多个实施方案中，裂解反应的控制通过独特的局部环境进行。例如，裂解标记物可包括化学部分，该化学部分存在于融合肽的其他部分，但局部环境不同，导致在裂解标记物处发生选择性裂解反应。例如，在多个实施方案中，裂解标记物包括色氨酸和距色氨酸5个氨基酸内的带电荷的氨基酸侧链。在多个实施方案中，带电荷的氨基酸位于色氨酸的氨基端。

在多个实施方案中，裂解反应的控制可通过融合肽的二级或三级结构实现。例如，在多个实施方案中，当相同的部分存在于裂解标记物和融合肽的其他部分时，融合肽的其他部分可折叠成二级或三级结构，诸如α-螺旋、β-折叠和类似的结构，以在物理上保护易受影响的部分，导致在裂解标记物处的选择性裂解。

在多个实施方案中，裂解反应对于裂解标记物相比对于融合肽上其他位置的选择性方面的次要或甚至主要的差异，可通过控制裂解反应的动力学得到放大。例如，在多个实施方案中，裂解剂的浓度通过调整含有裂解剂的洗脱溶剂的流速得到控制。在多个实施方案中，裂解剂的浓度保持在低水平上以放大选择性的不同。在多个实施方案中，用来接收洗脱溶剂的容器含有猝灭剂，以停止进一步裂解已从柱上释放出来的目标肽。

此外，可排除多种从亲和柱上移除肽的方法。例如，根据本发明的方法可特别排除使用在无裂解反应时具有竞争亲和力的化合物溶液来冲洗亲和柱的步骤。在一个实施方案中，特别排除使用咪唑溶液作为置换剂来冲洗亲和柱以帮助从亲和柱上移除融合肽的步骤。

在多个实施方案中，设想多次裂解。例如，已知胰岛素从胰岛素原前体产生，这需要两个裂解事件。两个裂解事件都是必需的，以便使成熟的胰岛素正确地折叠。因此，在多个实施方案中，根据本发明的方法可包括两个裂解标记物。优选地，当存在多于一个裂解标记物时，不同的裂解标记物是正交的，或者能够被不同的裂解剂特异性裂解。例如，在一个实施方案中，一个裂解标记物是甲硫氨酸而另一个裂解标记物是色氨酸。

在多个实施方案中，裂解剂选自NBS、NCS、溴化氰、Pd(H₂O)₄、2-邻碘苯甲酸、DMSO/硫酸或蛋白水解酶。多种方法和裂解剂在此详述。

A.NBS裂解

在一个实施方案中，根据本发明的裂解反应包括使用温和的溴化剂N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)来选择性裂解目标肽氨基端的色氨酰肽键。不希望被理论所限制，相信在含水及酸性条件下，NBS氧化色氨酸侧链的暴露吲哚环，从而启动可导致该位点肽键断裂的化学转化。图9显示了一个可能的用N-溴代琥珀酰亚胺选择性裂解色氨酸肽键的机理。根据该机理，活化的溴离子将色氨酸残基的吲哚环卤化，接下来通过一系列水解反应自发脱卤化。这些反应导致可促进裂解反应的羟吲哚衍生物的形成。

B.NCS裂解

在一个实施方案中，根据本发明的裂解反应包括使用温和的氧化剂N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)来选择性裂解目标肽氨基端的色氨酰肽键。不希望被理论所限制，相信在含水及酸性条件下，NCS氧化色氨酸侧链的暴露吲哚环，从而启动可导致该位点的肽键断裂的化学转化。

C.酶裂解

在多个实施方案中，可应用酶来裂解融合蛋白。例如，蛋白酶的使用是多样而选择性的，因为有很多蛋白酶识别特定的氨基酸序列。在多个实施方案中，丝氨酸或苏氨酸蛋白酶的活性位点会分别与丝氨酸或苏氨酸结合，并且启动导致蛋白质水解的催化机制。其他的酶包括胶原酶、肠激酶因子X_A、凝血酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶和ala枯草杆菌蛋白酶(alasubtilisin)。参见Uhlen和Moks，Meths.inEnz.，185：129-143(1990)和Emtage，“Biotechnology&ProteinProduction”in Delivery Systems for Peptide Drugs，pp.23-33(1986)。

D.另外的化学试剂

在多个实施方案中，裂解剂是诸如溴化氰、钯(II)水络合物(例如Pd(H₂O)₄)、甲酸和羟胺的化学试剂。例如，溴化氰可用于在目标肽氨基端的甲硫氨酸处选择性裂解融合肽。

IX.下游处理

在多个实施方案中，根据本发明方法生产的目标肽可进一步修饰。例如，在多个实施方案中，目标肽的C-端与α-羟基甘氨酸相连。在所需时间，目标肽(或者作为分离的目标肽，或者作为融合肽的一部分)暴露于酸催化，以获得乙醇酸和在目标肽羧基端的甲酰胺基团。位于羧基端的甲酰胺基团在多种神经肽中存在，并且认为其可以延长各种肽在体内的半衰期。

在多个实施方案中，根据本发明生产的目标肽可进一步修饰以改变其体内活性。例如，在多个实施方案中，可在目标肽上添加聚乙二醇(PEG)基团。

X.肽的营销

根据本发明的方法也涉及营销根据本发明的方法生产的目标肽。例如，在一个实施方案中，本发明涉及一种评估目标肽的商业市场的方法。这样的方法可以包括生产如这里描述的目标肽，使样品量的目标肽可无成本或以最低成本获得，以及测量一段时间内对目标肽的需求数量。以这种方式制备目标肽，其优势包括改进对未来需要的供给量和/或付费顾客未来的需求量的计算。或者，无成本或以最低成本提供目标肽最初可能会引起对目标肽的兴趣并发现能刺激未来销售的肽的有利特征。最低成本可包括接近于生产成本的价格，基本不包含涉及的盈利。在多个实施方案中，最低成本可以是竞争对手产品价格的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。

参考引入

所有在本说明书中提到的出版物、专利及专利申请在此通过引入并入本文，其程度与每一个出版物、专利或专利申请被专门及单独地通过引入并入本文的程度相同。

实施例

本文中的实施例提供了一些根据本发明的非限制性实施例。以下实施例包括真实的实施例和预言性的实施例。

实施例1

如下所述用1mM IPTG(Invitrogen)和0.2％L-阿拉伯糖(Calbiotech)诱导细胞以启动KSI-Aβ(1-42)的合成。平板接种的细胞在37℃温育过夜，然后来自该平板的一个菌落在8mL LB培养基+氨苄青霉素的起子培养液中生长过夜。第二天早晨，将起子培养物接种到1L LB培养基+氨苄青霉素中并生长至光密度(OD)为0.5。在此时，用1mM IPTG(Invitrogen)和0.2％L-阿拉伯糖(Calbiotech)诱导细胞以启动KSI-Aβ(1-42)的合成。

为优化细菌中KSI-Aβ(1-42)的产量，在诱导细菌前，然后在诱导后2、4、6和16小时(过夜生长)，采集1L接种的样品。利用12％丙烯酰胺凝胶分析样品，因为融合肽的分子量约为21kD。图3显示了在诱导前及诱导后2、4、6和16小时从细胞培养物中采集的样品的凝胶电泳典型数据。在诱导培养物并生长过夜时发生最佳的融合肽合成。

在诱导8小时后，用同样浓度的IPTG和L-阿拉伯糖及100mg氨苄青霉素再次诱导细胞以防止任何新的大肠杆菌菌株的生长。

实施例1A

重新设计构建体以便在KSI序列上游而不是下游放置His标记物。

实施例2

在诱导大肠杆菌产生KSI-Aβ(1-42)之后，在细胞裂解前加入含有25mM Tris pH 8.0、50mM NaC l、10％甘油和蛋白酶抑制剂1000×PMSF的裂解缓冲液。通过洗涤和离心，分离收集不可溶的包涵体。使用三种不同的洗涤缓冲液，其中含有不同浓度的Tris pH 8.0、NaCl和Triton X100。一旦洗净残留的细胞成分，将不可溶的包涵体溶解在含有25mM Tris pH 8.0、50mM NaCl、0.1mM PMSF和8M尿素的缓冲液中。8M尿素作为溶解蛋白质所需的离液剂。

将未诱导和诱导的细菌、通过高输出超声处理产生的细胞裂解产物和包涵体制备过程中每一洗涤步骤产生的上清液在12％丙烯酰胺凝胶上电泳。凝胶用考马斯蓝试剂染色。在诱导的样品中出现21kD，这提供了诱导导致包涵体合成的证据。图6显示典型的数据，通过细胞的凝胶电泳表明包涵体制备的各阶段，其中所述细胞通过高功率超声处理裂解并用一系列含有不同浓度的Tris、NaCl、PMSF、Triton-X100和尿素的缓冲液洗涤。在连续步骤过程中21kD带消失和在溶解包涵体后21kD带重现(第10泳道)表明包涵体被正确制备。因此，含有细胞裂解物的泳道几乎完全是蓝色的，因为在细胞破裂时，相对大量的各种蛋白质被提取出来。当反复洗涤裂解物中的杂质时，泳道变得清晰起来。

实施例3

溶解的包涵体内的蛋白质浓度通过Bradford试验进行测定。运行一系列NBS裂解反应，以决定色氨酰肽键裂解的最佳条件。在用过量N-乙酰甲硫氨酸(Acros)猝灭之前，从TCI America购买的3种浓度(等摩尔、3×和6×)的NBS与KSI-Aβ(1-42)反应不同的时间(0、15和30分钟)。由于淀粉样蛋白β，裂解产物只有5kD，利用较高百分比的丙烯酰胺凝胶(18％)确定溶液中的NBS裂解是否成功。凝胶表明，当6×NBS与KSI-Aβ(1-42)在室温下反应0至30分钟时发生最佳裂解。图10显示9种不同NBS裂解反应的凝胶电泳的典型数据。样品在18％丙烯酰胺凝胶上运行并进行银染色。泳道(1)：包涵体储备液；泳道(2)：0×NCS，0min；泳道(3)：1×NBS，30min；泳道(4)：1×NBS，60min；泳道(5)：3×NBS，0min；泳道(6)：3×NBS，30min；泳道(7)：3×NBS，60min；泳道(8)：6×NBS，0min；泳道(9)：6×NBS，30min；泳道(10)：6×NBS，60min。

实施例4

从Invitrogen购买的Ni-NTA亲和色谱树脂用与制备包涵体相同的溶解缓冲液平衡。接着，向树脂中充满溶解的包涵体，并收集流通液。之后柱体用5倍柱体积的50％EtOH冲洗，以移除尿素和流通液。之后，上载3×NBS，并将柱体放置在振荡器上30分钟。此时，用过量的乙酰甲硫氨酸猝灭反应，并收集流通液。接着用300mM咪唑冲洗柱体，以释放剩下的聚合蛋白并收集流通液。

SDS-PAGE分析表明，很少量的包涵体附着在Ni-NTA柱体上，其证据是在第一洗出液中出现大的21kD带。图8显示在如下所述的Ni-NTA亲和色谱后的凝胶电泳典型数据。将包涵体上样到平衡的Ni-NTA柱上，并用同样的缓冲液冲洗，收集流通液(泳道1)。柱体接下来用50％EtOH冲洗，以使其与裂解溶液缓冲液平衡(泳道2)。在室温下用3×NBS进行30分钟的柱上裂解，并收集流通液(泳道3)。该柱体用300mM咪唑冲洗，以洗去所有剩余的融合肽并收集流通液(泳道4)。用EtOH第二次冲洗以便为了柱上裂解而平衡柱体后，出现了更窄的条带。剩余的KSI-Aβ(1-42)发生非常少量的裂解。在振荡器上温育包涵体过夜不会改善柱上裂解，虽然此举确实改善了KSI-Aβ(1-42)与柱体的初始结合。

实施例5

对NBS溶液裂解的SDS-PAGE分析表明，在溶液中的裂解取得成功。图11显示与3×NBS反应30分钟然后用N-乙酰甲硫氨酸猝灭的包涵体的凝胶电泳的典型数据。同样的样品以递增的量(从10至25μl)上样，以显示5kD裂解产物的出现。

由于最佳裂解速度在35％-45％范围内，只产生少量的KSI-Aβ(1-42)。由于凝胶中含有少量的稀释的样品，该试验通过考马斯蓝染色没有检测到5kD的裂解产物。因此，显现裂解产物需要过量上载样品及过度显影银染色。见图11，在最右边的两个泳道模糊地出现5kD带。

实施例6

对所用直接材料的生产成本分析表明，通过重组表达、化学操纵和纯化的组合合成β-淀粉样蛋白(1-42)的成本显著低于其它制造商所定的价格(注意他们价格的组成包含日常开支、生产费用、人工成本等)。假设1升培养液的包涵体平均产率是大约5克/升，裂解率为50％NBS，而且考虑到纯化过程中的产品损失，估计材料中的0.11美元是合成1mg β-淀粉样蛋白(1-42)需要的全部成本。即使把所有其它诸如设施、仪器及人工等生产成本都包含在价格中，用本方法合成β-淀粉样蛋白(1-42)对消费者来说也会花费更少。见图12。

尽管在此已经显示和描述了本发明优选的实施方案，但对于本领域技术人员来说很明显这样的实施方案只作为范例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变更、改变和替换。应当理解，在此描述的本发明实施方案的各种替代方案可用来实施本发明。

Claims (22)

1.一种生产目标肽的方法，其包括

a)生产包含亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合肽；

b)使所述融合肽与亲和材料结合；

c)裂解所述融合肽以释放目标肽；及

d)从亲和材料上移除所述目标肽。

2.权利要求1的方法，其中所述目标肽选自由淀粉样蛋白β、降钙素、恩夫韦肽、依泊汀、依泊汀δ、红细胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖脑苷脂酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、胰岛素、胰岛素A、胰岛素B、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、干扰素、利拉鲁肽、促生长素抑制素、特立帕肽和组织纤溶酶原激活物(TPA)组成的组。

3.权利要求1的方法，其中所述生产融合肽的步骤在细菌表达系统中进行。

4.权利要求3的方法，其中所述细菌表达系统是大肠杆菌表达系统。

5.权利要求3的方法，其中所述融合肽进一步包含包涵体指引肽。

6.权利要求5的方法，其中在所述融合肽与亲和材料结合前，所述方法进一步包括从细菌表达系统中移除含有该融合肽的包涵体和溶解包涵体中的该融合肽。

7.权利要求5的方法，其中所述包涵体指引肽选自由为类固醇异构酶的包涵体指引肽、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段、和BRCA2的包涵体指引功能同系物组成的组。

8.权利要求1的方法，其中在所述融合肽与亲和材料结合之后，所述方法进一步包括洗涤所述亲和材料以去除未结合的材料。

9.权利要求1的方法，其中所述亲和标记物选自聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸或聚谷氨酸。

10.权利要求1的方法，其中所述可裂解标记物选自由Trp、His-Met、Pro-Met和非天然氨基酸组成的组。

11.权利要求1的方法，其中所述裂解步骤通过使用选自由NBS、NCS和Pd(H₂O)₄组成的组的试剂施行。

12.一种评估目标肽的商业市场的方法，包括

a)根据权利要求1的方法生产目标肽；

b)使样品量的目标肽可无成本或以最低成本获得；及

c)测量在一段时间内对目标肽的需求次数。

13.根据权利要求1的方法生产的目标肽，其中所述肽的纯度大于99％。

14.一种载体，包含：

a)编码亲和标记物的核苷酸序列；

b)编码可裂解标记物的核苷酸序列；及

c)编码目标肽的核苷酸序列；

其中所述核苷酸以可操作的组合排列，且进一步其中该可操作的组合的表达产生含有亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合蛋白。

15.权利要求14的载体，其中所述亲和标记物是聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸或聚谷氨酸。

16.权利要求14的载体，其中所述可裂解标记物是Trp、His-Met、Pro-Met或非天然氨基酸。

17.权利要求14的载体，其中所述目标肽选自由淀粉样蛋白β、降钙素、恩夫韦肽、依泊汀、依泊汀δ、红细胞生成素、艾塞那肽、因子VIII、因子X、葡糖脑苷脂酶、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、胰岛素、胰岛素A、胰岛素B、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、干扰素、利拉鲁肽、促生长素抑制素、特立帕肽和组织纤溶酶原激活物(TPA)组成的组。

18.权利要求14的载体，其进一步包含编码包涵体指引肽的核苷酸序列。

19.权利要求18的载体，其中所述包涵体指引肽选自由为类固醇异构酶的包涵体指引肽、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段、或BRCA2的包涵体指引功能同系物组成的组。

20.含有权利要求14的载体的细胞。

21.包含亲和标记物、可裂解标记物和目标肽的融合蛋白。

22.根据权利要求21的融合蛋白，其中所述可裂解标记物选自由Trp、His-Met、Pro-Met和非天然氨基酸组成的组。

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